7/28/2019 amilaze

1/11

-Amilaze1.Introducere

-Amilazele sunt endoglucanaze care catalizeaz hidroliza legturilor glicozidice n

amidon i n polizaharidele nrudite cu formarea de dextrine i oligozaharide cu formula C 1-OH

n configuraia .Legturile -1,4-glicozidice lng legturile -1,6 sunt rezistente la hidroliz.

7/28/2019 amilaze

2/11

Hidroliza extins a amilopectinelor cu -amilazele ,produc dextrine -limit n urma

hidrolizei legturilor -1,6.-Amilazele joac un rol important n metabolismul glucidic al

microorganismelor,plantelor i animalelor.

-Amilazele microbiene deriv din Bacillus lichenformis sau din organismele nruditepentru aplicaiile comerciale;sunt stabile la temperaturi de peste 90oC,relativ mai puin

dependente de ionii de Ca2+i active pe o raz larg a pH-ului.

-Amilazele pentru procesarea alimentelor sunt obinute prin fermentaia controlat a lui

Bacillus stearothermophillus ,Bacillus subtilis,ce conine Bacillus megaterium sau Bacillus

sterarothermophillus specie productoare de -amilaz,ca o pudr sau un lichid de culoare alb-

maroniu.

Aplicaiile tipice includ prepararea de sirop de amidon,dextroz,alcool,bere i produse de

patiserie.

-Amilazele sunt folosite n industrie la lichefierea amidonului cu producere de dextrine

care sunt hidrolizate de glucoamilaze n glucoz ,ingredientul de baz pentru siropul de

porumb,etanol carburant sau n producia de buturi alcoolice.

n industria patiseriei -amilazele sunt adugate n aluat pentru a asigura o surs continu

de zahr fermentescibil pentru creterea fermentaiei i a producerii de gaze.

-amilaza este una dintre enzimele ncorporate n detergenii de rufe pentru indeprtarea

petelor persistente de pe materiale i pentru a spori eficiena i reducerea agenilor chimici din

compoziia detergenilor.

II.Clasificare

Glucozidazele sunt clasificate n hidrolaze care sunt subdivizate n :O-glicozil;N-glicozil

i S-glicozil (E.C.3.2.1.,3.2.2 i 3.2.3).

-Amilaza hidrolizeaz legturile -1,4-D-glicozidice din oligozaharide i polizaharide

ntr-o manier aleatoare cu gruprile reductoare eliberate n configuraie .

7/28/2019 amilaze

3/11

n conformitate cu recomandrile IUBMB ,-amilazele au denumirea sistematic de -

1,4-glucanglucohidrolaz i numr de cod EC 3.2.11.Aceast clasificare este bazat pe tipul

reaciei catalizate i pe substraturile specifice a enzimelor individuale.

Recent, a fost propus o clasificare alternativ a glicozilhidrolazelor bazat pesimilaritatea secvenei de aminoacizi.Conform cu aceast clasificare sunt 70 de familii i

majoritatea -amilazelor aparin familiei 13 , impreun cu pullulanaz (EC

3.2.141),ciclomaltodextrin glucanotransferaza (EC 2.4.1.19) i trehaloz-6-fosfathidrolaza(EC

3.2.1.93).

Oricum -amilaza din Dictyoglomus thermophilum, Methanococcus jannaschii,

Pyrococcus furiosus, i Pyrococcus horikoshii aparin familiei 57.Aceast clasificare se bazeaz

pe reacia direct dintre secven i similaritile plierii i ofer un instrument convenabil pentruestimarea informaiei mecanice.

Cu toate acestea, clasificarea bazat pe asemnrile structurale i de secven pot cauza o

confuzie inutil, deoarece n acest regim,o enzim este definit de ctre secvena principal ca o

protein, dar nu n mod direct de ctre funciile sale catalitice.

III.Structur molecular

Numeroase secvene de aminoacizi de -amilaze sunt cunoscute, n primul rnd deduse

dinsecvene de ADN.

Un total de 70 de intrri sunt listate n Swiss-Prot: Aeromonas hydrophila, Alteromonas

haloplanktis, Dictyoglomus thermophilum, Escherichia coli, Bacillus amyloliquefaciens,B.

megaterium, Bacillus sp. (strain B1018), B. circulans, B. stearothermophilus, B. licheniformis,

B.subtilis, Paenibacillus polymyxa (Bacillus polymyxa), Butryrivibrio fibrisolvens,

Methanococcus jannaschii, Streptomyces lividans, S. violaceus (Streptomyces venezuelae), S.

griseus, S. limosus (Streptomyces albidoflavus), S. hygroscopicus, S. thermoviolaceus,

Clostridium acetobutylicum, Thermoanaerobacter thermosulfurogenes (Clostridium

thermosulfurogenes), T. ethanolicus (Clostridium thermohydrosulfuricum), T.

7/28/2019 amilaze

4/11

thermohydrosulfuricus (Clostrium thermohydrosulfuricum), T. saccharolyticum,

Thermomonospora curvata, Pyrococcus furiosus, P. horikoshii, Salmonella

typhimurium,Aspergillus niger, A awamori, A. oryzae, A. shirousami, Schizosaccharomyces

pombe (drojdie de fisiune), Saccharomycopsis fibuligera (drojdie de bere), Debaryomyces

occidentalis (yeast) (Schwanniomyces occidentalis), Oryza sativa (orez), Triticum aestivum

(grau), Hordeum vulgare (barley), Vigna mungo (rice bean) (black gram), Drosophila

melanogaster (fruit fly), D. mauritiana, D.yakuba, Aedes aegypti (yellow fever mosquito),

Dermatophagoides pteronyssinus (praf de acarian),Tribolium castaneum (gandac rou de fin),

Pecten maximum (king scallop) (pilgrims clam), Tenebrio molitor (yellow mealworm), Sus

scrofa (pig), Homo sapiens (human), Rattus norvegicus (rat), and Mus musculus (mouse).

Secvene de - amilaze de diferite origini au foarte puine asemnri perceptibile, cu

excepia a patru segmente (5-15)(Fig. 1). Trei reziduurile catalitice (dou Asp i unul de Glu ),

precum i reziduuri implicate n substrate obligatorii, sunt situate n aceste patru regiunile intens

conservate care sunt, de asemenea, gsite n GGTase (Bacillus macerans), pullulanase

(Klebsiella aerogenes), isoamylase(Psudomonas amyloderamosa), - glucozidaza(Saccharomyces

carlsbergenesis), i cyclodextrinase(Thermoanaerobacter ethanolicus), sugernd c aceste enzime

pot participa n acelai tip de mecanism de reacie (16).

Cteva amilaze microbieneBacillus circulans (17), Bacillus subtilis (18),Bacillus

stearothermophilus (19), Streptomyces limosus(20), Chalara paradoxa (21), Lactobacillus

amylovorus(22), i Cryptococcus sp. S-2 (23) sunt cunoscute nu doar pentru digestia granulei

de amidon solubil,dar si pentru digestia amidonului granulat. n plus, amilaza din pancreasul de

porcine (24) i amilaza din orz (25) conin segmente de C-terminal care au fost identificate

pentru a fi a raw starchbinding site .

7/28/2019 amilaze

5/11

Fig .1 Comparaie ntre regiunile de secven dintre : Bacillus stearothermophilus (5),

Bacillus amyloliquefaciens (6),Bacillus licheniformis (7), Aspergillus oryzae (8), Micrococcus

sp. 207 (9), Saccharomycopsis fibuligera (10),Drosophila melanogaster (fructe )(12), galben de

mealworm (13), pancreas de porcine (14), pancreas uman (15).

IV.Mecanism de reacie

-Amilazele hidrolizeaz legtura glicozidic prin retenia configuraiei

anomerice.Aciunile de retenie i invertire a glicozidazelor au fost subiectul a numeroase

cercetri i , cteva mecanisme au fost propuse s explice stereochimia procesului catalitic.

A.Mecanismul deplasrii nucleofilice

Pentru retenia glicozidazelor ,reacia precede 2 deplasri.Protonarea oxigenului

glicozidic exte concentrat pe atacul nucleofilic al anionului carboxilat la C1,rezultnd o legtur

covalent glicozil-enzim intermediar (fig.3).A 2-a deplasare este bazat pe hidroliza

legturilor carboxil-acetal i glicozil-enzim intermediar cu formare de dextrin ca produs n

configuraia .

7/28/2019 amilaze

6/11

Pentru invertirea glicozidazei ,reacia implic o singur deplasare.Oxigenul glicozidic

este protonat de acidul general,rezultnd o legtur maltozica C-O.

Figure 3 (A) mecanismul unei singure deplasri;(B)Mecanismul dublei deplasri cu formarea deenzima glicozidic intermediar

B.Mecanismul ionului deoxocarbon

n acest model ,reacia este descris de substituia SN1 (fig,4).Protonul de oxigen

glicozidic rezultat din hidroliza legaturilor ,duce la formarea unui ion de oxocarbon intermediar

care este stabilizat de reziduuri de anion carbozilat(46-48).De asemenea,s-a sugerat c mbinarea

dintre substratul de zahr cu poziia activ a enzimei induce o denaturare a lanului poliglucidicntr-o conformaie de tip jumtate de scaun,astfel slbind legturile C1-O4 cum este artat n cazul

lizoenzimei.Stereoselectivitatea reaciei depinde de direcia atacului nucleofilic a moleculelor de

ap asistat de o baz general.n -amilaz ,molecula de ap atac din fa (partea original a

oxigenului glicozidic),cu produsul meninnd configuraia .n invertirea glicozidazelor , i -

7/28/2019 amilaze

7/11

amilaza i glucozidaza,atac din spate ,rezultnd ntr-o inversie a configurrii.Aspectul atrgtor

al acestui model este c reaciile catalitice de invertire i de rsturnare apoate fi explicat printr-un

singur mecanism(50).Principala diferen ntre acest model i mecanismul de deplasare const nmiscarea tranzitorie sau stabil a ionului intermediar de oxocarbonium existent(51,52).

Formarea unui ion stabil de oxocarbon este de preferat n cazul in care ruperea legturii precede

un atac al apei facilitat de cataliza general.

Fig.4Mecanismul de reac ie a carbohidrailor care implic o molecul de oxocarbonintermediar

C. Ring-Opening Reaction-Reacia de deschidere a inelului

Un mecanism alternativ, care nu a fost bine primit ca cele dou modele de mai sus

;implic hidroliza legturi C-O endociclic ,ducnd la formarea de ion oxocarbon intermediar

aciclic.

n acest model nu exist nici o denaturare a substratului aa cum se arat n simularea

moleculei dinamice.n conforma ie scaun att ct i -anomerii, antiperiplanara orientareexocyclic la O4 pereche izolat ndepline te cerin a stereoelectronic n fragmentarea

inelul C-O legtur (54).A fost postulat, de asemenea, c protonarea are loc la oxigen ciclic nloc de oxigen glicozidic ,iar atacul nucleofilic din ap este urmat de o rotaie a centrului de

hemiacetal la poziia de hidroliz.(55)

7/28/2019 amilaze

8/11

MSURAREA ACTIVIT II AMILAZEI

Parametrii cinetici ai -enzimei din orz au fost msurate cu ajutorul diferitelor concentra ii de

substrat ET-G7PNP. La Km of 0.45 mM i o kcat of 1,2 *102

*sec_1

au fost obinute pentru -amilaz, o kcat=Km of 2.7 102mM_1 *sec_1. .-Amilaza din malul de orz 1 are o valoare a

kcat=Km 1.75 102mM _1 *sec_1 folosind ca substrat p-nitrofeniloligozaharidele (p-NPGlc7),

(78). Eficien a catalitic este, n general, n concordan cu cele ob inute de -amilaze de la alte

organisme.De exemplu, o kcat=Km of 2.5 102mM _1 *sec_1 a fost raportat pentru -amilaza din

Saccharomycopsis fibuligera n hidroliza malto-oligozaharidelor (79), i o valoare mai mare de

1.3 *103mM_1 *sec_1 a fost observat pentru acelai enzima folosind ca substart -amiloz

(80).-Amilaza din pancreasul de porcine a fost de kcat=Km of 5.8 103mM_1 * sec_1 cu

hidroliza p-NPGlc7(81).

Cre terea lungimii lan ului de substrat scade valoarea km i cre te kcat, a a cum s-a demonstrat n

enzima din Aspergillus oryzae Km=9,010-4 i 9,510-6 mM pentru maltotetroz i maltodextrin

VI (n=117),respectiv ,i kcat=1,2104 i 103min-1(82).

Metoda de msurare a activit ii -amilazei este caracterizat de tipul de substrat

angajat ntr-o procedur special.

Toate cele trei metode descrise mai jos au fost utilizate in mod curent de ctre autori

pentru analiza cantitativ a plantelor i -amilazelor recombinate.

A. Reducing Sugar Method-Metoda de reducere a zaharurilor

B. Dyed Starch Substrate Method-Metoda folosind ca substrat amidon colorat

Aceast procedur presupune hidroliza amidonului colorat ca substrat de-amilaz i

msurarea absorban ei la 610 nm a fragmentelor solubile colorate eliberate n solu ie de

degradare a substratului.Aceast metod nu este afectat de reducerea substan elori, prin urmare, se aplic n special la msurare activitii a-amilazei in culturi de celule care

con in glucoz sau alte zaharuri reductoare.Sunt disponibile dou tipuri de substrat de amidon

colorat n comer:

7/28/2019 amilaze

9/11

1.Dye-Labeled Crosslinked Starch -Amidon reticulat colorat2.Dye-Labeled Non-crosslinked Starch-Amidon nereticulat colorat

C.Defined Substrate Method-Metoda substratului definitUtilizarea de low-MW oligozaharide sintetice, cu o structura definit are avantajul de

eliminare a variabilitii substratului.Cu toate acestea, acestea nu sunt substraturi naturalei msurarea activitii pot s nu dezvluie unele propriet i unice ale enzimei,ca i legarea

amidonului crud i hidrolizat.Substraturile definite au fost iniial dezvoltate cu un cromofor ca

p-nitrofenol ataat la unitile de glucoz redus.

Aceste substraturi, cu toate acestea, sunt nespecifice pentru -amilaze, fr alte amilaze, cum ar

fi -amilaze sau glucoamylase, care pot de asemenea sa despice substratul.Foarte recent,unsubstrat specific a fost descoperit prin fixarea suplimentar a unui produs la resturile de glucoz

nereductoare(93, 94).Am folosit 4,6-etiliden-(G7)-p-nitrofenil-(G1)--D-maltoheptasid(Sigma)

ca substrat.Gruparea etilidenic n poziia 4,6 a G7 blocheaz aciunea exoamilazelor.-Amilaza

hidrolizeaz substratul fragmentelor de G2,G3 i G4-p-nitrofenol,care au fost mai departe

hidrolizate de -glucozidaz la p-nitrofenol i glucoz.Activitatea enzimei corespunde creterii

absorbanei la 405 nm din cauza eliberrii de p-nitrofenol,i de blocarea neasteptata a

substratului la capetele nereductoare la aciunea -amilazei i glucoamilazei.

VII.Purificarea -amilazei

Aceast metod ,descris de Mac Gregor i Morgon (95), a fost folosit n laboratoarele

noastre pentru a purifica -amilaza din orz.Malul de orz (250 g) a fost extras cu 500 ml tampon

acetat ce conine 1 nM CaCl2,pH=5,5.Suspensia a fost centrifugat (8000 g,15 minute) i

granulaia a fost supus la o a doua extracie folosind acelai tampon.

Extractele combinate (supernatanii) au fost nclzite la 70o

C pentru 15 minute iproteinele denaturate incluznd -amilaza au fost scoase de la centrifugare (8000 g,15

minute).Proteinele din supernatant au fost precipitate cu 60%( NH4)2SO4 la 4 oC ,redizolvate n

200 ml de tampon acetat 0,02M ce conine 1nM CaCL2 ,pH=4,7 i diluat cu acelai

tampon.Preparatul enzimei brute a fost ncrcat ntr-o coloan CM Sepharose CL-6B echilibrat

cu acelai tampon.Diluia a fost fcut folosind o curb etalon de la 0,02 M pn la 0,06 M acetat

7/28/2019 amilaze

10/11

(coninnd 1mM CaCl2,pH=4,7) i fraciunile active au fost cumulate pentru a da prepararea

brut a -amilazei 1.izoenzim.O a doua diluie a fost realizat cu o variaie a srii de acetat 0.06

M (coninnd 1mM CaCl2,pH=4,7) i acelai tampon coninnd 0,5 M NaCl,pentru a da

prepararea brut a -amilazelor 2-izoenzime.Prepararea enzimelor sunt concentrate de

ultrafiltrare (membran PM) i mai departe purificat fiind trecut prin coloana de afinitate CM

Sepharose CL-6B.

Legturile -amilazelor au fost diluat cu tampon acetat coninnd 8 mg/ml CHA a fost

ndeprtat prin schimbul de ioni cromatografic descris mai sus.

Pentru purificarea recombinrii -amilazei exprimat n mal ,urmtoarea metod a fost

folosit n laboratorul nostru.Celulele de mal ce secret recombinarea -amilazelor au fost

crescute n mediu 2L YEPD pentru 36 ore si centrifugat pentru 36 ore ,la 9000 g timp de 20minute.Supernatantul a fost filtrat printr+un filtru de ,0,2 ,concentrat prin ultrafiltrare folosind

Pellicon XL la o turaie de 35 ml/min.Retenatul a fost schimbat n 20 mM tampon acetat

,pH=5,coninnd 5mM CaCl2 .Enzima a fost separat prin coloana de afinitate a substratului

ciclohepta-amilazic n conformitate cu Silvanovich i Hill (96).Prepararea enzimei concentrate

(100 ml) a fost ncrcat cu CHA-S urmat de splri repetate cu 50 ml tampon,50 ml tampon

coninnd 4mM NaCl i 100 mM tampon.

Enzima absorbat a fost diluat cu tamponul coninnd 8 mg/ml CHA care a fost

ndeprtat prin dializ n 20mM acetat de sodiu,pH=5,tamponul coninnd 2mM CaCl2.

7/28/2019 amilaze

11/11