APOPTOZA

Apoptoza (apoptosis caderea petalelor florilor sau a frunzelor din pom) sau moartea celulara programata reprezinta un element central de mentinere a echilibrului intre generarea si moartea celulelor. APPT apare intr-o varietate de procese biologice: diferentiere, dezvoltare, maturizare celulara si in timpul manifestarii proceselor imunologice. Diferente intre apoptoza si necroza Necroza este o forma patologica de moartea celulara aparuta ca urmare a unei lezari celulare acute (distrugeri mecanice, hipoxie, liza celulare mediata de complement sau actiunea unui agent toxic foarte puternic). - este asociata initial cu o pierdere a integritatii membranei celulare, urmata de o pierdere a continutului celular si aparitia unui proces inflamator eliminarea celulelor necrotice este efectuata exclusiv de celulele sistemului mononuclear fagocitic. APPT afecteaza o singura celula sau grupuri mici de celule izolate si este un proces asincron. - moartea celulelor prin apoptoza este caracterizata printr-un proces de autodigestie controlata a celulelor isi mentin integritatea membranei plasmatice. - in faza finala se separa in fragmente mici, delimitatea de membrane, denumite corpi apoptotici si care sunt ulterior fagocitate de macrofage, fara inducerea unui raspuns inflamator.

Generalitati APPT apare: - in timpul embriogenezei (ex. involutia canalelor Wolff si Muller), - in timpul organogenezei, - in timpul turnover-ului tisular normal, - in cazul absentei actiunii unui hormon trofic asupra tesutului sau tinta, - la indepartarea timocitelor imature care au suferit o selectie negativa in timus (nu au fenotipul corespunzator) APPT celulelor somatice adulte include: - eliminarea celulelor din timpul refacerii tesutului epitelial si a formarii keratinocitelor, - atrofia prostatei si a cortexului adrenal a ca urmare a reducerii stimulului hormonului trofic, - atrofia fiziologica a glandei mamare postlactatie, - eliminarea limfocitelor B sau T dupa indepartarea actiunii stimulante a citokinelor trofice la sfarsitul reactiilor imunologice, - indepartea PMN dupa extravazarea lor in tesuturile inflamate. 50-70 miliarde celule mor in fiecare zi, in corpul uman, ca rezultat al apoptozei. Declansarea APPT prin actiunea unor factori este specifica tipului celular, acelasi factor putand induce sau nu acest proces, in functie de celulele asupra carora actioneaza. (ex. radiatiile ionizante determina aparitia APPT in celulele hematopoietice, dar nu au acelasi efect si asupra fibroblastilor sau celulelor de origine epiteliala). APPT este reglata prin cai de traducere ale semnalelor imlicate si in alte raspunsuri celulare specifice: modificarea calciului intracelular, activarea protein kinazelor si a fosfatazelor, modificari ale ph-ului si stressul oxidativ Se caracterizeaza printr-o cascada de modificari morfologice si biochimice distincte.

Stimuli care induc APPT - semnale fiziologice normale, cum ar fi hormonii care produc eliminarea celulelor in timpul diferentierii sau involutiei tesuturilor si organelor - eliminarea factorilor care inhiba APPT sau a unor componenti extracelulari importanti, ex. factorii de crestere. - actiunea unor stimuli toxici in doze mici: medicamente citotoxice, hipertermia, hipoxia in grad redus.Etapele apoptozeiIn urma stimulului apoptotic, celula va suferi o degradare controlata a organitelor celulare prin activarea caspazelor proteolitice. Modificarile morfologice sunt: Micsorarea celulei datorita dezintegrarii citoscheletului proteic de catre caspaze. Citoplasma apare densa si organitele strans compactate. Condensarea cromatinei de-a lungul membranei nucleare (picnoza) Membrana nucleara se intrerupe si ADN-ul se fragmenteaza intr-un proces numit kariorrhexis. Nucleul se imparte in mase granulare acestei degradari. Membrana celulara prezinta umflaturi neregulate. Celula se fragmenteaza in vezicule denumite corpi apoptotici, care sunt apoi fagocitati. Apoptoza progreseaza rapid si in timpul kariorrhexis-ului, activarea endonucleazelor produce fragmente scurte de ADN, de marimi egale. Acestea prezinta un aspect caracteristic de scara (ADN ladder) in gelul de agar dupa electroforeza in laborator. Vizualizarea acestui fenomen diferentiaza apoptoza de moartea celulara ischemica sau toxica.

Modificarile nucleare Fazele initiale sunt caracterizate prin condensarea materialului nuclear (picnoza), urmata de o marginalizare marcata a cromatinei de-a lungul membranei nucleare. Microscopic, apar ca granule fine, impachetate strans. Modificarile cromatinei sunt deseori insotite de convolutii ale membranei nucleare. O caracteristica este prezenta unor mase granulare rotunde sau ovalare provenite din centrul nucleolar fibrilar situatie in stransa apozitie cu cromatina condensata. Nucleul se rupe prin inmugurire in fragmente discrete care sunt inca marginite de o membrana dubla. Modificarile membranei celulare La nivelul membranei celulare, APPT este caracterizata initial prin pierderea structurilor membranare specializate, cum ar fi microvilii si regiunile de contact reprezentate de desmozomi. In aceasta faza se produc modificari biochimice discrete ale structurii membranei celulare, in special externalizarea fosfatidil serinei. Etapa umflaturilor citoplasmatice apare simultan cu primele evenimente nucleare si reprezinta un proces de condensare al citoplasmei care duce la compactizarea organitelor celulare. Doar relativa condensare a citoplasmei in absenta modificarilor tipice NU reprezinta un semn distinctiv al procesului apoptotic, densitatea citoplasmei variind considerabil de la o celula la alta, in multe tesuturi normale. Fragmentarea celulei si fagocitoza Celulele se fragmenteaza si formeaza corpi apoptotici, delimitati de membrane care contin material nuclear, organite intacte si citoplasma condensata. Inainte de descrierea amanuntita a modificarilor morfologice care au loc in timpul procesului apoptotic, aparitia unor inmugururi citoplasmatice in culturile celulare de celule leucemice era descrisa in lucrarile de specialitate ca posibilitatea existentei unor inmultiri prin inmugurire. Cei mai multi corpi apoptotici sunt fagocitati rapid de catre macrofagele rezidente sau de catre alte celule din vecinatate cum ar fi celulele epiteliale si celulele musculare netede vasculare. In interiorul fagozomilor corpii apoptotici sufera modificari degenerative si in final sunt degradati de catre enzimele lizozomale (foto). Fagocitoza este o componenta normala a procesului de APPT, celulele apoptotice exprimand pe suprafata lor markeri care determina captarea-liganzi pentru receporii macrofagelor (ex. fosfatidil serina pentru receptorii fosfatidil serinei, trombospondina pentru receptorii trombospondinei si lanturi glucidice pentru lectine).

Celulele viabile exprima CD47 pe suprafata membranei, care se leaga de receptorul SIRP- al macrofagelor pentru a preveni fagocitoza. Celulele apoptotice nu mai exprima CD47 si prezinta calreticulina, care va fi recunoscuta de adiponectina macrofagelor, urmand a se initia adeziunea si fagocitoza.

Genele apoptozei Cunostintele actuale au fost obtinute prin studii pe un nematod transparent, Caenorhabditis elaegans, la care au fost identificate 3 gene care codifica proteine implicate in initierea si desfasurarea APPT: ced-3, ced-4, ced-9. Caenorhabditis eleCunostintele actuale au fost obtinute prin studii pe un nematod transparent, Caenorhabditis elaegans, la care au fost identificate 3 gene care codifica proteine implicate in initierea si desfasurarea APPT: ced-3, ced-4, ced-9. gansMamifereFunctie

Ced-3Enzima de conversie a interleukinei 1 (ICE), caspaza 1 Efector al APPT

Ced-4Factorul de activare al proteazei implicate in apoptoza (Apaf 1)Activarea caspazei 3 (CPP32, apopaina)

Ced-9Bcl-2, Bcl-XLAntiapoptotica, antioxidanta

Activarea caspazelor in timpul apoptozei

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului APPT reprezinta o metoda eficienta de prevenire a transformarilor maligne deoarece elimina celulele cu leziuni genetice. APPT defectuoasa poate promova aparitia malignitatii permitand acumularea de celule capabile sa se divida si obstructionand excluderea variantelor genetice cu potential malign crescut. ADN-ul oncogenelor virale sta la baza unui numar foarte redus de neoplasme umane. Pentru restul bolilor maligne, oncogenele celulare nevirale si netransmisibile stau la baza aparitiei mutatiilor in genele celulor normale. Carcinogenii chimici sau radiatiile ionizante pot produce mutatii ale protooncogenelor. p53 Lezarea ADN determina o blocare a celulei in faza G1 a ciclului celular mediata de p53, gena apoptotica, in cazul in care leziunea nu poate fi reparata . Supresia mortii celulare prin p53 mutante poate duce la cancer. Proteina p53 mutanta nu mai are capactatea de a se lega de nucleu si de a bloca celulele in G1 in cazul aparitiei de ADN lezat si permite replicarea ADN-ului cu leziuni. Pierderea functiei p53 apare in 70% din cancerele colo-rectale, in 50% din cancerele pulmonare si in 40% din cancerele de san.Aparitia proteinelor p53 mutante in aproximativ 50% din totalitatea neoplasmelor umane reprezinta una din cele mai comune caracteristici ale malignitatii. Incapacitatea celulelor cu p53 mutant de a intra in APPT, ca raspuns la lezarea ADN, explica rezistenta la agentii chimioterapici sau la radiatii ionizante a celulelor tumorale cu p53 mutant, nivelul acestuia constituind un criteriu in aprecierea raspunsului la chimioterapie.

Calea p53: intr-o celula normala, p53 este inactivata de catre mdm2. Dupa lezarea ADN sau alte agresiuni, diferite cai vor conduce la disocierea complexului p53 si mdm2. Odata activat, p53 va bloca ciclul celular pentru a permite fie repararea si supravietuirea celulei sau apoptoza pentru a elimina celula lezata. Nu se cunoaste in prezent cum p53 face alegerea.p73 Gena este localizata in regiunea cromozomiala implicata in patogeneza neuroblastoamelor. Ea mimeaza o serie de activitati ale p53 de promovare a procesului apoptotic. Bcl-2 Asociata membranei mitocondriale inhiba APPT la cel putin 3 nivele:- controlul potentialului de membrana prin tiolii mitocondriali- reglarea permeabilitatii de membrana pentru moleculele mici pro apoptotice- ancorarea de membrana mitocondriala a proteinelor proapoptotice Proteina bcl-2 a fost izolata in 70% din cancerele umane de san, 30-60% din cele de prostata si 90% din cele colo rectale. Este asociata cu prognostic prost in leucemii, cancer prostatic, cancer de colon si neuroblastom. Exprimarea in exces a bcl-2 in unele linii tumorale confera celulelor rezistenta la agentii chimioterapici cum ar fi citozinarabinoza, metotrexat, vincristina si cisplatin. c-myc Codifica o proteina cu viata scurta (aproximativ 20 de minute) care se leaga specific de ADN. Proteina c-myc este un factor de transcriptie care supreseaza blocarea cresterii si promoveaza proliferarea prin modularea unor gene tinta. In cazul existentei unui nivel scazut de factor de crestere sau al leziunilor genomului, proteina c-myc este un inductor potent al APPT. Pare a fi activata in toate tumorile. FAS/Apo-1 Este o proteina de membrana care apartine familiei de receptori TNF/NGF. Gena FAS/Apo-1 poate fi considerata o gena supresoare a tumorilor datorita rolului ei pozitiv in inducerea APPT si de asemenea FAS/Apo-1 nefunctionala reprezinta un promotor al oncogenezei datorita incapacitatii de inducere a procesului apoptotic. FASL Proteina care se leaga de receptorul FAS si joaca un rol important in scaparea de sub controlul sistemului imun al tumorilor maligne. FASL este exprimata in unele si leucemii limfocitare T si in cancerele de colon. Potentialul agresiv si metastatic al unor tumori solide precum cancerul de colon poate fi datorat faptului ca exprimarea FASL de catre celula maligna duce la semnalizarea APPT in celulele T activate infiltrate.Celula tumorala nu exprima receptori FAS si exprimarea FASL marcheaza celula maligna ca tinta pentru distrugere prin activarea unui raspuns inflamator.DAP-kinaza (death associated protein) Este o kinaza Ca/ calmodulin dependenta care fosforileaza resturi de serina si treonina din proteine. Initial a fost descrisa ca mediator pozitiv al procesului apoptitic indus de interferonul . Absenta exprimarii DAP-kinazei suprima procesul apoptotic si promoveaza formarea metastazelor. Exprimarea ei este frecvent pierduta in carcinoamele umane si in leucemia cu celule B. Exprimarea DAP este absenta la celulele cu potential de metastazare ridicat si prezenta la celelalte. Caspazele Cercetarile efectuate aupra inhibitorilor caspazelor au aratat ca inhibitorii specifici ambelor cai de activare ale caspazelor (prin participarea mitocondriilor sau prin calea de semnalizare a receptorilor tanatogeni) sunt exprimati in exces in tesuturile tumorale. Exprimarea in exces a proteinei FLIP, inhibitor al caspazelor, care blocheaza transmiterea proceselor apoptotice de la receptorii Fas si TNFR a fost demonstrata in melanoamele maligne. Deoarece inhibitia caspazelor poate fi generala in transformarea neoplazica si/sau progresia tumorilor este tentanta speculatia conform careia genele caspazelor ca si gena p53 ar putea functiona ca supresori tumorali si prin mutatii somatice sau pe linia germinala sa confere tumorilor rezistenta la APPT. Aplicatii clinice potentiale Genele Bcl-2 si p53 sunt doua tinte potentiale ale terapiei moleculare in cancer. S-au studiat metode de crestere a exprimarii genelor care induc APPT (p53) si de blocare a efectelor genelor antiapoptotice (Bcl-2). Downreglarea Bcl-2 prin nucleotide antisens a dus la cresterea susceptibilitatii celulelor la efectele citotoxice ale 1-3-d-arabinofuranozilcitozinei (Ara C) - citarabina.

Acidul all-trans retinoic (ATRA) creste sensibilitatea blastilor din leucemiile acute mieloide (AML) la efectele citotoxice ale Ara C si daunorubicinei. ATRA face parte dintr-un grup de compusi cunoscuti sub numele de retinoizi care au efect antiproliferativ si sunt capabili sa induca diferentierea in linia celulara promielocitara HL-60. O parte a acestui efect se datoreaza down reglarii bcl-2 si este de asemenea responsabila pt cresterea chimiosensibilitatii dupa tratamentul cu ATRA. Studiile indica prezenta bcl-2 in mitocondriile promielocitelor leucemice si este absenta in mitocondriile celulelor care s-au diferentiat in urma tratamentului cu ATRA. Aceste rezultate sugereaza ca ATRA poate reduce exprimarea bcl-2 in celulele blastice din AML in vivo si creste sensibilitatea celulelor la APPT indusa de medicamentele citostatice. Inducerea mortii celulelor canceroase prin fosforilarea proteinei bcl-2 produsa de medicamentele care afecteaza integritatea microtubulilor ofera posibilitatea unei scheme terapeutice tintite. Antigenul de suprafata al celulelor B, CD-20 este o tinta eficace pentru imunoterapia bolilor maligne cu celule B deoarece legarea in vivo a anticorpilor anti CD-20 in prezenta celulelor care exprima receptori Fc duce la cresterea Ca si la APPT celulelor maligne. O directie posibila in lupta impotriva cancerului se bazeaza pe inducerea procesului apoptotic prin inlocuirea genelor afectate sau absente. Inducerea p53 in celulele tumorale p53 negative inhiba proliferarea prin blocarea ciclului celular in G1 si in viitor tratamentul cancerului hepatic ar putea fi posibil prin injectarea locala a unui virus inofensiv cu rol de vector a genei p53 intacte.