REV. CHIM. (Bucureºti) ♦ 59 ♦ Nr. 1♦ 200830

Studiul cinetic al procesului de zaharificare a maltodextrinei,utilizând amiloglucozidazã imobilizatã pe membrane

prin legare covalentãGHEORGHE BÃTRÎNESCU1*, DANA GARGANCIUC2, OVIDIU POPA3 , MIHAELA OLTEANU4

1 Institutul Naþional de Cercetare Dezvoltare pentru Ecologie Industrialã, Bucureºti, ªos. Panduri, Nr. 90-92, 050663,Bucureºti, România2 Agenþia Regionalã pentru Protecþia Mediului Bucureºti, Str. Al. Borneanu, Nr. 4, 060758, Bucureºti, România3 Univesitatea de ªtiinþe Agronomice ºi Medicinã Veterinarã-Facultatea de Biotehnologii, Bdul. Mãrãºti, Nr. 59, 011464, Bucureºti,România4 Universitatea Bucureºti, Facultatea de Chimie, Bdul. Regina Elisabeta, Nr. 4-12, 030018,Bucureºti, România

The membranes with immobilized enzymes have a double role, as a separation barrier and a biocatalyst.The membranes immobilize the enzymes in insoluble state by direct binding (e.g. covalent binding) or insoluble state, by adsorption at the separation surface, depending on the polymer nature and the membranestructure. The researches purpose was to emphasize the biocatalytic activity of a membrane-immobilizedenzyme system. This paper relates the original results from the kinetic study of maltodextrine saccharificationprocess. The dextrines are obtained by enzymatic hydrolise of starch with α-amilase.The process took placeinto an enzymatic membrane bioreactor equipped with an active membrane from brominatedpolyphenileneoxide with 28% bromination degree, having amyloglucosidase covalently immobilized. In thisbioreactor carries on the conversion of dextrines to maltose and glucose, under the biocatalytic action ofamyloglucosidase.

Keywords: enzymes , maltodextrine saccharification process, starch , amilase, amyloglucosidase

Biocataliza enzimaticã se aplicã frecvent în diversedomenii de activitate: industria alimentarã, chimico-farmaceuticã, medicinã umanã ºi veterinarã, în cercetare,pentru explicarea unor procese biochimice esenþiale ºialtele [1].

În majoritatea proceselor în care intervine biocatalizaenzimaticã se utilizeazã enzime solubile ºi ca urmareprocesele de acest fel decurg discontinuu. La sfârºitulprocesului, catalizatorul introdus (enzima solubilã) nu maipoate fi recuperat. Apare astfel o diferenþã faþã de catalizaclasicã în care un catalizator este utilizat de “n” ori, pânãla epuizarea acestuia [2].

Enzimele imobilizate au deschis noi perspective îndomeniul proceselor în care intervin biocatalizatorienzimatici, fãcând posibilã desfãºurarea acestora în sistemcontinuu, tratarea în condiþii optime a unor soluþii diluate,dispariþia enzimei din mediul rezultat dupã transformareºi evitarea formãrii de produse secundare nedorite.

Rolul dublu al membranelor cu enzime imobilizate, deseparare ºi de biocatalizator, le fac din ce în ce mai atractivepentru procesele de biocatalizã enzimaticã. În funcþie denatura polimerului din care se obþin ºi de structura lor,membranele imobilizeazã enzimele în stare insolubilã prinlegare directã sau în stare solubilã la suprafaþa de separare[3].

În lucrare sunt prezentate rezultate originale obþinutela studiul cineticii procesului de zaharificare a malto-dextrinei. Procesul s-a realizat într-un bioreactormembranar enzimatic de concepþie proprie din punct devedere constructiv ºi funcþional, echipat cu o membranãactivatã din polifenilenoxid bromurat [4], cu grad debromurare 28%, având amiloglucozidazã imobilizatã prinlegare covalentã. Reacþia care are loc în acest bioreactoreste de transformare a dextrinelor (obþinute prin hidroliza

* email : ecoind@incdecoind.ro

enzimaticã a amidonului, cu α-amilazã), sub acþiuneaamiloglucozidazei, în maltozã ºi glucozã [5]:

Scopul cercetãrilor a fost acela de a evidenþiacapacitatea biocataliticã a sistemelor membranã-enzimãimobilizatã.

Parte experimentalãMateriale utilizate

-Bioreactor prevãzut cu manta de încãlzire ºi curecirculare internã;

-Membranã funcþionalizatã (PPOBr 28%), cu amilo-glucozidazã imobilizatã - activitate enzimaticã 5,26 U/cm2;

- Maltodextrinã.

MetodeDeterminarea activitãþii amiloglucozidazice dupã

metoda SUMYZYME - Activitatea amiloglucozidazei sauputerea de zaharificare a amiloglucozidazei esteechivalentã cu cantitatea de enzimã care elibereazã 10 mgzahãr reducãtor (calculat ca glucozã, dupã metodaSCHORL) din soluþia de amidon 2% în 10 min. la 42oC. .

Mod de lucruÎn incinta bioreactorului (fig. 1) la fiecare experiment în

parte se introduc câte 500 mL maltodextrinã deconcentraþie impusã, care se termostateazã la temperaturadoritã. Prin deschiderea celor douã robinete ºi pornireapompei de alimentare a bioreactorului se recirculã soluþiade maltodextrinã (MD) prin membrana cu enzimãimobilizatã timp de 30 min. La sfârºitul timpului de reacþiese ia o probã din masa de reacþie ºi se determinã conþinutulde zaharuri reducãtoare totale. Pe baza acestuia ºi aconþinutului de zaharuri reducãtoare iniþiale (determinatla soluþia cu care a fost alimentat bioreactorul) secalculeazã parametrii cinetici.

REV. CHIM. (Bucureºti) ♦ 59 ♦ Nr. 1♦ 2008 31

Rezultate ºi discuþiiPentru studiul cinetic al reacþiei enzimatice s-a plecat

de la ecuaþia Michaelis-Menten. Viteza reacþiei enzimaticeeste:

(1)

Aceastã ecuaþie a permis determinarea valorilor vmaxºi KM pe baza variaþiei vitezei iniþiale de reacþie prinmodificarea concentraþiei de substrat.

Ecuaþia de mai sus a fost liniarizatã sub forma ecuaþieiEadie-Hofstee:

(2)

Din reprezentarea graficã pentru fiecare set deexperimente a dependenþei v=f(v/Cs) se obþine valoareavitezei maxime prin intersecþia dreptei obþinute cu axaordonatei ºi respectiv valoarea constantei Michaelis-Menten (KM) din panta dreptei respective.

Pentru punerea în evidenþã a activitãþii enzimatice aenzimei imobilizate ºi pentru determinarea parametrilorcinetici s-a utilizat ca substrat maltodextrinã (MD) cu unechivalent în dextrozã (DE) de 20%, obþinutã prin hidrolizacontrolatã a amidonului cu ajutorul enzimei α-amilazã.În scopul asigurãrii reproductibilitãþii ºi comparãriirezultatelor s-a preparat o cantitate mai mare de MDnecesarã realizãrii tuturor experimentelor.

Viteza de reacþie pentru fiecare experiment în parte s-adeterminat prin mãsurarea concentraþiei de zaharurireducãtoare totale obþinute dupã realizarea hidrolizeienzimatice a MD cu enzima imobilizatã. În cadrul fiecãruiexperiment hidroliza s-a realizat la acelaºi pH (5,5) ºi înacelaºi timp de reacþie (30 min.). Variabilele au fosttemperatura de reacþie (40 - 65°C) ºi concentraþia desubstrat (50 - 350 g/L). S-a utilizat aceastã exprimare aconcentraþiei datoritã imposibilitãþii determinãrii maseimoleculare medii a MD obþinute. Acesta este ºi motivulpentru care unitatea de mãsurã a KM este g/L.

Din datele obþinute privind variaþia vitezei de reacþie înfuncþie de concentraþia de substrat la temperaturile de 40,45, 50, 55, 60 ºi 65 oC ºi aplicând ecuaþia Eadie-Hofstee s-au trasat graficele v = f (v/Cs), reprezentate în figurile 2(a-f).

Fig. 1. Schema bioreactorului membranarenzimatic pentru zaharificarea maltodextrineiM - membranã cu enzimã imobilizatã; F - fritãpentru susþinerea membranei; C - concentrat;

P - permanent; T - vas termostatatR1, R2 - robinete

a b

c d

REV. CHIM. (Bucureºti) ♦ 59 ♦ Nr. 1♦ 200832

Tabelul 1VALORILE PARAMETRILOR CINETICI

(VMAX ªI KM ) AIAMILOGLUCOZIDAZEI (AMG)

IMOBILIZATE ªI SOLUBILE

Fig. 2.Variaþia vitezei de reacþie în funcþie de concentraþia de substrata)la 40oC; b)la 45oC; c)la 50oC; d)la 55oC; e) la 60oC; f) la 65oC

unde: v = viteza de reacþie; Cs = concentraþia de substrat.

Pe baza datelor obþinute ºi a graficelor corespunzãtoareau fost calculate valorile vmax ºi KM. Comparativ au fostdeterminaþi ºi parametrii cinetici ai enzimei solubile, latemperatura optimã de acþiune a enzimei, de 60oC.Rezultatele sunt prezentate în tabelul 1.

În cadrul experimentelor s-a determinat ºi timpul totalde utilizare a amiloglucozidazei imobilizate. Presiunea înbioreactor a fost menþinutã constantã la p = 2,5 bar. Dupã4 reacþii succesive, experimentele au fost oprite deoarecese constatã cã în ultimul proces de zaharificare activitateaenzimaticã scade sub 50% faþã de valoarea iniþialã, înconcordanþã cu scãderea gradului de zaharificare.

Numãrul optim de utilizãri repetate ale membranei cuamiloglucozidazã imobilizatã este de trei. La a patrafolosire are loc o scãdere puternicã a gradului dezaharificare, acesta ajungând la o valoare de 49% din gradulde transformare corespunzãtor primei utilizãri. Scãderease datoreazã atât colmatãrii membranei cât ºi inactivãriienzimei imobilizate. Colmatarea membranei este pusã înevidenþã de scãderea fluxului de permeat iar inactivareaenzimei imobilizate de atingerea unui palier în evoluþiagradului de zaharificare.

ConcluziiRezultatele studiului cinetic pun în evidenþã faptul cã

viteza de reacþie în procesul de zaharificare amaltodextrinei creºte pe de o parte cu creºtereaconcentraþiei substratului, iar de pe altã parte cu creºtereatemperaturii de reacþie, aspecte caracteristice majoritãþiienzimelor, atât solubile cât ºi imobilizate.

Viteza de reacþie creºte puternic în domeniul valorilormici ale concentraþiei substratului, ajungând ca la valorifoarte mari ale acestui parametru sã se atingã un palier(viteza rãmâne constantã). De asemenea, la temperaturi

mari (60-65°C) viteza de reacþie este de aproximativ 2-3ori mai mare decât cea pentru temperatura de 40°C.

Valorile parametrilor cinetici (vmax ºi KM) aiamiloglucozidazei (AMG) imobilizate, la temperaturaoptimã de acþiune a enzimei (60oC), sunt mai mari decâtcei ai enzimei în stare solubilã. Acest aspect evidenþiazãfaptul cã enzima imobilizatã are, la aceastã temperaturã,performanþe biocatalitice superioare enzimei în staresolubilã.

Rezultatele obþinute pun în evidenþã ºi faptul cãprocesele de difuzie nu sunt limitative într-o mãsurã foartemare pentru enzima imobilizatã studiatã, ca urmare aconcepþiei originale a bioreactorului membranar, din punctde vedere constructiv ºi funcþional. Acesta permitemenþinerea constantã a parametrilor de lucru prinaplicarea sistemului de curgere în regim tangenþial.

Studiul cinetic realizat demonstreazã o comportarefoarte bunã ca sistem catalitic a elementului central albioreactorului – biocatalizatorul imobilizat.

Bibliografie1.CHEETHAM P,S.J., Handbook of Enzyme Biotechnology, Ed Wiseman,A. Chichester –New York-Ontario-Brisbane, 1985, p.1052.HAGEN H,.A., PEDERSON, S., Enzymes in Industries, Gerhartz, W.,Ed. VCH Publishers, New York,19903.BÃTRÎNESCU, GH., GARGANCIUC, D., ROMAN, G., Enzymaticconversion with immobilized enzymes membranes, EuropeanMembrane Society, XVI Annual Summer School, Vezprem,Hungary,19994. GARGANCIUC, D., BÃTRÎNESCU, GH., NECHIFOR, GH., OLTEANU,M., Mat. Plast., in press 20085.ZARNEA, G., MENCINICOPSCHI, Gh., BRÃGÃREA, ªt. Bioingineriapreparatelor enzimatice microbiene, Ed. Tehnicã, Bucureºti, 1980, p.293

Intrat în redacþie: 26.03.2007

e f