Cap 3 Bilant de Populatii

19.04.23 1Ingineria Bioproceselor si Bioreactoare

Bilanţ de PopulaţiiAnumite evenimente specifice ale ciclului celular(i.e., distributia plasmidelor catre celulele-fiica in timpul diviziunii celulare in culturile recombinante) influenteaza performanta globala a culturii si impun dezvoltarea unui model de bilant de populatii bazat pe numarul de celule pentru a obtine o descriere corecta a acestor procese.

Proprietatile celulei sunt descrise de vectorul y, care poate contine informatii despre continutul celular ai componentilor intracelulari, varsta si marimea celulei, etc

Distributia celulelor in interiorul populatiei este data de functia de distributie a densitatii f(y,t), definita astfel incat f(y,t)∙dy reprezinta numarul de celule pe unitatea de volum in interiorul spatiului de proprietate de la y la y + dy la timpul t. Prin urmare numarul de celule pe unitatea de volum in populatie este dat de

,V

N t f t dy

y y

Jens Nielsen, John Villadsen, Gunnar Liden - Bioreaction Engineering Principles, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 2003


Bilanţ de PopulaţiiDeterminarea numarului total de celule din bilantul de substrat

Pentru o distributie a celulelor cu diferite cinetici de consum a substratului, viteza volumetrica de consum a substratului pentru un singur substrat limitativ este data de

Bilantul de masa pentru substratul limitativ devine astfel

, ,S

V

q t r S f t d y

y y y y

, ,inS

V

S SdSr S f t d

dt

y

y y y

Daca rS (y, S) este considerata independenta de starea celulara, solutia pentru starea stationara a bilantului de masa rezulta in

in

S

S SN t

r S



Bilanţ de PopulaţiiPentru un sistem omogen(sau pentru un element de volum omogen dat), bilantul dinamic pentru functia de distributie

Viteza de schimbare a proprietatilor ri – viteza in lungul axei i de proprietate in spatiul total de proprietate Vy

, , ,, , , inf t f t f tt f t h t

t

y

y y yr y y y

Viteza neta de formare a celulelor cu proprietatea y datorita diviziunii celulare

Debitul net de celule cu proprietatea y

Ecuatia de bilant de populatii este aplicabila numai pentru bioreactoare omogene (cu amestecare perfecta), unde functia de distributie a densitatii este aceiasi pentru fiecare element de volum din bioreactor. Ipoteza este rezonabila pentru bioreactoarele la scala de laborator, in timp ce pentru bioreactoarele folosite in industrie nu poate fi aplicata .Jens Nielsen, John Villadsen, Gunnar Liden - Bioreaction Engineering Principles, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 2003


Bilanţ de PopulaţiiForma generala a bilantului de populatiiCu un spatiu fizic ne-omogen, functia de distributie a densitatii devine deasemenea o functie de pozitie in spatiu– f(z,y,t) , unde z este spatiul fizic de stare, in timp ce f(z,y,t) d∙ zdy este numarul de celule din interiorul spatiului fizic cuprins intre z si z + dz si din interiorul spatiului de proprietate cuprins intre y si y + dy.Numarul total de celule pe unitatea de volum din populatie este dat de

Efectul dilutiei

, , ,, , , ,

, , , , , ,t f tf t f t dV

t f t h tt V dt V

z

y

v z z yz y z yr z y z y z y

Viteza neta de formare a celulelor cu proprietatea y datorita diviziunii celulare

Transportul net convectiv de celule cu proprietatea y

, ,V V

N t f t d dy z

z y z y

Forma generalizata a bilantului de populatii devine

Viteza schimbarii de proprietati



Bilanţ de Populaţii

Henson, M.A., 2003, Dynamic modeling of microbial cell populations, Current Opinion in Biotechnology 14:460–467


Bilanţ de PopulaţiiFormarea celulelor cu proprietatea y este descrisa de functia h(y,t) care permite si descrierea aparitiei unor evenimente discrete, ca diviziunea celulara. Functia h(y,t) este deseori impartita in doi termeni:

Viteza de formare a celulelor cu proprietatea y

, , ,h t b t f t y y y

, , ,h t h t h t y y y


Viteza de disparitie a celulelor cu proprietate y datorita diviziunii

Diviziunea celulara– eveniment singular (relativ independent de ceea ce se intampla cu celelalte celule).Considerand b(y,t) frecventa de diviziune– b(y,t)∙dt este probabilitatea ca o celula cu proprietatea y la un timp t se divide in intervalul t – t + dt.


Bilanţ de PopulaţiiIndependent de proprietatile celulare si conditiile de mediu, doua noi celule se formeaza ca urmare a diviziunii unei celule cu proprietatea y.

* * * *, 2 , , , , , ,V

h t b t p t f t d b t f t y

y y y y y y y y

* * * *, 2 , , , ,V

h t b t p t f t d y

y y y y y y


Functia de partitionare – probabilitatea formarii celulelor cu proprietatile y si y*-y, respectiv, in urma diviziunii unei celule cu proprietatea y*.

* *

*

, , 0,

, , 1

i i

V

p t y y

p t d

y

y y

y y y


Bilanţ de PopulaţiiIn unele situatii este suficient sa se obtina informatii legate de compozitia medie si de deviatia standard a populatiei.Acestea pot fi calculate pornind de la momentele functiei de distributie a densitatii

, ,y

nn

V

M y t y f y t dy


Momentul de ordin zero este egal cu numarul total de celule pe unitatea de volum.Momentul de ordin unu este egal cu compozitia medie a celulei

1

0

,yV

y f y t dyM t

y tM t N t

Momentul de ordin doi al functiei este asociat variantei

2

2 22 2

,yV

y f y t dyM t

t y t y tN t N t


Bilanţ de PopulaţiiPentru a dezvolta o intelegere fundamentala a eterogenitatii celulare si efectul acesteia asupra dinamicii populatiei microbiene, sunt necesare metode biochimice de analiza care ofera informatii la nivel mono-celular.

Citometria in flux a aparut ca o metoda foarte puternica de a masura distributia proprietatilor celulare in interiorul unor populatii mari de celule. Combinand tehnici de marcare a celulelor si analiza a dispersiei luminii si a semnalelor fluorescente, celulele pot fi diferentiate tinand cont de marime, continut de proteine, continut de ADN si de alte proprietati intracelulare.

Citometria in flux a fost combinata cu tehnici de injectie in flux pentru a produce sisteme automate care ofera masuratori in timp real a distributiei proprietatilor celulelor.

Cand ii sunt asociate modele de populati celulare corespunzatoare, citometria in flux in timp real poate permite dezvoltarea sistemelor computerizate care au capacitatea de a monitoriza si controla distributiile celulare in fermentatiile microbiene.



Bilanţ de PopulaţiiCea mai riguroasa abordare pentru a descrie efectul eterogenitatii celulare asupra dinamicii culturilor microbiene se bazeaza pe Ecuatia Bilantului de Populatii(PBE – Population Balance Equation).

Celulele individuale sunt diferentiate folosind variabile alese corespunzator care caracterizeaza starea intracelulara. Modele de PBE bazate pe un singur parametru de stare, precum varsta sau masa celulei, sunt cele mai des intalnite, datorita simplitatii lor.

In general ecuatia de bilant de populatii este cuplata cu ecuatiile de bilant material ale nutrientilor importanti din mediul extracelular.

De obicei se considera un singur substrat limitativ, din motivul simplitatii.




viteza de crestere pentru o singura celula

viteza de diviziune

functia de partititionare

functia de distributie a numarului de celule

concentratia de substrat

viteza de dilutie

concentratia substratului la intrare


Bilanţ de PopulaţiiDisponibilitatea modelelor discretizate PBE si/sau a modelelor aproximative de ordin redus faciliteaza proiectarea controllerelor cu feedback, care pot regla in mod direct distributia variabilelor legate de distributia celulelor.

Studiile recente s-au concentrat asupra chemostatelor ,unde viteza de dilutie si concentratia initiala a substratului limitativ sunt potentialele variabile manipulate.

Aceste studii au pus in evidenta relatia dintre the modelul dinamic al ciclului celular si strategia de control prin feedback aleasa.

Metabolismul celulelor individuale si dinamica populatiei pot avea de asemenea un impact major asupra proiectarii pornind de la un model a controllerelor.



Bilanţ de PopulaţiiModele de asamblare celulara

Un dezavantaj al folosirii modelelor PBE este lipsa unei baze biochimice ce determina functiile fiziologice asociate cresterii si diviziunii unei singure celule.

Incorporarea cailor de reactie intracelulare care ofera descrieri mecanistice ale acestor procese celulare este posibila daca functia de distributie reprezinta fractia masica (mai degraba decat numarul) a celulelor cu o anumita stare interna.

Starea intracelulara este reprezentata de un vector, potential de dimensiuni mari, care contine concentratiile diferitelor specii intracelulare – aceste modele de PBE structurate metabolic se asteapta sa fie greu de manipulat prin calcul intrucat discretizarea lor va produce un numar foarte mare (≥106 , in functie de descrierea metabolica ) de ecuatii diferentiale ordinare neliniare.




Vector de stare intracelular

Vector parametrii intracelulari (reactie si

fenomene de transport)

Vector parametrii extracelulari

Vector de stare extracelulara(substraturi, metaboliti si alte specii)


Bilanţ de PopulaţiiUn model dinamic al unei singure celule microbiene care descrie corespunzator procesele celulare de interes este necesar. Vectorul de stare al modelului de ecuatii ordinare diferentiale neliniare contine concentratiile diferitelor specii intracelulare.

Un ansamblu este construit pornind de la un numar potential mare de modele celulare individuale in care parametrii intracelulari sunt modificati aleator fata de valorile lor nominale pentru a surprinde eterogeneitatile asociate proceselor celulare particulare. In general perturbarile aleatoare sunt presupuse a fi normal distribuite cu zero medie si varianta corespunzatoare oricarui set de date disponibile.

Modelu ansamblului celular este completat adaugand ecuatii diferentiale, care surprind dinamica concentratiei speciilor extracelulare relevante.

Datele obtinute din simulari pot fi folosite pentru calcularea dinamicii distributiilor celulare, raportandu-se la orice proprietate intracelulara prezisa de modelul celular individual– folosind un numar suficient de mare de modele celulare individuale, mediile ansamblului celular sunt independente de numarul de celule iar distributiile celulare calculate sunt rezonabile.Henson, M.A., 2003, Dynamic modeling of microbial cell populations, Current Opinion in Biotechnology 14:460–467


Bilanţ de PopulaţiiDatorita nivelului de detalii introduse in formularea lor matematica, modelele de bilant de populatii celulare reprezinta cea mai precisa metoda de a descrie fenomenele complexe asociate cresterii celulare, consumului de nutrienti si formarii de produsi in culturile microbiene.

Formularea acestor modele permite, firesc, integrarea informatiilor despre diviziunea celulara si partitia materialului celular urmand diviziunea. Acest tip de informatii pur si simplu nu este prezent in modelele de tip continuum(care trateaza biomasa ca pe o entitate omogena).

Contrar modelelor continuum, care pot prezice doar o medie a proprietatilor populatiei, modelele de bilant de populatii sunt capabile sa prezica distributiile de proprietate pe intreaga celula.

Problema controlului diferitelor momente ale distributiei masei celulelor intr-un bioreactor continuu prin manipularea vitezei de dilutie este rezolvata.Mantzaris, N.V., Daoutidis, P., 2004, Cell population balance modeling and control in continuous bioreactors, Journal of Process

Control 14, 775–784


Bilanţ de PopulaţiiAnumiti metaboliti de interes(e.g. anticorpi monoclonali produsi de celulele hybridoma) sunt produsi doar in ultima parte a ciclului celular unde masa celulara este mai mare.

Pentru a mari productia de metabolit, este necesar sa se atinga o distribuitie a masei celulare pentru care momentele de ordin zero si unu sa fie maxime iar cel de ordinul doi minim.

Modelul folosit pentru simulari si generarea controllerului este un model celular de bilant de populatii, structurat pe masa, care ia de asemenea in consideratie consumul de substrat.

Trei cazuri diferite de control al parametrului de iesire sunt luate in consideratie: a) momentul de ordin intai al distributiei (concentratia biomasei),b) momentul de ordin zero al distributiei (densitatea celulara)c) momentul de ordin doi al distributiei.

Mantzaris, N.V., Daoutidis, P., 2004, Cell population balance modeling and control in continuous bioreactors, Journal of Process Control 14, 775–784


Bilanţ de PopulaţiiDinamica functiei de distributie de stareN(x,t) este descrisa de ecuatia generala de bilant de populatii

In cazul in care se pleaca de la presupunerea ca celulele mama isi impart egal materialul intre cele doua celule fiica, ecuatia generala de bilant de populatii devine o ecuatie functionala partial diferentiala


Bilanturile materiale pentru substratul S sunt incluse


Bilanţ de PopulaţiiDoua expresii diferite ale vitezei de crestere pentru o singura celula sunt luate in considerare

Celulele se divid cu viteza:


Functia de partitie- distributie simetrica beta

Functia de distributie a probabilitatii diviziunii se presupune ca depinde doar de masa celulei- partea stanga trunchiata a unei distributii Gaussiene


Bilanţ de PopulaţiiSe considera ca nu are loc decesul celular si ca celulele cresc intr-un propagator continuu, din care ies cu o viteza de dilutie D. Cu aceste presupuneri, dinamica populatiei celulare devine

Bilantul de masa pentru substrat


Termenul de crestere evidentiaza faptul ca celulele cu masa m sunt ‘pierdute’ ca urmare a cresterii lor in celule cu mase mai mari. Termenul de diviziune descrie pierderea celulelor cu masa m in urma diviziunii in celule fiica cu mase mai mici. Termenul de nastere arata formare celulelor cu masa m ca rezultat al diviziunii celulare al celulelor cu mase mai mari. Termenul de dilutie reprezinta viteza cu care celulele ies din bioreactor.



Simulari in bucla deschisa– viteza de crestere liniara

Densitate celulara stationara(zero moment) (cercuri goale)Moment de ordin 1(patrate goale)Moment de ordin 2(cercuri pline)Concentratia substratului(patrate pline) functie de viteza de dilutie



Bilanţ de PopulaţiiControlul momentului de ordin intai al distributiei– viteza este liniara in raport cu m


Metodele de control neliniar pot fi folosite pentru a impune un raspuns de ordinul intai in bucla inchisa pentru concentratia de biomasa

Legea de control necesara este

Necesita masuratori doar pentru concentratiile de substrat si biomasa, cea din urma pentru momentul de ordin intai care depinde de ea.



Simulare in bucla inchisa––viteza de crestere liniara.

Valoarea parametrului de ajustare a controllerului: k1=1.

Parametrul de iesire controlat: concentratia biomasei. M1(0)= 4.999 g/l (D = 0.1 h-1) M1,sp = 3 g/l (D = 0.953 h-1). (a)Dinamica iesirii controlate si intarii manipulate. Linie continua: concentratia biomasei(moment de ordin 1). Linie punctata: viteza de dilutie. (b)Dinamica distributiei masei in intreaga celula


Cap 3 Bilant de Populatii

Documents

Transcript of Cap 3 Bilant de Populatii