Claudiu Sebastian Andor Rezumat al tezei de doctorat · Mare, s-au desfăşurat în perioada...

Claudiu Sebastian Andor _______________________________ Rezumat al tezei de doctorat

REZUMAT Cercetările realizate în cadrul tezei intitulată: Studiu asupra serovarurilor de Salmonella izolate de la animale în arealul de epidemiosupraveghere al judeţului Satu Mare, s-au desfăşurat în perioada 2002-2008 şi au avut ca obiective principale următoarele:

• izolarea de tulpini din diverse nişe ecologice: animale bolnave, cadavre, purtători asimptomatici, probe de fecale şi furaje administrate în hrana animalelor;

• identificarea tulpinilor izolate pe baza caracterelor culturale, biochimice şi prin tipizare serologică;

• testarea prin metoda difuzimetrică a sensibilităţii sau rezistenţei tulpinilor izolate la antibiotice;

• detectarea prezenţei salmonelelor prin metode rapide imunoenzimatice în furaje de origine animală;

• stabilirea capacităţii imunizante a vaccinului inactivat Nobilis Salenvac, în urma administrării la găinile de reprodicţie şi verificarea transmiterii anticorpilor la puii de 1 zi şi cei de 41 de zile, titrul fiind stabilit printr-o tehnică ELISA competitivă. Lucrarea redactată cuprinde un număr de 227 pagini şi este structurată în două părţi

principale: prima parte intitulată “Studiu bibliografic” ce cuprinde 62 pagini şi partea a doua denumită “Cercetări proprii” structurată în nouă capitole, extinsă pe 165 pagini. În conţinutul tezei se regăsesc 63 de figuri (imagini foto, grafice, scheme) şi 28 de tabele.

Bibliografia selectată cuprinde 189 titluri din literatura de specialitate, autohtonă şi străină, inclusiv o serie de documente legislative elaborate de autoritatea sanitară veterinară din ţara noastră, directivele şi normele emise de Comunitatea Europenă.

În prima parte a lucrării, intitulată “Studiu bibliografic”, sunt prezentate date legate de istoric, taxonomia şi nomenclatura speciilor şi serovarurilor, ecologia, aspectele morfologice şi culturale, proprietăţile biochimice şi structura antigenică. De asemenea, sunt prezentate aspecte privind patogenitatea salmonelelor, implicaţiile în infecţiile animale, cu descrierea acestora ca infecţii primare şi secundare la diferite specii. O atenţie deosebită este acordată importanţei salmonelelor în sănătatea publică, fiind subliniat riscul pe care îl reprezintă produsele obţinute de la păsări, îndeosebi ouăle, care ocupă primul loc în producerea toxiinfecţiilor alimentare.

Un alt aspect de interes major şi actual în această parte a tezei este descrierea rezistenţei germenilor din genul Salmonella la factorii de mediu (fizici şi chimici) şi mai ales rezistenţa acestora la antibiotice, aspect alarmant datorită creşterii numărului de tulpini rezistente şi îndeosebi a celor multirezistente cum este cazul serovarului typhimurium fagotip 104, cu rezistenţă la ampicilină, cloramfenicol, streptomicină, sulfonamide şi tetracicline. În acest context se menţionează faptul că utilizarea fără discernământ a antibioticelor în raţii furajere, mai ales în scop preventiv, contribuie la creşterea numărului de tulpini multirezistente, aspect constatat mai recent şi în cazul fluorochinolonelor. În finalul primei părţi a tezei, este descrisă metodologia epidemiosupravegherii salmonelozelor în efectivele de animale şi păsări, implementată prin Programul Strategic de Supraveghere Sanitară Veterinară, aprobat de către Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi Pentru Siguranţa Alimentelor, reglementat prin directivele şi normele Comunităţii Europene. Toate aceste prevederi au ca obiectiv depistarea şi controlul germenilor din genul Salmonella în toate stadiile pertinente ale producţiei, în special la nivelul producţiei primare în vederea reducerii prevalenţei acestora şi a riscului pe care îl reprezintă pentru sănătatea publică. Partea a doua cuprinde şapte capitole în care sunt prezentate cercetările proprii, descrierea generală a rezultatelor, concluziile finale şi bibliografia.

1


În capitolul 13 intitulat “Cercetări privind izolarea salmonelelor prin metodele clasice” este prezentată conduita examenului bacteriologic prin utilizarea metodelor de izolare standardizate, în funcţie de felul probelor examinate şi rezultatele obţinute în urma analizelor. În perioada de studiu au fost examinate, prin metodele clasice, un număr de 12728 probe provenite de la diferite specii de animale şi făinuri proteice incriminate în stări morbide, prezentate în tabelul nr.1.

Tabel 1

Provenienţa probelor analizate pentru izolarea salmonelelor

Anul Specia

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

Total

Păsări 870 950 1100 1150 1200 1150 1250 7670

Porcine 180 210 230 225 240 320 195 1600

Bovine 130 156 170 135 145 160 195 1091

Ovine 145 176 135 85 110 94 69 814

Cabaline 45 64 37 56 48 39 40 329

Animale sălbatice 75 46 80 65 85 140 160 651

Animale cu blană 25 15 19 20 25 30 19 153

Furaje de natură proteică

45 30 40 60 85 90 70 420

Total 1515 1647 1811 1796 1938 2023 1998 12.728

În acest capitol au fost descrise mediile de cultură utilizate pentru izolarea salmonelelor, existând un sortiment bogat de medii de cultură pentru izolarea acestora (medii uzuale simple, medii de preîmbogăţire şi medii selective). În cazul probelor prelevate de la cadavre şi animale bolnave din focare de boală au fost făcute însămânţări pe medii uzuale (bulion şi agar nutritiv), apoi au fost efectuate pasaje pe mediile selective şi de diferenţiere.

Pentru probele de furaje, respectiv fecale, s-a realizat o preîmbogăţire în apă peptonată tamponată, repartizându-se 25 grame probă în 225 ml mediu. După etapa primară de izolare s-au făcut pasaje pe mediile de îmbogăţire Rappaport-Vasiliadis şi selenit pentru probele de furaje, iar în cazul probelor de fecale a fost utilizat mediul Rappaport-Vasiliadis semisolid modificat (MSRV) suplimentat cu 0.1% novobiocină. Pe suprafaţa acestui mediu salmonelele mobile cresc sub formă de spot cu halou clar în jurul punctului de inoculare (fig. 1).

Din mediile de îmbogăţire culturile au fost pasate pe medii selective: XLD (Xiloză-Lizină-Deoxicolat), MacConkey, Levine, Istrati Meitert, Salmonella-Shigella (SS), Wilson Blair şi Rambach. Dintre mediile selective utilizate pentru izolarea salmonelelor, mediul Rambach s-a dovedit a fi cel mai selectiv, pe suprafaţa acestuia putându-se face o diferenţiere clară între coloniile de nuanţă roşie tipice pentru Salmonella şi coloniile altor genuri bacteriene (fig. 2).

2


Fig. 2, Agar Rambach: cultură de Salmonella (colonii roz-roşii)

Fig. 1, Salmonella spp., sub formă de spot, mediu MSRV

Din probele examinate prin metoda clasică s-a reuşit izolarea a 175 tulpini suspecte de Salmonella, după aspectul coloniilor pe mediile selective, ce au fost identificate apoi biochimic şi serologic. În capitolul 14 intitulat “Cercetări privind comportamentul biochimic”, s-a urmărit diferenţierea speciilor genului Salmonella de celelalte genuri din familia Enterobacteriaceae pe baza caracterelor biochimice studiate atât pe medii politrope TSI, MIU şi SIM, cât şi prin sistemele microtest API 20E şi API ID 32E. În vederea caracterizării biochimice a tulpinilor izolate, din coloniile suspecte a fi Salmonella după aspectul lor pe mediile selective, se face o pasare în agar nutritiv pentru a se asigura puritatea culturii. Alături de utilizarea mediilor politrope TSI, MIU şi SIM, s-au efectuat următoarele teste: asimilarea zaharurilor, fermentarea zaharurilor, indolul, hidrogenul sulfurat şi utilizarea ureeii. Majoritatea tulpinilor de Salmonella izolate au produs hidrogen sulfurat (fig. 3), cu excepţia serovarului Salmonella abortus ovis (fig. 4) şi au fermentat glucoza.

La testele biochimice indol, uree şi oxidază toate tulpinile de Salmonella testate au fost negative, iar în ce priveşte mobilitatea, acestea au fost mobile producând o opacifiere în întreaga coloană a mediului. Sistemele microtest API 20E şi API ID32E au asigurat o caracterizare mai complexă a tulpinilor de Salmonella prin studierea a 20, respectiv 32 de proprietăţi biochimice, cu o diferenţiere mai sigură a acestora faţă de alţi germeni. În unele situaţii, în urma testelor efectuate, pe galeria API, s-a putut face identificarea serovarului de Salmonella (de exemplu S. choleraesuis).

3


Fig. 3, Salmonella H2S pozitivă (tub dreapta)

Fig. 4, Salmonella abortus ovis în mediul TSI (H2S negativă) şi MIU

În capitolul 15, intitulat ”Tehnici serologice pentru identificarea serovarurilor de Salmonella”, sunt prezentate reacţiile de aglutinare rapidă şi lentă pentru identificarea serovarurilor de Salmonella izolate. Prin utilizarea serurilor anti- Salmonella somatice polivalente şi de grup, tulpinile de Salmonella izolate au fost încadrate în trei grupe serologice astfel: din totalul de 175 tulpini, 115 (65,71%) fac parte din grupul serologic DO, 40 (22,85%) din grupul serologic BO şi 20 (11,42%) din grupul CO.

În urma reacţiei de aglutinare lentă, dintre antigenele reprezentate de tulpinile izolate şi antiserurile polivalente şi monovalente flagelare, acestea au fost încadrate în şapte serovaruri, cu următoarea incidenţă: Salmonella enteritidis 62,86% ; Salmonella typhimurium 6,86% ; Salmonella norwich 2,29% ; Salmonella abortus ovis 16% ; Salmonella cholerae suis 6,86% ; Salmonella agona 2,86% ; Salmonella dublin 2,29% (fig.5).

62.86%

6.86%2.29%

16%

2.86%6.86% 2.29%

Frecventa serovariantelor de Salmonella izolate

S. enteritidisS. typhimuriumS. norwicS. abortus - ovisS. agonaS.cholerae suisS. dublin

Fig. 5 – Frecvenţa serovarurilor de Salmonella izolate

4


În privinţa numărului de serovaruri identificate, pe specii de animale, conform datelor din tabelul 2, primul loc îl deţin păsările cu 110 tulpini de Salmonella enteritidis urmate de ovine cu 28 tulpini de Salmonella abortus ovis.

Tabel 2 Originea serovarurilor de Salmonella enterica izolate de la animale

SURSA DE IZOLARE

TOTAL

NUMĂR CURENT

SEROVAR

Găi

ni

Porc

ine

Ovi

ne

Bov

ine

Făin

uri

prot

eice

Num

ăr

%

1 S. abortusovis - - 28 - - 28 16 2 S. agona 5 - - - - 5 2,86 3 S. choleraesuis - 12 - - - 12 6,86 4 S. dublin - - - - 4 4 2,29 5 S. enteritidis 110 - - - - 110 62,86 6 S. norwich - 4 - - - 4 2,29

7 S. typhimurium - - - 12 - 12 6,86

8 TOTAL %

115 (65,71)

16 (9,14)

28 (16,0)

12 (6,85)

4 (2,28)

175 100

În capitolul 16, intitulat "Metode imunologice rapide de detecţie a salmonelelor"

sunt prezentate şi discutate rezultatele obţinute prin metodele imunoenzimatice: tehnica ELISA şi testul VIDAS, ce au fost utilizate în scopul detectării rapide a germenilor din genul Salmonella din probele de furaje. Prin cele două tehnici rapide au fost analizate 10 probe de furaje, din care cinci au fost contaminate artificial cu Salmonella grup DO, o probă a fost contaminată cu tulpina de referinţă Salmonella enteritidis, iar patru probe au fost tratate termic. Probele au fost analizate în paralel şi prin metoda clasică standardizată conform ISO 6579 / 2003 obţinându-se aceleaşi rezultate la toate metodele utilizate, conform tabelului 3.

Tabelul 3 Rezultatele testelor VIDAS SLM comparativ cu tehnica ELISA şi metoda de referinţă

Nr. crt. Specificare VIDAS

SLM ELISA Metoda clasică

1. Nr. total probe analizate 10 10 10 2. Probe negative 4 4 4 3. Probe pozitive confirmate 6 6 6 4. Probe fals negative 0 0 0 5. Sensibilitate 100% 100% 100%

Aceste tehnici imunoenzimatice se pretează foarte bine ca metode alternative de detecţie a salmonelelor, aplicate pentru screening rapid şi sensibil, evitându-se astfel apariţia unor focare de infecţie la animale şi toxiinfecţii alimentare.

În capitolul 17 intitulat "Studiu privind comportamentul tulpinilor de Salmonella faţă de unele substanţe antimicrobiene" sunt prezentate şi discutate amplu rezultatele de rezistenţă sau sensibilitate la antibiotice a tulpinilor testate prin metoda difuzimetrică.

5


Antibioticele utilizate au fost: ampicilin/sulbactam, acid nalidixic, ceftazidin, ceftriaxonă, ciprofloxacin, colistin sulfat, enrofloxacin, flumequină, furazolidon, gentamicină, neomicină, nitrofurantoin, streptomicină, tetraciclină şi trimetroprim sulfamethoxazole.

0

10

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

10 0

Num

arul

tulp

inilo

r de

Salm

onel

la te

stat

e (%

)

Sensibil

Intermediar

Rezistent

Antibiotice

Fig. 6, Sensibilitatea antimicrobiană a tulpinilor de Salmonella enterica izolate Dintre antibioticele testate, tulpinile de Salmonella au dovedit o sensibilitate constantă

la ceftriaxonă, enrofloxacin şi gentamicină, şi o deosebită rezistenţă la tetraciclină, furazolidon şi acid nalidixic (tabel 4 şi fig.6).

Tabel 4

Sensibilitatea antimicrobiană a tulpinilor de Salmonella enterica izolate

SENSIBIL INTERMEDIAR REZISTENT ANTIBIOTIC NR. % NR. % NR. %

TOTAL NR.

AMPICILIN / SULBACTAM 130 76.02% 10 5.85 31 18.13% 171 ACID NALIDIXIC 12 7.02% 10 5.85 149 87.13% 171 CEFTAZIDIM 105 61.40% 14 8.19 52 30.41% 171 CEFTRIAXONE 165 96.49% 4 2.34 2 1.17% 171 CIPROFLOXACIN 94 54.97% 39 22.81 38 22.22% 171 COLISTIN SULFAT 15 8.77% 37 21.64 119 69.59% 171 ENROFLOXACIN 140 81.87% 20 11.70 11 6.43% 171 FLUMEQUINE 9 5.26% 15 8.77 147 85.96% 171 FURAZOLIDON 7 4.09% 8 4.68 156 91.23% 171 GENTAMICINA 125 73.10% 40 23.39 6 3.51% 171 NEOMICINA 7 4.09% 11 6.43 153 89.47% 171 NITROFURANTOIN 5 2.92% 9 5.26 157 91.81% 171 STREPTOMICINA 115 67.25% 15 8.77 41 23.98% 171 TETRACICLINA 8 4.68% 4 2.34 159 92.98% 171 TRIMETROPRIM – SULFAMETOXAZOL 112 65.50% 25 14.62 34 19.88% 171

6


În urma rezultatelor obţinute s-a putut stabili o corelaţie între comportamentul la substanţele antimicrobiene şi originea tulpinilor, în sensul că valorile procentuale mari ale antibiorezistenţei au fost prezente la tulpinile izolate de la animale în hrana cărora s-au administrat substanţe medicamentoase ca promotor de creştere şi în scop profilactic.

În capitolul 18 intitulat "Studii de biologie moleculară" sunt prezentate rezultatele obţinute prin două variante ale tehnicii PCR (metoda clasică şi Real time) a unui număr de 7 probe de material patologic din care 6 contaminate artificial cu tulpină de referinţă Salmonella enteritidis. Metoda a fost optimizată astfel încât să se poată determina nivelul cel mai scăzut de contaminare, putându-se stabili limita de detecţie şi limita de cuantificare.

Comparativ cu alte metode alternative de detecţie pentru Salmonella, cele două tehnici de PCR prezintă sensibilitate şi specificitate pentru detecţia salmonelelor net superioară precum şi un timp foarte scurt de obţinere a rezultatelor.

În capitolul 19 intitulat "Metodologia imunoprofilaxiei" sunt prezentate rezultatele imunoprofilaxiei contra salmonelozelor la găinile de reproducţie rasă grea, efectuată prin administrarea vaccinului inactivat Nobilis Salenvac intramuscular în doză de 0.5ml / pasăre la vârsta de 40 zile cu rapel la 120 zile, obţinute prin determinarea titlului de anticorpi anti Salmonella prin tehnica ELISA competitivă din serul sangvin prelevat de la câte 15 capete de păsări din următoarele categorii: lot 1 - găini reproducţie rasă grea; lot 2 - pui de o zi, proveniţi din păsări vaccinate; lot 3 - pui de 41 zile.

La găinile de reproducţie valoarea minimă a raportului S/N (densitatea optică a probei împărţită la media martorului negativ) a fost 0.07, cea maximă de 0.16 cu o medie de 0.11, iar la puii de o zi valoarea minimă a fost de 0.13, valoarea maximă de 0.23 şi valoarea medie de 0.18. La toate probele au fost detectaţi anticorpi postvaccinali anti-Salmonella. În cazul puilor de 41 zile nu s-au detectat anticorpi postvaccinali anti-Salmonella enteritidis, valoarea minimă a raportului S/N a fost de 0.79, aceasta fiind mai mare decât valoarea maximă de 0.59 a raportului până la care probele sunt considerate pozitive (fig. 7).

0.79

0.110.18

0.99

0.160.23

1.11

0.130.07

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1 2 3

Categoria de pasari testate

S/N (g

rup

de titru

)

min.mediumax.

Fig. 7, Valorile minime şi maxime a raportului S/N pe loturi de păsări (1 - găini de reproducţie 38 săptămâni; 2 - pui broiler de o zi; 3 - pui broiler 41 zile)

Valoarea indicelui P, în urma prelucrării statistice prin testul t student, a raportului S/N, al celor trei categorii de păsări a fost mai mică decât 0.01 indicând o relaţie foarte semnificativă a acestora din punct de vedere statistic (tabel 5).

7


Tabel 5 Calculul valorii indicelui P prin compararea raportului S/N la cele trei loturi de pasari

Nr. Ctr. Reproducţie Broiler Broiler 1 zi Reproducţie

Broiler Broiler 41

zile Broiler 1 zi Broiler 41 zile

1 0.124 0.173 0.124 1.113 0.173 1.113 2 0.073 0.167 0.073 1.085 0.167 1.085 3 0.096 0.22 0.096 0.795 0.22 0.795 4 0.108 0.205 0.108 0.918 0.205 0.918 5 0.134 0.168 0.134 1.031 0.168 1.031 6 0.147 0.159 0.147 0.967 0.159 0.967 7 0.095 0.221 0.095 1.113 0.221 1.113 8 0.136 0.195 0.136 0.974 0.195 0.974 9 0.08 0.201 0.08 0.904 0.201 0.904 10 0.09 0.182 0.09 0.999 0.182 0.999 11 0.124 0.238 0.124 0.897 0.238 0.897 12 0.104 0.134 0.104 1.064 0.134 1.064 13 0.113 0.159 0.113 1.017 0.159 1.017 14 0.11 0.229 0.11 1.063 0.229 1.063 15 0.161 0.177 0.161 0.981 0.177 0.981

Media 0.113 0.188533333 0.113 0.994733333 0.1885333 0.994733333

Dev. Std. 0.024379188 0.029498958 0.024379188 0.088029358 0.029499 0.088029358

Testul t 0,0000219 0,0000276 0,00003053

Prezenţa salmonelelor într-o gamă tot mai largă de alimente de origine animală şi mai

nou şi în produse vegetale, face ca îmbolnăvirile şi mai ales toxiinfecţiile alimentare produse de aceşti germeni să deţină un loc important. Gravitatea şi extinderea focarelor de boală sunt argumente temeinice ce justifică aplicarea unor măsuri riguroase de epidemiosupraveghere, prin care se urmăreşte reducerea riscului apariţiei îmbolnăvirilor în care sunt implicate salmonelele. Pentru a răspunde cât mai eficient acestui deziderat trebuie alocate fonduri economice adecvate, concretizate în conceperea unor programe comunitare de monitorizare şi raportare, aflate în permanentă optimizare, deziderat căruia am incercat să-i răspundem şi prin investigaţiile din prezenta teza de doctorat.

8


SUMMARY The researches realized within the thesis entitled “Study on Salmonella serovars isolated from animals in the epidemio-surveillance area of Satu Mare County, took place between 2002-2008 and pointed the following major directions of investigation:

• strain isolation from various ecologic niche: corpse, sick animals, asymptomatic bearers, excrement samples and fodders administrated in animals food;

• the isolated strain identification on the basis of cultural, biochemical characteristics and by serologic typification;

• the testing by diffusimetrical method of the sensibility or resistance of the isolated strains to antibiotics;

• the detecting of Salmonella presence by immuno-enzymatic rapid methods in the fodders of animal origin. The thesis has 227 pages and it is structured in two main parts: the first part entitled

“Bibliographic study” comprises 62 pages and the second part named “Personal researches” is structured in eight chapters, extended on 165 pages. It contains 63 figures (photo images, graphics, and charts) and 28 tables.

The selected reference contains 189 titles of both Romanian and foreign literature in the field.

The first part, entitled “Bibliographic study”, is presenting data related to the historic, taxonomy and genus nomenclature, ecology, morphologic and cultural aspects, biochemical properties and antigenic structure. There are also presented aspects regarding the Salmonella pathogenesis, the implication in animal infections, with their description as primary and secondary infections at different animal species and in public health by alimentary toxic infections production. The primary source of toxic infections with Salmonella is represented by the products obtained from birds of which the eggs take the first place.

Another important and actual aspect in this part is the description of the Salmonella genus germs resistance to the medium factors (physical and chemical) and especially their resistance to the antibiotics, an alarming aspect due to the growth of the resistant strains number and mainly of those multi-resistant as it is the case of typhimurium fagotype 104 serovar, with resistance at: ampicillin, cloramfenicol, streptomycin, sulphamides and tetracycline.

An alarming fact is represented by the fluorochinolone utilization without judgment especially for preventive purpose by adding antibiotics in fodder ratios, thus contributing to the growth of the multi-resistant strains number. At the end of the first part it is described the methodology of the Salmonella epidemio-surveillance at the animals, implemented by the Sanitary-Veterinary Surveillance Strategic Programme, approved by the Veterinary Sanitary National Authority and for Food Safety, regulated by the European Community norms that have as goal the germ discovery and control from Salmonella genus in all the pertinent stages of the production, especially at the level of primary production, in order to reduce their prevalence and the risk that they represent for the public health. The second part gathers six chapters, the general description of the results, the final conclusions and the bibliography. In chapter 13 entitled “Researches regarding the Salmonella isolation by classic methods” it is presented the development of the bacteriologic exam by using standard isolation methods, according to the type of the analyzed samples and the results obtained after the analysis.

9


During the study period there were examined, by classic methods, a number of 12728 samples from different animal species and protean flours incriminated in morbid conditions, presented in table no. 1.

Table 1

The origin of the analyzed samples for Salmonella isolation

Year Specie

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

Total

Birds 870 950 1100 1150 1200 1150 1250 7670

Porcine 180 210 230 225 240 320 195 1600

Bovines 130 156 170 135 145 160 195 1091

Sheep 145 176 135 85 110 94 69 814

Horses 45 64 37 56 48 39 40 329

Wild animals 75 46 80 65 85 140 160 651

Furry animals 25 15 19 20 25 30 19 153

Protean fodder 45 30 40 60 85 90 70 420

Total 1515 1647 1811 1796 1938 2023 1998 12.728

In this chapter it is described the culture media used for Salmonella isolation, existing a wide range of culture media for their isolation (simple usual media, pre-enrichment media and selective media). In the case of the samples collected from corpses and sick animals from disease centers, sowings on usual media were made (bullion and nutritive agar), then they were passed on the respective media.

For the fodder and excrement samples, a pre-enrichment was realized in tamponed peptone water, distributing 25 grams of sample in 225 ml medium. After the primary isolation stage there were made passages on Rappaport-Vasiliadis pre-enrichment media (MSRV) and selenite for the fodder samples, and in the case of the excrement samples the modified semisolid Rappaport-Vasiliadis medium was used supplemented with 0.1% novobiocin, on its surface the mobile Salmonella growing under the form of spot with clear halo around the inoculation point (fig. 1).

From the enrichment media the cultures were passed on selective media: XLD (Xilosis-Lysine-Deoxycholate), Mac Conkey, Levine, Istrati Meitert, Salmonella-Shigella (SS) agar, Wilson Blair and Rambach. From the selective media used for Salmonella isolation, the Rambach medium proved to be the most selective and on its surface we could make a clear differentiation between the red colonies typical for Salmonella (fig. 2) and the colonies of other bacterial genus.

10


Fig. 2, Agar Rambach: Salmonella culture (pink-red colonies)

Fig. 1, Salmonella spp under the form of MSRV medium spot

From the samples examined by the classical method we managed to isolate 175 strains

suspect of Salmonella, from the aspect of the colonies on selective media that afterwards were identified from a biochemical and serological point of view.

Chapter 14 entitled “Researches regarding the biochemical behavior”, has in view Salmonella genus differentiation from the other genus from Enterobacteriaceae family on the basis of the studied biochemical characteristics, both on TSI, MIU and SIM polytrope media and by API 20E and API ID 32E micro test systems. In view of the biochemical characterization of the isolated strains from the colonies suspect to be Salmonella after their aspect on the selective media, a passage in nutritive agar is made in order to assure the culture purity. Using TSI, MIU and SIM polytrope media, the following tests were made: sugars assimilation, sugars fermentation, indole, sulphuretted hydrogen and urea. The majority of isolated Salmonella strains produced sulphuretted hydrogen (fig. 3), except for the Salmonella abortus ovis serovar (fig. 4) and they fermented the glucose.

At the indole, urea and oxidase biochemical tests all the tested Salmonella strains were negative, and regarding the mobility, they were mobile producing a turbidity in the whole medium column. API 20E and API ID32E micro test systems assured a wider characterization of the Salmonella strains by studying 20 respectively 32 biochemical properties, with a more certain differentiation from other germs. In some cases, after the tests, on the API gallery we could identify the Salmonella serovar (S. choleraesuis for example).

11


Fig. 4, Salmonella abortus ovis in TSI medium (H2S negative) and

Fig. 3, H2S positive Salmonella (right tube)

Chapter 15 entitled “Serologic techniques for the identification of Salmonella serovars” we present the reactions of fast and slow agglutination for the identification of the isolated Salmonella serovars. By using anti Salmonella serum polyvalent somatic and of group, the isolated Salmonella strains were included in three serologic groups: from the total of 175 strains, 115 belong to the DO serologic group, 40 to BO serologic group and 20 to CO group.

Following the slow agglutination reaction, from the antigenes represented by isolated strains and flagelar polyvalent and monovalent serum, they were included in seven serovars, with the following incidence: Salmonella enteritidis 62,86% ; Salmonella typhimurium 6,86% ; Salmonella norwich 2.29% ; Salmonella abortus ovis 16% ; Salmonella cholerae suis 6,86% ; Salmonella agona 2,86% ; Salmonella dublin 2,29% (fig.5).

The frequency of isolated Salmonella serovariants

62.86%

6.86%2.29%

16%2.86%6.86%2.29% S. enteritidis

S. typhimuriumS. norwicS. abortus - ovisS. agonaS.cholerae suisS. dublin

Fig. 5 – The frequency of isolated Salmonella serovars

12


Regarding the serovars number, identified on animal species, according to the data from table 2, the first place is occupied by the birds with 110 strains of Salmonella enteritidis followed by sheep with 28 strains of Salmonella abortus ovis.

Table 2 The Salmonella enterica serovars origin isolated from animals

ISOLATION SOURCE TOTAL

No.

SEROVAR

Poul

try

Porc

ine

Shee

p

Bov

ines

Prot

ean

Flou

rs

Num

ber

%

1 S. abortusovis - - 28 - - 28 16 2 S. agona 5 - - - - 5 2,86 3 S. choleraesuis - 12 - - - 12 6,86 4 S. dublin - - - - 4 4 2,29 5 S. enteritidis 110 - - - - 110 62,86 6 S. norwich - 4 - - - 4 2,29

7 S. typhimurium - - - 12 - 12 6,86

8 TOTAL %

115 (65.71)

16 (9.14)

28 (16.0)

12 (6.85)

4 (2.28)

175 100

Chapter 16, entitled “Fast immunologic methods of Salmonella detection” presents

and discusses the results obtained by immuno-enzymatic methods: ELISA technique and VIDAS test, that were used in order to detect rapidly the Salmonella genus germs from the fodder samples. By the two rapid techniques 10 fodder samples were analyzed, from which five were artificially contaminated with DO group Salmonella, one sample was contaminated with Salmonella enteritidis reference strain, and four samples were treated thermicaly. The samples were analyzed in parallel and by the standardized classical method according to ISO 6579 / 2003; the same results were obtained to all the analyzed methods, as presented in table 3.

Table 3 The results of VIDAS SLM compared with ELISA and the reference method

No. Specification VIDAS

SLM ELISA

Classic

method

1. Total number of analyzed samples 10 10 10 2. Negative samples 4 4 4 3. Confirmed positive samples 6 6 6 4. False negative samples 0 0 0 5. Sensibility 100% 100% 100%

These immuno-enzymatic techniques adapt very well as alternative methods of Salmonella detection, applied for rapid and sensitive screening, avoiding the emergence of some centre of contagion at animals and food toxi-infections.

13


In chapter 17 entitled “Study regarding the Salmonella strains behavior confronted by some antimicrobial substances” we present and discuss the results of resistance or sensibility to antibiotics of the tested strains by diffusimetrical method. The used antibiotics were: ampicillin/sulbactam, nalidixic acid, ceftazidim, ceftriaxone, ciprofloxacin, colistin sulphate, enrofloxacin, flumequine, furazolidone, gentamicin, neomycin, nitrofurantoin, streptomycin, tetracycline, and trimetropin sulphametoxazole.

0

10

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

10 0

The

num

ber o

f tes

ted

Salm

onel

last

rain

s (%

)

Sensible

Intermediary

Resistant

Antibiotics

Fig. 6. Antimicrobial sensibility of isolated Salmonella enterica strains From the tested antibiotics, the Salmonella strains proved a constant sensibility to

ceftriaxone, enrofloxacin and gentamicin, and an important resistance to tetracycline, furazolidone and nalidixic acid (table 4 and fig.6).

Table 4

Antimicrobial sensibility of isolated Salmonella enterica strains

SENSITIVE INTERMEDIAR RESISTANT TOTAL

ANTIBIOTIC NO. % NO. % NO. % NO. AMPICILLIN / SULBACTAM 130 76.02% 10 5.85 31 18.13% 171 NALIDIXIC ACID 12 7.02% 10 5.85 149 87.13% 171 CEFTAZIDIM 105 61.40% 14 8.19 52 30.41% 171 CEFTRIAXONE 165 96.49% 4 2.34 2 1.17% 171 CIPROFLOXACIN 94 54.97% 39 22.81 38 22.22% 171 COLISTIN SULPHATE 15 8.77% 37 21.64 119 69.59% 171 ENROFLOXACIN 140 81.87% 20 11.70 11 6.43% 171 FLUMEQUINE 9 5.26% 15 8.77 147 85.96% 171 FURAZOLIDONE 7 4.09% 8 4.68 156 91.23% 171 GENTAMICIN 125 73.10% 40 23.39 6 3.51% 171 NEOMYCIN 7 4.09% 11 6.43 153 89.47% 171 NITROFURANTOIN 5 2.92% 9 5.26 157 91.81% 171 STREPTOMYCIN 115 67.25% 15 8.77 41 23.98% 171 TETRACYCLIN 8 4.68% 4 2.34 159 92.98% 171 TRIMETROPRIN - SULPHAMETOXAZOLE 112 65.50% 25 14.62 34 19.88% 171

14


After the obtained results we could establish a correlation between the behavior to antimicrobial substances and the strains origin, in the sense that the higher percentage values of antibioresistance were present at the isolated strains from the animals in whose food were administrated medicinal substances as growth promoter and in prophylactic purpose.

In chapter 18 entitled “Molecular biology studies” we present the results obtained by two variants of PCR technique (classic method and Real time) of a number of 9 pathologic material samples from which six artificially contaminated with Salmonella enteritidis reference strain. The method was optimized so that it can determine the lowest level of contamination, being able to establish the detection limit and the quantification limit.

Comparatively to other alternative methods of Salmonella detection, the two PCR techniques present sensibility and specificity for Salmonella detection, clearly superior and also a very short time of results acquirement.

In chapter 19 entitled “Immuno prophylaxis methodology” we present the immuno prophylaxis results against Salmonella at Broiler hens, realized by the intramuscular administration of Nobilis Salenvac inactivated vaccine in doses of 0.5ml / bird at 40 days with revaccination at 120 days, obtained by the anti Salmonella antibodies determination by competitive ELISA technique from the sanguineous serum extracted from 15 bird from the following categories: batch 1 – reproduction broiler hens; batch 2 – one day chickens, originated from vaccinated birds; batch 3 – 41 days chickens.

At the reproduction hens the minimum value of the S/N relation (optic density of the sample divided to the negative witness media) was of 0.07, the maximum value 0.16 with an average of 0.11, and to the one day chickens the minimum value was 0.13, the maximum value 0.23 and the medium value 0.18. At all the samples post vaccine anti Salmonella antibodies were detected. In the case of the 42 days chickens no post vaccine anti Salmonella antibodies were detected; the minimum value of S/N relation was 0.79, bigger than the maximum value of 0.59 of the relation until which the samples are considered positive (fig. 7).

0.070.13

0.79

0.110.18

0.99

0.160.23

1.11

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

S/N

(titr

atio

n gr

oup)

1 2 3

Category of tested birdsmin.

medium

max.

Fig. 7. The minimum and maximum values of S/N relation on birds batches (1. – 38 weeks

reproduction hens; 2-one day broiler chicken; 3-41 days broiler chicken)

15


16

The P index value after the statistic processing by t student test of the S/N relation of the three bird categories was smaller than 0.01 indicating a very significant relation from a statistic point of view (table 5).

Table 5 The calculus of P index value by comparing the S/N relation to the three birds batches

No.

Broiler Reproduction

Broiler 1 day

Broiler Reproduction

Broiler 41 days

Broiler 1 day

Broiler 41 days

1 0.124 0.173 0.124 1.113 0.173 1.113 2 0.073 0.167 0.073 1.085 0.167 1.085 3 0.096 0.22 0.096 0.795 0.22 0.795 4 0.108 0.205 0.108 0.918 0.205 0.918 5 0.134 0.168 0.134 1.031 0.168 1.031 6 0.147 0.159 0.147 0.967 0.159 0.967 7 0.095 0.221 0.095 1.113 0.221 1.113 8 0.136 0.195 0.136 0.974 0.195 0.974 9 0.08 0.201 0.08 0.904 0.201 0.904 10 0.09 0.182 0.09 0.999 0.182 0.999 11 0.124 0.238 0.124 0.897 0.238 0.897 12 0.104 0.134 0.104 1.064 0.134 1.064 13 0.113 0.159 0.113 1.017 0.159 1.017 14 0.11 0.229 0.11 1.063 0.229 1.063 15 0.161 0.177 0.161 0.981 0.177 0.981

Average 0.113 0.188533333 0.113 0.994733333 0.1885333 0.994733333

Std. Dev. 0.024379188 0.029498958 0.024379188 0.088029358 0.029499 0.088029358

T test 0,0000219 0,0000276 0,00003053

The presence of salmonella in an increasingly wide range of foods of animal origin

and newer in plant products, making food poisoning caused by these germs to keep an important place in the world. Severity and extension of disease outbreaks are arguments that justify the thorough implementation of rigorous epidemio-surveillance measures, which aims to reduce the risk of illness involving Salmonella.

To effectively respond to this concept, adequate economic funds should be allocated, materialized in the design of judicious monitoring and reporting programs, in permanent optimization goal, which we tried to answer them by the investigations in this PhD thesis.

Claudiu Sebastian Andor Rezumat al tezei de doctorat · Mare, s-au desfăşurat în perioada...

Documents

Transcript of Claudiu Sebastian Andor Rezumat al tezei de doctorat · Mare, s-au desfăşurat în perioada...