1

CandiSelect™ 4 63746 Mediu agar cromogen pentru izolarea selectivă a drojdiilor, identificarea directă a Candida albicans și identificarea prezumtivă a Candida tropicalis, Candida glabrata și Candida krusei.

1- SCOPUL UTILIZĂRII CandiSelect™ 4 este un mediu agar cromogen utilizat pentru: Izolarea selectivă a drojdiilor. Identificarea directă a Candida albicans prin detectarea

activității enzimatice specifice, rezultând în colonii de culoarea roz până la purpuriu.

Identificarea prezumtivă a Candida tropicalis, Candida glabrata și Candida krusei conform culorii turcoaz și a aspectului morfologic al coloniilor.

Detectaea de cultui mixte de drojdii. 2- SUMAR ȘI EXPLICAȚIE Frecvența infecțiilor fungice invazive a înregistrat o creștere constantă în ultimii douăzeci de ani. Dat fiind progresul recent în domeniul intervențiilor medicale și chirurgicale și creșterea populației de pacienți imunodeprimați, varietatea și lista fungilor patogeni umani continuă să crească. Este general acceptat faptul că speciile de Candida sunt o cauză comună de infecție nosocomială asociate cu o rată semnificativă a morbidității și mortalității și cu costuri ridicate de asistență medicală.1

Candida albicans este soecia de Candida cel mai des impolicată în aceste infecții, dar speciile non-albicans precum Candida glabrata și Candida krusei prezintă o frecvență în creștere. Mai mult, infecțiile cauzate de cele din urmă specii variază adeseori din punct de vedere al susceptibilității antifungice. Conform celor mai publicate îndrumări cu privire la tratamentul candidozei, diagnosticarea rapidă și exactă a infecției este necesară înainte de inițierea tratamentului adecvat.2 CandiSelect™ 4 este un mediu cromogen selectiv pentru identificarea C. albicans și pentru identificarea prezumtivă a principalelor specii de drojdii patogene: C. glabrata, C. tropicalis și C. krusei. Coloniile de C. albicans au un aspect de culoare roz până la purpuriu. Coloniile C. tropicalis colonies au un aspect turcoaz, de colonii sferice, cu aspect morfologic neted. C. glabrata sunt colonii cu un aspect de culoare turcoaz pal, plate și lucioase, cu un aspect morfologic neted, și cel mai adesea prezintă așa-numita caracteristică a modelului de culoare „ochi-de pește” (colonii turcoaz mai închise la culoare în partea centrală). Coloniile C. krusei au un aspect turcoaz-albastrui, cu un aspect morfologic in general rugos, aspect uscat și contur neregulat 3- PRINCIPIUL PROCEDURII CandiSelect™ 4 conține substraturi cromogene care reacționează cu enzimele secretate de celulele de drojdie, rezultând în colonii cu diverse pigmentări.

Aceste enzime sunt specifice speciilor, permițând identificarea organismului după nivelul speciei, in funcție de culoare și caracteristicile coloniei.1 Identificarea lui Candida albicans se bazează pe detectarea activității enzimatice a hexozaminidazei, specifică acestei specii, prin utilizarea unui substrat cromogen conținut în mediu, inducând colonii colorate în nuanțe de roz până la purpuriu. Detectarea activității enzimatice a fosfatazei, prin utilizarea unui al doilea substrat prezent în mediu, permite identificarea prezumtivă a Candida tropicalis, Candida glabrata și Candida krusei pe baza colorării în turcoaz a coloniilor, asociată cu un aspect morfologic tipic pentru fiecare dintre aceste specii. Creșterea majorității contaminanților bacterieni este împiedicată de cloramfenicol și gentamicină. 4- REACTIVI Pachet de 20 de vase Petri dishes (90 mm) (CANDI 4) – Nr. catalog: 63746 CandiSelect™ 4 este un mediu selectiv gata de utilizare. Formulare aproximativă mediu (g/L) Amestec peptonă 8 Glucoză 5 Substraturi cromogene 0.2 Cloramfenicol + Gentamicină 0.5 Agar 13 5- AVERTISMENTE ȘI PRECAUȚII Utilizare pentru diagnosticare in vitro. Respectați tehnicile aseptice și măsurile stabilite împotriva riscurilor microbiologice pe tot parcursul desfășurării procedurilor. După utilizare, plăcile pregătite, recipeintele cu probe și alte materiale potențial contaminate vor fi sterilizate sau eliminate conform procedurilor de laborator stabilite. Toate probele umane ar trebui să fie tratate ca și cum capabile să transmită boli infectioase, inclusiv virusurile hepatitice și virusul imunodeficienței umane, prin utilizarea de măsuri de precauție universale și îndrumările instituționale adecvate.3-7 Fișa de siguranță (FS) este disponibilă la cerere (sau pe bio-rad.com). Expunerea prelungită la lumină a mediului CandiSelect™ 4 poate duce la recuperarea redusă și/sau la colorarea organismelor QC sau a izolatelor de pacienți.

2

6- INSTRUCȚIUNI PENTRU DEPOZITARE Depozitați plăcile la 2-8°C, protejate de lumină Plăcile vor fi păstrate în ambalajul original plastic si carton până sunt gata de utilizare. Închideți ambalajul de fiecare dată după ce extrageți una dintre plăci. Plăcile vor fi utilizate înainte de data de expirare indicată pe etichetă și tipărită pe placă. Reduceți la minimum expunerea la lumină înainte și în timpul incubării, întrucât lumina ar putea distruge cromogenii din mediu. 7- DETERIORAREA PRODUSULUI Mediul ar trebuie să fie ușor opalescent și de culoarea galben deschis, precum aceea a chihlimbarului. Plăcile agar CandiSelect™ 4 cu un aspect de culoare albăstruie nu vor funcționa optim. Plăcile nu vor fi folosite dacă sunt vizibile semne de contaminare, uscare, cracare sau orice alte semne de deteriorare. 8- RECOLTAREA ȘI MANIPULAREA PROBELOR Probele vor fi recoltate și manipulate conform procedurilor standard de Microbiologie clinică. Utilizați un mediu de transport adecvat în cazul în care probele vor fi prelucrate cu întârziere. 9- PROCEDURA Materiale asigurate: Plăci agar Bio-Rad CandiSelect™ 4. Materiale necesare, dar care nu sunt furnizate Incubator, 35-37°C Materiale de laborator necesare pentru aceasta procedură Materiale opționale ce nu sunt furnizate Medii de cultură suplimentare Organisme de control al calității Procedură test Aduceți mediul CandiSelect™ 4 la temperatura camerei, protejat de lumină, înainte de utilizare. A nu se utiliza în cazul în care există umiditate excesivă pe suprafața de agar. Inoculare: Inoculați probele clinice direct pe CandiSelect™ 4,

utilizând tehnici de izolare convenționale. În cazul probelor recoltate pe un tampon, mai întâi rulați tamponul pe o pătrime din placă și utilizați o ansă pentru izolare. Consultați recomandările curente pentru depozitarea corectă a probelor biologice.7

CandiSelect™ 4 mai poate fi inoculat și cu colonii de drojdie ce au fost izolate anterior pe un alt mediu de cultură (subcultivare). În ceea ce privește mediul cromogen, este foarte important să însămânțați cu ansa la intervale foarte apropiate pentru a obține colonii bine ziolate, pentru o morfologie și o colare distincte a coloniilor.

Incubare: Incubați placa la o temperatură cuprinsă între 35-37°C timp

de 24 până la 48 ore în poziție răsturnată (partea agar în sus). (Dacă nu se există nicio creștere, prelungiți perioada de incubare la până la 72 ore). A nu se incuba într-un incubator CO2.

Speciile ce aparțin claselor Cryptococcus și Geotrichum cresc mai rapid la 30°C decât la 37°C. Dacă este suspectată o infecție cu Cryptococcus neoformans este recomandată inocularea unei a doua plăci agar în paralel, care va fi incubată la 30°C.

10- REZULTATE Citire / Interpretare: Citiți plăcile și identificați drojdia în funcție de culoare și de aspectul morfologic al coloniilor. Creșterea optimă și morfologia cea mai specifică vor fi atinse în aproximativ 48 de ore. 1) Identificare directă a Candida albicans Coloniile colorate de la roz până la purpuriu (activitate a hexozaminidazei pozitivă) indică prezența Candida albicans. Coloniile cu suprafața alba și culoarea roz până la purpuriu dedesubt (vizibilă dacă răsturnați placa) vor fi identificate ca Candida albicans. După o perioadă de incubație de 48 ore, este posibil să fie observată o difuzie de culoare în jurul coloniei, precum și un halo de culoare mov. 2) Identificare prezumtivă Coloniile de culoare turcoaz sunt pozitive pentru activitate fosfatază. Coloniile de culoare turcoaz intens, colorate uniform, cu un

morfotip sferic, neted (N): identificare prezumtivă a Candida tropicalis. După o perioadă de incubație de 48 ore, culoarea turcoaz este intensă și poate fi observat și un halo difuzie de culoare turcoaz în jurul coloniei.

Coloniile de culoare turcoaz pal care sunt plate și lucioase, cu un aspect morfologic neted (N), și o caracteristică foarte frecvent întâlnită, modelulde culoare „ochi-de pește” (colonii turcoaz mai închise la culoare în partea centrală): identificare prezumtivă a Candida glabrata.

Coloniile întinse, de culoare turcoaz-albastru, cu un aspect morfologic in general rugos (A), aspect uscat și contur neregulat: identificare prezumtivă a Candida krusei.

3) Testare suplimentară În urma unei perioade de incubare de 48 de ore, coloniile

de culoare albă sau albastru deschis (și care nu prezintă niciun fel de morfologie tipică), vor fi identificate prin metodele convenționale de identificare.

Testele de identificare convențională, cum ar fi testele de aglutinare cu latex sau analiza caracteristicilor biochimice, morfologice și metabolice (ex. Bio-Rad AuxaColor™ 2) și testarea pentru sensibilitatea la medicamente antifungice (ex. Bio-Rad Fungitest™) pot fi efectuate direct utilizând coloniile izolate pe CandiSelect™ 4. Notă: Bio-Rad AuxaColor™ 2 și Bio-Rad Fungitest™ nu sunt disponibile în SUA.

11- CONTROLUL CALIĂȚII DE CĂTRE UTILIZATOR Înainte de utilizare examinați plăcile pentru a constata o eventuală contaminare sau deterioare (vezi Secțiunea 7 de mai sus). Funcționalitatea poate fi evaluată în cazul organismelor despre care se știe că prezintă reacții specifice.

3

Organismele recomandate sunt:

Organism testare

Rezultate preconizate pentru CandiSelect™ 4 timp de 48 de ore, colonii izolate

C. albicans ATCC 24433

Colonii de culoare roz până la purpuriu

C. glabrata ATCC 66032

Colonii netede, lucioase, turcoaz, adeseori mai închise la culoare în partea centrală

C. tropicalis ATCC 750

Colonii netede, sferice, de culoare turcoaz

C. krusei ATCC 14243

Colonii cu aspect aspru, de culoare turcoaz, adeseori cu contur neregulat

C. parapsilosis ATCC 90018

Colonii de culoare albă până la o nuanță deschisă de albastru

S. aureus ATCC 25923

Nicio creștere

E. coli ATCC 25922

Nicio creștere

Testele pentru controlul calității trebuie efectuate conform îndrumărilor și cerințelor organizațiilor de acreditare sau de reglementare locale, de stat și/sau federale, precum și ocnform procedurilor interne pentru Controlul calității ale laboratorului. Consultați documentele pentru îndrumare relevante ale CLSI, precum și reglementările CLIA cu privire la practicile pentru Controlul calității aflate în vigoare. 12- LIMITĂRI ALE PROCEDURII Tulpinile de Candida dubliniensis prezintă activitate a

hexozaminidazei și prezintă o culoare între roz și purpuriu în acest mediu, dar această specie este izolată numai în cazuri foarte rare.

Tulpini rare de Candida albicans prezintă colonii de culoare albă după o perioadă de incubație de 48 de ore.

Unele probe complexe (expectorații, mostre traheo-bronsice, scaune) s-ar putea colora într-o nuanță de albastru nu foarte intens atunci când sunt inoculate direct pe placă. Prin urmare, se recomandă ca aceste probe să fie însămânțate cu ansa la intervale foarte apropiate pentru a obține colonii bine ziolate, disociate de probă.

Unele tulpini de Candida parapsilosis, Candida kefyr și Candida lusitaniae cu o activitate mai intensă a fosfatazei pot prezenta colonii de culoare turcoaz pal după o perioadă de incubație de 48 de ore.

Anumite tupini de drojdie mai pretențioase prezintă cerințe metabolice specifice (factori de creștere, temperatură de incubație etc.) și nu pot crește pe acest mediu.

CandiSelect™ 4 permite identificarea prezumtivă a Candida tropicalis, Candida glabrata și Candida krusei. Pentru un diagnostic definitiv, se recomandă confirmarea identificării cu ajutorul testelor de identificare convenționale.

13- VALORI PRECONIZATE Speciile din clasa Candida sunt agenții cel mai frecvent implicați în infecțiile fungice invazive. O formă de candidoză invazivă, candidemia, se află pe locul patru în rândul celor mai des întâlnite infecții în sânge infection în rândul pacienților spitalizați în Statele Unite ale Americii. În urma unui studiu realizat la CDC s-a constatat că candidemia se manifestă la 8 persoane din 100.000 anual. Printre persoanel cu risc ridicat de infecție cu candidemia se numără copii cu greutate scăzută la naștere, pacientii supusi

interventiilor chirurgicale, precum si cei ale caror sisteme

imunitare sunt deficitare.8

14- CARACTERISTICI DE PERFORMANȚĂ Trei metode au fost utilizate pentru evaluarea performanțelor mediului. În acest studiu, identificarea a fost confirmată prin metode de referință printre care se numără testul de blasteză, de micro-fermentare, de morfologie microscopică, clamidio-sporulare pe mediu de orez-agar-Tween, teste de identificare rapidă și teste de asimilare. 1) În cadrul unui studiu prospectiv au fost testate 1034 de probe clinice de origine respiratorie, urogenitală, ENT sau de altă origine și au fost identificate 347 izolate de Candida; 46 dintre acestea au provenit din 22 probe polimicrobiene . Probe monomicrobiene: Identificarea directă a Candida albicans (din 235 de izolate

identificate). Mediul CandiSelect™ 4 prezintă o sensibilitate de 29,4% și 77,0% la 24 de ore și respectiv 48 de ore. Specificitatea mediului a fost de 100%.

Identificarea prezumptivă a Candida glabrata (din 21 izolate identificate), Candida tropicalis (din 15 izolate identificate) și Candida krusei (din 3 izolate identificate): 85,7% din Candida glabrata au fost identificate în decursul a

48 de ore. 53,3% din izolatele Candida tropicalis au fost identificate în

decursul a 48 de ore. 66,7% din izolatele Candida krusei (2 din 3 izolate) au fost

identificate în decursul a 48 de ore. Probe polimicrobiene: Identificare directă: În cadrul unui studiu de 16 probe pozitive pentru Candida albicans, 100% au fost identificate în decursul a 72 ore.

Specie Număr de

tulpini Sensibilitate

24 ore 48 ore 72 ore Candida albicans

16 37,5% (6/16)

93,8% (15/16)

100% (16/16)

Identificare prezumtivă: În probele polimicrobiene, 73,3% din izolatele Candida

glabrata (15 probe pozitive) și 75% din Candida tropicalis (4 probe pozitives) au fost identificate corect în decursul a 48 de ore.

Specie Număr de

tulpini Sensibilitate

24 ore 48 ore 72 ore Candida glabrata

15 ND 73,3% (11/15)

86,7% (13/15)

Candida tropicalis

4 ND 75% (3/4)

75% (3/4)

2) În cadrul unui al doilea studiu, 78 organisme izolate pe mediu agar Sabouraud au fost subculturate pe mediu CandiSelect™ 4. Sensibilitatea CandiSelect™ 4 pentru identificarea directă a Candida albicans și identificarea prezumtivă a Candida glabrata, Candida tropicalis și Candida krusei din cadrul acestui studiu sunt indicate mai jos:

Specie Număr de

izolate Sensibilitate

24 ore 48 oreCandida albicans

21 95,2% (20/21)

100% (21/21)

Candida glabrata

23 ND 91%

(21/23) Candida 14 ND 100%

4

tropicalis (14/14) Candida krusei

5 60% (3/5)

100% (5/5)

Din cele 15 izolate rămase 12 au fost alte specii de Candida și 3 au fost Candida care nu au puttu fi identificate conform nivelului de specie cu ajutorul metodelor de identificare convenționale. 3) Cel de-al treilea studiu a evaluat creșterea drojdiilor rar izolate și a fungilor filamentoși utilizând tulpini din colecția de laborator. Astfel, mediul CandiSelect™ 4 a permis creștereaTrichosporon sp., Geotrichum sp., Cryptococcus neoformans, Scedosporium apiospermum, Rhizopus sp., Fusarium sp., Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger și Aspergillus flavus. 15- REFERINȚE 1. Sendid B, Francois N, Standaert A, Dehecq E, Zerimech

F, Camus D, Poulain D. Evaluarea prospectivă a noului mediu cromogen CandiSelect 4 pentru diferențierea și identificarea prezumtivă a speciilor patogene principale de Candida. J Med Microbiol. 2007 Apr;56(Pt 4):495-9.

2. Pappas PG, Rex JH, Sobel JD, Filler SG, Dismukes WE, Walsh TJ, Edwards JE, Societatea Americană de Boli Infecțioase America. Îndrumări pentru tratamentul candidozei. Boli clinice infecțioase. 2004 Ian 15;38(2):161-89

3. Comitetul Național pentru Standarde Clinice de Laborator. 2001. Îndrumări aprobate M29-A2. Protejarea lucrătorilor în laborator de infecții dobândite profesional, Ediția a 2-a. NCCLS, Wayne, Pa.

4. Garner, J.S. 1996. Comitetul Consultativ cu privire la Practicile de Control al Infecțiilor Intraspitalicești, Departamentul de Sanatate si Servicii Umane SUA, Cetrele pentru Controlul și Prevenția Bolilor. Ghid privind precauțiile de izolare în spitale. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80.

5. U Departamentul de Sanatate si Servicii Umane SUA. 1999. Biosecuritate în laboratoare microbiologice și biomedicale Publicație HHS (CDC), ediția a 4-a U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.

6. Directiva 2000/54/CE A Parlamentului și Consiliului European 18 Septembrie 2000 cu privire la protejarea lucrătorilor de riscurile aferente expunerii la agenți biologici la locul de muncă (a șaptea directivă individuală în cadrul Articolului 16(1) al Directivei 89/391/EEC). Jurnalul Oficial L262, 17/10/2000, p. 0021-0045.

7. Proceduri de bază de laborator Bacteriologie clinică. Organizația Mondială a Sănătății. Geneva. 1991. Ediția 1.

8. Candidoza invazivă – website CDC http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/candidiasis_inv_g.htm

9. Casal M. and Linares M.J. (1983). Contribuții la studiul profilurilor enzimatice ale organismelor de drojdie de interes medical Mycopathologia 81. 155-159.

10. Dalton et Al. (1989). Identificarea rapidă a Candida albicans cu ajutorul 4-methylumbelliferyl-N-Acétyl-ß-DGalactosaminide. Microbiologie de diagnosticare și boli infecțioase 12. 521-523.

11. Manafi M. et Al. (1991). Substraturi fluorogenice și cromozomice folosite in diagnosticarile bacteriene. Analize microbiologice 55. 335-348.

12. Perry J.L. and Miller G.R. (1987). Umbelliferyl Labeled Galactosaminide ca sprijin pentru identificarea Candida albicans. J. Clin. Microbiol. 25. 2424-2425.

13. Sangar V.K., Cortes J.M., Self L.W. (1975). Producere fosfatază acidă ca sprijin pentru caracterizarea rapidă a speciilor Candida. Revista americană de tehnologie medicală 41. 327-32.

14. Smith R.F., Blasi D., Dayton S.L. (1973). Activitatea fosfatazei în cadrul speciilor Candida și al altor drojdii izolate din material clinic. Applied Microbiology 26. 364-7.

15. Vogel K, Hinnen A. (1990). Sistemul fosfatazic al drojdiei. Microbiologie moleculară 4. 2013-7.

Simbol

Plăcile depozitate vor fi protejate de lumină.

Distribuitor SUA: Bio-Rad Laboratories Redmond, WA 98052, SUA Pentru comenzi clienți SUA și Serviciul tehnice: 1-800-2-BIORAD (1-800-224-6723)

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33

04- 2008 – Nr. parte 26205 A