Măsuri pentru protecţia muncii şi asigurarea securităţii înlaboratoarele de biochimie .................................................................................................. 5 Recoltarea sângelui .............................................................................................................. 7

Condiţii de recoltare ........................................................................................................... 7 Recoltarea sângelui capilar ................................................................................................ 8 Recoltarea sângelui venos .................................................................................................. 8 Condiţiile de conservare a probelor recoltate .................................................................... 9 Obţinerea plasmei şi a serului .......................................................................................... 10

Prepararea soluţiilor procentuale molare, normale ...................................................... 10 Noţiunea de pH ................................................................................................................... 15

Ionizarea apei şi produsul ionic al apei ....................................................................... 15 Scara de pH .................................................................................................................. 16 Determinarea pH-ului cu ajutorul indicatorilor acido-bazici ..................................... 16 Demonstrarea capacităţii de tamponare: ..................................................................... 18

Determinarea colorimetrică a pH-ului prin metoda cu soluţii tampon ........................... 19 Volumetrie .......................................................................................................................... 20

Principiile analizei volumetrice .................................................................................. 20 Clasificarea metodelor volumetrice ............................................................................. 21 Calcule în analiza volumetrică .................................................................................... 22 Tehnica titrării .............................................................................................................. 22 Erorile determinărilor volumetrice .............................................................................. 23 Surse de erori ............................................................................................................... 23

Acidimetria volumetrică .................................................................................................. 25 Titrări acido-bazice ...................................................................................................... 25 Titrarea unui acid tare cu o bază tare .......................................................................... 25 Determinarea factorului unei soluţii de HCl 0,1N cu ajutorul unei soluţii etalon ..... 26 Dozarea unei soluţii de NaOH cu soluţia de HCl 0,1 N cu factor cunoscut ............... 27 Dozarea amoniacului prin diferenţă ............................................................................ 27 Titrarea unui acid slab cu o bază tare .......................................................................... 28 Aplicaţie: Dozarea acidului lactic cu o soluţie titrată de NaOH ................................ 29 Titrarea unei baze slabe cu un acid tare ...................................................................... 30

Oxidimetria volumetrică .................................................................................................. 31 Permanganometrie ........................................................................................................... 32

Stabilirea factorului soluţiei de KMnO4 0,1N ............................................................ 32 Determinări permanganometrice în mediu acid .......................................................... 33 Dozarea acidului oxalic (micrometodă) ...................................................................... 33 Dozarea apei oxigenate (macrometodă) ...................................................................... 34

Iodometrie ........................................................................................................................ 35 Dozarea substanţelor reducătoare ................................................................................ 36 Stabilirea factorului soluţiei de Na2S2O3 0,01 N ....................................................... 36 Dozarea substanţelor oxidante ..................................................................................... 37 Dozarea K3 [ Fe(CN)6 ] (macrometodă) ..................................................................... 37 Dozarea K3 [ Fe(CN)6 ] (micrometodă) ........................................................................ 38

Complexometria volumetrică .......................................................................................... 38 Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometrică (metoda Budesinsky) ................................................................................................... 40

Volumetria prin reacţii de precipitare .............................................................................. 42 Dozarea clorurilor prin metoda Volhard ..................................................................... 43

Identificarea glucidelor ..................................................................................................... 44 Reacţii de reducere ...................................................................................................... 44

1

Identificarea dizaharidelor ........................................................................................... 51 Identificarea polizaharidelor ........................................................................................ 52

Identificarea glucidelor ..................................................................................................... 53 Identificarea aminoacizilor şi proteinelor ....................................................................... 54

Reacţii de culoare ...................................................................................................... 54 Reacţii de precipitare ale proteinelor ............................................................................... 58

Dozarea aminoacizilor monoamino-monocarboxilici prin metoda Sörensen ............ 61 Identificarea nucleoproteinelor ........................................................................................ 63 Vitamine .............................................................................................................................. 64

Identificarea vitaminelor prin metoda cromatografică .................................................... 64 Dozarea iodometrică a acidului ascorbic din urină(metoda Palladin) ............................................................................................................. 66

Enzime ................................................................................................................................. 67 Influenţa concentraţiei substratului asupra vitezei de reacţie enzimatică ............................................................................................ 69 Determinarea constantei lui Michaelis pentru urează ..................................................... 70 Determinarea activităţii catalazei sanguine ..................................................................... 73 Determinarea activităţii transaminazelor (metoda colorimetrică cu 2,4-dinitrofenilhidrazină) ....................................................... 74 Determinarea activităţii fosfatezei alcaline (Metoda Bodansky) .......................................................................................................... 78

Explorarea echilibrului acido-bazic ................................................................................. 83 Determinarea rapidă a rezervei alcaline (bicarbonat actual) ....................................... 84 Metoda Astrup ............................................................................................................. 84

Ioni anorganici .................................................................................................................... 85 Determinarea potasiului seric .......................................................................................... 85

Dozarea flamfotometrică a potasiului seric ................................................................. 87 Dozarea calciului şi magneziului ..................................................................................... 88

Dozarea calciului ......................................................................................................... 88 Determinarea cationului calciu în sânge ..................................................................... 88 Dozarea calciului prin metoda permanganometrică .................................................... 90 Dozarea calciului prin metoda complexonometrică .................................................... 92 Dozarea magneziului prin metoda Mann şi Yoe ......................................................... 94

Dozarea ionului de clor din ser prinmetoda Schales ................................................................................................................. 96 Dozarea ferului seric (metoda Heilmeyer modificată) .................................................... 97 Dozarea fosfatului anorganic din ser prinmetoda Briggs ( cu deproteinizare) .............................................................................. 100

Compuşi organici ............................................................................................................. 103 Dozarea azotului total din ser prin metoda Kjeldahl ..................................................... 103 Dozarea proteinelor totale din ser prin metoda biuretului ............................................ 106 Electroforeza proteinelor serice .................................................................................... 108 Dozarea azotului neproteic din ser prin metoda Kjeldahl ............................................. 112 Dozarea ureei din ser prin metoda cu urează ................................................................ 114 Dozarea ureei din ser prin metoda Kowarski ................................................................ 115 Dozarea acidului uric din ser ......................................................................................... 119 Dozarea creatininei din ser prin metoda Folin .............................................................. 121 Dozarea bilirubinei din ser prin diazorecţia van den Bergh .......................................... 123 Glucoza .......................................................................................................................... 125

Determinarea glicemiei prin metoda Hagedorn-Jensen (titrimetrică) ..................... 125

2

Dozarea glucozei prin metoda enzimatică (glucozoxidază) ..................................... 128 Teste rapide pentru determinarea glicemiei .............................................................. 130 Alte tehnici de determinare a glicemiei în laborator ................................................. 132

Dozarea beta-lipoproteinelor după Burstein ................................................................ 133 Dozarea colesterolului total din ser prin metoda enzimatică ....................................... 135 Dozarea colesterolului total şi liber ............................................................................... 136 Obţinerea, purificarea şi identificarea lecitinei (gălbenuş de ou) ................................ 138 Hemoglobina .................................................................................................................. 141

Dozarea hemoglobinei in sânge ( metoda Drabkin) .................................................. 141 Dozarea hemoglobinei sub formă de oxihemoglobină ............................................ 142

Analiza urinei ................................................................................................................... 142 Examenul fizic al urinei ................................................................................................. 143 Examenul chimic al urinei ............................................................................................. 146 Analiza compuşilor patologici din urină ....................................................................... 147

Identificarea proteinelor urinare ................................................................................ 147 Evidenţierea puroiului ............................................................................................... 150 Identificarea glucidelor urinare ................................................................................. 150 Identificarea corpilor cetonici urinari ........................................................................ 155 Teste rapide pentru identificarea corpilor cetonici ................................................... 157 Identificarea acizilor biliari ....................................................................................... 157 Identificarea pigmenţilor biliari urinari ..................................................................... 158 Identificarea urobilinogenului şi stercobilinogenului ............................................... 159 Identificarea sângelui ................................................................................................. 160

Teste rapide de diagnostic din urină .............................................................................. 161 Test rapid de sarcină ...................................................................................................... 161 Analiza de laborator a urinei .......................................................................................... 162 Determinări în urina din 24 de ore. ............................................................................... 162

Dozarea clorurilor din urină (metoda Mohr) ............................................................. 162 Dozarea acidului uric din urină ................................................................................. 163 Dozarea creatininei din urină .................................................................................... 164

Determinarea de clearance (coeficientul de epurare) renal ........................................... 164 Analiza calculilor urinari ............................................................................................... 165

Identificarea unor componenţi prin reacţii specifice: ............................................... 166 Analiza salivei ................................................................................................................... 167

Identificarea unor componenţi ai salivei ....................................................................... 167 Determinarea pH-ului şi a capacităţii tampon a salivei ............................................ 169

Analiza sucului gastric ..................................................................................................... 170 Determinarea acidităţii gastrice ..................................................................................... 170

Analiza lichidului cefalorahidian ................................................................................... 172 Examenul fizic ............................................................................................................... 173 Examenul chimic al lichidului cefalorahidian ............................................................... 173

Analiza scaunului ............................................................................................................. 174 Metode fizice de analiză folosite în laborator ............................................................... 176

Fotometria ..................................................................................................................... 176 Spectrofotometru Spekol .......................................................................................... 178

Spectrofotometrul de absorbţie atomică ........................................................................ 180 Spectrofotometrul de absorbţie atomică .................................................................... 181

Flamfotometria ............................................................................................................... 182 Fotometrul cu flacără (flamfotometrul) ..................................................................... 182

Potenţiometria cu electrozi cu electroni ioni - selectivi ................................................ 184

3

Măsurarea pH-ului cu electrodul de sticlă ................................................................ 184 Valori patologice de laborator care ameninţă viaţa ..................................................... 185

Limitele valorilor normale ............................................................................................. 185

4

Măsuri pentru protecţia muncii şi asigurarea securităţii în

laboratoarele de biochimie

1. Întregul personal şi studenţii, trebuie să cunoască şi să respecte regulile de protecţia

muncii şi asigurarea securităţii, pentru prevenirea accidentelor de muncă.

2. Tot personalul care lucrează în laboratoarele de analize biochimice este obligat să

poarte halate curate.

3. Aparatele electrice (centrifugă, termostate, frigidere, spectrofotometru etc.) trebuie să

aibă prizele împământate şi izolare electrică perfectă. Fixarea lor în priză se face

numai cu mâna uscată.

4. Înainte de începerea oricărei lucrări de laborator trebuiesc însuşite tehnic problemele

teoretice.

5. Toate reacţiile chimice se execută în conformitate cu condiţiile prescrise (cantitatea,

concentraţia, vesela, etc.).

6. Masa de lucru se păstrează într-o ordine şi curăţenie exemplară.

7. Nu se execută nici o operaţie în vase murdare.

8. După întrebuinţare toate vasele de laborator se spală cu apă de robinet şi cu apă

distilată.

9. Nu se aglomerează masa cu vase şi aparate inutile, pe masă se pun numai reactivii şi

vesela necesară pentru lucrarea respectivă.

10. Sticlele cu reactivi să fie întotdeauna închise cu dop. Dacă se folosesc diferiţi reactivi

trebuie avut grijă să nu se schimbe dopurile. Excesul luat dintr-un reactiv nu trebuie

turnat înapoi în sticlă.

11. Încăperea unde se prepară acizii minerali, apa de brom, solvenţii organici trebuie să

fie prevăzută cu nişă, exhaustor şi ventilaţie electrică.

12. Înainte de folosirea unor substanţe inflamabile (sulfură de carbon, benzină, eter, etc.)

se sting toate becurile de gaz.

13. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu extinctor, să se facă instructaj periodic de

utilizarea extinctorului şi să fie precizată o echipă care să intervină în caz de incendiu.

14. Evaporarea solvenţilor inflamabili se va face numai pe băi de nisip sau băi de apă

electrice, sub nişe cu tiraj convenabil.

15. Trebuie să se lucreze cu mare precauţie cu metalele alcaline, fosfor, brom, clor, acid

azotic, substanţe toxice şi inflamabile.

5

16. Pipetarea produselor biologice se face cu pipete prevăzute cu filtru de vată.

17. Pipetarea acizilor concentraţi şi bazelor se face cu pipetă cu volum mai mare decât

volumul de pipetat şi prevăzute cu filtru de vată.

18. Bromul se măsoară numai sub nişă, cu pipete cu bulă, prevăzute cu o pară de cauciuc

pentru aspirare. Acidul sulfuric diluat se prepară prin turnarea acidului sulfuric

concentrat în vasul cu apă şi nu invers.

19. În timpul încălzirii unei eprubete care conţine un lichid capătul deschis al eprubetei

nu se ţine spre cel care efectuează operaţia şi nici spre vecini.

20. Nu se lasă substanţe în vase neetichetate.

21. Substanţele toxice se ţin sub cheie şi în borcane sau sticle prevăzute cu etichete cu cap

de mort.

22. Este strict oprită gustarea reactivilor deoarece majoritatea substanţelor chimice

folosite sunt toxice sau caustice.

23. Mirosirea substanţelor chimice nu se face prin apropierea nasului direct la gâtul sticlei

cu reactivi, ci prin aducerea unui curent de aer care conţine vapori ai substanţelor de

la gâtul sticlei cu ajutorul palmei în apropierea nasului.

24. Când se lucrează cu substanţe care în cursul operaţiei se pot împrăştia sau se pot

produce mici explozii, se folosesc ochelari de protecţie.

25. Tuburile de oxigen, bioxid de carbon şi azot lichid se depozitează, în afara

laboratorului. Când sunt strict necesare anumitor operaţii în laborator ele se ancorează

cu lanţ în locuri anume prevăzute.

26. Cromatografia şi electroforeza se efectuează în încăperi izolate de restul laboratorului

şi prevăzute cu ventilatoare electrice.

27. În legătură cu lucrarea practică efectuată se notează toate observaţiile precum şi schiţa

instalaţiei folosite.

28. Acizii minerali şi hidroxizii concentraţi, hârtiile şi eprubetele sparte nu se aruncă în

chiuvete.

29. După terminarea activităţii, se pun toate vasele la loc, se curăţă masa şi se controlează

dacă aparatura electrică a fost scoasă din prize şi robinetele de apă şi gaz închise.

30. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu o trusă de prim ajutor care să conţină

medicamente şi material sanitar strict necesar (antinevralgice, cardiotonice,

antibiotice, antiseptice, calmante, feşi, tifon etc.).

31. Este interzisă păstrarea alimentelor în frigidere cu produse biologice,. pentru a evita

pericolul de infectare.

6

32. Este necesar ca măsurile de protecţia muncii, asigurarea securităţii, prevenirea

toxicităţii să fie prelucrate cu fiecare grupă de studenţi la începutul activităţii anului

universitar şi reamintite periodic.

33. În cazul unor accidente se va apela la conducătorul lucrării.

Recoltarea sângelui

Analizele chimice ale constituenţilor anorganici şi organici sanguini se pot realiza

pe sânge venos, capilar şi arterial (foarte rar).

Investigaţiile comparative pe sânge capilar şi venos au arătat că nu există diferenţe

dependente de modul de prelevare pentru următoarele substanţe: sodiu, potasiu, clor,

calciu, fosfor, colesterol, uree, proteine totale. În schimb pentru glucoză s-au găsit valori

mai mici în sângele venos faţă de cel arterial, pentru piruvat şi lactat valori mai mari în

sângele venos decât în cel capilar iar pentru amoniac valorile din sângele arterial sunt mai

mari decât cele din sângele venos.

Condiţii de recoltare

În mod curent, recoltarea sângelui se efectuează dimineaţa, à jeun (pe nemâncate).

Analizându-se influenţa micului dejun (masă uşoară) asupra concentraţiei unor

constituenţi sanguini, s-a găsit că recoltarea sângelui à jeun nu este obligatorie în cazul

dozării următoarelor elemente: clor, sodiu, potasiu, calciu, bicarbonat, uree, creatinină,

acid uric, proteine totale, colesterol, amilază, ceruloplasmină, fosfatază alcalină, fosfatază

acidă, transaminaze, leucinaminopeptidază, colinesterază.

În principiu, utilizarea sângelui total în cadrul diferitelor investigaţii este admisă

numai în cazul în care concentraţia substanţei urmărite este aproximativ aceeaşi în

globulele roşii şi în plasmă, aşa cum este cazul glucozei şi al azotului ureic.

Datorit] conţinutului diferit în apă al sângelui (81%) şi al plasmei sau serului (93%),

valorile glucozei din ser sunt cu 12% mai mari ca cele obţinute în sânge. Concentraţiile

medii ale unor componenţi organici şi anorganici şi activităţile medii ale unor enzime din

plasmă şi eritrocite sunt redate în tabelul de mai jos.

Component (concentraţie) Eritrocite Plasmă EritrocitePlasmă

7

Azot neproteic (mg/100 ml) 44,0 25,0 1,80Creatinină (mg/100 ml) 1,8 1,1 1,60Azot ureic (mg/100 ml) 14,0 17,0 0,82Acid uric (mg/100 ml) 2,5 4,6 0,54Glucoză (mg/100 ml) 74,0 90,0 0,82Colesterol (mg/100 ml) 139,0 194,0 0,72Potasiu (mEq/l) 100,0 4,4 22,7Sodiu (mEq/l) 16,0 140,0 0,11Clor (mEq/l) 52,0 104,0 0,50Calciu (mEq/l) 0,5 5,0 0,10Magneziu (mEq/l) 5,5 2,2 2,5Fosfor anorganic (mEq/l) 2,5 3,2 0,78Bicarbonat (mEq/l) 19,0 26,0 0,73

Utilizarea plasmei în locul serului pentru dozările diferiţilor constituenţi prezintă

un singur avantaj: hemoliza mai slabă a plasmei faţă de hemoliza produsă în timpul

obţinerii serului (recoltare, coagulare, transport).

Cu excepţia unor enzime (fosfataza acidă, lactatdehidrogenază şi aldolaza) care se

eliberează în timpul coagulării din trombocite, nu se constată diferenţe între concentraţia

plasmatică şi serică a celorlalţi constituenţi.

Recoltarea sângelui capilar

Recoltarea sângelui capilar se face din pulpa degetului, din călcâi (la nou născuţi)

sau din lobul urechii (la pacienţii în stare de şoc), după următoarea tehnică :

- se spală locul cu eter se usucă, se înţeapă suficient de adânc cu un ac steril;

- se lasă sângele să curgă spontan până când se formează o picătură apreciabilă

din care se recoltează cu ajutorul unei micropipete cantitatea de sânge necesară; dacă

sângele nu curge spontan în cantitate suficientă, se pot folosi manevre ajutătoare: frecarea

degetului în cazul prelevării din pulpă, a gambei în cazul prelevării din călcâi sau aplicare

de alcool 70° în cazul prelevării din lobul urechii; după prelevare se pune pe locul

înţepăturii un tampon steril.

Recoltarea sângelui venos

Recoltarea sângelui venos se efectuează din venele plicii cotului (la adult şi copii

mari), din fontanelă şi venele jugulare (la sugari şi copii mici).

Recoltarea din venele plicii cotului se face după următoarea tehnică:

8

- se fixează garoul deasupra cotului, se dezinfectează tegumentul în locul

puncţionării cu alcool 70 %;

- se puncţionează vena şi se recoltează sângele prin ac fie direct în eprubetă prin

scurgere liberă, fie prin aspirare în seringă ;

- după recoltare se îndepărtează garoul şi se tamponează locul puncţionat cu un

tampon de vata îmbibat în alcool.

Se folosesc ace şi seringi de unică utilizare s-au ace şi vase speciale pentru

recoltarea sângelui, vasele în care se recoltează trebuie să fie în perfecta stare de curăţenie

şi uscare întrucât urmele de alcool, apă etc. pot produce hemoliza sângelui, iar diferitele

impurităţi pot falsifica rezultatele dozărilor.

Poziţia corpului şi staza venoasă influenţează rezultatele obţinute în cazul

determinării elementelor figurate (eritrocitele, etc.) şi a celor cu greutate moleculară mare

(proteinele totale, fracţiunile proteice individuale, colesterolul din complexul

lipoproteinelor etc.).

De exemplu: valoarea proteinelor totale creşte de la 6,63 g/100 ml în poziţie de

deccubit la 7,65g/100 ml în ortostatism.

În cazul determinării substanţelor cu greutate moleculară mică, poziţia corpului şi

staza venoasă nu afectează valoarea rezultatelor excepţie, făcând lactatul, piruvatul şi

amoniacul.

Condiţiile de conservare a probelor recoltate

Probele de sânge total recoltat pe heparină se păstrează la 4° C, iar dozările

trebuie făcute în mai puţin de 4 ore de la recoltare. Păstrarea prea îndelungată (chiar la

4°C) este contraindicată. Conservarea probelor la temperatura camerei determină

perturbări în compoziţia electroliţilor, enzimelor şi diferiţilor metaboliţi.

În cazul plasmei sau serului, determinările metaboliţilor şi enzimelor trebuie

realizate, de asemenea, în decurs de 4 ore de la recoltare, în condiţiile păstrării la

temperatura camerei. Fără alterări importante, serul sau plasma pot fi păstrate la 4° C timp

de 24 ore. În cazul dozărilor după 24 ore de la recoltare plasma sau serul trebuie congelat

sau liofilizat, formă de conservare preferabilă adăugării de conservanţi (amestec timol-

fluoru0ră: 10 mg fluorură de sodiu + 1 mg timol/ml sânge sau streptomicină 1 mg/l0 ml

sănge).

9

Obţinerea plasmei şi a serului

Analizele biochimice se pot efectua pe sânge total, plasmă sau ser. Plasma

sanguină se obţine prin centrifugarea sângelui proaspăt recoltat pe un anticoagulant

(fluorură de sodiu, amestec de oxalaţi de potasiu şi amoniu, heparină etc.); supernatantul

este constituit din plasma sanguină, iar sedimentul din elementele figurate.

Serul sanguin se obţine prin centrifugarea sau decantarea sângelui recoltat fără

anticoagulant, după ce a fost lăsat să coaguleze la temperatura camerei timp de 30-60

minute.

Serul normal este limpede, de culoare galben pai şi se deosebeşte de plasma

sanguină prin faptul că nu mai conţine fibrinogen. În condiţii fiziologice, aspectul serului

poate fi :

- opalescent datorită particulelor de grăsime provenite dintr-un regim foarte bogat

în lipide, caz în care clarificarea se poate obţine prin deproteinizare sau extracţia

lipidelor cu amestec alcool-eter (3/1);

- galben-brun datorită substanţelor carotenoide provenite din alimentaţie excesiv

vegetariană ;

- de la roz la roşu intens datorită prezenţei hemoglobinei, rezultat al hemolizei

produsă prin greşeli în tehnica de recoltare a sângelui.

În condiţii patologice, serul poate prezenta următoarele modificări de culoare :

- opalescent în nefroza lipoidică;

- galben-brun în ictere de diferite etiologii; în contact cu aerul, bilirubina se poate

transforma în biliverdină, sângele devenind verzui.

Prepararea soluţiilor procentuale molare, normale

O soluţie este un amestec omogen de două sau mai multe substanţe inseparabile

prin mijloace mecanice ca filtrarea sau centrifugarea. La o soluţie se disting două

componente: solventul sau componenta care dizolvă şi solutul(soluţii) sau componenta

(componentele) care se dizolvă. Raportul dintre un solut şi solvent se exprimă prin

concentraţia soluţiei.

Există mai multe moduri de exprimare a concentraţiei unei soluţii:

a) Concentraţia procentuală care la rândul ei poate fi de trei feluri:

10

- concentraţia procentuală de masă - grame solut în 100 g

soluţie, (m/m)

De exemplu 100 g soluţie 15% (m/m) H2SO4 conţine 15 g H2SO4 şi 85

g apă.

- concentraţia procentuală volumetrică - ml solut în 100 ml

soluţie, (v/v)

De exemplu 100 ml soluţie 4% (v/v) etanol se prepară completând 4 ml

CH3CH2OH până la 100 ml cu apă. În acest caz facem abstracţie de

contracţia de volum, fenomen larg întâlnit în prepararea soluţiilor

procentuale volumetrice. Într-o expresie restrânsă acest fenomen poate

fi scris astfel: v solut + v solvent > v soluţie. Pentru soluţii diluate el poate fi

neglijat.

- concentraţia procentuală mixtă - grame solut în 100 ml soluţie,

(m/v)

De exemplu 100 ml soluţie 0,8% (m/v) NaCl (ser fiziologic) conţine în

acest volum 0,8 g NaCl

b) Concentraţia molară (m, M) reprezintă numărul de moli de solut aflaţi într-un

litru de soluţie.

c) Concentraţia molală, mai rar folosită, se defineşte prin numărul de moli de

solut dizolvaţi în 1000 g de solvent.

d) Concentraţia normală reprezintă numărul de echivalenţi-gram de solut dintr-un

litru de soluţie.

Se numeşte echivalent cantitatea de substanţă în greutate care într-o reacţie

chimică dată poate înlocui sau lega 8 părţi în greutate de oxigen sau 1,008 părţi în

greutate de hidrogen. Cantitatea de substanţă în grame, egală numeric cu echivalentul, se

numeşte echivalent-gram.

Pentru calcularea echivalentului-gram se ţine cont de următoarele reguli:

• echivalentul-gram a unui acid este egal cu raportul dintre masa moleculară (M) a

acidului şi numărul de ioni H+ angajaţi în reacţie. De exemplu, într-o reacţie de

neutralizare cu HCl

EgHCl = M HCl

1 = 36,5 g HCl,

iar într-o reacţie în care H3PO4 cedează toţi cei 3 ioni H+ :

11

EgH PO3 4 = M H PO3 4

3

98

332 7= = , g H3PO4

• echivalentul-gram a unei baze este dat de masa moleculară a sa împărţită la numărul

ionilor HO- care participă la reacţie. Dacă toţi ionii HO- participă la reacţie

echivalentul-gram al bazei se poate calcula împărţind masa moleculară a acesteia la

valenţa metalului. De exemplu:

EgNaOH = M NaOH

140= g NaOH E

MgCa OH

Ca OH

( )

( )

2

2

2

74

237= = = g Ca(OH)2

În sensul mai larg al bazelor generalizate, echivalentul gram se calculează

cunoscând numărul de protoni care sunt legaţi.

• pentru săruri, echivalentul-gram este dat de raportul dintre masa moleculară şi

produsul dintre numărul atomilor de metal din molecula de sare şi valenţa acestui

metal, sau raportul dintre masa moleculară şi produsul dintre numărul radicalilor acid

şi valenţa acestora. De exemplu:

EM

Fe SO

Fe SO

2 4 3

2 4 3

2 3

400

666 7( )

( ),=

×= = g Fe2(SO4)3

Ca şi în cazul acizilor, bazelor şi sărurilor, echivalentul-gram a unei substanţe

oxidante sau reducătoare se calculează pe baza stoicheometriei redox a reacţiei la care

participă aceasta. În reacţiile de oxido-reducere atomii îşi schimbă valenţa. Echivalentul

se defineşte ca fiind raportul dintre masa moleculară a compusului chimic şi numărul de

electroni cedaţi sau primiţi în reacţie de atomul (atomii) care se oxidează sau se reduc.

De exemplu, în permanganometrie, în mediu acid ionul de mangan din KMnO4,

acceptă 5 electroni:

7+ 2+

2KMnO4 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 3H2O + 5[O]

Prin urmare, EM

gKMnO

KMnO

4

4

531 6= = , g KMnO4

- variaţia stării de oxidaţie a ionului de mangan din KMnO4 în mediu slab alcalin

sau neutru este 3.

7+ 4+

2KMnO4 + H2O = 2KOH + MnO2 + 3[O]

EM

gKMnO

KMnO

4

4

3

158

352 7= = = , g KMnO4

12

- variaţia stării de oxidaţie a manganului din KMnO4 în mediu puternic alcalin

este 1

+7 +6

2KMnO4 + 2KOH = 2K2MnO4 + H2O + [O]

EgKMnO4 = = 158g KMnO4

1. Soluţii procentuale

a) Prepararea unei soluţii de NaCl 10 % (m/m)

Conform definiţiei 100 g soluţie NaCl 10 % trebuie să conţină 10 g NaCl şi 90 g

apă. Se cântăresc 10 g NaCl la balanţa tehnică care se introduc într-un pahar Berzelius şi

se adaugă 90 ml de H2O distilată. Se omogenizează amestecul cu ajutorul unei baghete de

sticlă.

b) Prepararea unei soluţii de CH 3COOH 15 % (v/v)

Conform definiţiei 100 ml soluţie CH3COOH 15 % trebuie să conţină 15 ml

CH3COOH glacial şi restul H2O distilată. Se măsoară într-un cilindru gradat 15 ml

CH3COOH glacial şi se completează volumul cu H2O distilată până la 100 ml. Se

omogenizează amestecul cu ajutorul unei baghete de sticlă.

c) Prepararea unei soluţii de Na 2CO3 5%(m/v)

100 ml soluţie Na2CO3 5 % trebuie să conţină 5 g Na2CO3 anhidru şi H2O distilată.

Se cântăresc 5 g Na2CO3 anhidru la balanţa tehnică, se introduc într-un cilindru gradat şi

se completează cu H2O distilată până la 100 ml. Se omogenizează amestecul cu ajutorul

unei baghete de sticlă. În cazul în care se lucrează cu Na2CO3 . 10 H2O se vor lua în

considerare masele moleculare pentru a se determina cantitatea în grame a sării hidratate

ce corespunde greutăţii de sare anhidră.

M Na CO anh2 3106

.= M Na CO H O2 3 210 286. =

106 g Na2CO3 anh. ............... 286 g Na2CO3.10 H2O

5 g Na2CO3 anh. ............... x

x = 13,49 g Na2CO3 . 10 H2O

Se vor cântări 13,49 g Na2CO3 . 10 H2O la balanţă şi se va proceda în modul

descris mai sus.

13

M KMnO 4

1

Regula amestecurilor

Dintr-o soluţie mai concentrată se poate prepara o soluţie mai diluată cu ajutorul

regulei amestecurilor. De exemplu, având la dispoziţie o soluţie de NaCl 2 % (m/m) să se

prepare 20 ml soluţie NaCl 0,9 %(m/m). Valorile concentraţiilor celor două soluţii, având

concentraţia mai mare, respectiv mai mică decât concentraţia soluţiei de preparat, se

aşează în colţurile de sus ale unui dreptunghi imaginar. Valoarea concentraţiei soluţiei de

preparat, se aşează la intersecţia celor două diagonale. Valorile numerelor ce reprezintă

concentraţiile se scad pe diagonală (numerele mai mici se scad din cele mai mari).

Rezultatele se scriu în colţurile de jos ale dreptunghiului. Aceste numere reprezintă părţi

în greutate din soluţiile respective (grame, kilograme, etc.).

2 0

0,9

0,9 părţi NaCl 2 % 1,1 părţi H2O distilată…2 părţi NaCl 0,9%(m/m)

Deci, se pot amesteca 0,9 părţi NaCl 2 % cu 1,1 părţi H2O distilată pentru a

rezulta 2 părţi soluţie de NaCl 0,9%(m/m). Având în vedere că soluţia NaCl 0,9% (m/m)

este diluată putem tolera conversia părţilor de greutate, în volume. Adică,

20 ml (soluţie) NaCl 0,9 %(m/v) ..........x ............y

x = 9 ml NaCl 2 %

y = 11 ml H2O distilată

Aproximaţia făcută este utilă deoarece este mai uşoară măsurarea volumetrică a

soluţiilor în loc de cea gravimetrică.

2. Soluţii molare

a) Prepararea unei soluţii de H2SO4 0,1 M având la dispoziţie soluţie de H2 SO4

20 % (m/m) cu densitatea 1,139 g/cm3. Conform definiţiei, 1000 ml H2SO4 0,1 M conţin

0,1 moli H2SO4. Deci:

14

1000 ml H2SO4 0,1 M .................. 9,8 g H2SO4 pur

100 g sol. H2SO4 20 % .............. 20 g H2SO4 pur

x g sol. H2SO4 20 % …………..9,8 g H2SO4 pur

x = 49 g sol. H2SO4 20 %(m/m)

vm= = =ρ

49

113943 02

,, ml sol. H2SO4 20 %(m/m)

În balonul cotat de 1000 ml se introduce o cantitate de H2O distilată, se adaugă

43,02 ml soluţie H2SO4 20 % şi apoi se aduce la cotă cu H2O distilată după răcirea

amestecului la temperatura menţionată pe balon (20ºC). După ce se fixează dopul

balonului cotat se omogenizează soluţia prin agitare energică.

3. Soluţii normale

Prepararea unei soluţii de H2SO4 0,1 N având la dispoziţie soluţie H2SO4 20 %

(m/m) cu densitatea 1,139 g/cm3. Conform definiţiei 1000 ml sol. H2SO4 0,1 N conţin 0,1

EgH SO2 4 . Deci:

1000 ml H2SO4 0,1 N .............. 4,9 g H2SO4 pur

100 g sol. H2SO4 20 % ........... 20 g H2SO4 pur

x g sol. H2SO4 20 % .......... 4,9 g H2SO4 pur

x = 24,5 g sol. H2SO4 20 %(m/m)

vm= = =ρ

24 5

113921 51

,

,, ml sol. H2SO4 20 %

Noţiunea de pH

Ionizarea apei şi produsul ionic al apei

Deşi apa pură este considerată neelectrolit, ea conduce totuşi curentul electric.

Acest lucru se datorează faptului că o parte din moleculele ei sunt ionizate. Ionizarea apei

poate fi scrisă conform ecuaţiei:

H2O + H2O <---------> H3O+ + OH-

Are loc un transfer de protoni ducând la un echilibru. Constanta de aciditate a apei va fi:

15

Ka=[ ][ ]

[ ]22

3

OH

OHOH −+

La temperatura de 25°C apa se află ionizată în proporţie de o moleculă la 555

milioane de molecule. De aceea se consideră că, prin ionizare, concentraţia apei (de la

numitor) rămâne practic constantă şi deci poate fi înmulţită cu constanta de aciditate.

Ka ⋅ [H2O]2 = Pi = [H3O+] [OH-]

Constanta Pi este numită produsul ionic al apei sau constanta de autoprotoliză a

apei. Deoarece la temperatura de 25°C produsul ionic al apei are valoarea de

10-14 moli2/l2, înseamnă că în apa pură la 25°C concentraţia ionilor de hidroniu, egală cu

cea a ionilor de hidroxid, este 10-7moli/l.

[H3O]+ = [OH-] = 10-7moli/l

Scara de pH

În soluţii diluate, acizii tari pot fi consideraţi practic ionizaţi complet. Astfel, într-

o soluţie apoasă 0,1N de HCl (0,1 moli/l) concentraţia ionilor de hidroniu este practic

egală cu concentraţia totală a acidului. Este comod să se exprime concentraţia ionilor de

hidroniu dintr-o soluţie apoasă în formă logaritmică. Se numeşte exponent al concentraţiei

ionilor de hidroniu sau pH logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentraţiei ionilor

de hidroniu din soluţie (Sørensen, 1909):

pH = - lg [H3O+]

Punctul neutru: O soluţie apoasă este neutră când concentraţiile ionilor de

hidroniu şi ionilor de hidroxid sunt egale, conform ecuaţiei:

[H3O+] = [OH-] = 10-7moli/l

Punctul neutru, în soluţii apoase, este la pH = 7. O soluţie cu pH < 7 este acidă; o soluţie

cu pH > 7 este bazică.

Determinarea pH-ului cu ajutorul indicatorilor acido-bazici

Indicatori de pH (acido-bazici) sunt substanţe organice colorate (acizi sau baze

slabe) care îşi modifică culoarea în funcţie de pH. Condiţiile pe care trebuie să le

îndeplinească un indicator de pH sunt următoarele: schimbarea de culoare să fie

reversibilă, şi să se producă brusc, deci într-un interval de pH cât mai mic, să fie solubil în

apă, să aibă putere de colorare (culoare intensă), chiar la concentraţii mici; schimbarea de

16

culoare să se producă la adaosul unor concentraţii mici de acid sau de bază; să fie stabil în

condiţiile obişnuite de lucru.

Dacă indicatorul este un acid slab (AH), în soluţie apoasă are loc reacţia

protolitică:

AH + H2O <─────> H3O+ + A-

În cazul albastrului de bromtimol, acidul slab AH este galben iar baza conjugată

A- este albastră. Prin schimbarea acidităţii soluţiei indicatorului îşi schimbă culoarea

fenomen numit viraj, datorită trecerii lui din stare protonată în cea deprotonată sau invers.

Constanta de aciditate al indicatorului va fi:

[A-]

Ka = [H+] ────

[AH]În forma logaritmică:

[A-] [A-]

lgKa = lg[H+] + lg ──── sau - lg[H+] = -lgKa + lg ───

[AH] [AH] Adică:

-lg[H+] = pH şi -lgKa = pKa, deci:

[A-] [albastru]

pH = pKa + lg ─── sau pH = pKa + lg ________

[AH] [galben]

Ochiul uman nu poate distinge decât cca. 10% dintr-o culoare în prezenţa unei alte culori.

Dacă [A-] = 10[AH], soluţia va fi albastră şi pH1 = pKa + 1. Dacă 10[A-] = [AH], soluţia

va fi galbenă şi pH2 = pKa - 1. Prin urmare:

pH1 - pH2 = ∆pH = 2

Acest interval de pH se numeşte intervalul de viraj al indicatorului care înseamnă

intervalul de pH în care are loc schimbarea culorii indicatorului (de la albastru la galben

în cazul nostru) odată cu schimbarea pH-ului soluţiei. Fiecare indicator are un interval de

viraj specific. La valori de pH inferioare intervalului de viraj indicatorul îşi păstrează

culoarea, iar peste acest interval la fel. Din culoarea soluţiei unui indicator se poate

aprecia pH-ul soluţiei.

17

Indicatorii acido-bazici pot fi simpli, micşti şi universali. Indicatorii simpli se

caracterizează printr-un interval de viraj relativ mic (cca 2 unităţi de pH).

Indicatorii simpli se pot folosi pentru tatonarea pH-ului necunoscut. pH-ul

necunoscut se poate estima cu o eroare de un semiinterval de viraj.

Indicatorii universali sunt amestecuri de indicatori simpli ale căror intervale de

viraj sunt parţial suprapuse sau, în cazul cel mai bun, unul în continuarea celuilalt.

Indicatorii universali au intervale de viraj mai mari decât ale celor simpli. În comerţ se

găsesc hârtii indicatoare impregnate cu indicatori universali. Prin compararea culorii

obţinute cu o scară de culori etalon, se poate determina pH-ul unei soluţii cu o precizie de

aproximativ + 0,5 unităţi pH.

În tabelul de mai jos apar câteva exemple de indicatori simpli cu caracteristicile

lor:

DenumireaIntervalul de

viraj (∆pH)

Sub interval

de viraj

În cadrul intervalului

de viraj

Peste

intervalMetil violet 1,0 - 3,2 verde albastru violetMetil oranj 3,1 - 4,4 roşu portocaliu galbenRoşu metil 4,4 - 6,2 roşu roz galbenAlbastru de

bromtimol6,2 - 7,6 galben verde albastru

Fenolftaleină 8,2 - 10,0 incolor roz roşu-violet

Sistemele tampon: sunt formate dintr-o sare hidrolizabilă şi acidul slab sau baza slabă

rezultată prin hidroliză. O soluţie care îşi schimbă numai puţin pH-ul, la adăugarea unei

cantităţi mici de acid sau bază tare se numeşte soluţie tampon. O caracteristică a unei

soluţii tampon este capacitatea de tamponare.

Capacitatea de tamponare a unei soluţii este capacitatea ei de a se opune variaţiei de pH la

adaosul de acid tare sau bază tare şi se exprimă prin numărul de echivalenţi de acid sau

bază care schimbă pH-ul unui litru de soluţie cu o unitate. Ea se micşorează prin diluare.

Demonstrarea capacităţii de tamponare:

Reactivi: Indicator Bogen (amestec de roşu metil şi albastru de bromtimol,

cu intervalul de viraj între pH 4,4-7,6)

18

Sol. tampon fosfat pH = 7

Sol.de HCl N/10

Sol. de NaOH N/10

Modul de lucru:

În două pahare Berzelius (1, 1a) se pune apă distilată şi se adaugă câte 2 ml de

indicator. Dacă apa este neutră culoarea soluţiilor este verde. În alte două pahare (2, 2a)

de aceiaşi mărime se prepară soluţie tampon cu pH = 7, la care se adaugă câte 2 ml soluţie

de indicator obţinându-se tot culoarea verde. Se adaugă câte 1 ml HCl N/10 în paharele

1şi 2 şi se amestecă cu bagheta: se observă o puternică variaţie a culorii soluţiei din

paharul 1 ceea ce indică o mare variaţie a pH-ului. În paharele 1a şi 2a se adaugă câte 1

ml NaOH N/10, se amestecă cu bagheta şi se observă la fel o mare variaţie a culorii

soluţiei din paharul 1a. În paharele 2 şi 2a culoarea se schimbă foarte puţin, deoarece pH-

ul s-a modificat foarte puţin.

În două pahare Berzelius (1, 1a) se prepară soluţie tampon cu pH = 7 şi se adaugă

câte 2 ml indicator. În alte 2 pahare (2, 2a) se prepară soluţie tampon cu acelaşi pH, însă

de zece ori mai diluat, adăugând câte 2 ml indicator şi în aceste pahare. Se pipetează câte

1 ml HCl N/10 în paharele 1 şi 2, şi câte 1 ml NaOH N/10 în paharele 1a şi 2a. Se

amestecă cu bagheta. În paharele 2 şi 2a se observă schimbarea mai pronunţată a culorii

indicatorului deoarece, soluţiile tampon fiind mai diluate, li s-a micşorat capacitatea de

tamponare.

Determinarea colorimetrică a pH-ului prin metoda cu soluţii tampon

Principiu:

Se adaugă soluţiei de cercetat un anumit volum dintr-un indicator potrivit şi se

compară culoarea pe care o capătă soluţia, cu culoarea produsă de aceiaşi cantitate de

indicator adăugată unei serii de soluţii tampon cu pH-uri cunoscute. pH-ul soluţiei de

cercetat va fi egal cu pH-ul soluţiei de referinţă cu culoarea identică.

Reactivi: - Sol. de CH3COOH N/10

- Sol. de CH3COONa N/10

- Sol. de KH2PO4 M/15

19

- Sol. de Na2HPO4 M/15

- Indicator Bogen (amestec de roşu metil şi albastru de bromtimol)

Modul de lucru:

Se prepară în două serii de eprubete soluţii tampon cu pH diferit conform

tabelelor:

Tampon acetat (Walpole)

CH3COOH N/10 ml 8,2 6,3 4,0 2,1 1,0CH3COONa N/10 ml 1,8 3,7 6,0 7,9 9,0

pH 4 4,4 4,8 5,2 5,6

Tampon fosfat (Sørensen)

KH2PO4 M/15 ml 8,8 7,3 5,1 2,8 1,3 0,5Na2HPO4 M/15 ml 1,2 2,7 4,9 7,2 8,7 9,5

pH 6 6,4 6,8 7,2 7,6 8,0

În fiecare soluţie se adaugă câte 0,2 ml indicator Bogen. Eprubetele se agită

energic pentru omogenizarea culorii. Culoarea soluţiilor va fi diferită în fiecare eprubetă

în funcţie de pH. Se adaugă 0,2 ml indicator la 10 ml din soluţia de cercetat şi se

omogenizează. Se compară culoarea obţinută cu culorile seriei. Dacă culoarea soluţiei

cercetate este identică cu culoarea uneia din soluţiile tampon (acetat sau fosfat), pH-ul lor

este identic. Dacă culoarea se încadrează între culorile a două soluţii tampon consecutive

se consideră că pH-ul soluţiei cercetate este media aritmetică a valorilor de pH a celor

două soluţii tampon.

Volumetrie

Principiile analizei volumetrice

Analiza volumetrică se bazează pe măsurarea de volume, operaţie ce se execută

comod cu vase calibrate (cilindrii gradaţi, baloane cotate, pipete, biurete). Principiul

analizelor volumetrice constă în măsurarea volumului de reactiv necesar producerii

reacţiei cantitative cu substanţa de determinat ce se află în soluţia de analizat. Operaţia de

adaos a soluţiei de reactiv se face în pică- turi, din biuretă şi se numeşte titrare.

Pot fi urmărite volumetric numai acele reacţii care au loc univoc, (fără reacţii

secundare şi cantitativ) şi cu viteză foarte mare. Pentru marcarea sfârşitului reacţiei,

20

respectiv a punctului de echivalenţă, se folosesc fenomene ce pot fi puse în evidenţă prin

observare vizuală (schimbări de culoare, apariţii de precipitate) sau instrumentală

(potenţiometru, conductometru, spectrofotometru). Pentru observarea vizuală a sfârşitului

titrării în modul cel mai obişnuit se folosesc indicatorii, substanţe care îşi schimbă

culoarea în punctul de echivalenţă.

La punctul de echivalenţă reactanţii sunt prezenţi în cantităţi echivalente, deci în

amestecul de reactivi nu se află în exces nici substanţa de dozat şi nici reactivul titrat.

Volumul de reactiv adăugat pentru atingerea punctului de echivalenţă se numeşte volum

de echivalenţă.

Spre a putea stabili concentraţia substanţei de analizat este necesar ca soluţia de

reactiv folosită la titrare să fie de concentraţie cunoscută, să fie suficient de stabilă şi să se

prepare relativ uşor.

Metodele volumetrice se caracterizează prin rapiditate, în majoritatea cazurilor o

determinare volumetrică se face în câteva minute.

Clasificarea metodelor volumetrice

Metodele volumetrice pot fi: a) directe

b) indirecte - prin retitrare

- prin intermediul unui substituent

În cazul metodelor de titrare directă, reacţia dintre componentul de determinat şi

reactivul de titrare este de echivalent la echivalent. Prin retitrare se titrează excesul unui

reactant adăugat soluţie de analizat (vezi dozarea NH3). În cazul folosirii unui substituent,

produsul de reacţie titrabil rezultat prin substituţie se formează în cantitate echivalentă cu

componentul de determinat (ex. complexometria).

În ceea ce priveşte natura reacţiilor care stau la baza metodelor volumetrice,

clasificarea acestora este:

a.) metode de titrare acido-bazică sau neutralizare

b.) metode de titrare redox (permanganometria, iodometria)

c.) metode de titrare prin formare de complecşi (complexometria)

d.) metode de titrare prin formare de precipitat (ex. argentometria)

21

Calcule în analiza volumetrică

Raportul de concentraţie între soluţia reală (aproximativ normală) şi cea teoretică

(exact normală) se numeşte factorul soluţiei.

Factorul exprimă numărul de ml de soluţie exact normală care echivalează cu 1 ml

din soluţia preparată:

FV

Vt

r

= unde: Vt - volumul teoretic (a soluţiei exact normale)

Vr - volumul real ( a soluţiei preparate)

Factorul soluţiilor exact normale este 1,000. Ele folosesc ca soluţii etalon şi cu

ajutorul lor se determină factorul soluţiilor aproximativ normale. Soluţiile mai diluate au

un factor subunitar, soluţiile mai concentrate au un factor supraunitar. Practic valoarea

factorului trebuie să fie între 0,8000-1,2000.

Pe lângă factor concentraţia exactă a soluţiilor se poate exprima şi cu ajutorul

titrului. Titrul unei soluţii reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în grame din 1 ml

soluţie. De exemplu: pentru o soluţie de NaOH care conţine 4,653 g pe litru titrul are

valoarea de 0,004653.

Tehnica titrării

Pregătirea instrumentelor pentru titrare

Biureta se spală cu apă distilată şi apoi se clăteşte cu soluţia de titrare de două ori.

După utilizarea mai îndelungată a biuretei este necesară degresarea tubului gradat al

acesteia. Aceasta se poate realiza cu amestec cromic sau cu soluţie de detergent.

Se umple biureta cu soluţia de titrare peste gradaţia 0, apoi se scoate pâlnia care a

servit pentru introducerea lichidului în biuretă şi se potriveşte la zero nivelul lichidului

lăsând să cadă încet lichidul în exces într-un vas colector. Dacă robinetul se mişcă greu

sau biureta picură, se scoate robinetul, se şterge de umezeală şi se unge cu un strat subţire

şi uniform de vaselină. Partea inferioară a manşonului robinetului se usucă cu ajutorul

hârtiei de filtru şi apoi se introduce robinetul uns la locul lui. Bulele de aer prezente în

biuretă pot să cauzeze erori la titrare ceea ce impune îndepărtarea lor.

Modul de lucru:

La începutul titrării dăm drumul soluţiei din biuretă în picături repezi agitând în

continuu conţinutul flaconului Erlenmayer, în care se găsesc, exact măsurat, volumul

soluţiei de titrat plus indicatorul. De obicei se observă o schimbare temporară de culoare a

22

indicatorului în locul unde cad picături de reactiv în soluţie. Spre sfârşitul titrării

concentraţia substanţei de dozat scade şi la contactul picăturilor de reactiv cu soluţia de

dozat schimbarea temporară a culorii soluţiei este mai persistentă. În această fază viteza

de picurare se reduce treptat în aşa fel încât după adăugarea ultimei picături necesare, să

fie posibilă închiderea rapidă a robinetului. Picătura aderată pe vârful biuretei se

introduce în vasul de titrare prin atingerea de peretele interior al acestuia şi se amestecă cu

lichidul de titrat aplecând vasul în direcţia lichidului ce se prelinge pe peretele vasului.

Titrarea se consideră terminată când ultima picătură produce o schimbare slabă dar

sesizabilă şi stabilă a culorii lichidului.

Erorile determinărilor volumetrice

În analizele chimice pot interveni două tipuri de erori:

- erori sistematice

- erori întâmplătoare

Erorile sistematice au valori constante şi sunt întotdeauna pozitive sau negative.

Erorile întâmplătoare au valori şi semne diferite. Ele se pot elimina prin efectuarea

unui mare număr de determinări şi prin calcularea mediei aritmetice a volumelor de

echivalenţă cu valori apropiate. Volumele de echivalenţă ale căror valori sunt exagerat de

îndepărtate se exclud

Practic se efectuează titrarea a trei probe paralele efectuându-se media aritmetică

între volumele de echivalenţă identice sau cele cu valoare foarte apropiată. Se acceptă o

diferenţă între volumele de echivalenţă mai mică sau egală cu 0,2 ml. Să luăm un

exemplu. Volumele de echivalenţă obţinute la titrarea a trei probe paralele sunt: V1 = 7

ml; V2 = 7,1 ml; V3 = 7,4 ml. Diferenţele V3 - V1 şi V3 - V2 sunt mai mari de 0,2 ml, deci

V3 se exclude. Volumul mediu ( v−

) luat în calcul va fi în acest caz media aritmetică dintre

V1 şi V2 şi are valoarea de 7,05 ml. Dacă toate probele au valori foarte diferite rezultatele

nu sunt interpretabile iar titrările trebuie să fie repetate.

Surse de erori

Eroarea de paralaxă ( eroarea de citire) intervine la citirea incorectă a nivelului

soluţiei din vasul de măsurat. Volumul de soluţie într-un vas de măsurat este egal cu

volumul nominal al vasului în cazul în care punctul inferior al meniscului lichidului este

tangent la cota de pe vas. Pentru citirea corectă a poziţiei meniscului ochiul

observatorului trebuie să fie pe orizontală într-un plan tangent la menisc iar vasul trebuie

să aibă o poziţie verticală.

23

Vorbim despre eroarea de paralaxă în minus când ochiul observatorului este

deasupra acestei orizontale, respectiv eroare de paralaxă în plus, când ochiul se găseşte

sub nivelul orizontului. Pentru evitarea erorii de paralaxă se folosesc biuretele Schellbach

care sunt prevăzute cu o dungă albastră pe un fond alb. La nivelul meniscului dunga

albastră se întrerupe formând două vârfuri ascuţite care se ating într-un punct. Se citeşte

poziţia acestui punct de contact.

Eroarea de scurgere se datorează faptului că soluţiile apoase umezesc sticla şi, la

golirea rapidă o parte din lichid aderă pe suprafaţa biuretei, deci soluţia nu se scurge

cantitativ în vasul de titrare. Pentru evitarea acestei erori, viteza de scurgere pe parcursul

titrării trebuie să fie mică.

Eroarea de picurare

În analiza volumetrică, soluţiei de analizat i se adaugă soluţia titrată până când

ultima picătură produce o schimbare sesizabilă şi stabilă a culorii soluţiei. În cele mai

multe cazuri acest efect se datorează unui exces a soluţiei cu care se titrează. Pentru

reducerea acestui exces, ciocul biuretei trebuie să fie cât mai subţire pentru ca picăturile

de titrant să fie cât mai mici.

Eroarea de temperatură

Vasele de măsurat volume, biurete, baloane cotate, pipete sunt etalonate pentru o

anumită temperatură (200C). Diferenţa dintre temperatura de etalonare a vasului şi

temperatura reală a soluţiei de măsurat determină o diferenţă de volum, care poartă

denumirea de eroare de temperatură. Se poate evita această eroare prin respectarea

temperaturii de etalonare. Diferenţele mici de 1-20C sunt, în majoritatea cazurilor,

neglijabile.

24

Acidimetria volumetrică

Titrări acido-bazice

În titrările de neutralizare, stabilirea volumului de echivalenţă sau de neutralizare

se face cu ajutorul indicatorilor acido-bazici care, cum am arătat sunt în formă neionizată

acizi slabi (AH) sau baze slabe (B). În tabelul de mai jos sunt exemplificaţi mai mulţi

indicatori acido-bazici cu precizarea naturii lor de acid sau bază. Sunt incluşi şi câţiva din

indicatorii utilizaţi la determinarea pH-ului (vezi mai sus). Evident, tăria acestor acizi

creşte către cel al cărui interval de pH este cel mai mult sub valoarea 7.

Pentru prepararea soluţiilor de indicatori se folosesc ca solvenţi apa, dar mai ales

alcool apos, cei mai mulţi în concentraţie de 0,1 %.

Indicatorul AH = acid; B = bază Interval de pH Culorile limităAcidă Alcalină

Albastru de timol (AH) 1,2 - 2,8 roşie galbenăAlbastru de bromfenol (AH) 3,0 - 4,6 galbenă vilet-albastrăMetiloranj (B) 3,1 - 4,4 roşie oranjVerde de bromcrezol (AH) 4,0 - 5,6 galbenă albastrăRoşu de metil (AH) 4,4 - 6,2 roşie galbenăPurpură de bromcrezol (AH) 5,2 - 6,8 galbenă purpurieAlbastru de bromtimol (AH) 6,2 - 7,6 galbenă albastrăRoşu neutral (B) 6,8 - 8,0 roşie galbenăRoşu de crezol (AH) 7,2 - 8,8 galben roşieFenolftaleină (AH) 8,0 - 10,0 incoloră roşieAlbastru de timol (AH) 8,0 - 9,6 galbenă albastrăTimolftaleină (AH) 9,4 - 10,6 incoloră albastrăGalben de alizarină (AH) 10,0 - 12,0 galben liliachie

Titrarea unui acid tare cu o bază tare

Principiu: În cazul titrării unui acid tare, de exemplu HCl, cu o bază tare, de

exemplu NaOH, la echivalenţă se formează o sare nehidrolizabilă, în exemplul dat NaCl

şi mediul devine perfect neutru. La neutralitate avem:

[ ] [ ]H OH+ − −= = 10 7 ioni g/l pHechiv. = 7

[ ]H + pe parcursul titrării este egală cu concentraţia acidului rămas netitrat. După

echivalenţă [ ]OH − este egală cu concentraţia bazei introdusă în exces. Pentru alegerea

indicatorului adecvat, este necesară cunoaşterea pH-ului la punctul de echivalenţă. La un

exces (eroare) de 1% reactiv pH-ul soluţiei variază brusc. La titrarea unui acid tare cu o

25

bază tare intervalul de eroare corespunde aproximativ intervalului de pH 4-10, ceea ce

înseamnă că se poate folosi orice indicator care are un interval de viraj între pH 4-10. În

figura de mai jos apare curba de titrare a unui acid tare cu o bază tare cu precizarea a doi

indicatori ce permit punerea în evidenţă a punctului de echivalenţă (P.E.) al reacţiei

Determinarea factorului unei soluţii de HCl 0,1N cu ajutorul unei soluţii

etalon

Prepararea unei soluţii de HCl aproximativ 0,1 N

Ne propunem să preparăm 1 litru sol. HCl aproximativ 0,1 N având la dispoziţie o

soluţie HCl 15% (g/100 g) cu ρ = 1,075 g/cm3.

Din definiţia concentraţiei normale:

1000 ml HCl 0,1 N conţin 0,1 Eq HCl = 3,65 g HCl

100 g HCl 15 % .............15 g HCl

x g HCl 15 %............. 3,65 g HCl

x = 24,33 g HCl 15 %

ρ = m

V V =

24 33

1 075

,

, = 22,6 ml HCl 15 %

Într-un balon cotat de 1000 ml se introduce o cantitate mică de H2O bidistilată, se

adaugă 22,6 ml HCl 15 % şi se completează cu H2O bidistilată până la cotă.

Omogenizarea soluţiei se realizează prin agitarea energică.

Stabilirea factorului soluţiei de HCl 0,1 N preparată

Pentru stabilirea factorului soluţiilor se folosesc soluţiile etalon, stabile din punct

de vedere chimic şi cu factor cunoscut (eventual F = 1,000). O astfel de soluţie etalon se

poate prepara prin cântărirea şi dizolvarea în apă a KHCO3, necesar în titrarea de mai jos.

Pentru determinarea factorului soluţiei de HCl 0,1 N preparată anterior se măsoară

exact cu ajutorul unei pipete câte 10 ml sol. KHCO3 în 3 pahare Erlenmeyer. Se adaugă

26

câte 3 picături de metiloranj şi se titrează, cele trei probe paralele, până la virajul

indicatorului de la galben la portocaliu. CO2 format în urma reacţiei se îndepărtează prin

fierberea probelor 2-3 minute. În cazul în care după răcirea probelor culoarea a revenit la

galben, se continuă titrarea până la portocaliu.

Din cele 3 volume de echivalenţă se face media aritmetică şi se obţine v−

HCl . La

baza calcului stă relaţia:

v−

HCl . FHCl = VKHCO3 . FKHCO3

10 x FKHCO3

de unde FHCl = ————

v−

HCl

Dozarea unei soluţii de NaOH cu soluţia de HCl 0,1 N cu factor cunoscut

În trei flacoane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml sol. NaOH, se adaugă câte 3

picături de metiloranj şi se titrează cu soluţie titrată de HCl 0,1 N până la virajul

indicatorului de la galben la portocaliu. Concentraţia procentuală mixtă a soluţiei de

NaOH se exprimă în g/100 ml şi se calculează în felul următor:

- se face media aritmetică a celor trei volume de echivalenţă şi se obţine v−

HCl

- conform definiţiei concentraţiei normale, 1000 ml HCl 1 N conţin 1 EgHCl

- din ecuaţia reacţiei chimice NaOH + HCl = NaCl + H2O rezultă că 1 EqHCl

reacţionează cu 1 EqNaOH deci:

1000 ml HCl 1 N ............. 40 g NaOH

1000 ml HCl 0,1 N............ 4 g NaOH

v−

HCl × FHCl ................... x g NaOH

x = 4

1000

× ×−v FHCl - reprezintă g NaOH conţinute în volumul sol. de

NaOH titrate (10 ml).

CNaOH%(m/v) = 10 • x, reprezintă concentraţia procentuală mixtă a soluţiei de

NaOH.

Dozarea amoniacului prin diferenţă

Principiu:

27

Metoda directă de dozare a amoniacului cu o soluţie titrată de HCl 0,1 N, în

prezenţă de metiloranj, este în general evitată datorită pierderilor de amoniac prin

desorbţie. Este preferată metoda dozării amoniacului prin diferenţă. Soluţia de amoniac se

tratează cu un volum de soluţie titrată de HCl, ce conţine un exces de acid şi se determină

excesul de HCl prin titrare cu o soluţie titrată de NaOH în prezenţă de metiloranj.

Reacţiile sunt următoarele:

NH3 + HCl = NH4Cl; NaOH + HCl = NaCl + H2O.

Reactivi: - Soluţie de HCl 0,1N cu factor cunoscut

- Metilorange, soluţie alcoolică 0,1%

Modul de lucru:

În trei flacoane Erlenmeyer se introduc câte 10 ml HCl 0,1 N, 5 ml soluţie de

NH3, 1-2 picături de metiloranj şi se titrează excesul de acid cu o soluţie titrată de NaOH

0,1 N până la virajul indicatorului de la roşu la portocaliu.

Calcul:

1000ml HCl 0,1 N ................……. 1,7 g NH3

vHCl × FHCl - v−

NaOH × FNaOH ...........…x

x = g NH3/ 5 ml

vHCl × FHCl - v−

NaOH × FNaOH = volumul teoretic de HCl, obţinut pe cale

titrimetrică, ce conţine cantitatea de HCl care a reacţionat cu NH3 din

probă; vHCl = 10 ml; v−

NaOH 0,1 N = media aritmetică a volumelor de

echivalenţă obţinute la titrarea celor 3 probe paralele.

Concentraţia soluţiei de amoniac se exprimă în g/100 ml, adică C NH3 %(m/v) = 20 • x

Titrarea unui acid slab cu o bază tare

Principiu:

La titrarea unui acid slab cu o bază tare se formează o sare hidrolizabilă. De

exemplu titrarea acidului lactic cu o soluţie titrată de NaOH implică următoarele procese

chimice:

28

CH3 CH

OH

COOH + Na+ + HO- CH3 CH

OH

COO- + Na+ + H2O

H2O H+ + OH-

H+ + CH3 - CH - COO- CH3 - CH - COOH

OH OH

Din ecuaţii reiese că anionii acidului slab, rezultaţi prin ionizarea completă a sării,

se combină cu H+ rezultaţi în urma procesului de disociere a H2O . Astfel [ ]H + descreşte,

iar [ ]OH − > [ ]H +

ceea ce determină reacţia alcalină a soluţiei. La punctul de

echivalenţă soluţia are un pH > 7. În general, soluţiile apoase ale sărurilor acizilor slabi

cu baze tari sunt alcaline. Se alege acel indicator al cărui interval de viraj conţine valoarea

pH-ului soluţiei sării hidrolizabile. În cazul de faţă este folosit indicatorul fenolftaleină, al

cărui interval de viraj este cuprins între 8-10 unităţi de pH. Aşa cum se vede în figura de

mai jos, în care acidul slab este CH3COOH, folosirea unui indicator cu interval de viraj în

mediul acid nu permite punerea în evidenţă cu precizie punctul de echivalenţă al reacţiei

Aplicaţie: Dozarea acidului lactic cu o soluţie titrată de NaOH

Reactivi: - Soluţie NaOH 0,1N cu factorul cunoscut

- Soluţie alcoolică de fenolftaleină 0,1%

Modul de lucru:

În trei flacoane Erlenmayer se măsoară câte 10 ml soluţie acid lactic, se adaugă 3-

4 picături de fenolftaleină şi se titrează cele trei probe cu o soluţie titrată de NaOH 0,1 N,

până la virajul indicatorului de la incolor la roz slab persistent cel puţin 20 de secunde .

29

Concentraţia acidului lactic se exprimă în procente mixte şi se calculează în felul

următor:

1000 ml NaOH 0,1 N ............... 9 g acid lactic

v−

× FNaOH ............................ x

x = g/10 ml c% (m/v) = 10 • x

Titrarea unei baze slabe cu un acid tare

Principiu:

La titrarea unei baze slabe cu un acid tare se formează o sare hidrolizabilă, pH-ul

în punctul de echivalenţă fiind mai mic decât 7. În general soluţiile apoase ale sărurilor

acizilor tari cu baze slabe sunt acide. De exemplu titrarea unei soluţii de NH3 cu o soluţie

titrată de HCl implică următoarele procese chimice:

NH3 + H2O NH4OH

NH4OH + H+ + Cl- NH4 + Cl- + H2O

H2O H+ + OH-

NH4 + OH- NH4OH

+

+

Ionii OH- rezultaţi în urma procesului de disociere a H2O au tendinţa de a

reacţiona cu o parte din ionii de amoniu formaţi. Astfel [ ]OH − descreşte, iar [ ]H +

>

[ ]HO− ceea ce determină reacţia acidă a soluţiei. La punctul de echivalenţă soluţia are un

pH < 7. Prin urmare se alege acel indicator al cărui interval de viraj conţine pH-ul soluţiei

sării rezultate în urma titrării (NH4Cl). În acest caz se poate folosi metiloranjul (figura de

mai jos).

30

Titrările acizilor slabi cu baze slabe (şi invers), nu produc variaţii bruşte şi mari a

pH-ului în jurul punctului de echivalenţă. De aceea ele sunt rar utilizate în titrimetria

acido-bazică.

Oxidimetria volumetrică

Date generale

În oxidimetrie toate reacţiile chimice au loc cu transfer de electroni, ele

denumindu-se oxido-reduceri sau reacţii redox.

După reactivii utilizaţi oxidimetria se poate împărţi în:

a) Permanganometria , care foloseşte drept componentă oxidantă KMnO4.

b) Iodometrie, în care ca reactiv se foloseşte I2 sau I-, ca oxidant respectiv reducător,

după caz.

c) Alte procedee [bromatometrie(KBrO3), cerimetrie (Ce(SO4)2), bicromatometrie

(K2Cr2O7), iodatometrie (KIO3)] utilizează compuşii precizaţi între paranteze ca oxidanţi.

Reacţiile redox pot fi utilizate în vederea unor dozări, dacă ele întrunesc anumite

condiţii:

- să fie totale în sensul dorit ( adică să fie cantitative),

- să decurgă cu viteză mare, pentru ca deteminările să se efectueze într-un timp scurt,

- să se poată observa uşor punctul de echivalenţă, care arată sfârşitul reacţiei chimice.

Grupa metodelor volumetrice bazate pe reacţii redox cuprinde procedee de

determinare cantitativă, care se realizează prin titrarea substanţelor reducătoare cu

oxidanţi şi a substanţelor oxidante cu reducători.

Majoritatea reacţiilor redox sunt reversibile, al căror echilibru dinamic poate fi

deplasat într-un sens sau altul în funcţie de condiţiile de lucru.

Ca în oricare altă metodă volumetrică şi în oxidimetrie (titrimetria redox) se

urmăreşte atingerea punctului de echivalenţă care se poate indica vizual sau instrumental.

De exemplu, în permanganometrie, permanganatul de potasiu este o substanţă colorată ce

poate să funcţioneze ca indicator, fiindcă un mic exces de reactiv produce o schimbare de

culoare uşor sesizabilă. În cazul titrărilor iodometrice, la punctul de echivalenţă poate să

apară un exces de iod molecular sau să dispară acest exces, ceea ce se poate indica cu

ajutorul amidonului ştiut fiind că amidonul formează cu I2 un complex violet intens

colorat.

31

Permanganometrie

Principii:

Permanganatul de potasiu, KMnO4, este unul dintre oxidanţii cei mai folosiţi,

datorită potenţialului de oxidare mare al sistemului MnO4-/Mn2+. Oxidarea se poate

efectua atât în mediu acid cât şi în mediu neutru sau alcalin. Puterea oxidantă a

permanganatului scade mult cu creşterea pH-lui soluţiei. Reacţiile care se petrec în

diferite medii sunt cele arătate mai înainte la calcularea echivalenţilor-gram ai KMnO4.

Rescrierea simplificată a lor pune în evidenţă numărul de electroni acceptaţi de o

moleculă de oxidant:

- în mediu acid KMnO4 acceptă 5 electroni/moleculă:

MnO4- + 8H+ + 5e- <=> Mn 2+ + 4H2O;

- în mediu neutru sau aproape neutru se transferă 3 electroni:

MnO4-+ 4H+ + 3e- <=> MnO2 + 2H2O

- în mediu alcalin, acceptă un singur electron:

MnO4- + e- <=> MnO4 2-

Permanganatul de potasiu cristalin este de culoare violetă, aproape neagră.

Lumina, creşterea temperaturii, a diluării, a acidităţii sau a alcalinităţii soluţiei, prezenţa

corpilor străini mai ales în pulbere, accelerează descompunerea permanganatului. De

aceea soluţiile de KMnO4 se păstrează în soluţie neutră, în sticle brune (la întuneric) şi la

temperatura obişnuită.

Stabilirea factorului soluţiei de KMnO4 0,1N

Având în vedere instabilitatea KMnO4 este necesară determinarea periodică a

factorului soluţiei de KMnO4 folosindu-se ca substanţă etalon acidul oxalic.

Reactivi: - Soluţie (COOH)2 0,1N cu factor cunoscut

- Soluţie H2SO4 20%

Modul de lucru:

În trei baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie de acid oxalic 0,1N cu

factor cunoscut, se adaugă câte 10 ml H2SO4 20%, se încălzeşte la 70-80°C şi se titrează

cu KMnO4 0,1N până la roz slab, persistent cel puţin 10 secunde.

Factorul soluţiei de KmnO4 se calculează după formula:

VKMnO4 ⋅ F KMnO4 = V acid oxalic ⋅ F acid oxalic unde VKMnO4 este media aritmetică a volumelor de

echivalenţă a celor trei probe paralele.

32

Vacid oxalic • Facid oxalic

FKMnO4 = ——————— VKMnO4

Determinări permanganometrice în mediu acid

Permanganatul de potasiu în mediu puternic acid (H2SO4 20%), la temperatura de

70-80 °C, se reduce la sarea manganoasă (MnSO4) punând în libertate oxigen, conform

reacţiei cunoscute

2KMnO4 + 3H2SO4 = K2SO4 + 2MnSO4 +3H2O +5[O]

Reacţia decurge autocatalitic deoarece ionii manganoşi (Mn2+ şi Mn3+) formaţi în

primul moment catalizează reducerea în continuare a permanganatului de potasiu.

Decolorarea soluţiei se produce datorită faptului că MnSO4 format este incolor în soluţii

diluate.

Soluţia acidă de permanganat serveşte în oxidimetrie, pentru dozarea volumetrică

a acidului oxalic, a apei oxigenate şi a altor substanţe (acidului azotos, etc). Sfârşitul

titrării se recunoaşte prin dispariţia sau apariţia culorii violete determinate în soluţie de

ionul MnO4-.

Dozarea acidului oxalic (micrometodă)

Principiu:

Reacţia titrimetrică este următoarea:

5(COOH)2 +2KMnO4 +3 H2SO4 = K2SO4 +2MnSO4 +10CO2 +8H2O

Reactivi: - Soluţie H2SO4 20%

- Soluţie KMnO4 0,01 N cu factor, FKMnO4, cunoscut

Modul de lucru:

În trei flacoane Erlenmeyer se măsoară câte 1 ml soluţie de acid oxalic de dozat.

Se adaugă câte 1 ml H2SO4, 2 ml apă bidistilată şi se încălzeşte până la 70-80°C. Se

titrează cu KMnO4 0,01N până când soluţia rămâne colorată în roz slab cel puţin 10

secunde.

Calcul

1000 ml KMnO4 0,01N reacţionează cu 0,01 Eq-gram de acid oxalic= 0,45 g acid oxalic

V KMnO4 F KMnO4 ............................................................ x g acid oxalic

x g (COOH)2 ………...........................…………………… 1 ml soluţie

33

c%(m/v) = 100•x

Această reacţie nu se produce direct: o picătură de soluţie de permanganat nu se

decolorează imediat când este adăugată într-o soluţie conţinând exces de acid oxalic şi

sulfuric. Culoarea roz a soluţiei (datorată prezenţei ionului MnO4-) persistă, dispărând

numai după un anumit interval de timp deoarece reacţia redox corespunzătoare are o

cinetică lentă până la formarea catalizatorului (Mn3+). Apoi ionii Mn3+ se reduc la Mn+2,

care este un proces instantaneu. În ultima etapă manganul (II) format reacţionează rapid

cu ionul MnO4- (VII), formându-se Mn (III) foarte reactiv care oxidează acidul oxalic,

finalul titrării fiind determinat de epuizarea (COOH)2 din probă şi apariţia unui mic exces

de ioni MnO4- care colorează persistent soluţia de titrat. Secvenţa de reacţii ale procesului

autocatalitic este următoarea:

(1) Mn(VII) + (COOH)2 -------> Mn(III) +CO2 (lent)

(2) Mn(III) + (COOH)2 -------> Mn(II) + CO2 (instantaneu)

(3) Mn(II) + Mn(VII) ---------> Mn(III) (rapid).

În stadiul iniţial viteza reacţiei este controlată de etapa lentă (1). De îndată ce concentraţia

ionilor Mn(II) devine apreciabilă, reducerea permanganatului poate să se desfăşoare rapid

pe calea procesului (3). Spre finalul titrării culoarea MnO4- dispare tot mai greu datorită

scăderii concentraţiei acidului oxalic. Reacţia este accelerată în final, ca şi la început, prin

încălzire la 70-80ºC .

Dozarea apei oxigenate (macrometodă)

Principiu:

Dozarea se poate face tot prin titrarea directă cu permanganat în soluţie de acid

sulfuric. Apa oxigenată (peroxid de hidrogen) funcţionează atât ca oxidant, după reacţia:

H2O2+2H++2e- → 2H2O; cât şi ca reducător, după reacţia: H2O2 ⇔ 2H++O2;

În soluţie acidă permanganatul de potasiu este redus după reacţia:

5H2O2 +2KMnO4 +3 H2SO4 = K2SO4 +2MnSO4 +8H2O +5O2

Modul de lucru:

În trei flacoane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie de apă oxigenată de

dozat. Se adaugă câte 10 ml H2SO4 20%. Se titrează cu soluţie de KMnO4 0,1N cu factor,

FKMnO4, cunoscut până când soluţia rămâne colorată în roz slab.

34

Calcul:

1000 ml KMnO4 0,1N sunt echivalenţi cu ...................1,7 g apă oxigenată

V KMnO4 F KMnO4 ............................................................ x g apă oxigenată

x g H2O2………………………………………………… 10 ml soluţie

c% (m/v) = 10•x

Iodometrie

Principiu:

Metoda se bazează pe sistemul redox:

I2 + 2e- <=> 2I- al cărui potenţial redox standard biochimic este E0′ = 0,62 V (pH = 7)

În soluţii de iodură conţinând ionul I3-, reacţia redox şi valoarea potenţialului redox

standard biochimic sunt:

I3- + 2e- <=> 3 I- E0′ = 0,54 V (pH=7)

În aceste reacţii, iodul molecular este oxidant, iar substanţele care au un potenţial

redox mai mic decât + 0,54V vor fi oxidate de către iod şi se vor putea determina uşor.

Un exemplu este reacţia cu tiosulfat:

I2 + 2S2O32- → 2I- +S4O6

2- (ioni tetrationat)

Substanţele care au potenţial redox mai mare (substanţele oxidante), cum este

ionul Fe3+, pun în libertate iodul molecular conform reacţiei:

2Fe3+ + 2I- → 2Fe2+ + I2

Calculul de bază al iodometriei este deci următorul: din cantitatea de iod eliberat

de un oxidant sau din cantitatea de I2 redusă de un reducător se poate calcula cantitatea

oxidantului sau reducătorului.

Sfârşitul reacţiei dintre substanţa de analizat şi iod, în prezenţă de iodură, este

determinată cu ajutorul amidonului, care formează un compus colorat intens albastru, de

forma [(C6H10O5)4I]4 •KI. Sensibilitatea indicatorului este mare, punându-se în evidenţă

circa 1,5 mg iod la litru de soluţie, (∼ 10-5N) acidulată cu HCl sau H2SO4. Creşterea

temperaturii soluţiei de titrat sau prezenţa alcoolului metilic sau etilic micşorează

sensibilitatea indicatorului.

Tot ca indicator în iodometrie se poate folosi o soluţie alcoolică 0,2% de α-naftol-

flavonă, care cu iodul dă un compus colorat tot în albastru. Acest indicator este însă mult

35

mai sensibil decât amidonul şi se poate folosi la titrarea soluţiilor mai diluate de iod (∼ 10-

3n) sau la titrarea iodometrică a soluţiilor colorate, în lumină ultravioletă când, la un exces

de iod, fluorescenţa albastră a indicatorului dispare. În acelaşi mod se foloseşte şi

rodamina B, a cărei fluorescenţă roşie la lumina ultravioletă dispare în prezenţa unui mic

exces de iod.

Dozarea substanţelor reducătoare

Substanţele reducătoare pot fi dozate în două feluri:

- substanţa de dozat se titrează direct cu soluţie de iod,

- substanţei de dozat i se adaugă soluţie de iod în exces şi excesul de iod se titrează cu o

soluţie de tiosulfat de sodiu cu factor cunoscut. Sfârşitul acestor titrări poate fi determinat

cu unul din indicatorii prezentaţi mai sus.

Reacţia titrimetrică este: 2Na2S2O3 + I2 → 2NaI + Na2S4O6

Stabilirea factorului soluţiei de Na2S2O3 0,01 N

Principiu:

În cazul soluţiei etalon de permanganat de potasiu au loc următoarele reacţii:

10 KI + 2 KMnO4 + 16 HCl = 12 KCl + 2 MnCl2 + 5 I2 + 8 H2O

I2 + 2 Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6

Reactivi: - Soluţie de KMnO4 0,01 N cu factorul FKMnO4

- Soluţie de HCl 15%

- Soluţie de KI 0,5%

Modul de lucru:

În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie de permanganat 0,01 N, se

adaugă câte 5 ml soluţie de HCl 15% şi 10 ml soluţie de KI 0,5%.

După 5 minute de repaus se titrează cu tiosulfat de sodiu iodul pus în libertate

până la culoarea galben-deschisă a soluţiei. Se adaugă 2 ml soluţie de amidon 0,5% şi se

continuă titrarea până la albastru pal agitând puternic. O picătură de soluţie de tiosulfat în

exces decolorează complet soluţia.

Calcul:

Se foloseşte formula VNa2S2O3•FNa2S2O3 = VKMnO4•FKMnO4

VKMnO4•FKMnO4

adică FNa2S2O3 = ——————

36

VNa2S2O3

Dozarea substanţelor oxidante

Din soluţia de KI oxidanţii pun în libertate iod elementar. Cantitatea de iod pus în

libertate este echivalentă cu cantitatea substanţei oxidante adăugate. Iodul elementar pus

în libertate se dozează prin titrare cu tiosulfat de sodiu care reduce iodul la ioni de iodură

conform reacţiei de mai sus.

Dozarea K3[Fe(CN)6] (macrometodă)

Principiu:

Iodul rezultat prin oxidarea ionilor I- de către ionii [Fe(CN)6]3- conform reacţiei,

2 [Fe(CN)6]3- + 2 I- ↔ 2 [Fe(CN)6]4- + I2, este titrat cu tiosulfat de sodiu în prezenţa

amidonului ca indicator. Reacţia are loc în mediu slab acid (CH3COOH) însă, fiind

reversibilă, deplasarea ei spre dreapta se realizează prin adaosul de ioni Zn2+ din

amestecul CH3COOH – ZnSO4. Are loc reacţia:

2 K4[Fe(CN)6] + 3 ZnSO4 → K2Zn3[Fe(CN)6]2 + 3 K2SO4

Ireversibilitatea acestei reacţii se datorează insolubilităţii sării duble a ferocianurii.

Reactivi: - Soluţie KI 0,5 %

- Soluţie CH3COOH - ZnSO4 (3% fiecare)

- Soluţie Na2S2O3 0,01 N cu factor cunoscut

- Soluţie amidon 0,5 %

Modul de lucru:

În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml fericianură de potasiu. Se adaugă

câte 10 ml soluţie de KI şi 15 ml CH3COOH - ZnSO4. După 5 minute se titrează cu

soluţie de tiosulfat de sodiu 0,01N iodul pus în libertate până la decolorarea aproape

completă a soluţiei. Se adaugă 2 ml soluţie de amidon şi se continuă titrarea până la

dispariţia culorii albastre.

Calcul:

1000 ml Na2S2O3 0,01N ……………………………..3,29 g K3[Fe(CN)6]

V•FNa2S2O3.......................................…………....x g

x g K3[Fe(CN)6]……………………………….10 ml sol

c%(m/v) = 10 • x

37

Dozarea K3[Fe(CN)6] (micrometodă)

Principiu şi reactivi: sunt aceeaşi ca şi la macrometodă.

Modul de lucru:

În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 2 ml apă bidistilată. Se adaugă cu

ajutorul micropipetei câte 0,10 ml fericianură de potasiu. Se adaugă câte 1 ml soluţie de

KI şi 1,5 ml CH3COOH - ZnSO4. După 5 minute se titrează iodul eliberat cu soluţie de

tiosulfat de sodiu 0,01N în prezenţa de 0,2 ml amidon până la dispariţia culorii albastre.

Calcul:

1000 ml Na2S2O3 0,01N ……………………………..3,29 g K3[Fe(CN)6]

V•FNa2S2O3.......................................…………....x g

x g K3[Fe(CN)6]……………………………….0,1 ml sol

c%(m/v) = 1000 • x

Sistemul I2/I- se găseşte în concentraţie foarte mică în apa de mare (0,05 mg/l), deoarece

iodul este legat în cea mai mare parte sub formă organică. Plantele marine extrag iodura

din apa de mare. Iodura se regăseşte în cenuşa acestor plante. Se mai găseşte iodură în

cantităţi variabile (7-46 g/m3) în apele fosile care însoţesc petrolul şi, în concentraţii mai

mici, în unele ape minerale.

Iodul apare, în concentraţii foarte mici, în toate vieţuitoarele şi este indispensabil

pentru viaţa acestora. La animalele superioare, iodul este concentrat în glanda tiroidă într-

o proteină numită tireoglobulină. Lipsa de iod în apa de băut, în special în unele regiuni

muntoase, determină apariţia, la populaţia acelor regiuni, a unor maladii ale glandei

tiroide (guşă).

Complexometria volumetrică

Metodele complexometrice servesc la dozarea cationilor prin titrare cu soluţia

agentului complexant. Prin metodele indirecte se pot doza complexometric şi anioni,

precum şi substanţele organice. Din numărul mare de reactivi unul frecvent folosit este

complexonul III (EDTA Na2) utilizat spre exemplu pentru titrarea ionilor Ca2+.

38

CH2

CH2

N

N

CH2

CH2

CH2

CH2

COOH

C

C

COOH

O

O

O-

O-Na+

Na++ Ca2+

CH2

CH2

N

N

CH2CH2

COO-

C O

OCa

CH2

CH2 C

COO-O

O

2-

+ 2 Na+ + 2H+

complexon III complexonat de

(etilendiamino-tetraacetatul disodic) calciu

Existenţa mai multor cicluri pentaatomice imprimă moleculei o mare stabilitate.

Stabilitatea complexului format este una din condiţiile pe care trebuie să o îndeplinească o

reacţie care stă la baza unei metode complexometrice. Stabilitatea se exprimă cantitativ

prin constanta de stabilitate KMY. Dacă notăm cu M ionul de metal şi cu Y agentul de

complexare, reacţia de complexare este următoarea:

M + Y MY

Constanta de stabilitate este exprimată prin relaţia:

[ ][ ] [ ]K

MY

M YMY =⋅

Valoarea constantei de stabilitate depinde de natura complexului şi de o serie de alţi

factori, cum ar fi pH-ul soluţiei.

Indicatorii folosiţi în complexometrie sunt indicatorii metalocromici, coloranţi

organici, care formează complecşi interni cu cationii metalici, de altă culoare decât aceea

a indicatorului liber.

Indicatorul trebuie să fie ales în aşa fel încât stabilitatea complexului format de el

cu ionii de metal să fie mai mică decât stabilitatea complexului format agentul de

complexare cu ionii metalici. În tabelul de mai jos sunt prezentaţi principalii indicatori

metalocromici, cationii pentru care sunt folosiţi şi logaritmul constantelor de stabilitate

ale lor în mediile precizate.

39

Indicator

metalcromicCationi Mediu lg KMY

Eriocrom negru T Cd2+

Co2+

Cu2+

Mg2+

Pb2+

Zn2+

NaClO4 0,3N

-

NaClO4 0,3N

-

NaClO4 0,3N

NaClO4 0,3N

12,74

20,00

21,38

7,00

13,19

12,31

Murexid Ca2+

Cu2+

Ni2+

-

-

KNO3 0,1N

2,68

3,50

3,36Acid sulfosalicilic Al3+

Cu2+

Fe3+

NaClO4 0,2N

NH4ClO4 0,2N

-

10,01

9,04

14,05

Ftaleincomplexon Ba, Sr, CaXilenoloranj Be2+

Bi3+

La3+

Pb2+, Zn2+,

Hg2+, Sn2+

NaClO4

NaNO3 0,2N

NaClO4 0,2N

-

-

3,92

75,60

11,67

-

-Acid calconcarbonic Ca2+ - -

Cromazurol S Al3+

Cu2+

Fe3+

Ni2+

KCl 0,2N

NaClO4 0,1N

KCl 0,1N

-

4,32

4,10

15,60

9,30α, α`- Dipiridil Fe2+

Zn2+

KCl 0,1N

KCl 0,1N

3,70

4,35

Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometrică

(metoda Budesinsky)

Principiu :

Fosfatul cupric, greu solubil în apă, reacţionează în mediu neutru cu aminoacizii

formând complecşi de tipul chelaţilor. Un aminoacid monoamino-monocarboxilic

40

complexează ionii Cu2+ în raport de 2:1 formând un complex solubil în apă. Reacţia este

următoarea:

6 HC

COOH

R

NH2 +Cu3(PO4)2 3HC

COO

R

NH

H

Cu N

H

H

CH

OOC

R

+ 2PO43- + 6H+

Excesul de fosfat cupric nedizolvat se poate separa prin centrifugare sau filtrare.

Prin adăugare de HCl la filtrat se eliberează ionii cuprici din complex conform reacţiei:

HC

COO

R

NH

H

Cu N

H

H

C

OOC

R

H + 2HCl Cu2++ 2 Cl- + 2 HC

COOH

R

NH2

Ionii cuprici eliberaţi se dizolvă prin titrare cu complexon III în prezenţa

indicatorului metalocromic piridilazonaftol (PAN). Reacţia titrimetrică de complexare

este următoarea:

CH2

CH2

N

N

CH2 COOH

CH2 C O

CH2

CH2 COOH

C O

O

O

-

-Na+

Na++ Cu2+

CH2

CH2

N

NCH2

CH2

CH2

CH2

Cu

COO-

COO-

C

C

O

O

O

O + 2Na+ + H+

2-

Reactivi: - soluţie complexon III 0,01N cu factor cunoscut

- soluţie HCl 0,01N

- indicator PAN 0,1 % în soluţie etanolică

- suspensie de Cu3(PO4)2

Modul de lucru:

În trei flacoane Erlenmeyer se pipetează câte 5 ml soluţie aminoacid, 5 ml

suspensie agitată de Cu3(PO4)2, se agită bine şi apoi se lasă 5 minute în repaos. Amestecul

se filtrează şi din filtrate se pipetează câte 5 ml în trei flacoane Erlenmeyer curate. Se

adaugă către 1 ml soluţie HCl, 3 picături indicator PAN şi se titrează ionii Cu 2+ eliberaţi

41

cu o soluţie de complexon III 0,01 M până la virajul indicatorului de la roşu violet la

galben-verzui.

Calcul:

Dacă se cunoaşte natura aminoacidului prezent se ia în calcul masa moleculară a

lui. Dacă este vorba de un amestec de aminoacizi monoamino-monocarboxilici rezultatul

se exprimă în mg N α-aminic/100 ml sau mmoli N α-aminic/l.

1000 ml sol. complexon III 0,01 M ....................0,01 × 2 × 14 g N

v− × FComplexon III ................................... .............................. x

x = .......g/ 2,5 ml c% (m/v) = 40 • x

Volumetria prin reacţii de precipitare

Principii:

Soluţia de reactiv formează cu componentul de dozat un precipitat insolubil. Din

volumul reactivului folosit pentru precipitarea completă a componentului de dozat se

calculează cantitatea componentului respectiv. Pot fi utilizate numai acele reacţii, la care

precipitatul format are compoziţie constantă, reacţia decurge rapid şi punctul de

echivalenţă poate fi indicat. Fiecare metodă necesită indicator aparte. Dacă în cursul

titrării se formează precipitat alb sau de culoare deschisă, putem folosi un indicator care

cu ionul de dozat sau cu excesul reactivului dă reacţie de culoare sau precipitat colorat.

Dintre metodele bazate pe reacţii de precipitare cea mai des utilizată este argentometria,

în care se întrebuinţează ca reactiv AgNO3. Azotatul de argint (ionii de Ag+ ) formează cu

ionii Cl-, Br-, I-, SCN- precipitate practic insolubile.

Prepararea unei soluţii de AgNO3 0,01N

Azotatul de argint chimic pur se deshidratează la 210-250ºC. După răcire se

cântăreşte cantitatea necesară (1,6989 g/l) se dizolvă şi se completează cu apă distilată la

volumul necesar. Dacă nu se măsoară exact cantitatea teoretică de AgNO3, soluţia va avea

factorul:

Cantitatea măsuratăF AgNO3 = ————————

1,6989

Soluţia se păstrează în sticlă brună.

42

Stabilirea factorului soluţiei de NH4SCN 0,01 N

Principiu:

În vederea determinării, un volum precis de AgNO3 0,01 N (cu factorul cunoscut)

se titrează cu NH4SCN. Are loc reacţia:

AgNO3 + NH4SCN = AgSCN + NH4NO3

Drept indicator serveşte alaunul feric. Indicarea sfârşitului titrării are loc prin

următoarea reacţie: Fe3+ + 3 SCN- = Fe(SCN)3

Formarea sulfocianurii de fer, substanţă intens colorată în roşu, indică un mic

exces de NH4SCN.

Modul de lucru:

În trei baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie 0,01 N AgNO3 cu

factorul cunoscut. Se adaugă 5 ml HNO3 10% şi 2 ml alaun feric ca indicator. Se titrează

cu soluţia de NH4SCN 0,01 N, agitând puternic, până la roz pal persistent. Se calculează

factorul din relaţia:

VSCN¯•F SCN¯ = VAgNO3•F AgNO3

Dozarea clorurilor prin metoda Volhard

Principiu:

Dozarea indirectă a ionului de clor după Volhard constă în următoarele etape. La

soluţia de analizat, acidulată cu HNO3, se adaugă în exces o soluţie titrată de AgNO3. Are

loc reacţia:

AgNO3 + Cl¯ = AgCl + NO3¯ Excesul de azotat de argint se titrează cu sulfocianură în

prezenţă de Fe3+ ca indicator. AgNO3 + SCN¯ = AgSCN + NO3¯

Modul de lucru:

În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie care conţine ionii de Cl¯,

se adaugă 20 ml soluţie 0,01N de azotat de argint 10 ml acid azotic 10% se aduce la

fierbere, se adaugă 2 ml alaun feric 20%. Se titrează cu o soluţie 0,01 N de NH4SCN

agitând puternic, până la roz slab, persistent timp de 5 – 10 secunde.

Calcul:

Rezultatul se va exprima în mM/l. Fiind vorba de o titrare prin diferenţă,

raţionamentul este identic cu cel din cazul determinării amoniacului.

43

Identificarea glucidelor

Reacţii de reducere

Reacţiile de reducere nu sunt specifice doar glucidele reducătoare, ele fiind date şi

de alte substanţe neglucidice cu caracter reducător. Caracterul reducător al

monozaharidelor şi a unor dizaharide este datorat prezenţei în molecula lor a funcţiunii

carbonilice, care se poate oxida, reducând la cald şi în mediu alcalin cationii metalelor

grele: Cu, Ag, Bi, precum şi unele substanţe organice ca acidul picric, indigoul, etc.

1. Reacţia Fehling

Principiu:

Gruparea carbonil din glucidele reducătoare reduce la cald Cu2+ până la Cu+ din

complexul solubil format în mediu alcalin cu sarea Seignette (tartrat dublu de sodiu şi

potasiu). Se formează Cu2O, pulbere de culoare roşie-cărămizie, conform reacţiilor:

CuSO4 + 2KOH → Cu(OH)2 + K2SO4

C6H12O6 + 2 Cu(OH)2 → C6H12O7 + Cu2O + 2 H2O

acid gluconic

Reactivi: - Reactivul Fehling se obţine în urma amestecării soluţiei I şi II în

volume egale, operaţie ce se desfăşoară în momentul întrebuinţării.

- Soluţia I: CuSO4 35 g/1000 ml soluţie

- Soluţia II: 150 g sare Seignette şi 90 g NaOH la 1000 ml soluţie

- Soluţii 2% de glucoză, fructoză, lactoză.

Modul de lucru:

Se amestecă într-o eprubetă 1 ml reactiv Fehling I cu 1 ml reactiv Fehling II se

adaugă 2 ml soluţie de glucid şi se încălzeşte până la fierbere agitând continuu. În

prezenţa unui glucid reducător se formesază un precipitat roşu-cărămiziu de Cu2O.

2. Reacţia Benedict

Principiu:

Glucidele reducătoare reduc la cald în mediu alcalin hidroxidul de cupru de

culoare albastră în oxid de cupru (I) de culoare roşie-cărămiziu. Reacţia Benedict prezintă

avantajul că se foloseşte un singur reactiv, ionul de Cu2+ fiind complexat în soluţie de

către citratul de sodiu.

44

Reactivi: - Reactivul Benedict: 173 g citrat de sodiu şi 100 g Na2CO3

anhidru se dizolvă în 800 ml H2O distilată fierbinte, se filtrează şi

se aduce volumul la 850 ml. Se dizolvă separat 17,3 g CuSO4• 5

H2O în 100 ml H2O distilată, se adaugă sub agitare primei soluţii şi

se completează volumul soluţiei finale la 1000 ml.

- Soluţii 2% de glucoză, fructoză, lactoză.

Mod de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie de glucid şi 3 ml reactiv Benedict, se

încălzeşte până la fierbere agitând continuu. Apariţia unui precipitat roşu-cărămiziu

implică existenţa în soluţie a glucidului reducător.

3. Reacţia Tollens

Principiu:

Glucidele reducătoare reduc la cald Ag+, din azotatul de argint amoniacal, la Ag

metalic care se depune pe pereţii eprubetei sub forma unei oglinzi (oglinda de argint),

conform reacţiilor:

AgNO3 + NaOH → AgOH + NaNO3

AgOH + 2 NH3 → [Ag(NH3)2]OH

C6H12O6 + 2 [Ag(NH3)2]OH → C6H12O7 + 2 Ag + 4NH3 + H2O

Reactivi: - soluţie AgNO3 5% în apă distilată

- soluţie NH4OH 20%

- soluţii 2% de glucoză, fructoză, lactoză.

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 1 ml AgNO3, se adaugă picătură cu picătură soluţie de

amoniac până la dizolvarea precipitatului format iniţial. Se adaugă 1 ml soluţie glucidică

şi se introduce eprubeta într-o baie de apă încălzită la fierbere. În cazul existenţei unui

glucid reducător în soluţia glucidică se formează oglinda de argint. Încălzirea eprubetei se

poate face şi direct la flacără sub agitare blândă.

4. Reacţia Nylander

Principiu:

Gruparea carbonil din glucidele reducătoare reduce azotatul de bismut în bismut

metalic de culoare neagră.

45

Reactivi: - Reactivul Nylander: 20 g azotat bazic de bismut, 40 g sare

Seignette şi 100g NaOH se dizolvă în apă pentru 1000 ml soluţie.

- Soluţii 2% de glucoză, fructoză, lactoză.

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie glucidică şi 1 ml reactiv Nylander, se

încălzeşte până la fierbere agitând continuu. În prezenţa unui glucid reducător în soluţie

apare un precipitat negru-brun.

5. Reacţia Barfoed

Principiu:

Reacţia Barfoed permite diferenţierea monozaharidelor reducătoare, pentru care

reacţia este pozitivă, de dizaharidelor reducătoare pentru care reacţia este negativă.

Principiul reacţiei constă în reducerea în mediu acid a ionilor de Cu2+ la Cu+ din Cu2O,

care se depune pe fundul eprubetei sub forma unui precipitat roşu-cărămiziu. De fapt

reacţia este potrivită atât pentru monozaharide cât şi pentru dizaharide reducătoare.

Diferenţa constă în vitezele de reacţie foarte diferite: mari pentru monozaharide; mici

pentru dizaharidele reducătoare.

Reactivi: - Reactivul Barfoed: 13,3 g acetat de cupru se dizolvă în 200 ml

H2O distilată, se filtrează şi se adaugă 1,8 ml acid acetic glacial.

- Soluţii 2% de glucoză, fructoză

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie glucidică şi 2 ml reactiv Barfoed, se

încălzeşte până la fierbere agitând continuu timp de 1-2 minute. Apariţia unui inel de

precipitat roşu-cărămiziu la suprafaţa soluţiei şi depunerea de precipitat roşu-cărămiziu pe

fundul eprubetei pune în evidenţă prezenţa monozaharidelor.

6. Reacţia cu acidul picric

Principiu:

Glucidele reducătoare reduc una din grupările nitro ale acidului picric (de culoare

galbenă) la grupare amino, cu formare de acid picramic (de culoare brun-roşie).

46

Această reacţie poate servi la dozarea colorimetrică a glucidelor reducătoare (metoda

Crecelius-Seifert).

Reactivi: - acid picric 0,5%

- glucoză 1%

- NaOH 10%

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie de glucoză, 2 ml acid picric şi 1 ml NaOH.

Se încălzeşte până la fierbere, agitând continuu până la apariţia unei coloraţii roşii-brune.

Reacţii de culoare

Reacţiile de culoare sunt specifice monozaharidelor care sub acţiunea acizilor

minerali concentraţi se deshidratează şi se transformă în furfurol sau în derivaţi ai lui.

HO - C - C - OH

H

H2C CH - CHO

O O

H

H H

3 H2O O

CHO

pentoză

furfurol

CHO

O3 H2OH H

H

OO

CH - CHOHC

H

HO - C - C - OH

HO - CH2 - HO - H2C -

hexozăhidroximetil - furfurol

Furfurolul şi derivaţii lui pot reacţiona cu fenolii, în urma reacţiei rezultând

compuşi coloraţi.

1. Reacţia Molisch

47

Principiu:

În prezenţa acidului sulfuric concentrat, monozaharidele (pentozele, hexozele) se

transformă în furfurol (hidroximetil furfurol) care reacţionează cu α -naftolul în raportul

1:2 formând produşi de condensare de culoare violetă. Această reacţie o dau la cald toate

glucidele deorece, sub acţiunea H2SO4 conc. ele hidrolizează punând în libertate

monozaharidele.

R CHO +

OH

OH

H

HH2OO

O

OH

OH

CHR

Reactivi: - reactivul Molisch: soluţie alcoolică 5% de alfa-naftol

- H2SO4 conc.

- soluţie de glucoză 1%

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie glucoză 1%, se adaugă 1-2 picături din

soluţia de alfa-naftol şi apoi se toarnă cu precauţie pe peretele înclinat al eprubetei H2SO4

conc. La suprafaţa de contact a celor două straturi de lichide cu densităţi diferite se

formează un inel violet.

2. Reacţia Bial

48

Principiu:

Reacţia Bial serveşte la identificarea pentozelor, pentru care reacţia este pozitivă,

faţă de hexoze, ea fiind negativă.

În prezenţa acizilor minerali tari, pentozele reacţionează cu orcina (5-metil-

rezorcina) formând produşi de condensare de culoare violetă sau albastru-verde în funcţie

de natura acidului folosit.

Reactivi: - reactivul Bial: 6 g orcină se dizolvă în 200 ml alcool etilic 96% şi

se adaugă 40 picături sol. FeCl3 10%

- HCl conc.

- soluţie 1% de fructoză, arabinoză, glucoză

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 2 ml sol. de pentoză, iar în altă eprubetă 2 ml soluţie de

glucoză. Se adaugă în fiecare eprubetă 10 picături reactiv Bial şi câte 2 ml HCl conc. Se

agită conţinutul eprubetelor, se astupă cu dopuri de vată şi se lasă într-o baie de apă ce

fierbe timp de 10 minute. Conţinutul eprubetei în care se găseşte soluţia de pentoză

devine albastru-verzui.

3. Reacţia Seliwanoff

Principiu:

Reacţia Seliwanoff serveşte la diferenţierea cetozelor de aldoze. Monozaharidele

în prezenţa HCl conc. reacţionează cu rezorcina (sau alţi polifenoli) formând produşii de

condensare coloraţi. Reacţia este mai rapidă şi mai intensă în prezenţa cetozelor, când se

obţin produşi coloraţi în roşu decât în prezenţa aldozelor, când se obţin produşi coloraţi în

roz deschis.

Reactivi: - reactivul Seliwanoff: 0,15 g rezorcină, 100 ml HCl conc., 200 ml

H2O distilată.

- soluţie de fructoză, glucoză 2%

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduce 1 ml soluţie fructoză şi în altă eprubetă 1 ml soluţie

de glucoză. Se adaugă în ambele eprubete câte 2 ml reactiv Seliwanoff şi se încălzesc

probele până la fierbere. După răcire, conţinutul eprubetei cu fructoză se colorează în

roşu, iar a celei cu glucoză în roz slab.

Reacţia cu fenilhidrazina

49

Reacţia este specifică glucidelor reducătoare şi are ca rezultat formarea

osazonelor. Osazonele diferitelor glucide se deosebesc între ele prin structura cristalină

ceea ce determină imagini microscopice diferite, aşa cum se vede în figura de mai jos. De

asemenea ele se deosebesc prin solubilitate, puncte de topire.

Principiu:

Reacţia glucidelor reducătoare cu fenilhidrazina decurge în două etape:

- la rece, se formează fenilhidrazina

- la cald, în prezenţa unui exces de reactiv, se formează osazona specifică

glucidului folosit. Cetonele reacţionează ca şi aldozele. Prin RMN s-a

dovedit că osazonele au o structură chelatică ciclică.

Reactivi: - fenilhidrazină solidă

- CH3COONa •H2O

- acid acetic glacial

- soluţii 10% de glucoză, lactoză, maltoză

Modul de lucru:

Se introduc câte 5 ml soluţie de glucoză, lactoză şi maltoză în câte o eprubetă, se

adaugă 0,5 ml acid acetic glacial, puţină fenilhidrazină şi o cantitate dublă de acetat de

sodiu. Se agită şi se introduc eprubetele într-o baie de apă la fierbere timp de 1/2 de oră.

După răcire apar cristalele galbene specifice, care se vor examina la microscop, punând 1-

2 picături din fiecare probă pe o lamelă de sticlă.

50

H

C = O

HC - OH

R

+ H2N - NH - C6H5

H2OR

HC - OH

C = N - NH - C6H5

H

glucid reducător

fenilhidrazină

fenilhidrazonă

H

C = N - NH - C6H5

H-C - OH

R

+ H2N - NH - C6H5

NH3

C6H5 - NH2

R

C = O

C = N - NH - C6H5

H

H

C = N - NH - C6H5

C = O

R

fenilhidrazinăH2O

+ H2N - NH - C6H5

R

C = N - NH - C6H5

C = N - NH - C6H5

H

osazonă

Identificarea dizaharidelor

Dizaharidele pot fi reducătoare - maltoză, lactoză sau nereducătoare - zaharoza.

După o prealabilă hidroliză a legăturii glicozidice şi cele nereducătoare vor da reacţiile

caracteristice de reducere şi culoare ale monozaharidelor.

51

Reactivi: - reactiv Benedict

- reactiv Barfoed

- acid clorhidric 10%

- hidroxid de sodiu 10%

- soluţii 2% de zaharoză, lactoză, maltoză

Modul de lucru:

Se introduc câte 2 ml soluţie maltoză, zaharoză şi lactoză în câte o eprubetă, se

adaugă 2 ml reactiv Benedict şi se încălzesc soluţiile pănâ la fierbere. Reacţia este

pozitivă în cazul maltozei şi a lactozei care sunt dizaharide reducătoare. Într-o altă

eprubetă se introduc 2 ml zaharoză, 3 picături HCl 10% şi se aduce soluţia la fierbere.

După răcire se neutralizează cu 3 picături de NaOH 10%, se adaugă apoi 2 ml reactiv

Benedict şi se încălzeşte din nou la fierbere. Reacţia va fi pozitivă pentru că în urma

hidrolizei au rezultat două monozaharide reducătoare.

Identificarea polizaharidelor

Principiu:

Polizaharidele cu importanţă biologică - amidonul, dextrinele, glicogenul -

formează cu iodul la rece combinaţii colorate diferit:

- amidonul cu iodul - albastru

- dextrinele cu iodul - brun-roşu clar

- glicogenul cu iodul - cărămiziu opalescent

Aceste combinaţii sunt termolabile, la cald culoarea dispare şi reapare la răcire

ceea ce sugerează termodisocierea lor.

Reactivi: - soluţie apoasă de iod: se amestecă 0,2 g I2 cu 1 g KI şi 2 ml apă

distilată. După dizolvare se completează la 100 ml cu apă distilată.

- soluţii 2% de amidon, dextrine, glicogen

Modul de lucru:

Se introduc câte 2 ml soluţie amidon, dextrină, glicogen în câte o eprubetă. Se

adaugă apoi 1-2 picături soluţie de iod şi se observă culorile obţinute. Se verifică

dispariţia culorilor prin încălzirea eprubetelor şi reapariţia lor la răcire.

52

Identificarea glucidelor

1. Reacţia cu iod

incolor roşu-brun albastru amidon

monozaharide clar opalescent dizaharide dextrine glicogen

sol.fără glucid

2. Reacţia Benedict (sau Fehling)

pozitivă negativă glucid reducător glucid nereducător

soluţie fără glucid

3. Reacţia Barfoed

pozitivă negativă 3'.Hidroliză acidă monozaharid dizaharid

4.Reacţia Bial 4".Reacţia de formare a osazonelor

4'.Reacţia Benedict pozitivă negativă maltosazona lactosazona pentoze hexoze

pozitivă negativă zaharoza sol.fără glucid

5. Reacţia Selivanov

pozitivă negativă fructoză glucoza

53

Identificarea aminoacizilor şi proteinelor

Reacţii de culoare

Reacţiile de culoare nu sunt specifice moleculei proteice ca un tot, ci sunt date de

prezenţa în molecula proteică a unor componente structurale, cum ar fi legăturile

peptidice în cazul reacţiei biuretului sau prezenţa unor anumiţi aminoacizi în cazul

celorlalte reacţii.

Reacţia biuretului

Principiu:

Substanţele care conţin legături peptidice (începând cu tripeptidele) reacţionează

cu Cu2+ în soluţie puternic alcalină dând o coloraţie caracteristică violetă, purpurie,

datorită formării unui complex colorat în care ionul Cu2+ este unit prin legături

coordinative cu heteroatomi ai aminoacizilor angajaţi în legătura peptidică. Această

reacţie se foloseşte şi pentru dozarea substanţelor proteice prin metodă spectrofometrică.

Simbolizând cu Ri respectiv Ri+1 radicali ai aminoacizilor legaţi prin legătura

peptidică, această legătură se poate reprezenta în felul următor:

Cel mai simplu compus care dă această reacţie este biuretul, de unde şi numele

reacţiei. Formula biuretului este:

Reactivi: - Sol. CuSO4 1%

- Sol. NaOH 10%

Mod de lucru:

La 1-2 ml soluţie de cercetat se adaugă un volum egal de NaOH şi 3-5 picături de

soluţie de CuSO4. Se obţine o coloraţie albastră - violetă, fotometrabilă.

54

Reacţia ninhidrinei

Principiu:

Ninhidrina (tricetohidrindenhidrat) reacţionează cu aminoacizii în soluţie apoasă,

neutră sau slab alcalină şi la cald, cu formarea unui compus colorat. Coloraţia variază

pentru diverşii aminoacizi de la roz, roşu la albastru-violet (purpura lui Ruhemann) şi

este galbenă pentru prolină, galben-brun pentru hidroxiprolină. Această reacţie este dată

nu numai de aminoacizi, ci şi de peptide şi proteine. Reacţia cu ninhidrină este una din

reacţiile generale folosite pentru identificarea şi dozarea aminoacizilor în special la

metoda cromatografică.

Reactiv: - Sol. de ninhidrină 0,1% cu adaos de piridină.

Mod de lucru:

La 2-3 ml soluţie de cercetat se adaugă 0,5 ml soluţie de ninhidrină, se încălzeşte

soluţia la fierbere cca 30 secunde, apoi se răceşte. Se observă formarea unei coloraţii

albastru-violet (fiindcă se lucrează cu un amestec de aminoacizi).

Reacţia xantoproteică

Principiu:

Această reacţie este caracteristică aminoacizilor aromatici. Astfel fenilalanina,

tirozina, triptofanul dau o coloraţie galbenă la încălzire cu acidul azotic concentrat.

Reacţia este datorată nitrării nucleului benzenic, respectiv imidazolic. Se poate da ca

exemplu reacţia fenilalaninei cu acidul azotic:

Reactivi: - HNO3 conc.

- Sol. NaOH 5%

Mod de lucru:

La 1 ml soluţie de cercetat se adaugă câteva picături de HNO3 concentrat. Apare

un precipitat alb sau o tulburare. După fierberea conţinutului 1-2 minute apare o culoare

55

galbenă. La fierbere precipitatul se poate dizolva parţial sau complet. Dacă după răcire

soluţia se alcalinizează, culoarea se intensifică, se schimbă în galben portocaliu. Apariţia

petelor galbene pe piele în urma acţiunii acidului azotic concentrat se explică tot prin

reacţia xantoproteică.

Reacţia Adamkiewicz-Hopkins-Cole (reacţia triptofanului)

Principiu:

Triptofanul (aminoacid care se găseşte în aproape toate proteinele) dă cu acidul

glioxilic (OHC-COOH) o coloraţie violetă. Se foloseşte ca reactiv acidul acetic glacial,

care conţine ca impuritate acid glioxilic.

Reacţia este specifică nucleului indolic, astfel produşii obţinuţi prin

descompunerea triptofanului (indolul şi derivaţii săi) dau şi ei reacţia pozitivă.

Reactivi: - Acid acetic glacial

- Acid sulfuric concentrat

Mod de lucru:

La 2 ml soluţie de cercetat se adaugă 2 ml acid acetic glacial, se amestecă şi se

introduc pe fundul eprubetei 2 ml H2SO4 concentrat. La suprafaţa de separaţie se

formează un inel violet. Reacţia se foloseşte în laboratoarele clinice pentru diferenţierea

meningitei tuberculoase de meningitele de altă etiologie, această reacţie fiind pozitivă

numai din lichidul cefalo-rahidian al pacienţilor cu meningită tuberculoasă. Meningita

este inflamaţia membranelor care învelesc creierul şi măduva spinării.

Reacţia tioaminoacizilor (reacţia cisteinei, cistinei)

Principiu:

Prin fierberea unei soluţii alcaline conţinând tioaminoacizi sau proteine ce conţin

în moleculă aminoacizi cu sulf, sulful se eliberează ca sulfură de sodiu (Na2S). Sulfura de

sodiu rezultată se tratează cu acetat de plumb şi se formează un precipitat negru-brun de

sulfură de plumb.

Reactivi: - Sol. de NaOH 30%

- Sol. de acetat de plumb 10%

Mod de lucru:

La 1 ml soluţie de cercetat se adaugă acelaşi volum de NaOH 30% şi se fierbe 3-5

minute. După fierbere se adaugă 1-2 ml soluţie de acetat de plumb şi se fierbe din nou. Se

obţine un precipitat sau numai o coloraţie brun-neagră.

56

Reacţia Pauli (reacţia histidinei şi tirozinei)

Principiu:

Tirozina, histidina şi proteinele conţinând aceşti aminoacizi, formează prin

cuplare cu acidul diazobenzensulfonic, un colorant azoic roz care se intensifică la roşu

prin alcalinizare. Sinteza sării de diazoniu are loc prin reacţia:

Reacţia de cuplare este următoarea (se ia în considerare şi alcalinizarea):

Sarea de diazoniu + tirozină + NaOH

Reactivi: - Sol. de acid sulfanilic 1% în HCl 10%

- Sol. de NaNO2 5%

- Sol. de Na2CO3 30% sau NaOH 10%

Mod de lucru:

Se diazotează 1 ml soluţie de acid sulfanilic adăugând 1 ml soluţie de nitrit de

sodiu. Se amestecă acidul diazobenzensulfonic obţinut cu 1 ml soluţie de cercetat şi după

57

O-Na+

CH2

I H - C - NH2

I COO-Na+

N=N

SO3-Na+ + H2O

Colorant azoic

neutralizare cu 3-4 ml soluţie de Na2CO3 (sau câteva picături de NaOH) se obţine o

coloraţie roşie.

Reacţia Sakaguchi (reacţia argininei)

Principiu:

Soluţiile care conţin substanţe cu radicalul guanidinic în moleculă, dau în mediu

alcalin în prezenţa alfa-naftolului şi a hipocloritului sau hipobromitului de sodiu

combinaţii colorate în roşu.

Reactivi: - Soluţie de hipoclorit de sodiu

- Soluţie alfa-naftol: se dizolvă 0,1 g alfa-naftol în aprox. 25 ml

alcool etilic şi se diluează cu apă la 100 ml.

- Soluţie de NaOH 10%

Mod de lucru:

Se ia într-o eprubetă 1 ml soluţie proteică diluată şi se alcalinizează cu 1 ml

soluţie NaOH 10%. Se adaugă 1 ml soluţie alfa-naftol şi soluţia de hipoclorit de sodiu

picătură cu picătură până la apariţia unei culori vişinii. Culoarea dispare la cald.

Reacţii de precipitare ale proteinelor

Principiu:

Proteinele sunt precipitate de acizi minerali (H2SO4, HNO3, HCl) sau organici

(acid tricloracetic, tanic, ferocianic, sulfosalicilic), soluţii concentrate de săruri (sulfat de

sodiu, sulfat de amoniu, etc.), alcooli (metanol, etanol, etc.), acetonă, ioni de metale grele

(săruri de argint, mercur, cupru, plumb), încălzire. Precipitarea poate fi reversibilă sau

ireversibilă.

Precipitarea salină

Principiu:

Proteinele sunt macromolecule hidratate în soluţie apoasă. Dacă sărurile metalelor

uşoare sau de amoniu (sulfat de amoniu, sulfat de sodiu, clorură de sodiu, sulfat de

magneziu) adăugate soluţiilor proteice ating o anumită concentraţie, deshidratează

particulele proteice, care precipită. Precipitatul de proteină obţinut prin precipitare salină

poate fi redizolvat prin micşorarea concentraţiei sării (prin dializă, diluare), deci este o

precipitare reversibilă.

58

Deoarece proteinele precipită la concentraţii diferite de săruri, precipitarea salină

(salting-out) poate fi folosită şi pentru fracţionarea proteinelor. Astfel globulinele

precipită în soluţii semisaturate de sulfat de amoniu, iar albuminele numai în soluţii

saturate de sulfat de amoniu.

Reactivi: - Sol. de proteină (ser sanguin uman, bovin sau cabalin)

- Sol. saturată de (NH4)2SO4

- (NH4)2SO4 solid

- NaCl solid

- MgSO4 solid

- Acid acetic glacial

Mod de lucru:

Într-o eprubetă se toarnă 3 ml soluţie de proteină. Se adaugă acelaşi volum de

soluţie saturată de sulfat de amoniu. Astfel obţinem o soluţie semisaturată de (NH4)2SO4.

După câteva minute precipită globulinele. Precipitatul se separă prin filtrare. Filtratul

conţine albuminele. Se pune în filtrat sulfat de amoniu solid până la saturare (când noi

cantităţi de sare nu se mai solvă). În această soluţie vor precipita albuminele.

În două eprubete se toarnă câte 3 ml soluţie de proteină. Într-una din eprubete se

adaugă NaCl, în cealaltă MgSO4, până la saturare. După câteva minute în ambele eprubete

precipită globulinele. Precipitatul se filtrează. Filtratul conţine albuminele deoarece

sărurile adăugate nu precipită albuminele în soluţie neutră. Filtratul se acidulează cu

câteva picături de acid acetic glacial. În această soluţie slab acidă precipită albuminele.

Precipitarea cu ionii metalelor grele

Principiu:

Proteinele cu sărurile metalelor grele (plumb, cupru, mercur, argint, etc.) formează

combinaţii greu solubile. Precipitarea se produce deja la concentraţii mici de săruri şi

precipitatul obţinut în acest caz nu se mai dizolvă după micşorarea concentraţiei sării prin

diluare sau dializă, deci este o precipitare ireversibilă.

Reactivi: - Sol. de HgCl2 10%

- Sol. de CuSO4 10%

- Sol. de Pb(CH3COO)2 10%

- Sol. de AgNO3 5%

59

Mod de lucru:

În 4 eprubete se toarnă câte 1 ml soluţie de proteină. În fiecare eprubetă se adaugă

picătură cu picătură soluţie din fiecare reactiv. În toate eprubetele se formează precipitate.

Acetatul de plumb şi sulfatul de cupru nu trebuiesc adăugate în exces, deoarece

precipitatul format se solvă în exces de reactiv (salting-in).

Precipitarea cu acizii minerali

Reactivi: - HNO3 conc.

- HCl conc.

- H2SO4 conc.

Mod de lucru:

În 3 eprubete se toarnă câte 1 ml de acid azotic, clorhidric respectiv sulfuric. În

fiecare eprubetă se stratifică cu precauţie câte 1 ml din soluţia de proteină. La suprafaţa de

separare dintre cele două soluţii se obţin precipitate albe sub formă de disc (inel). Apoi

eprubetele se agită. Precipitatele formate se dizolvă în exces de acid clorhidric şi sulfuric,

dar nu şi în exces de acid azotic. Precipitarea proteinelor cu acid azotic concentrat

serveşte pentru punerea în evidenţă a proteinelor din urină patologică.

Precipitarea cu acizi organici

Acidul tricloracetic şi acidul sulfosalicilic sunt reactivii specifici pentru

precipitarea proteinelor. Acidul tricloracetic este foarte adecvat pentru deproteinizarea

lichidelor biologice (de ex. ser sanguin), deoarece precipită numai proteinele din soluţie,

nu şi produşii de degradare ai acestora. Se mai foloseşte ca precipitant amestecul de acid

picric cu acid citric (reactiv Esbach), util în determinarea cantitativă a proteinelor.

Reactivi: - Sol. de acid sulfosalicilic 20%

- Sol. de acid tricloracetic 10%

- Sol. de acid picric 1,2%

Mod de lucru:

Într-o eprubetă la 1-2 ml soluţie de proteină se adaugă câteva picături de reactiv.

Se formează un precipitat abundent.

60

Precipitarea prin încălzire

Principiu:

Proteinele la încălzire coagulează. Coagularea este cea mai rapidă la punctul

izoelectric. În mediu puternic acid sau bazic proteinele nu coagulează la încălzire,

deoarece sarcina electrică le conferă o mai mare stabilitate în stare dizolvată.

Reactivi: - Sol. de CH3COOH 1%

- Sol. de CH3COOH 10%

- Sol. de NaOH 10%

- NaCl crist.

Mod de lucru:

În 5 eprubete se toarnă câte 1-2 ml soluţie de proteină. Se adaugă reactivi conform

tabelului.

Nr. eprubetei Adaos1. …………………………. -2. …………………………. 2-3 pic. acid acetic 1%3. …………………………. 10-15 pic. acid acetic 10%4. …………………………. 10-15 pic. acid acetic 10% + NaCl (câteva cristale)5. …………………………. 10-15 pic. NaOH 10%

Aceste eprubete se supun încălzirii şi se observă apariţia precipitatelor.

Dozarea aminoacizilor monoamino-monocarboxilici prin metoda Sörensen

Principiu:

Aminoacizii au o structură amfiionică. Din această cauză soluţiile lor, datorită

capacităţii de tamponare, micşorează saltul de pH la adaosul de acid sau bază sare. În

consecinţă aminoacizii nu pot fi titraţi prin metode acidimetrice sau alcalimetrice curente.

Adăugându-se soluţiei de aminoacid un exces de formaldehidă, se blochează

gruparea amoniu. Rezultă o bază Schiff, care se comportă ca un acid slab (carboxilic).

Aciditatea grupării carboxilice se titrează cu NaOH, în prezenţa fenolftaleinei ca

indicator.

R - CH - COO- + H2C = O R - CH - COO- + H2O + H+

I I

NH3+ N = CH2

Bază Schiff

61

R - CH - COO- + H+ + NaOH R - CH - COO-Na+ + H2O I I N = CH2 N = CH2

Reactivi: - Sol. de NaOH N/10 cu factorul FNaOH

- Fenolftaleină 0,1% în soluţie alcoolică

- Formaldehidă (substanţa este foarte reactivă, se autooxidează,

deci conţine şi acid formic ca impuritate. Prezenţa acestui acid ar

da eroare la titrare. Din acest considerent formaldehida este

alcalinizată cu NaOH în prezenţă de fenolftaleină până la virajul

indicatorului).

Mod de lucru:

În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10,0 ml soluţie probă de aminoacid (pH

≈ 6). Trebuie adusă şi această soluţie la pH = 9, de aceea se pun câte 3 picături de

fenolftaleină şi se adaugă picătură cu picătură sol. de NaOH până la apariţia culorii roz.

Acest volum de NaOH folosit nu se ia în considerare la calcul. În fiecare balon se adaugă

câte 2 ml soluţie de formaldehidă, sub acţiunea căreia soluţia devine acidă (pH ≈ 3).

Astfel dispare culoarea roz, soluţia devenind incoloră. Fiecare soluţie se titrează cu soluţie

de NaOH până la virajul indicatorului. Variaţiile de pH sunt reprezentate pe următoarea

schemă:

62

pH 14

9

6

3

0

Alcalini-zare

+CH2O Titrare cu NaOH

Calcul:

Întrucât se lucrează cu un aminoacid oarecare monoamino-monocarboxilic sau cu

un amestec de aminoacizi monoamino-monocarboxilici, nu putem folosi greutatea

moleculară la calcul. Din acest considerent rezultatul se exprimă în mg % azot alfa-

aminic sau în mmoli N aminic/l. Dacă volumul mediu de titrare a probelor se notează cu

Vm, calculul este următorul:

1 ml NaOH 0,1 N . . . . . . . . . . . .1,4 mg N aminic

Vm × FNaOH . . . . . . . . . . . . . . X mg . . . . . . 10 ml probă

Y mg . . . . . .100 ml probă

100

Y = 10 × X mg N % = × X mmoli N aminic/l. 14

Identificarea nucleoproteinelor

Principiu:

Scheletul structural al acizilor nucleici este construit din baze azotate, pentoze şi

acid fosforic. Prin hidroliză acidă aceste aceste subunităţi se eliberează şi pot fi puse în

evidenţă

Reactivi: - Sol de H2SO4 5%

- Sol. de NH3 10%

- HNO3 conc.

- Sol. de molibdat de amoniu

- Sol. amoniacală de AgNO3

- Reactiv Bial

- HCl conc.

Modul de lucru:

a) Hidroliza: într-un balon cu fund rotund se introduc 5-10 g drojdie de bere, la

care se adaugă 40 ml H2SO4 5%. Se astupă balonul cu un dop prevăzut cu un refrigerent

ascendent şi se fierbe 60-90 minute. O parte din hidrolizat se filtrează şi se împarte în 3

eprubete în care se identifică părţile componente ale acizilor nucleici.

b) Identificarea pentozelor: în prima eprubetă se adaugă 10 picături reactiv Bial şi

2 ml HCl conc. Se agită conţinutul eprubetei se astupă cu un dop de vată şi se lasă pe o

63

baie de apă ce fierbe timp de 10 minute. Conţinutul eprubetei se colorează în albastru

verde.

c) Identificarea H3PO4: In a doua eprubetă se adaugă soluţie de NH3 până la

reacţia slab alcalină, apoi câteva picături de HNO3 conc., 1 ml soluţie de molibdat de

amoniu. La încălzire se obţine un precipitat galben de fosfomolibdat de amoniu.

d) Identificarea nucleobazelor: în a treia eprubetă se adaugă soluţie de NH3 până

la reacţia alcalină, se filtrează şi se adaugă cca. 1 ml soluţiei amoniacală de AgNO3. După

câtva timp se formează un precipitat floconos galben-brun de săruri ale bazelor purinice.

Identificarea bazelor purinice din hidrolizat se poate face şi cu ajutorul reacţiei

murexidului. Murexidul este un colorant provenit din produsul de oxidare cu HNO3 conc.

a bazelor purinice şi amoniac.

Modul de lucru:

1-2 picături din soluţia de analizat se usucă pe o placă de porţelan pe baie de apă.

Cu baghetă se adaugă o picătură de HNO3 conc. După evaporare se atinge cu o baghetă

înmuiată în amoniac. Apare o coloraţie roşie care se schimbă spre albastru violaceu când

se adaugă o picătură de NaOH.

Vitamine

Identificarea vitaminelor prin metoda cromatografică

Princi piu:

Cromatografia este o metodă fizico-chimică de separare a componenţilor unui

amestec, care utilizează fenomenele ce au loc la interfaţa a două faze. Ea poate fi folosită

în scopuri analitice sau preparative. Pe suprafaţa dintre două faze dintre care una este

staţionară (faza solidă sau lichidă adsorbită pe un material poros) şi una mobilă (solvent

lichid sau gaz) pot avea loc fenomene de adsorbţie, schimb de ioni sau partiţie între două

faze lichide nemiscibile.

Faza staţionară la cromatografia în strat subţire este constituită dintr-un strat de

silicagel sau oxid de aluminiu în stare dispersă depus pe o lamă de sticlă. Developarea se

face cu un solvent apolar (benzen, toluen, petrol) sau un amestec de solvenţi apolari.

Dacă substanţele cromatografiate sunt incolore, decelarea petelor (spoturilor)

formate pe placa cromatografică se face cu ajutorul unor reactivi care dau reacţii de

culoare cu substanţele amintite.

64

Identificarea componenţilor se poate face:

- prin decuparea spoturilor şi analiza lor ulterioară prin metode chimice sau fizice.

- prin aplicarea simultană pe placă a substanţelor etalon, spotul format de o anumită

substanţă cunoscută se va găsi după developare la aceeaşi distanţă de punctul de start ca

şi acela dat de componentul identic din amestec.

- prin determinarea valorii (raportul dintre distanţa parcursă de spot şi de frontul

solventului în acelaşi interval de timp) Rf este caracteristic pentru fiecare substanţă în

condiţii de lucru standardizate.

Modul de lucru:

a) Pregătirea plăcii cromatografice

Se prepară prin agitarea silicagelului în alcool etilic (2 g silicagel, 6 ml alcool) o

suspensie care se toarnă pe suprafaţa unei plăci de sticlă. Prin mişcarea plăcii se întinde

cât mai uniform suspensia şi se continuă mişcarea plăcii până când prin evaporarea

alcoolului mobilitatea suspensiei scade şi suspensia rămâne nemişcată. După uscarea

completă a plăcii laturile longitudinale se şterg pe o lăţime de 0,5 cm.

b) Aplicarea amestecului de analizat

La o distanţă de 1 cm de la unul din capetele plăcii, cu ajutorul unei capilare se

aplică soluţia de cercetat precum şi soluţiile etalon din vitamine urmărite. Diametrul

maxim admis al probelor aplicate este cca. 5 mm. Cantitatea minimă de vitamină aplicată

este aproximativ 3 µg.

c) Developarea

Plăcile se introduc într-un vas cu toluen cu capătul pe care s-au aplicat soluţiile,

aşezat în solvent. Placa în timpul developării are o poziţie înclinată la 20-30º faţă de

orizontală. Solventul migrează prin capilaritate de-a lungul stratului de adsorbant. Pentru

a împiedica evaporarea, cromatografia se face într-o atmosferă saturată cu vaporii

solventului, adică vasul este ermetic închis.

d) Localizarea petelor

După uscarea plăcilor, componentele migrate sunt evidenţiate cu ajutorul unui

strat subţire de H2SO4 98% turnat pe placă cu ajutorul unei pipete în aceeaşi parte în care

au fost aplicate probele. Poziţia plăcii trebuie să asigure deplasarea acid sulfuric în sensul

în care s-a făcut developarea. Vitaminele liposolubile în contact cu acid sulfuric se

65

colorează astfel: vitamina A – albastru-violet, β - carotenul – albastru, vitamina D2 –

galben-portocaliu, vitaminele E, K1, K2, K3 – brun.

Dozarea iodometrică a acidului ascorbic din urină

(metoda Palladin)

Principiu:

Acidul ascorbic este oxidat în mediu acid de I2 la acid dehidroascorbic

Iodul necesar oxidării rezultă din interacţiunea KIO3 cu KI în mediu acid.

După oxidarea completă a vitaminei C iodul în exces dă o culoare albastră în

prezenţa amidonului.

Reactivi: - soluţie HCl 2%;

- soluţie KI 0,1N;

- soluţie KIO3 0,004N;

- soluţie amidon 0,5%.

Modul de lucru:

Se cântăreşte 1 g din produsul vegetal de analizat (ace de brad, fructe de măceşe,

etc.) şi se triturează cu o soluţie de HCl 2% şi 5g nisip de cuarţ spălat prealabil cu HCl.

Triturarea începe cu o mică cantitate de HCl. După aceea masa omogenă se pune într-un

vas de 50ml, se spală mojarul cu acid clorhidric 2% şi după introducerea soluţiei de

spălare în vasul cotat, se aduce la semn cu HCl 2%. Lichidul se lasă să se limpezească,

decantează şi se filtrează prin vată. Primii 10ml se aruncă.

Când se lucrează cu urină se iau 10ml urină în vasul gradat, se aduce la cotă cu HCl

2%, se amestecă şi se filtrează.

66

O

C

HC

+ I 2

HO C

CHO

HO CH

CH 2OH

O O

CH 2OH

CHHO

C

C

HC

C

O

O

O + 2HI

10 ml din filtrat se pun într-un flacon conic, se adaugă 30ml apă distilată, 5ml

soluţie de iodură de potasiu şi 5ml HCl 2%. Se titrează cu o soluţie de iodat de potasiu

0,004N folosind ca indicator amidon. Culoarea albastră trebuie să se menţină 30 secunde.

Calculul: se efectuează ţinând cont de faptul că 1ml soluţie KIO3 0,004N

corespunde la 0,352mg acid ascorbic (M. acid ascorbic =176). Rezultatul se raportează la

100g produs analizat sau la cantitatea de urină eliminată in 24 ore.

Valori normale 50-150 μmol/zi (10-30mg/zi). Variaţiile lor nu sunt concludente

din punct de vedere clinic. De aceea se foloseşte proba încărcării cu acid ascorbic.

Se administrează intravenos 1000mg acid ascorbic şi după ce se colectează urină

timp de 5 ore, adăugând la fiecare fracţiune de urină câte 10% acid acetic glacial.

În mod normal se elimină in 5 ore cel puţin 400mg acid ascorbic. O eliminare mai

scăzută pledează pentru hipovitaminoză sau avitaminoză C.

Enzime

Introducere

Enzimele, biocatalizatori proteici, sunt produse de materia vie şi prezenţa lor este

necesară pentru desfăşurarea reacţiilor chimice în toate sistemele biologice. Enzimele au

şi însuşiri ale catalizatorilor utilizaţi în reacţiile chimice din lumea nevie. Ele sunt însă

superioare acestor catalizatori în mai multe privinţe:

a) Asigură reacţiilor chimice pe care le catalizează viteze cu câteva ordine de

mărime mai mari,

b) Reacţiile pe care le catalizează au loc în condiţii blânde: temperatură sub 50°C,

presiune atmosferică, pH în jurul valorii 7, forţă ionică moderată. Comparativ,

catalizatorii chimici acţionează la temperaturi ridicate, presiuni mari şi valori extreme de

pH;

c) Au specificitate foarte mare ceea ce asigură ca în reacţiile pe care le catalizează

să nu participe decât substraturile pentru care enzimele sunt specifice.

Multe enzime au şi însuşiri neîntâlnite la catalizatorii chimici cum sunt:

a) Activitatea lor poate fi reglată (mărită sau micşorată) de anumiţi efectori;

b) Catalizează reacţii endergonice imposibile d.p.d.v. termodinamic prin transferul

energiei libere necesare de la reacţii exergonice.

Cinetica enzimatică studiază viteza reacţiilor catalizate de enzime în funcţie de

concentraţia substratului [S], de concentraţia enzimei [E] şi de influenţele unor factori

67

fizico-chimici cum sunt: temperatura, pH-ul, cofactori, etc. Concepţia unanim admisă în

enzimologie că formarea din substrat a produsului de reacţie implică existenţa

complexului enzimă-substrat (ES), redată prin ecuaţia:

K1 K3E + S ⇔ ES ------> E + P,

K2

a fost statuată în primul rând ţinând cont de alura dependenţei vitezei reacţiilor catalizate

de enzime de concentraţia de substrat (Leonor Michaelis şi Maud Menten, 1913).

Din punct de vedere al localizării enzimele se clasifică în:

Enzimele secretate cu rol activ în plasmă, ca de exemplu:

a) enzimele plasmatice funcţionale, produse în special în ficat (ceruloplasmina)

b) enzimele coagulării, lipoproteinlipaza (LPL), lecitin-colesterol-aciltransferaza

(LCAT).

Nivelul lor plasmatic scade cu lezarea celulelor producătoare.

Enzimele secreto-excretate, provenind din glandele exocrine şi pancreas. Ele sunt

excretate şi acţionează la nivelul tubului digestiv, de exemplu amilaza, lipaza, tripsina.

Activităţile lor cresc în plasmă prin lezarea celulelor de origine sau prin prezenţa unui

obstacol la nivelul căilor excretorii precum şi prin creşterea permeabilităţii membranei

celulelor secretorii;

Enzimele celulare cu loc de acţiune în celulele din care provin, a căror activitate

plasmatică creşte prin lezarea celulelor de origine. Exemple sunt glutamic-oxalacetic

transaminaza (GOT), glutamic-piruvic transaminaza (GPT), lactat dehidrogenaza (LDH),

fosfataza alcalină şi acidă, creatin kinaza (CK), etc.

Concentraţia majorităţiilor enzimelor celulare este constantă în timp. Fac excepţie

enzimele inductibile/represibile şi enzimele plasmatice funcţionale intracelular cum ar fi

CK (creatin kinaza), GOT, LDH, GPT, GDH (glutamat dehidrogenaza), γGT (γ-glutamil-

transaminaza), SDH (sorbitoldehidrogenaza), OTC (ornitin transcarba-milaza) fosfatazele

acidă şi alcalină, ale căror concentraţii cresc sau scad în anumite stări patologice (leziuni

de ţesut).

Din punct de vedere medical, enzimologia contribuie astăzi în măsură hotărâtoare

la cunoaşterea cauzelor a numeroase boli, diagnosticul şi urmărirea evoluţiei acestora,

elaborarea pe baze ştiinţifice a medicamentelor.

68

Influenţa concentraţiei substratului asupra

vitezei de reacţie enzimatică

Concentraţia substraturilor celor mai multe enzime variază destul de mult în

funcţia de starea metabolică a ţesutului şi de alţi factori. Dependenţa vitezei de reacţie de

concentraţia substratului constituie aspectul cel mai important al cineticii enzimatice. Una

din principalele mărimi ale cineticii enzimatice este activitatea enzimatică.

Pentru exprimarea activităţii enzimatice se folosesc în prezent mai multe sisteme

de unităţi ceea ce îngreunează interpretarea rezultatelor. Uniunea Internaţională de

Biochimie recomandă exprimarea activităţii enzimelor în mod unitar, în ”unităţi

internaţionale” (UI sau U). Unitatea internaţională de activitate enzimatică reprezintă

cantitatea de enzimă care transformă un µmol de substrat într-un minut, la 25 ºC, în

condiţii optime (concentraţia maximală a substratului, forţa ionică a tamponului, pH

optim).

1UI = 1 µmol substrat /min.

Conform SI unitatea de măsură a activităţii enzimatice este katalul.

1 katal = 1 mol substrat / sec

Se folosesc subunităţile ( m, µ, n, p) katalului. În determinările pe lichide

biologice se raportează activitatea enzimei la 1000 ml (vezi tabelul „limitele valorilor

normale. Se foloseşte de asemenea exprimarea şi în miliunităţi internaţionale pe mililitru

(mU/ml) ceea ce de fapt nu modifică valorile numerice respective. Chiar şi atunci când se

utilizează UI, apar diferenţe ale valorilor limitelor normale, datorită varietăţii metodelor

folosite pentru determinări.

Principiu:

Pentru o cantitate dată de enzimă, viteza,v, a reacţiei enzimatice creşte odată cu

creşterea concentraţiei substratului [S], până când întreaga cantitate de enzimă se

saturează cu substrat. Se atinge astfel viteza

maximă,vmax, care nu va fi depăşită chiar dacă

în continuare concentraţia substratului va

creşte, în cazul în care substratul în exces nu

inhibă propria enzimă. Acest principiu este

descris de ecuaţia Michaelis-Menten (pentru

deducere vezi cursurile de biochimie):

69

[ ][ ]SK

Svv

M += max unde KM, constanta lui Michaelis.

Reprezentarea grafică a lui v în funcţie de [S] (temperatura, pH-ul şi [E] fiind

constante) este o curbă cu alură hiperbolică. Din analiza curbei reiese că v creşte liniar cu

creşterea [S] numai pentru valori mici ale acesteia, apoi creşterea se face tot mai lent

pentru ca la concentaţii mari de substrat, viteza reacţiei să rămână constantă. Fiecare

enzimă se caracterizează prin valorile particulare KM şi vmax ale lor.

Determinarea constantei lui Michaelis pentru urează

Principiu:

În determinarea experimentală se va folosi ca substrat ureea şi ca enzimă ureaza

din boabe de soia. Ureaza catalizează următoarea reacţie:

Viteza de reacţie este proporţională cu cantitatea de amoniac eliberat în unitatea de timp

(1min). Aceasta se determină prin titrare cu o soluţie de HCl cu factor cunoscut.

HCl + NH3 ---------> NH4Cl

Cunoscând concentraţiile substratului din probe care se consideră constante pe parcursul

fazei de incubaţie şi calculând vitezele de reacţie, exprimate în µmoli uree transformaţi

într-un minut, pe baza datelor titrimetrice se face reprezentarea grafică (v, [S]) din care se

poate calcula KM pentru urează.

Reactivi: - Soluţie de uree 0,1 M- Soluţie de uree 1,0 M

- Soluţie de urează: fie o soluţie de enzimă cristalizată, fie o

suspensie de făină de soia. Se păstrează în frigider.

- Soluţie de tampon fosfat 0,1 M, pH=7

- Soluţie de CuSO4 5%

- Indicator roşu de metil 0,1% în soluţie alcoolică

70

O=CNH2

H2O CO2+ 2NH 3ureazã

+NH2

Modul de lucru:

Conform tabelului se prepară o serie de 6 probe introducându-se în toate aceeaşi

cantitate de enzimă şi soluţii de concentraţii crescătoare ale substratului. În tabel vor fi

consemnate pe baza datelor experimentale (titrimetrice) şi a efectuării calculelor, valorile

ai , m

şi vi (i=1,6).

În proba martor se inactivează enzima, înainte de a se introduce substratul,

adăugând 5 picături soluţie CuSO4 5%. Reacţiile chimice (în cazul probelor 1-6),

declanşate în momentul amestecării enzimelor cu substratul, sunt lăsate să se desfăşoare

timp de 25 min., apoi sunt întrerupte prin adaosul inhibitorului, adică a câte 5 picături

soluţie CuSO4. Se măsoară în fiecare probă cantitatea de NH3 format, prin titrarea cu

soluţie de HCl în prezenţa indicatorului roşu metil (3 picături) care virează de la galben

la roşu. Culoarea galben dată de indicator, înaintea virajului, se datorează amestecului

coloristic cu culoarea albastră dată de ionii Cu2+ hidrataţi.

Calculul:

1mol HCl........................................1 mol NH3..................1/2moli uree

1000 ml HCl N/20............................................. ........._____1_____moli uree 2.20 (ai-m)

ml..............................................................................xi____________

xi = (ai-m)•25 µmoli uree transformaţi în 25 minute

vi = (ai-m)•25/25 = ai-m µmoli uree/ 1 min.

Reprezentarea grafică

Pe un sistem rectangular de axe de coordonate trasat pe hârtie milimetrică se

aplică pe ordonată o scară a valorilor vitezelor de reacţie. Pe abscisă se trec concentraţiile

molare ale ureei din cele şase probe menţionate în tabel. Se reprezintă grafic punctele (vi,

[S]). Curba hiperbolică se trasează printre punctele experimentale. Porţiunea dreaptă,

paralelă cu abscisa (corespunzătoare saturării E cu S), se prelungeşte până la intersecţia

cu ordonata, intersecţia corespunzând valorii vmax. La valoarea vmax/2, se duce o dreaptă

paralelă cu abscisa până la intersecţia cu curba şi de la această intersecţie se duce o

dreaptă paralelă cu ordonata până la intersecţia cu abscisa. Acest punct corespunde valorii

KM (concentraţia de substrat corespunzătoare semi-vitezei maxime). Ea este într-o primă

71

aproximaţie constanta de disociere a complexului enzimă-substrat (urează-uree). Deci, se

stabilesc (1) vmax, (2) vmax/2 şi (3) KM.

72

Interpretarea rezultatelor

Valorile mari ale KM corespund unei legături slabe între E şi S iar valorile mici ale

KM corespund unei legături puternice între E şi S. Valorile lui KM pentru diverse enzime

sunt cuprinse între 10-1- 10-6 moli/litru. În cazul ureazei, KM∼ 10-2 moli/litru ceea ce

plasează această enzimă în rândul celor cu afinitate (constantă de stabilitate a complexului

E-S) mică faţă de substrat.

Determinarea activităţii catalazei sanguine

Principiu: Catalaza din sânge este o oxidoreductază foarte activă, care

descompune apa oxigenată, în apă şi oxigen molecular: 2 H2O2 → 2 H2O + O2

Activitatea ei se determină prin dozarea apei oxigenate rămasă nedescompusă

într-un sistem cu concentraţia iniţială a H2O2 cunoscută. Este o metodă indirectă: catalaza

dintr-un microlitru de sânge acţionează asupra unei cantităţi determinate de apă

oxigenată; excesul de apă oxigenată se dozează prin titrare cu KMnO4 în mediu acid; din

diferenţă se calculează numărul catalazic.

+7 -1 +2 0

2 KMnO4 + 5 H2O2 + 3 H2SO4 → 2 MnSO4 + K2SO4 + 8 H2O + 5 O2

+7 + 5e +2

Mn ―――→ Mn -2 - 2e 0

O2 ―――→ O2

Reactivi: - Sânge diluat 1‰ (v/v)

- Soluţie de H2O2 2%

- Soluţie de H2SO4 20%

- Soluţie de KMnO4 N/10 cu factorul FKMnO4 cunoscut

Mod de lucru: În patru flacoane Erlenmeyer se pipetează:Proba 1 Proba 2 Martor 1 Martor 2

Apă distilată (ml) 2 2 2 2Sânge diluat (ml) 1 1 1 1

- - se fierbe şi se răceşteApă oxigenată (ml) 2 2 2 2

Repaus 30’ la temperatura camereiAcid sulfuric (ml) 5 5 5 5

Titrare cu KMnO4 până la roz slab stabil (ml) b1 b2 a1 a2

Media =b1 +b2 / 2 = bm Media =a1 +a2 / 2 = am

73

x 2

x 5

Calculul:

Volumul mediu de titrare pentru probe (bm) este mai mic decât cel pentru martori (am) deoarece catalaza descompune o parte din apa oxigenată din probe.

1ml KMnO4 N/10----------------------------------------------------------1,7 mg H2O2

(am-bm)FKMnO4 --------------------------------------------------------------x

x = (am-bm)FKMnO4 • 1,7 mg H2O2 descompuse de catalaza din 1 ml sânge diluat

1/1000 (1µl sânge integral). Această valoare se numeşte număr catalazic.

Interpretarea rezultatelor

Valorile normale ale numărul catalazic (cifre catalazice) sunt cuprinse înte 14-18.

Acatalazemia este o deficienţă înnăscută, a catalazei din eritrocite şi alte ţesuturi,

având ca principal simptom gangrena cavităţii bucale. Dacă se face concomitent şi

hemograma, se poate calcula şi Indicele catalazic = (am-bm)FKMnO4 • 1,7 / nr. globule roşii

(în milioane).

Indicele catalazic este cel care are valoare de diagnostic. Este scăzut în cancer,

anemie, caşexie şi în 80 % din afecţiunilor hepatice.

Determinarea activităţii transaminazelor

(metoda colorimetrică cu 2,4-dinitrofenilhidrazină)

Principiu:

Transaminazele catalizează reacţia de transfer a grupării amino de la un alfa-

aminoacid la un alfa-cetoacid. Transaminazele cu cea mai mare importanţă clinică sunt:

glutamic-oxalacetic-transaminaza (GOT, aspartat aminotransferaza-AST) şi glutamic-

piruvic-transaminaza (GPT, alanin aminotransferaza-ALT). Acestea catalizează

următoarele procese reversibile:

oxaloacetat

aspartat

glutamat

α cetoglutarat

piruvat

alanină

GOT(AST)

GPT(ALT)

74

GOT este o enzimă localizată în proporţie de 60% în citoplasmă şi 40% în

mitocondrii, în special în muşchiul scheletic, miocard şi ficat. În reacţia catalizată de

GOT se foloseşte ca substrat amestecul aspartat-α-cetoglutarat din care rezultă oxalacetat

şi glutamat. Oxalacetatul se decarboxilează spontan trecând în piruvat. Piruvat rezultă şi

din reacţia catalizată de GPT având ca substrat amestecul alanina-α-cetoglutarat

Piruvatul rezultat din aceste reacţii reacţionează cu 2,4-dinitro-fenil-hidrazina în mediu

alcalin dând dinitro-fenil-hidrazona corespunzătoare de culoare roşie, care se determină

fotometric:

Datorită faptului că şi ceilalţi alfa-cetoacizi prezenţi (alfa-cetoglutarat) formează

fenil-hidrazone, cu absorbţii la diferite lungimi de undă, se măsoară extincţia dinitro-

fenil-hidrazonei piruvatului la lungimea de undă de 520 nm unde fenil-hidrazona alfa-

cetoglutaratului absoarbe slab.

Intensitatea coloraţiei produse este proporţională cu intensitatea activităţii

enzimei. Activitatea transaminazelor se calculează în funcţie de cantitatea de acid piruvic

care se formează într-un minut.

Reactivi: - Substrat GOT: 1,50 g K2HPO4, 0,20 g KH2PO4, 0,039 g alfa-

cetoglutarat de sodiu (sau 0,030 g acid alfa-cetoglutaric) şi 1,57 g

aspartat de sodiu (sau 1,32 g acid aspartic) se dizolvă în aproximativ

80 ml apă bidistilată. Se ajustează cu NaOH 0,4N pH-ul soluţiei la 7,4

apoi se completează volumul la 100 ml cu apă bidistilată.

- Substrat GPT: 1,50 g K2HPO4, 0,20 g KH2PO4, 0,030 g acid alfa-

cetoglutaric (sau 0,039 g alfa-cetoglutarat de sodiu) şi 1,78 g alanină

se dizolvă în aproximativ 80 ml apă bidistilată, se aduce pH-ul la 7,4

cu NaOH 0,4N, apoi se completează la 100 ml cu apă bidistilată.

- Soluţie de 2,4-dinitro-fenil-hidrazină 1 mM în HCl 2M: se dizolvă

19,8 mg dinitro-fenil-hidrazină în 10 ml HCl (d = 1,19 g/cm3) şi se

completează la 100 ml cu apă bidistilată.

75

- Soluţie standard de piruvat de sodiu 2 mM: se dizolvă în 100 ml apă

bidistilată 22 mg piruvat de sodiu (1 ml soluţie conţine 2 µmoli

piruvat). Se adaugă 0,3 ml cloroform pentru conservare.

- Soluţie NaOH 0,4N

Modul de lucru:Atât pentru GOT cât şi pentru GPT se pregătesc câte trei eprubete: probă (P),

standard (S) şi blanc (B).

GOT GPT

P S B P S BSol.substrat GOT (ml) 0,5 0,5 0,5 - - -Sol.substrat GPT (ml) - - - 0,5 0,5 0,5

Se incubează 5 minute la 37°CSer (ml) 0,1 - - 0,1 - -Sol.standard PIR (ml) - 0,1 - - 0,1 -Se incubează la 37°C 60 minute 30 minuteSol.2,4-dinitrofenilhidrazină (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5Ser (ml) - - 0,1 - - 0,1Sol.NaOH 0,4 N (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Se omogenizează conţinutul eprubetelor şi după 5 minute se citeşte extincţia

probelor (EP) şi a standardului (ES) faţă de blanc, la 520 nm, în cuva de 1 cm.

Calcul:

Ştiind că soluţia standard conţine 0,2 µmoli piruvat /0,1 ml se calculează

cantitatea de piruvat rezultat din reacţia pentru fiecare enzimă şi se exprimă activitatea

enzimatică în µmoli piruvat format/min./1000 ml ser (în condiţiile de lucru) şi se notează

cu X:

Pentru GOT: X=(EP/EB) • 0,2 • (1/60) • (1/0,1) • 1 000 µmoli piruvat

Pentru GPT: X=(EP/EB) • 0,2 • (1/30) • 1 000 µmoli piruvat

Activitatea enzimatică reală nu este dată direct de valoarea obţinută colorimetric,

deoarece hidrazona colorată se formează şi cu alfa-cetoglutarat din substrat, iar pe de altă

parte, condiţiile nu sunt cele optime (37°C în loc de 25°C şi prezenţa alfa-cetoglutaratului

care formează hidrazonă). S-au calculat tabele de corecţie prin comparaţie cu datele

76

obţinute cu metoda de referinţă, care exprimă activitatea enzimatică reală, măsurând

spectrofotometric în UV transformarea NADH + H+ in NAD+, în prezenţa enzimelor

indicatoare: malat-dehidrogenaza (MDH) în amestec cu GOT şi lactat-dehidrogenaza

(LDH) în amestec cu GPT.

Reacţiile enzimatice sunt următoarele:

GOT

alfa-cetoglutarat + L-aspartat --------------> L-glutamat + oxalacetat

MDH

oxalacetat + NADH + H+ ----------------> L-malat + NAD+

GPT

alfa-cetoglutarat + L-alanina --------------> L-glutamat + piruvat

LDH

piruvat + NADH + H+ ----------------> L-lactat + NAD+

Din tabelul de corecţie se citeşte activitatea enzimatică reală (determinată prin metoda

enzimatică) exprimată în Unităţi Internaţionale (UI = µmoli/min./l, 25°C) care corespunde

valorilor X calculate.

UI UI UI UIX GOT GPT X GOT GPT X GOT GPT X GOT GPT2 2 1 26 23 9,5 54 60 23 80 384 3 2 28 25 10 56 24 82 396 5 2,5 30 27 11 58 25 84 408 6 3 32 29 12 60 26 86 4210 7 4 34 31 13 62 27 88 4412 9 4,5 36 33 14 64 29 90 4614 11 5 38 35 15 66 30 92 4816 13 6 40 37 16 68 31 94 5018 15 7 42 39 17 70 33 96 5220 17 7,5 44,46 41,44 18,19 72 34 98 5422 19 8 48 47 20 74 35 100 5623 20 8,5 50 51 21 76 36 102 6024 21 9 52 55 22 78 37

Observaţii:

1. Dacă activitatea enzimatică depăşeşte 60 UI se va repeta determinarea cu incubaţie

scurtă: 20 de minute pentru GOT si 10 minute pentru GPT. Rezultatele obţinute se vor

înmulţi cu 3. Este de preferat ca în locul scurtării timpului de incubaţie să se facă

77

diluţii ale serului 1:5, 1:10, 1:20 în apă distilată şi se reia cu fiecare diluţie tehnica de

lucru de la început. La calcul se ţine seama de diluţie.

2. Sticlăria utilizată trebuie să fie perfect curată, spălată în final cu multă apă distilată,

deoarece urme de detergenţi pot inhiba considerabil activitatea enzimatică.

Interpretarea valorilor obţinute

Valori normale: GOT: Adulţi: 2-20 UI. Copii sub 3 luni: până la 40 UI

GPT: Adulţi: 2-16,5 UI. Copii până la 5 ani: 0,2-13 UI

Valori patologice: În cazul leziunilor celulare mai uşoare creşte activitatea GPT,

ea fiind o enzimă citoplasmatică, iar în cazul leziunilor mai grave creşte şi activitatea

GOT (GOT este prezentă şi în microsomi)

GOT : - creşteri marcate ( 10-100 ori ) în: infarct miocardic, hepatită virală acută,

necroza toxică a ficatului

- creşteri moderate în: hepatite cronice, icter mecanic, mononucleoza infecţioasă,

anemii hemolitice, boli ale musculaturii striate

GPT: - creşteri marcate ( ~ 100 ori ) în: hepatita virală acută, necroza toxică a ficatului

- creşteri moderate în: hepatite cronice, ciroză, mononucleoza infecţioasă, hepatita

de stază cardiacă.

Raportul de Ritis: GOT/GPT ~ 1,2-1,3. În leziunile inflamatorii ale ficatului acest

raport scade datorită creşterii mai mari ale activităţii GPT. În leziunile necrotice raportul

creşte datorită creşterii mai marcate a activităţii GOT.

Determinarea activităţii fosfatezei alcaline

(Metoda Bodansky)

Fosfatazele sunt un grup de enzime cu rol important în metabolism, capabile să

hidrolizeze esterii fosforici, eliberând acid ortofosforic. În sânge întâlnim în special un

grup de fosfomonoesteraze care acţionează diferit, în funcţie de pH-ul mediului şi de

prezenţa unor efectori (ionul de Mg2+).

Cele mai importante enzime din grupa fosfomonoesterazelor sanguine sunt:

fosfatază alcalină - acţionează la pH 8,4 - 9,1

fosfatază acidă - acţionează la pH 5,1 - 6,0

78

Fosfatazele alcaline sunt foarte răspândite în corpul animal. Cele mai bogate surse

sunt: epiteliul intestinal, părţile în creştere ale oaselor, rinichi, glandele mamare,

leucocite.

Principiu:

Sub acţiunea catalitică a fosfatazei alcaline serice β−glicerolfosfatul de sodiu este

hidrolizat eliberându-se fosfat monosodic.

CH2

CH

CH2

OH

OH

CH2

CH

CH2

OH

OH

O P OH

O

O-Na+

+ HOH OH + NaH2PO4

Activitatea enzimei se determină dozând cantitatea de ioni fosfat eliberat, printr-o

metodă colorimetrică.

Ionul fosfat reacţionează cu acidul molibdenic rezultând un complex

fosfomolibdenic care este redus de sulfitul de sodiu şi hidrochinonă la albastru de

molibden, care este alcătuit dintr-un amestec de oxizi de molibden în stări de oxidare

diferite.

HPO42- +12 MoO4

2- + 23 H+ + 3 NH4+ → (NH4)3PMo12O40 + 12H2O

Oxizii de molibden sunt atât de fin dispersaţi încât intensitatea culorii obţinute

este proporţională cu cantitatea de molibden din fosfomolibdat, deci cu cantitatea de

fosfor din probă. Deci global, procesul respectă legea Lambert – Beer în ce priveşte

concentraţia fosforului.

Reactivi: - soluţie de substrat de β glicerolfosfat de sodiu pH -9,6, 0,5g

β glicerolfosfat de sodiu la care se adaugă 0,425 g veronal sodic, totul se dizolvă în cca

50 ml de apă, în balon cotat de 100 de ml Se adaugă 2,2 ml NaOH 0,1 N. Se completează

la 100 ml cu apă distilată şi se ajustează la pH 9,6

- NaOH N/10

- Hidrochinonă 1%

- Sulfit de sodiu 20%

- Acid tricloracetic 10%

- Molibdat de amoniu 2,5%

- Soluţie etalon de fosfat: KH2PO4 p.a. se usucă câteva zile în

exicator. Se cântăresc 4,3866 g, se dizolvă în puţină apă şi cu apă, se aduce la semn la

79

balon cotat de 1000 ml, se adaugă câteva picături de cloroform drept conservant. Această

soluţie conţine 1 mg de fosfor / 1 ml.

Curba de etalonare

Pentru realizarea curbei de etalonare, se diluează de 50 de ori soluţia etalon, astfel

1ml soluţie conţine 20 µg fosfor. Se măsoară într-o serie de eprubete 0,5; 1; 2; 3; 4 şi 5 ml

din această soluţie standard. La fiecare probă se adaugă câte 2 ml acid tricloracetic 20% şi

apă până la 10 ml. După amestecare, din acest amestec se măsoară câte 5 ml într-o alta

eprubetă, după care se adaugă 2 ml molibdat de amoniu 2,5%, 1 ml hidrochinonă şi 2 ml

sulfit de sodiu. După 5 minute se citeşte exticţia şi se reprezintă grafic luând pe ordonată

extincţia la λ= 610 nm în cuvă de 1 cm, iar pe abscisă cantitatea de fosfor în µg (adică 5,

10, 20, 30, 40, 50 µg)

Modul de lucru:

În două eprubete se măsoară câte 5 ml substrat (pH = 9,6). Prima eprubetă se

menţine timp de 5 minute la 37º C după care se introduce 1 ml ser şi se lasă astupată

jumătate de oră la 37º C.

În eprubeta a doua se măsoară 1 ml ser şi deoarece acesta constituie martorul, se

introduc 4 ml acid tricloracetic 10% pentru inactivarea enzimei. După incubarea de o

jumătate de oră, prima eprubetă se tratează cu 4 ml acid tricloacetic 10%. Atât proba cât

şi martorul se agită energic 1-2 minute şi se filtrează, iar din filtrat se iau câte 5 ml în

două pahare Erlenmeyer şi se dozează cantitatea de fosfat anorganic după cum urmează.

Se adaugă în fiecare pahar, în ordine, 1 ml molibdat de amoniu, 1 ml sulfit de

sodiu, 1 ml hidrochinonă şi 2 ml apă bidistilată. După 20 de minute de repaus se citeşte

extincţia probei faţă de martor la λ = 610 nm.

Calcul:

Se face pe baza curbei de etalonare. Rezultatul se exprima în unităţi Bodansky

(UB). O unitate Bodansky este activitatea fosfatazică pentru care 1 mg fosfor este eliberat

într-o oră la 37º C şi pH = 9,6 de 100 ml ser din substratul de β−glicerolfosfat.

Valori normale: Adulţi: 2 - 4 U.B. / 100 ml ser

Copii: 2 - 8 U.B. / 100 ml ser

Sugari: 3 – 10 U.B. / 100 ml ser

Transformarea unităţilor Bodansky, în unităţi internaţionale (mU/ml sau UI/l) se

face înmulţind cu factorul de conversie 8,3.

80

Modificările patologice apar în două mari categorii de afecţiuni: osoase şi

hepatobiliare. Astfel creşte mult în boli în care există o activitate crescută a

osteoblastelor: Boala Paget (osteodistrofie deformentă), hipoparatiroidismul primar şi

secundar, rahitism infantil, osteomalacie, metastaze osoase ale unor tumori maligne, icter

prin obstrucţie (dozarea fosfatazei constituind în acest caz un mijloc biochimic de

diagnostic diferenţial al icterelor).

O creştere fiziologică se observă în sângele matern aproximativ în trimestrul trei

al sarcinii şi atinge maximumul în timpul travaliului. La făt, concentraţia serică a

fosfatazei creşte, dar este sub valoarea maternă şi se însoţeşte de fixarea ionilor Ca2+ şi

−34PO . Concentraţia mai mare în sângele matern se explică printr-o trecere transplacentară

de la făt la mamă.

Scăderea fosfatazei alcaline apare în ciroză hepatică, hepatită cronică.

Fosfataza acidă are valori normale cuprinse în intervalul 4,5 – 13,5 UI/l (enzimă

totală) şi 0,05 – 3,6 UI/l (fracţiunea prostatică). Valorile cresc în carcinomul de prostată

(cu metastaze osoase), boala Gaucher, prostatită acută şi cronică, necroză hepatică

datorată hepatitelor acute şi cornice.

Determinarea activităţii amilazei serice prin

metoda Wohlgemuth.

Prin acţiunea amilazei salivare (α-amilaza) asupra amidonului, în cavitatea bucală,

se rup legăturile 1,4-glicozidice. Cum legăturile 1,6 ca şi cele 1,4 din vecinătatea

ramificaţiilor, nu pot fi desfăcute de către α-amilază, produşii de digestie a amidonului

vor fi, pe lângă maltoză, fragmente oligozaharidice de dimensiuni variabile - dextrine

limită. Dextrinele limită sunt hidrolizate ulterior, sub acţiunea unei hidrolaze, amilo-1,6-

glucozidaza, la maltoză care, în intestin este hidrolizată la glucoză de maltază. Activitatea

amilazică a intestinului se datorează trecerii amilazelor pancreatice şi salivare în sânge.

pH-ul optim al amilazei salivare este aproape de neutralitate, cofactorul fiind ionul Cl-.

Prin adăugarea de iod, amidonul rămas după reacţia enzimatică dă un compus de

adiţie iod-amidon, de culoare albastră a cărei intensitate este proporţională cu concentraţia

amidonului rămas după incubaţie şi invers proporţională cu activitatea enzimatică.

Coloraţia roşie care poate să apară în soluţiile cu amidonul parţial hidrolizat se datorează

complexelor iod-dextrine.

81

Principiu:

Se determină cantitatea minimă de amilază serică necesară pentru a hidroliza

complet 2 mg amidon, în 30 minute la 38°C.

Reactivi: - Soluţie de NaCl 0,9%

- Soluţie de amidon 0,1%

- Soluţie de KI3 N/10

Modul de lucru:

Se iau 8 eprubete care se numerotează de la 1 la 8. În fiecare se introduce câte un

ml soluţie NaCl 0,9%. În prima eprubetă se adaugă 1 ml ser. Pipeta se spală de 3 ori prin

aspirare în amestecul din prima eprubetă şi cu aceeaşi pipetă se trece 1 ml din amestec în

a doua eprubetă. Din nou se spală pipeta prin aspirare în a doua eprubetă şi se trece 1 ml

în a treia. Operaţia se repetă până la ultima eprubetă din care se aruncă 1 ml din amestec.

În acest mod se obţine următoarea serie de diluţii succesive ale serului: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16,

1/32, 1/64, 1/128, 1/256, adică 1/2n unde n este numărul de ordine al eprubetei.

Se adaugă apoi în fiecare eprubetă câte 2 ml soluţie amidon. Se agită şi se aşează

în baie de apă la 38ºC. După 30 de minute se scot, se răcesc repede la un curent de apă,

apoi în fiecare se introduc câte 1-2 picături de soluţie de iod. Se agită şi se observă

culoarea formată. Culoarea galbenă indică lipsa amidonului, cea roşie arată prezenţa

produşilor intermediari de hidroliză (dextrine), iar cea albastră semnalează prezenţa

amidonului nehidrolizat. Se notează ultima eprubetă în care amidonul a fost hidrolizat.

Cu această metodă nu se poate face diferenţă între amilaza salivară şi cea

pancreatică. Există, însă, metode electroforetice pentru a diferenţia cele două izoenzime:

migrarea electroforetică a amilazei salivare este mai rapidă decât a celei pancreatice.

Calcul:

Rezultatul se exprimă în unităţi Wohlgemuth (UW). Unitatea amilazică Wohlgemuth

reprezintă cantitatea de enzimă necesară pentru a hidroliza un mg amidon în 30 minute la

38ºC. Pentru calcul se consideră ultima diluţie în care nu apare culoarea albastră.

Rezultatul în unităţi Wohlgemuth se obţine înmulţind diluţia cu 2. De exemplu, dacă

coloraţia albastră apare în eprubeta a 5-a înseamnă că amidonul a fost hidrolizat până la a

4-a eprubetă. Calculăm diluţia acestei eprubete care este 1/16 faţă de serul iniţial. Dacă:

1/16 ml ser hidrolizează 2ml sol. amidon 0,1% atunci, 1 ml ser hidrolizează x ml sol.

amidon 0,1% sau x mg amidon.

1•2 x = ─── = 32 UW

82

1/16

Interpretarea valorilor obţinute:

Valori fiziologice: în sânge: 8-32 U.W.

în urină : 8-64 U.W.

Valori patologice: - activitatea amilazică scăzută apare în afecţiunile

pancreatice, gastrice şi duodenale.

- activitatea amilazică crescută apare în afecţiuni ale

ficatului, vezicii biliare, în alterări ale funcţiei renale, afecţiuni ale glandei salivare

(parotidită acută, sialadenită), sarcină extrauterină, fiindcă cantităţi mici de amilază există

în trompele uterine, infarct intestinal. Valoarea diagnostică a amilazemiei se corelează cu

tulburările digestive, pancreatita acută, parotidita epidemică.

Observaţii:

1. Amilaza serică este stabilă timp de o săptămână dacă serul se ţine la frigider sau

congelator.

2. Saliva conţine de 1000 ori mai multă amilază decât serul de aceea este necesar ca

pipetările să se facă cu atenţie evitându-se scurgerea salivei în pipetă.

3. Eprubetele vor fi bine spălate cu apă distilată, de asemenea şi pipetele, înlăturându-se

urmele de detergent care ar putea influenţa reacţia enzimatică.

Explorarea echilibrului acido-bazic

Modificările echilibrului acido-bazic a lichidelor din organismul viu, duc la

acidoză sau alcaloză. pH-ul sângelui este cuprins în intervalul 7,35-7,45. În mod normal,

raportul echivalenţilor de HCO3- şi H2CO3 este de 20/1, de exemplu 24 mEq bicarbonat şi

1,2 mEq acid carbonic. În locul raportului [HCO3-]/[H2CO3], un raport mai practic este

[HCO3-]/pCO2 unde pCO2 este presiunea parţială a CO2 din sânge.

Scăderea acestui raport duce la acidoză, iar creşterea lui la alcaloză. Dacă scade

numărătorul, este vorba de acidoză respiratorie (reducerea eliminării prin expiraţie a CO2)

sau metabolică. Creşterea raportului datorită creşterii numărătorului indică o alcaloză

metabolică. Scăderea raportului [HCO3-]/pCO2 datorat creşterii pCO2 produce acidoză

respiratorie. Creşterea raportului determinat de scăderea pCO2 produce alcaloză

respiratorie. În funcţie de modificările pH-lui se realizează acidoza sau alcaloza

compensată sau decompensată. Când pH-ul nu este modificat este vorba de acidoză sau

83

alcaloză compensată. Când pH-ul scade sub 7,35 este vorba de acidoză decompensată, iar

când pH-ul creşte peste 7,45 se poate vorbi de alcaloză decompensată. Valori ale pH-ului

sângelui sub 6,9 sau peste 7,9 sunt incompatibile cu viaţa. Cele mai importante sisteme

tampon care funcţionează permanent în organism sunt: sistemul bicarbonat/acid carbonic,

sistemul fosfaţilor (HPO42-/H2PO4

-), sistemul proteinelor si sistemul hemoglobinei

(deprotonată/protonată).

Determinarea rapidă a rezervei alcaline (bicarbonat actual)

Principiu:

Bicarbonaţii din ser sunt descompuşi cu acid azotic, cu degajare de CO2, iar

excesul de acid azotic se titrează în prezenţă de roşu de fenol cu soluţie de hidroxid de

sodiu.

Reactivi: - soluţie acid azotic 0,1 N cu factorul FHNO3

soluţie roşu de fenol 0,04% în alcool etilic de 60%;

soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 N cu factorul FNaOH

Modul de lucru: La 1 ml ser nehemolizat se adaugă 1 ml soluţie acid azotic 0,1N şi 4 picături

soluţie roşu de fenol 0,04%. Se agită timp de 2 minute pentru îndepărtarea dioxidului de

carbon. Se microtitrează cu v ml soluţie de hidroxid de sodiu 0,1N până la primul viraj

portocaliu.

Calcul:

1 ml NaOH 0,1N ..................................................0,1mEq −3HCO

NaOHHNO FvF ⋅−3

................................................... x mEq −3HCO

x = rezerva alcalină dintr-un ml ser.

Obsevaţie: Factorul soluţiei de HNO3 0,1N se determină prin titrare cu soluţia de

NaOH 0,1N cu factor cunoscut, folosind roşu de fenol ca indicator.

Metoda Astrup

Spre deosebire de măsurătorile de bicarbonaţi şi de pH efectuate în plasmă,

metoda Astrup ţine cont şi de rolul tamponului de hemoglobină şi de intervenţia

anhidrazei carbonice din eritrocite. Metoda se bazează pe relaţia invers proporţională

dintre pCO2 şi valorile de pH din sânge. Este o micrometodă în care se utilizează un

electrod capilar de sticlă pentru măsurarea pH-ului (dozarea potenţiometrică a pH-ului cu

electrod de sticlă, pag.183). Determinările se fac din sânge capilar. Se măsoară trei valori

84

de pH (în condiţii anaerobe, în condiţii de pCO2 scăzut şi pCO2 crescut). Cu ajutorul

acestor trei valori se pot calcula factorii principali ai echilibrului acido-bazic dintr-o

nomogramă.

Ioni anorganici

Determinarea potasiului seric

Potasiul este un important cation intracelular pentru organism. În celulă, parţial,

el este slab legat cu proteinele şi cu ionul fosfat. În tulburările metabolice celulare însoţite

de o scădere a potenţialului energetic (diabet zaharat, acidoze, hipertiroidism etc.) celula

pierde din acest motiv şi potasiul care este ulterior eliminat. Cation principal în fluidul

intracelular, K+ este implicat în funcţia nervoasă şi musculară, în funcţionarea Na+/K+-

ATP-azei. În timpul contracţiei musculare, potasiul din spaţiul intracelular trece în cel

extracelular, iar în locul lui în celulă intră sodiul. Supradozarea cu ioni K+ determină

scăderea (oprirea) activităţii cardiace, ulcerul intestinului subţire. Necesarul zilnic de

potasiu este de 1,875-5,625 g /kilocorp

Sursele: vegetale, fructe (nuci, banane, mere, struguri, portocale) boabe de cereale

seminţe de floarea soarelui, carne slabă.

Principiu:

Hexanitrocobaltiatul (ΙΙΙ) trisodic (Reactiv Konninck) formează cu ionul K+ în

soluţii neutre, un precipitat galben cristalin de hexanitrocobaltiat (ΙΙΙ) dipotasic-

monosodic. Grupările nitro din compus se oxidează în mediu acid cu KMnO4 în exces.

Excesul de KMnO4 se titrează iodometric cu tiosulfat de sodiu.

Na3[Co(NO2)6] + 2 KCl-------------> NaK2[Co(NO2)6] + 2NaCl

5 NaNO2 + 2 KMnO4 + 3 H2SO4 ----> 5 NaNO3 + 2 MnSO4 + K2SO4 +3 H2O

2 KMnO4 + 10 KΙ + 8 H2SO4 ------------> 5 Ι2 + 2 MnSO4 + 6 K2SO4 +8 H2O

Ι2 + 2 Na2S2O3 --------------------------------> Na2S4O6 + 2 NaΙ

Reactivi: - Reactiv Konninck (hexanitrocobaltat (ΙΙΙ) trisodic). Prepararea

reactivului Konninck:

- Soluţia A: Se dizolvă 1,25 g Co(NO3)3 în 2,5 ml H2O. După dizolvare se adaugă

0,0625 ml CH3COOH glacial.

- Soluţia B: Se dizolvă 56 g NaNO2 în 9 ml H2O bidistilată, prin încălzire.

85

Soluţia A se amestecă cu soluţia B. Pentru îndepărtarea vaporilor nitroşi se

trece prin soluţie un curent de aer timp de 60 minute (trompă de vid). Se lasă în

repaus 2 ore după care se filtrează. Dacă culoarea se închide din nou se trece

din nou un curent de aer.

- Alcool etilic 70°

- Soluţie fosfat disodic 5%

- H2SO4 20%

- KMnO4 0,01N

- KΙ 10%

- Amidon 1%

- Na2S2O3 0,05N

Modul de lucru:

Într-o eprubetă de centrifugă se măsoară:

- 1 ml reactiv Konninck (Sol.A + B), apoi 1 ml ser. Se agită şi se lasă în repaos 20

minute. Eprubeta se supune centrifugării la 2000 rpm timp de 10 minute. După decantarea

lichidului supernatant, precipitatul sedimentat se spală cu 5 ml etanol iar dispersia

etanolică se supune din nou centrifugării şi decantării

Precipitatul rămas se dizolvă cu 5 ml fosfat disodic, prin fierbere 5 minute. Soluţia

se goleşte într-un flacon Erlenmeyer de 100 ml iar eprubeta se spală în flacon cu 1 ml

H2SO4 20%. În tabel apar cantităţile de reactivi care se introduc în flaconul Erlenmeyer cu

probă şi în unul cu martor.

Probă MartorPrecipitat dizolvat -

H2O bidistilată (ml) - 5H2SO4 20% (ml) 1 2KMnO4 0,01N (ml) 20 20

Repaus 20 minute (ml)KΙ 10% (ml) 3 3Amidon 1% (ml) 2 2

Proba şi martorul se titrează cu Na2S2O3 0,05N până la dispariţia culorii albastre

determinate de prezenţa I2.

Calcul:

1 ml Na2S2O3 0,05N corespunde la 0,065 • 5 mg K

86

mg K% = (v1 - v2) • 5 • 0,065 • 100; unde v1 = nr. ml Na2S2O3 folosiţi la titrarea

martorului şi v2 = nr. ml Na2S2O3 folosiţi la titrarea probei

Valori normale: 13-21 mg/100 ml ser; 3,3-5,4 mmol/l

Variaţii patologice: - Hiperpotasemii: arsuri intense, hemoragii, infarct

miocardic, sindroame maligne, pancreatite acute hemoragice, necroze viscerale,

insuficienţă suprarenală acută sau cronică, sindrom hemolitic, nefrită acută sau cronică. -

Hipopotasemii: diaree, vomismente, nefropatii tubulare, acidoze diabetice, comă

diabetică, administrare prelungită de diuretice, hipercorticism suprarenal, boala Cushing,

tumoră suprarenală, tratament cortizonic.

Deficienţa de potasiu apare după răniri sau terapie cu diuretice. Deficienţa de potasiu

determină slăbirea tonusului muscular, paralizii, confuzii mentale.

Dozarea flamfotometrică a potasiului seric

În ultimul timp, metodele chimice de determinare ale potasiului au fost înlocuite

prin analiza flamfotometrică. Factorii care au favorizat utilizarea flamfotometriei ca

metodă uzuală în laboratoarele clinice pentru determinarea în lichidele biologice a

metalelor alcaline (Na+ şi K+) şi metalelor alcalino-pământoase (Ca2+ şi Mg2+), au fost:

simplitatea metodei, rapiditatea metodei, consumul minim de substanţe, limita de eroare

(2-3%) apropiată de limita de eroare din determinările chimice.

Principiu:

Serul nehemolizat se diluează cu apă bidistilată, apoi se pulverizează într-un

dispozitiv special cu ajutorul unui curent de gaz purtător. Aerosolii formaţi în urma

pulverizării se amestecă cu unul din amestecurile de gaze: metan-aer, propan-aer sau

acetilenă-aer care arde într-un arzător special (Brenner), dând naştere la spectre

caracteristice. Liniile spectrale ale potasiului pot fi selecţionate cu ajutorul unui filtru.

Lumina flăcării este proiectată cu ajutorul unei oglinzi concave, prin filtrul de selecţie, pe

o celulă fotoelectrică, ceea ce produce un fotocurent, care se poate măsura cu ajutorul

unui galvanometru. Intensitatea fluxului luminos este proporţională cu concentraţia

ionilor K+ din ser. Alte detalii privind această analiză instrumentală sunt cuprinse în

capitolul privind unele aparate de analiză fizică de la sfârşitul îndrumătorului.

87

Dozarea calciului şi magneziului

Dozarea calciului

Rolul calciului în organism

Calciu este cel mai abundent mineral din organismul uman. Un adult de 70 kg

conţine în ţesuturi aproximativ 1,2 kg calciu. Aportul zilnic necesar de calciu este 1 gram,

din care se absorb doar 10-20%. Calcemia (concentraţia plasmatica a calciului) normală

este 9-11 mg%, 4,5-5,5 mEq/l sau 2,25 -2,75 mmol/l. Calciul îndeplineşte în organism un

rol plastic participând prin combinaţiile sale insolubile la structura scheletului osos a cărui

principală componentă minerală este hidroxiapatita, 3Ca3(PO4)2•Ca(OH)2 şi un rol

dinamic sub formă de ioni Ca2+ prezenţi în fluidele, cum ar fi plasma sau urină, sub forma

a trei fracţiuni:

1. Calciu legat de proteine (proteinate de calciu) aproximativ 1 mmol/l. Această formă

depinde de concentraţia relativă a proteinelor şi calciului din plasmă. Pe baza acestei

dependenţe se poate aprecia fracţiunea de calciu ionizat, cunoscând calciul total din

ser sau plasmă şi nivelul proteinei din ser sau plasmă. Tehnica constă în folosirea

nomogramei MacLean şi Hastings, cunoscând cei doi parametri amintiţi anterior se

citeşte direct valoarea calciului ionizat de pe nomogramă.

2. Calciul legat de molecule mici (complecşi de calciu sau chelaţi) acizi organici, numit

şi calciu complexat dializabil. Acesta poate străbate membranele semipermeabile

(celofan) spre deosebire de calciul legat de proteine.

3. Calciul liber, forma biologică activă ce intervine în coagularea sângelui în activarea

enzimelor (proteaze), în buna funcţionare a inimii, muşchilor şi nervilor.

Determinarea cationului calciu în sânge

Calciul este cationul prezent predominant în spaţiul extracelular. În laboratoarele

de analize clinice, calciul din sânge se poate doza prin diferite metode. Metodele fizice

folosite sunt: fotometria de flacără, spectroscopie de absorbţie atomică, folosirea

electrozilor ion-selectivi. Metodele chimice folosite sunt precipitarea calciului sub formă

de oxalat şi apoi dozarea oxalatului de calciu format cu ajutorul permanganatului de

potasiu şi metoda complexonometrică. Metodele optice sunt descrise în principiu la

sfârşitul îndrumătorului. Metodele potenţiometrice cu electrod pentru Ca2+ utilizează un

88

milivolmetru cu impedanţă de intrare mare similar cu pH-metrului care în locul

electrodului de sticlă utilizează electrodul selectiv pentru ionii de Ca2+.

Metodele chimice (volumetrice) sau fizice cu excitare (flamfotometrie,

spectroscopie de absorbţie atomică) permit determinarea concentraţiei totale a calciului.

Singurele metode care pot determina calciul ionizabil (singurul care este biologic activ)

sunt metodele nernstiene, adică cele care folosesc electrozi selectivi.

Toţi electrozii selectivi au ca particularitate o parte care este numită în mod curent

“membrană”. Această membrană conferă selectivitatea electrodului. Membranele sunt de

mai multe tipuri: membrane de sticlă (pentru măsurarea pH-ului), membrane solide

(pentru măsurare concentraţiei F-, CN-) şi membrane lichide (pentru măsurarea Ca2+,

Mg2+).

Electrodul membrană-lichidă pentru Ca2+ este constituit din următoarele

componente principale:

-Un fir de argint metalic acoperit cu clorură de argint, scufundat într-o soluţie de

CaCl2

-Un rezervor central în care se află CaCl2 şi firul de argint

-O membrană poroasă “millipor” de PVC care joacă rolul unui suport inert,

impregnat cu o soluţie organică compusă din sarea de calciu a acidului

didecilfosforic dizolvată într-un solvent nemiscibil cu apa (de exemplu: di – n -

octil fenil fosfat).

Ionul de calciu este comun atât soluţiei apoase (soluţie a cărei concentraţie vrem s-o

determinăm) cât şi soluţiei organice cu care este impregnată membrana “millipor”. În

această soluţie organică se va reţine ionul de calciu de către un contraion (ion cu semn

opus), în cazul de faţă didecil fosfatul, care fiind insolubil în apă nu poate părăsi soluţia

organică. Între cele două soluţii (apoasă şi organică) apare o diferenţă de potenţial

nernstiană (respectă legea lui Nernst).

Diferenţa de potenţial este măsurată cu ajutorul instrumentului, care este gradat

direct în unităţi de concentraţie a ionilor de Ca2+ (pCa). Concentraţia ionilor de calciu,

poate fi apreciata şi indirect folosindu-se nomograme. Sunt două tipuri de nomograme

utilizate în acest scop. Nomograma MacLean-Hastings cu ajutorul căreia se poate deduce

concentraţia calciului ionizat, cunoscând calciu total din ser sau plasmă şi concentraţia

totală a proteinelor din ser sau plasmă.

Cea de a doua nomogramă utilizabilă pentru deducerea concentraţiei Ca2+, se

bazează pe faptul că ionizarea ionilor de calciu variază linear în funcţie de pH-ul serului

89

sau plasmei. Acest tip de extrapolare se poate face numai între limitele variaţiei pH-ului

fiziologic (6,8 - 7,8), pentru că numai în această plajă de pH variaţia este lineară (vezi

figura de mai jos).

În diagrama pH-Ca2+ liber prezentată, ordonata (concentraţia ionilor de Ca2+) este

divizată nelinear. Cunoscând valorile pCa şi pH (măsurate cu electrozii selectivi

corespunzători) se poate stabili natura tulburării de care suferă pacientul

(hiper/hipoparatiroidism primar, acidoză/alcaloză acută, etc.).

Dozarea calciului prin metoda permanganometrică

Principiu

Se precipită ionul de calciu sub formă de oxalat de calciu. Precipitatul format se

dizolvă în acid sulfuric, iar acidul oxalic eliberat se va titra cu o soluţie de permanganat

de potasiu, până la apariţia unei coloraţii slab roz.

CaCl2 + (COONH4)2 → (COO)2Ca + 2NH4Cl

(COO)2Ca + H2SO4 → (COOH)2+ CaSO4

5(COOH)2 + 2KMnO4 + 3H2 SO4 → 2MnSO4 + K2SO4 + 10CO2 + 8H2O

90

Reactivi: - soluţie de oxalat de amoniu 4% (soluţie saturată)

- soluţie de hidroxid de amoniu 2%

- soluţie de acid sulfuric 1N

- soluţie de permanganat de potasiu 0,01 N cu factorul FKMnO4

Modul de lucru:

Se pipetează 1 ml ser, 1 ml soluţie saturată de oxalat de amoniu şi 2 ml de apă

bidistilată într-o eprubetă de centrifugă. Se amestecă prin agitare şi se lasă minim 30 de

minute în repaus. Se centrifughează timp de 10 minute la 4000 turaţii pe minut.

Supernatantul se îndepărtează printr-o singură răsturnare a eprubetei şi peste precipitat se

adaugă 4 ml din soluţia de hidroxid de amoniu 2%, se agită, apoi se centrifughează. Se

îndepărtează supernatantul cum s-a arătat mai sus şi se mai face o spălare cu soluţia de

hidroxid de amoniu, se centrifughează şi se elimină supernatantul. Peste precipitatul astfel

spălat se adaugă 2 ml acid sulfuric 1N şi se ajută dizolvarea prin încălzire pe o baie de apă

la 60-70ºC. Se recomandă ca temperatura să nu depăşească 70°C pentru a se evita

descompunerea acidului oxalic. Se titrează cu soluţia de permanganat de potasiu la cald

până la apariţia unei coloraţii roz palid care trebuie să persiste minimum un minut. În

paralel se face şi o probă martor. Tot într-o eprubetă de centrifugă, se introduc 2 ml acid

sulfuric 1 N, se încălzeşte pe o baie de apă la 70°C şi se titrează cu soluţia de

permanganat de potasiu la cald până la apariţia unei coloraţii roz palid care trebuie să

persiste minimum un minut.

Calcul:

1 ml soluţie KMnO4 0,01 N conţine 0,01 miliechivalenţi de KMnO4.

Stoichiometric 0,01 miliechivalenţi de KMnO4 vor reacţiona cu 0,01 miliechivalenţi de

Ca ceea ce reprezintă 0,2 mg de calciu.

x = (a-b) • F KMnO4 • 0,20 (mg Ca /1ml ser)

x•100 = mg Ca /100 ml ser sau

(a-b) • F KMnO4 • 5 (mmol Ca /l)

în care: a = număr de ml soluţie KMnO4 0,01 N utilizaţi la titrarea probei de analizat iar b

= număr de ml soluţie KMnO4 0,01 N utilizaţi la titrarea martorului.

Valori normale: ser 9-11 mg / 100 ml la adulţi sau

2,2-2,8 mmol / l

7-14 mg / 100 ml la copii sau

1,8-3,5mol / l

91

Valori scăzute:- hipofuncţie paratiroidiană

- avitaminoză sau hipovitaminoză D

- uremie

La valori de sub 1,7 mmol / l (6,8 mg%) apar fenomene de tetanie.

Valori crescute: - hiperfuncţie paratiroidiană

- neoplazii osoase (osteosarcom, mielom multiplu, unele

leucemii)

- hipervitaminoză D

- deshidratare

Dozarea calciului prin metoda complexonometrică

Eliminarea calciului în urină este în funcţie de conţinutul de calciu din alimente şi

de rata de absorbţie digestivă.

Principiu:

Ionii de calciu din urină în mediu puternic alcalin se vor titra cu EDTANa2, adică

complexon III (sarea de sodiu a acidului etilendiaminotetraacetic) în prezenţa murexidului

(purpurat de amoniu) ca indicator. Indicatorul va fixa ionii de calciu (culoarea soluţiei va

fi roz) care prin titrare vor fi apoi complexaţi cu EDTA. Indicatorul eliberat va colora

soluţia în violet. Murexidul, indicator metalocromic (pentru calciu şi alţi cationi) are

gradul de ionizare în funcţie de pH-ul mediului. Reacţiile prin care ionii Ca2+ sunt

complexaţi de indicator şi de complexon sunt:

Ca2+ + Ind3- ↔ CaInd-

rozCa2+ + Y4- ↔ CaY2-

complexonul deprotonat

Reacţia titrimetrică care produce virajul indicatorului este:

CaInd- + Y4- → CaY2- + Ind3-

violet

Reactivi: - soluţie complexon III 0,001 N .

- soluţie de NaOH 9 N

- soluţie indicator murexid 0,1%

92

Modul de lucru:

Se foloseşte urină proaspătă, fără conservanţi. Se pregătesc două pahare

Erlenmeyer de câte 100 ml şi se pipetează în fiecare următoarele:

Exprimarea

cantităţilorProba Martor

Urină ml 2 -Apă bidistilată ml 50 52Soluţie de NaOH 9 N ml 0,2 0,2Indicator murexid pic. 1 1Culoare roz roz-violaceu

Se titrează cu EDTA 0,01N până la violet A ml B ml

Se execută o probă şi un martor, martorul se titrează dacă este necesar până la

culoarea violet stabilă, pentru a se lua în calcul şi urmele de calciu din reactivi.

Calcul:

În calcularea rezultatelor se are în vedere că complexul din 1 ml soluţie

complexează 0,2 mg Ca2+:

1ml EDTA 0,01N-----------------------------------------------0,2 mg Ca

(A-B)•FEDTA------------------------------------------------------x

x= (A-B)• FEDTA•0,2 mg Ca / 2ml

Considerând că urina de 24 ore are volumul de 1500 ml:

g Ca în urina de 24 de ore = (A-B)• FEDTA•0,2 • 1500 / 2 • 1000

g Ca în urina de 24 de ore = (A-B)• FEDTA•0,15

Valori normale:

- sugari 0,01 - 0,14 g/24 ore - copii şi adulţi 0,1 - 0,2 g/24 ore

sau 0,25 - 3,5 mmol/24 ore sau 2,5 - 5,0 mmol/24 ore

Valori crescute apar în boala Recklinghausen, osteoporoze, după fracturi,

intoxicaţii cu vitamina D, hipercalciurie ideopatică.

Valori scăzute apar în spasmofilie, tetanie infantilă, osteomalacie, rahitism,

hipopara-tiroidism.

93

Dozarea magneziului prin metoda Mann şi Yoe

Un adult de 70 kg conţine aproximativ 24 g de magneziu, care este distribuit

inegal în organism, având o concentraţie mai mare în ţesuturile cu activitate metabolică

mai intensă, cum ar fi creierul, inima, ficatul, rinichii, tiroida. Totuşi scheletul conţine

60% din magneziu. Muşchii scheletici şi miocardul conţine 35%, iar 1% se găseşte în

compartimentul extra-celular, din acesta aproximativ două treimi fiind sub formă ionizată,

restul fiind legat de albumine. Principalele organe implicate în metabolismul Mg sunt

intestinul şi rinichii.

Magneziul are un rol cheie în numeroase funcţii mediate enzimatic, fiind implicat

în formarea de substrate enzimatice (ATP Mg, GTP Mg) precum şi în activarea directă a

enzimelor. Funcţiile membranare care sunt influenţate de magneziu includ conducerea

impulsului nervos şi modularea activităţii canalelor de calciu.

Principiu:

Colorantul Mann şi Joe (1- azo - 2 – hidroxi – 3- (2,4 – dimetil carboxamilido)

naftalin – 1’ (2 - hidroxibenzen) – 4 – sulfonat de sodiu) este albastru. În mediu alcoolic,

la pH 9-10, acesta formează cu Mg2+ (în cantităţi de ordinul microgramelor) un complex

de culoare roşie, iar intensitatea coloraţiei este proporţională cu concentraţia cationului.

Materiale necesare: - spectrofotometru

- micropipete de 20µl (0,02ml)

Reactivi: - Reactivul Mann şi Yoe: se dizolvă 8 mg colorant în 75 ml alcool

absolut (eventual prin fierbere cu reflux) şi după dizolvare se

aduce la 100 ml cu alcool absolut.

- Soluţie tampon (pH 9-10): 20 g tetraborat de sodiu cristalizat cu

10 molecule de apă, se dizolvă la cald în 500 ml apă bidistilată,

apoi se completează cu apă bidistilată la 1000 ml.

- Soluţie standard de Mg2+ 2 mg/ 100ml: se dizolvă 203 mg MgSO4

cristalizat cu 7 molecule de apă în 500 ml apă bidistilată, se adaugă

1 ml cloroform (conservant), apoi se completează la 1000 ml cu

apă bidistilată

- Soluţie acid percloric 0,33 N: se dizolvă 2,85 ml HClO4 70% în

100 ml apă distilată

94

Modul de lucru:

Se pregătesc în trei eprubete următoarele mixturi:

Probă Blanc StandardSoluţie tampon (ml) 1,0 1,0 1,0Ser (ml) 0,02 - -Standard de Mg2+ (ml) - - 0,02Apă bidistilată (ml) - 0,02 -

Se amestecă bine Reactiv Mann şi Yoe (ml) 1,0 1,0 1,0

Se agită bine mixturile şi după 15-30 de minute se citeşte exticţia probei şi a

standardului faţă de blanc în cuva de 1cm la λ = 505 nm.

Calcul:

Ep/Es x 2 = mg Mg% Ep/Es x 1,64 = mEq/l

Valori normale

nou născuţi: 1,6 - 2,3 mg% sau 1,32 -1,90 mEq/l sau 0,66-0,95 mmol/l

adulţi: 1,6 - 2,4 mg% sau 1,56-2,38 mEq/l sau 0,8-1,2 mmol/l

Modificări patologice

În practica medicală deficitul de magneziu este întâlnit relativ frecvent, dar el nu

este întotdeauna identificat deoarece are expresie medicală mai puţin specifică comparativ

cu carenţa altor elemente (exemplu ferul) şi apare într-un context complex în asociere cu

alte afecţiuni care pot domina tabloul.

Deficitul de magneziu apare în următoarele cazuri:

Aport deficitar, alimentaţie parenterală, cure drastice de slăbire, alcoolismul

cronic, vărsături datorate alimentaţiei dezechilibrate, hipersudoraţie, eliminarea crescută a

magneziului prin urină (etanolul antrenează diureza osmotică). Afecţiunile care evoluează

cu malabsorbţie, rezecţiile intestinale, enteropatiile acute sau cronice, diarea, steatoreea,

terapia cu diuretice, provoacă de asemenea depleţia de magneziu. În practica pediatrică,

deficitul poate apărea din următoarele cauze: disgravidia - sărăcire a organismului matern

cu repercusiuni asupra capitalului de magneziu al nou născutului, creşterea rapidă a

copilului în primele luni, lapte matern sărac în magneziu, tulburări gastrointestinale la

această vârstă. Terapia cu calciu şi vitamina D în doze mari favorizează pierderile urinare

de magneziu. În diabetul zaharat apare hipomagnezemia datorită pierderilor urinare de

magneziu antrenate de diureza osmotică. Stresul fizic şi psihic favorizează depleţia de

magneziu.

95

Manifestări clinice ale deficitului de magneziu (hipomagnezemie) sunt polimorfe

şi nespecifice. Ele pot fi: insomnie, anxietate, depresie , cefalee, slăbiciune musculară,

crampe, parestezii, hiperreflexe, dificultăţi de înghiţire, senzaţie de constricţie toracică,

tulburări de adaptare a vederii.

Supraîncărcare de magneziu se constată la nou născuţii ai căror mame au fost

tratate cu sulfat de magneziu în contextul eclampsiei de sarcină. În insuficienţa renală, în

special concomitent cu medicaţia pe bază de Mg2+ (antacizi, laxative), se produce

hipermagnezemie. Simptomele hipermagnezemiei sunt: hipotensiune, greţuri, vărsături,

bradicardie, hiporeflex osteotendinos, hipotonie musculară.

Dozarea ionului de clor din ser prin

metoda Schales

Principiu:

Ionul Cl-, principal anion al plasmei sanguine, în mediu acid se titrează cu

Hg(NO3)2 formând HgCl2, moleculă nedisociată. Se foloseşte ca indicator

difenilcarbazona care formează un compus de culoare violet cu ionii Hg2+ în exces. Nu

este necesară deproteinizarea, cu excepţia serurilor puternic icterice.

Reactivi: - Soluţie de azotat mercuric 0,01 N

- Soluţie indicator de difenilcarbazonă 0,01 M

- Soluţie H2SO4 2/3 N

- Soluţie standard de clorură de potasiu 0,1 N

Modul de lucru:

96

În două flacoane Erlenmeyer de 25 ml se pipetează:

Probă StandardApă distilată ml 1,0 1,0Ser ml 0,1 -Standard KCl ml - 0,1H2SO4 2/3 N 1 pic. 1 pic.Indicator difenilcarbazonă 2 pic. 2 pic.

Ambele probe se titrează până la aceiaşi culoare violet cu Hg(NO3)2 0,01 N. Se notează

volumul în ml folosit la titrarea probei (v1) şi cel folosit la titrarea standardului (v2).

Calcul:

1 ml Hg(NO3)2 0,01 N corespunde la______________________________0,355 mg Cl-

v1 / v2 ________________________________________________________ x

x = mg Cl-/0,1 ml ser = v1 / v2 • 0,355

mg Cl- / 100 ml ser = v1 / v2 • 355

mEq Cl- / l = v1 / v2 • 100

Observaţii: În cazul serurilor puternic icterice se efectuează deproteinizarea.

După deproteinizare, culoarea indicatorului la viraj tinde spre albastru, pe când la ser

neproteinizat spre violet.

Valori normale pentru adulţi:

340 – 390 mg clor/100 ml ser

96 – 110 mEq clor/ litru de ser

Valori scăzute până la 250 mg/100 ml ser se întâlnesc în insuficienţă corticosuprarenală

(boala Addison), în diaree sau vărsături prelungite, când organismul pierde pe lângă apă

şi o cantitate apreciabilă de NaCl.

Valori crescute se întâlnesc în stări de sete, în hiperfuncţia corticosuprarenală şi în

insuficienţa renală.

Dozarea ferului seric (metoda Heilmeyer modificată)

97

Principiu:

Se tratează serul sanguin cu acid clorhidric când se eliberează Fe3+ din legătura sa

cu proteinele (transferina). Se precipită proteinele serice cu acid tricloracetic, după filtrare

Fe3+ din filtrat este redus cu hidrochinonă la Fe2+. Ionii de Fe2+ formează cu

ortofenantrolina şi, mai specific, cu α,α’-dipiridil, un complex colorat în roşu. Intensitatea

coloraţiei roşii va fi proporţională cu concentraţia ferului din probă.

Reactivi: - Soluţie HCl 1N;

- Soluţie CCl3COOH 20%;

- Soluţie hidrochinonă 2%;

- Soluţie ortofenantrolină clorhidrică 1% (se poate utiliza şi

ortofenantrolină, iar pentru dizolvare se acidulează iniţial cu 2-3

picături de HCl concentrat)

- Soluţie semisaturată de CH3COONa. Se diluează extemporaneu o soluţie

saturată (la temperatura camerei cu apă bidistilată) în proporţie de 1:1

- Soluţie standard concentrată de fer 10 mg%: 0,0497 g FeSO4· 7H2O, ad

100 ml cu apă bidistilată sau 0,0702 g Fe(NH4)2(SO4)2· 6H2O, ad 100

ml cu apă bidistilată. Standardul concentrat se păstrează la frigider. Se

diluează extemporaneu 1 ml la 100 ml cu apă bidistilată obţinându-se

un standard de lucru de 100 µg Fe % cu stabilitate limitată la 1-2 luni.

Modul de lucru:

În trei eprubete se pipetează conform tabelului:

98

Probă (ml) Standard (ml) Blanc (ml)sol. HCl 1 N 1 1 1ser (nehemolizat) 2 - -apă bidistilată - - 2sol. standard de fier (100 µg%) - 2 -

Agitare, 10 min. repausacid tricloracetic 20% 2 2 2

10 min. repaus, filtrare şi apoi în eprubetefiltrat 2 2 2sol. hidrochinonă 2% 0,2 0,2 0,2sol. o-fenantrolină 1% 0,1 0,1 0,1sol. acetat de sodiu 2 2 2

Fiecare eprubetă se agită şi după 5 minute se citeşte extincţia probei (Ep) şi a standardului

(Es) faţă de blanc, în cuva de 1 cm, la λ = 510 nm.

Calcul:

Sideremia se calculează cu următoarea formulă:

Fe µg% = Ep/Es•Cst = Ep/Es•100 (Cst = concentraţia standardului de fer = 100 µg%)

Valori normale: - femei: 80-130 µg% (14,3-23,3 µmoli/l)

- bărbaţi: 90-160 µg% (16,1-28,6 µmoli/l)

Valori crescute: creşterea reabsorbţiei (absenţa blocadei mucoasei), depozitarea

excesivă a ferului în organism (hemosideroză, hemocromatoză), tratament cu fer în exces,

etc.

Valori scăzute: scăderea aportului (dietă inadecvată, regim făinos-lactat), scăderea

absorbţiei (rezecţii de stomac/intestin, diaree cronică, sindrom de malabsorbţie),

aclorhidrie, pierderi mari de sânge.

Proteina plasmatică transportoare de fer este transferina (siderofilina) sintetizată în

ficat. Capacitatea totală de fixare a ferului (CTFFe) corespunde cantităţii totale de

siderofilină şi se exprimă în µg Fe/100 ml plasmă. Valorile normale ale CTFFe se

încadrează între 250-420 µg% Fe. În deficitul de transferină sunt scăzute atât sideremia

cât şi, evident, CTFFE. În anemia feriprivă sideremia este mult scăzută, în timp ce CTFFe

este mult crescută, cauza fiind utilizarea ferului plasmatic pentru producţia de

hemoglobină. La rândul ei producţia accelerată de hemoglobină poate fi cauzată de

pierderile cronice de sânge, sarcini repetate, hemoragii puternice.

99

Dozarea fosfatului anorganic din ser prin

metoda Briggs ( cu deproteinizare)

În serul sanguin şi alte lichide biologice fosforul se găseşte sub trei forme:

1. Combinat în proteine (a) sau acizi nucleici (b) ca:

(a) fosfoproteine ( cazeina din lapte, vitelina din gălbenuşul de ou)

(b) nucleoproteine (mediul intracelular animal, etc.).

2. Sub formă acidosolubilă, adică neprecitabilă cu acid tricloracetic:

a. fosfor anorganic ( acid ortofosforic (H3PO4), H2PO4-, HPO4

2-, Me4P2O7),

b. nucleotide, c. esteri fosforici ai glucidelor, d. acid fosfogliceric, e. acid fosfopiruvic, f.

acid creatinfosforic, g. acizi trifosforici

3. Fosfolipide: lecitine, cefaline, sfingomieline etc.

Fosfaţii anorganici îndeplinesc unele roluri în lichidele şi ţesuturile biologice:

a) Sistemul tampon al fosfaţilor (H2PO4-/ HPO4

2-). În organismul uman mediul

intern are bazicitatea uşor crescută peste neutralitate, pH = 7,35 -7,45. Menţinerea

constantă a pH-ului în mediu intern este realizată, alături de alte sisteme tampon, prin

sistemul tampon al fosfaţilor. Acest sistem poate fi alcătuit din două săruri: fosfat

monoacid (Na2HPO4 sau K2HPO4) - care constituie componenta bazică a sistemului - şi

fosfatul diacid (NaH2PO4 sau KH2PO4) care este componenta acidă. De fapt,

componentele funcţionale în cursul tamponării sunt anionii acestor săruri: HPO42- şi

H2PO4-. La pH-ul normal (7,4), concentraţia anionului HPO4

2- este aproximativ de 5 ori

mai mare decât cea a anionului H2PO4-.

Componenta bazică, HPO42-, tamponează aciditatea mediului prin reacţia:

HPO42- + H+ ---------> H2PO4

-

Componenta acidă, H2PO4-, eliberează protoni care neutralizează ionii OH- ai

bazelor:

H2PO4- + OH- ------------> H2O + HPO4

2-

După cum se observă, produşii rezultaţi în ambele cazuri sunt componentele

sistemului tampon.

Sistemul tampon al fosfaţilor este operant în special în hematii, dar şi în celulele

tubulilor renali.

b) În sânge există un raport aproximativ invers proporţional între ionii fosfat şi

calciu. La nivel renal, hormonul paratiroidian creşte reabsorbţia calciului şi inhibă

100

reabsorbţia ionilor fosfat (acţiune fosfaturică). Efectele la nivelul oaselor şi rinichilor, ale

hormonului cresc calcemia, fără o creştere echivalentă a concentraţiei fosfatului,

împiedicându-se astfel atingerea unor concentraţii critice la care aceşti ioni să formeze

fosfat tricalcic insolubil. De fapt concentraţiile serice ale acestor ioni depăşesc pragul de

solubilitate al fosfatului tricalcic. Totuşi, conţinutul în proteine şi alţi metaboliţi din ser

previne precipitarea sării tricalcice.

Principiu:

Se precipită proteinele cu acid tricloracetic şi se separă prin filtrare. În filtratul

acidulat fosfatul anorganic, împreună cu molibdatul de amoniu, formează fosfomolibdatul

de amoniu ( un complex de culoare galbenă):

12 (NH4)2MoO4 + H3PO4 + 21H+-----> (NH4)3PO4 ⋅ 12MoO3 + 21NH4+

+12H2O(galben)

HPO42- + 12MoO4

2- + 3NH4+ +23H+ → (NH4)3[P(Mo3O10)4].6H2O + 6H2O

Aceasta este redus la albastru de molibden (un amestec de oxizi de molibden,

(MoO2)2.MoO4, fin dispersaţi în apă) de către hidrochinonă şi apoi sulfit de sodiu.

Intensitatea culorii albastre este proporţională cu concentraţia complexului, deci cu

cantitatea de fosfat anorganic din probă, adică culoarea produsă de oxizii de molibden

este fotometrabilă (se supune legii Lambert-Beer).

Aparatură: - Spectrofotometru Spekol.

Reactivi: - Acid tricloracetic 20%

- Soluţie de molibdat de amoniu în mediu acid obţinut prin dizolvarea a

25g molibdat de amoniu în 300ml H2O la care se adaugă 75ml H2SO4

concentrat iar apoi se completează la 500ml cu apă.

- Soluţie de hidrochinonă 1% acidulată cu o picătură de H2SO4

concentrat.

- Soluţie sulfit de sodiu 20% care se împrospătează la fiecare serie de

determinări.

- Soluţie standard stoc de fosfat (2 mgP/ml) preparată folosind ca

substanţă etalon KH2PO4.

- Soluţie standard de lucru (20 µgP/ml) obţinută prin diluarea soluţiei

stoc de fosfat.

101

Curba de calibrare

1 2 3 4În baloane Erlenmeyer se măsoară:Sol. Standard de lucru de P (1ml=20µgP), ml 0,5 1 3 5Acid tricloracetic 20%, ml 2 2 2 2Apă bidistilată, ml 7,5 7 5 3Din acest amestec se măsoară în baloane Erlenmeyer: 5 5 5 5Molibdat de amoniu, ml 1 1 1 1Sulfit de sodiu 20%, ml 1 1 1 1Hidrochinonă 1%, ml 1 1 1 1Apă bidistilată, ml 2 2 2 2

Se omogenizează conţinutul baloanelor şi după 30 min. se citeşte extincţia faţă de blanc la

λ=600 nm.

Modul de lucru:

Se prepară o probă şi un blanc în conformitate cu tabelul de mai jos:

Proba BlancÎn baloane Erlenmeyer se măsoară:

Ser, ml 2 -Apă bidistilată, ml 4 5Acid triloracetic 20%, ml 4 -

Agitare energică şi repaus 10 minFiltrare în eprubete + -

În baloane Erlenmeyer se măsoară:Din filtrat, ml 5 -Molibdat de amoniu, ml 1 1Sulfit de sodiu 20%, ml 1 1Hidrochinonă 1%, ml 1 1Apă bidistilată, ml 2 2

Se omogenizează conţinutul baloanelor şi după 30 min se citeşte extincţia probei

faţă de blanc la λ = 600 nm.

Determinarea fosfatemiei se face raportând extincţia probei citită faţă de blanc la

curba de etalonare.

102

Valori normale: - adulţi:2,5-4,5 mg/100 ml ser (0,8-1,5 mmol/l)

- copii: 4-6 mg/100 ml ser (1,3-1,9 mmol/l)

Variaţii patologice:

Valori scăzute: Hipofosfatemii apar în hiperparatiroidism, rahitism, osteomalacie.

Valori crescute: Hiperfosfatemii apar în hipoparatiroidism, acromegalie,

hipervitaminoză D, tubulopatii renale, insuficienţe renale acute şi

cronice.

Compuşi organici

Dozarea azotului total din ser prin metoda Kjeldahl

Principiu:

Dozarea azotului din materiale biologice se face după metoda pusă la punct de

către Kjeldahl în 1883. Componentele organice azotate din ser se transformă prin

mineralizare în săruri de amoniu care în aparatul Wagner-Parnas eliberează amoniac.

Amoniacul este captat într-o soluţie de H2SO4 în exces iar excesul de H2SO4 se titrează cu

o soluţie de NaOH în prezenţa indicatorului Groak.

Reactivi: - H2SO4 conc.

- Amestec catalizator CuSO4 . 5 H2O şi K2SO4 (1:3), (m:m)

- H2O2 3 %;

- NaOH 30 %;

- H2SO4 N/100;

- NaOH N/100;

- Indicator Groak: la 100 ml sol. alcoolică saturată de roşu metil se

adaugă 4 ml sol. de albastru de metilen 1 %;

Dozarea decurge în trei faze: mineralizarea, antrenarea cu vapori şi titrarea

Mineralizarea pentru distrugerea materiei organice se face cu H2SO4 conc., la

temperatură ridicată şi în prezenţa ionilor de cupru:

2 N + 3 C + 3H2SO4 → 2 NH3 + 3 CO2 + 3 SO2

103

Sulfatul de potasiu ridică temperatura de fierbere la 350-4000 C iar ionii de cupru,

din sulfatul de cupru, au rolul de a cataliza reacţia. În cazul mineralizării NH3

reacţionează cu H2SO4 prezent, transformându-se în sulfat de amoniu, conform reacţiei:

2 NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

Înaintea antrenării cu vapori, NH3 se eliberează din sulfatul de amoniu cu NaOH

concentrat:

(NH4)2SO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O

şi se antrenează cu vapori în aparatul Wagner-Parnas, într-un volum cunoscut de H2SO4

N/100. Excesul de H2SO4 N/100 se titrează cu NaOH N/100 în prezenţă de indicator

Groak.

Aparatură: Aparatul Wagner-Parnas este alcătuit din balonul A (generator de

vapori) în care se formează vaporii de apă, care prin vasul B (deflegmator) trec în balonul

de antrenare C antrenând de aici amoniacul. Aburii sunt condensaţi în refrigerentul

descendent D, iar soluţia apoasă de amoniac se colectează în flaconul Erlenmayer E care

conţine soluţia de H2SO4 N/100.

Modul de lucru:

1) Mineralizarea :

Într-un balon Kjeldahl de mineralizare se introduc 1 ml H2O distilată, 0,1 ml ser,

2 ml H2SO4 conc., un vârf de spatulă amestec catalizator şi 2-3 picături soluţie de H2O2.

Mineralizarea are loc pe flacără mică sub nişă. După 10 minute balonul Kjeldahl se

răceşte la temperatura camerei fiind lăsat în repaos sub nişă (atenţie, emană vapori

corozivi de H2SO4 !).

.

2) Spălarea aparatului Wagner-Parnas:

104

Înaintea acestei distilări aparatul Wagner-Parnas, cu reziduuri de la antrenarea

precedentă se spală. Pentru aceasta se procedează în felul următor: Se înlocuieşte flaconul

E cu un pahar Berzelius care conţine apă distilată. Se spală pâlnia F cu H2O distilată, apoi

se închide din nou robinetul ei. Prin răcirea şi condensarea vaporilor de apă presiunea din

aparat scade sub cea atmosferică şi astfel conţinutul vasului de distilare C este aspirat în

vasul B, din care apa se îndepărtează prin robinetul H în paharul Berzelius. Se răceşte

balonul A cu ajutorul unei cârpe ude până când apa distilată din pahar este aspirată până

în vasul B de unde se îndepărtează prin robinetul H iar după terminarea spălării se

deschide robinetul de siguranţă G şi se poate pregăti distilarea.

3) Antrenarea NH3 cu vapori de apă.

Într-un flacon Erlenmeyer (E) de 100 ml se pipetează 20 ml H2SO4 N/100, se

adaugă 2-3 picături de indicator Groak şi flaconul se aşează sub refrigerentul D în aşa fel

încât capătul acestuia să fie introdus în soluţie. Conţinutul mineralizat al balonului

Kjeldahl se diluează cu precauţie cu 2 ml H2O distilată şi se introduce prin pâlnia F în

vasul de distilare C. Balonul Kjeldahl se spală de 3 ori cu câţiva ml de apa distilată iar

aceasta se colectează tot în pâlnia F.

Se adaugă prin pâlnia F 20 ml NaOH 30%. Se închide robinetul pâlniei F, se

introduce flacăra sub balonul A şi apoi se închide robinetul de siguranţă G se aşteaptă

până când vaporii antrenatori ajung la nivelul refrigerentului D, toate robinetele fiind

închise. Distilarea se face 3 minute, din acest moment, mai precis, după ce prima picătură

de condens cade pe tubul refrigerentului descendet D. În acest timp amoniacul trece

cantitativ în flaconul E.

După terminarea distilării se coboară flaconul în care s-a colectat condensul şi se

lasă să mai picure câteva picături. Cu ajutorul unei pisete se spală capătul refrigerentului

D în acest flacon. Numai după aceasta se scoate becul de gaz de sub balonul A. După

aceasta se poate trece la spălarea aparatului prin procedeul descris mai sus. Conţinutul

flaconului Erlenmayer E se supune titrării.

4) Titrarea

Excesul de H2SO4 N/100 din flaconul Erlenmeyer se titrează cu NaOH N/100 în

prezenţa indicatorului Groak.

Calcul :

105

1 ml sol. H2SO4 N/100 ................. 0,14 mg N

a F b FH SO NaOH⋅ − ⋅2 4 ................... x

x = ( a F b FH SO NaOH⋅ − ⋅2 4 ) × 0,14 mg N/0,1 ml sol.

a = 20 ml H2SO4 N/100

b = volumul de NaOH N/100 consumat la titrare.

Dozarea proteinelor totale din ser prin metoda biuretului

Principiu:

Proteinele reacţionează cu ionii de cupru în soluţie alcalină formând un complex

proteic de culoare violetă. Avantajul constă în faptul că se foloseşte un singur reactiv în

care hidroxidul de cupru este menţinut în soluţie sub formă de complex format cu tartratul

dublu de sodiu şi potasiu, stabilizat cu iodură de potasiu. Reacţia de complexare cu ionii

Cu2+ este dată de compuşi care conţin în molecula lor cel puţin două legături peptidice.

Cel mai simplu compus care dă această reacţie este biuretul, compus care ia

naştere prin încălzirea ureei.

2 O CNH2

NH2

t0

NH3

O

O C

CNH2

NH2

NHCuSO4

NaOH

biuret

H N C

C

O

O

N

N

H

H

( - ) C u N

N ( - )

H

H

C

C

O

O

N H

2 -

+ 2 N a +

106

Aparatura: Spectrofotometru sau fotometru cu filtre

Reactivi: - Soluţia A: 4,5 g tartrat de sodiu şi potasiu se dizolvă în 40 ml

NaOH 0,2 N. Se adaugă sub agitare 1,5 g CuSO4.5 H2O dizolvat în

10 ml H2O, apoi 0,5 g KI şi se completează cu NaOH 0,2 N până

la 100 ml. Se conservă în sticlă brună timp nelimitat.

- Soluţia B: se dizolvă 5 g KI în 1000 ml de NaOH 0,2 N. Se

conservă în sticlă brună timp nelimitat.

- Soluţia de lucru: se diluează 1 volum soluţie A cu 4 volume

soluţie B. Se poate utiliza o săptămână, păstrându-se în sticlă

brună.

- NaCl 0,9 %.

Modul de lucru:

Se lucrează în 2 eprubete conform tabelului:

Proba BlancSol. de lucru ml 5,0 5,0NaCl 0,9% ml - 0,1

Ser ml 0,1 -

Se omogenizează conţinutul eprubetelor şi după 30 de minute se măsoară extincţia

probei (E) faţă de blanc, la λ = 546 nm, folosind cuva de 1 cm.

Calcul:

c (g/100ml) = E

E

V

V

E

cm

F

P11% 2 77

5 1

0 1× = ×

,

,

,

E × 18,4 = g proteine/100 ml ser; VF -volumul final; VP -volumul serului; E cm11% -coeficientul de

extincţie procentual

Valori normale:

6,5 - 8,2 g/100 ml

Valori crescute se întâlnesc în: deshidratări acute produse de vărsături, diaree,

diabet, diabet insipid, poliurie; Hiperproteinemii apar şi în: mielom multiplu

macroglobulinemia Waldenstrőm, boala Osler, boala Besnier-Boeck-Schaumann, anemie

pernicioasă, infecţii acute şi cronice

107

Valori scăzute: se întâlnesc în: afecţiuni hepatice, ciroze hepatice, intoxicaţii cu

benzen, CCl4; Proteinemia scade şi în stări de şoc produse de arsuri, hemoragii;

Hipoproteinemii se întâlnesc în: afecţiuni renale, tumori maligne, inaniţie.

Hiperproteinemie relativă apare în deshidratări acute produse de vărsături, diaree,

poliurie care apare la pacienţii cu diabet insipid şi diabet zaharat. În cazurile enumerate nu

creşte de fapt cantitatea de proteine circulante ci creşte doar concentraţia lor din cauza

pierderii de lichid din organism.

Hiperproteinemie absolută apare în boli inflamatorii cronice (tuberculoză

pulmonară, lupus eritematos sistemic, sarcoidoză). În mielomul multiplu (plasmocitom)

se produce proliferarea canceroasă a unei clone de plasmocite producătoare de

imunoglobuline al căror nivel creşte în sânge. Macroglobulinemia Waldenström este un

limfom malign cu hipergamaglobulinemie. Apare hiperproteinemie şi în unele forme de

leucemie.

Hipoproteinemie relativă apare în cadrul diluării sângelui circulant prin

administrare de perfuzii sau prin ingerare excesivă de lichide.

Hipoproteinemie absolută apare în deficitul genetic de anticorpi sau albumină,

afecţiuni hepatice grave (ciroză cu evoluţie spre insuficienţă hepatică, intoxicaţii cu

benzen, CCl4) în care este compromisă funcţia hepatică de sinteză a proteinelor. Pacienţii

cu tumori maligne prezintă hipoproteinemie datorită catabolismului proteic accentuat. În

inaniţie şi sindrom de malabsorbţie apare carenţă de proteine datorită aportului

insuficient, sau datorită tulburării de absorbţiei intestinală. Se pot pierde cantităţi

însemnate de proteine în sindromul nefrotic (prin filtrul renal lezat trec numeroase

molecule de proteină şi se elimină prin urină), sau poate avea loc pierdere de proteine pe

cale intestinală (enterocolită). Hipoproteinemie mai apare în arsuri extinse, hemoragii,

ascită (lichid bogat în proteine apărut în cavitatea abdominală în cadrul insuficienţei

hepatice).

Electroforeza proteinelor serice

Principiu:

Electroforeza se bazează pe proprietatea particulelor încărcate electric de a migra

spre polul pozitiv sau negativ sub acţiunea tensiunii electrice. În funcţie de pH proteinele

108

se comportă ca anioni şi vor migra spre anod (+), sau ca şi cationi şi vor migra spre catod

(-). În cursul electroforezei componenţii amestecului de analizat se vor separa datorită

vitezelor de deplasare diferite. În funcţie de mediul în care are loc migrarea există două

tipuri de electroforeză: electroforeza în fază liberă şi electroforeza zonală. În cazul

electroforezei în fază liberă migrarea are loc în fază lichidă. Electroforeza zonală

foloseşte o fază solidă sau un gel de amidon, agar, agaroză etc. pentru migrare.

Electroforeza zonală este tipul cel mai folosit în laborator.

Aparate şi materiale: - Sursă de curent continuu: redresor (0-500 V, 0-50 mA)

- Cameră de electroforeză confecţionată din material

plastic care conţine două cuve prevăzute cu electrozi de

platină, şi o punte mobilă pe care se vor pune lamele cu

probele de analizat. În camera de electroforeză închisă cu

un capac se realizează echilibrul lichid (tampon)-vapori de

apă.

Schema aparatului de elecroforeză.

a) plăcuţă de sticlă acoperită cu gel de agaroză; b) suport; c) benzi de hârtie de filtru; d)

soluţie tampon; e) electrozi.

Reactivi:

- Soluţie tampon: tampon Tris-barbital [tris-hidroximetil-

aminometan 7,2 g/l; acid dietilbarbituric (veronal) 1,82 g/l;

dietilbarbiturat de sodiu (medinal) 10,2 g/l; etiltiosalicilat de mercur

(conservant) 0,02 g/l], pH = 8,6

- Gel de agaroză: se prepară o soluţie de agaroză 1% în soluţia

tampon, prin încălzire la fierbere, care se toarnă pe plăcuţe de sticlă

degresate anterior cu alcool. Gelurile se pot păstra în frigider 2-3 zile

în cutii umede de plastic.

- Soluţie de fixare: se amestecă 90 ml metanol cu 20 ml acid

acetic glacial şi cu 90 ml apă bidistilată. Compoziţia ei este metanol

45% şi acid acetic 10%.

109

d

- Colorant: roşu de Ponceau 0,1% în soluţie de acid tricloracetic

10%.

Modul de lucru:

a.) În camera umedă se introduc în cele două cuve laterale volume egale de soluţie

tampon, măsurate cu cilindrul gradat. Aceste două compartimente nu comunică între

ele, deoarece numai în felul acesta curentul electric trece numai prin gel.

b.) Se scoate lama de sticlă cu gel din cutia de plastic. Se aşează o bandă de hârtie de

filtru pe o zonă a gelului unde urmează să fie depusă proba. După umectare se

îndepărtează imediat hârtia de filtru şi se pune în locul ei o matriţă pentru probe.

Matriţa trebuie să adere la gel. Cu o seringă cu Hamilton se introduce 1 µl de ser în

şanţul creat de matriţă şi se aşteaptă 5 minute pentru absorbţia serului în gel. După 5

minute se îndepărtează excesul de ser cu o bandă de hârtie de filtru. Se scoate matriţa

şi se pune lama pe puntea care se află în mijlocul camerei de electroforeză. La

extremităţile lamelor se aplică două hârtii de filtru Whatman îmbibate cu soluţie

tampon. Aceste hârtii de filtru sunt îndoite la capete astfel încât cu un capăt să acopere

aproximativ 1/2 cm din lungimea lamei (gelului), iar celălalt capăt să facă legătura cu

soluţia tampon din cuvele cu electrozi.

c.) Se închide etanş aparatul, se conectează cuvele la redresor şi se lasă probele la migrat

1 h la 170 V.

d.) După migrare se scot lamele din camera de electroforeză şi se introduc 10 minute în

soluţia de fixare, aflată într-o cutie Petri.

e.) Colorarea se face prin îmbibare timp de 5 minute într-o soluţie de colorant aflat într-o

cutie Petri. Excesul de colorant de pe plăcuţe se îndepărtează prin spălare cu apă

distilată.

f.) Uscarea se poate face la termostat sau la temperatura camerei. Gelul uscat va avea

consistenţa unui film.

g.) Determinarea cantitativă a fracţiunilor proteice se face cu ajutorul unui densitometru

optic. Acesta trasează automat curba de extincţie (reflexie optică), care prezintă atâtea

maxime câte fracţiuni sunt. Aparatul calculează valorile procentuale ale fracţiunilor

proteice. În cazul serului normal, prin electroforeza în gel de agaroză, rezultă

următoarele 6 fracţiuni:

110

Fracţiunea Valoarea procentuală g/100ml

Albumine 50-59 3,50-4,20

α1 - Globuline 3-5 0,25-0,40

α2 - Globuline 7-9 0,50-0,65

β1 + β2- Globuline 11-14 0,80-1,02

γ - Globuline 16-20 1,10-1,40

Interpretarea valorilor fracţiunilor proteice.

1. Hiperalbuminemiile apar în puţine stări patologice, mai importante fiind leucozele

limfatice cronice.

2. Hiperglobulinemie globală (α, β, γ ) se întâlneşte în cazul tumorilor maligne, bolilor

infecţioase acute sau cronice, afecţiunilor hepatice cronice, nefropatiilor cronice.

3. Hiperalfaglobulinemia asociată sau nu cu hiperbetaglobulinemia se întâlneşte în

inflamaţii acute (reumatism poliarticular acut, boli infecţioase acute, infarct

miocardic), sindrom nefrotic (cresc îndeosebi α2 – globulinele), tumorile maligne,

poliartrita reumatoidă.

4. Hiperbetaglobulinemia izolată se întâlneşte în β - plasmocitom, hepatite acute

virotice sau toxice, diabet zaharat, sindrom nefrotic, icter obstructiv prelungit.

5. Hiperalfa şi hipergamaglobulinemia sunt întâlnite în inflamaţiile acute şi cronice, în

tumori maligne.

6. Hipergamaglobulinemie izolată se întâlneşte în afecţiunile cu implicaţie imunologică

cum sunt:

- boli infecţioase acute sau cronice: hepatită virotică, mononucleoză infecţioasă;

- limfogranulomatoză benignă, tuberculoză, sifilis, stafilococi, streptococi

endocardită bacteriană subacută;

- colagenaze: poliartrită reumatoidă, lupusul eritematos diseminat, sclerodermie;

- afecţiuni hepatice: hepatite cronice, ciroze;

- afecţiuni neoplazice de sistem: boala Hodkin, leucemii.

7. Hipogamaglobulinemia se întâlneşte în :

- agamaglobulinemie şi hipogamaglobulinemie congenitală;

- afecţiuni digestive: inflamaţia mucoasei digestive, neoplasm digestiv;

- sindrom nefrotic;

111

- insuficienţă cardiacă;

- arsuri întinse;

- eczeme generalizate.

În figură sunt prezentate proteinogramele obţinute prin citirea electroforegramelor

la densitometru optic, în câteva cazuri patologice precum şi în cazul normal. a) Normal

(vezi tabelul de mai sus), b) Inflamaţie acută, c) Inflamaţie cronică, d) Sindrom nefrotic,

e) Enteropatie exudativă, f) Ciroză hepatică, g) Mielom multiplu, h)

Hipogamaglobulinemie.

Dozarea azotului neproteic din ser prin metoda Kjeldahl

Principiu:

Azotul neproteic reprezintă azotul din substanţele ce rămân în soluţie după

deproteinizarea serului (uree, acid uric, creatină, creatinină, aminoacizi, amoniac, etc.).

Dintre acestea azotul ureic reprezintă mai mult de 50 %. Diferenţa dintre azotul total

neproteic şi azotul ureic se numeşte azot rezidual.

După precipitarea şi îndepărtarea proteinelor conţinutul de azot neproteic se

determină după acelaşi principiu ca şi în cazul dozării azotului total din ser prin metoda

Kjeldahl.

Aparatură: Aparatul Wagner-Parnas.

112

Reactivi: - Fosfowolframat de sodiu 10 %

- H2SO4 0,58 N

- H2SO4 conc.

- Amestec catalizator CuSO4.5H2O şi K2SO4 (1:3)

- H2O2 3 %

- NaOH 30 %

- H2SO4 N/100 cu factorul FH2SO4

- NaOH N/100 cu factorul FNaOH

- Indicator Groak

Modul de lucru:

1) Deproteinizarea serului: Într-un flacon Erlenmeyer se introduc 2 ml ser, 4 ml

H2O bidistilată, 2 ml soluţie de fosfowolframat de sodiu şi 2 ml H2SO4 0,58 N. Se agită

energic şi după 10 minute proba se filtrează.

2) Mineralizarea : Într-un balon Kjeldahl se introduc 2 ml filtrat, 2 ml H2SO4

conc., 2-3 picături soluţie de H2O2 şi un vârf de spatulă de amestec catalizator.

Mineralizarea are loc pe flacără mică sub nişă. După 10 minute balonul Kjeldahl se

răceşte la temperatura camerei.

3) Spălarea aparatului Wagner-Parnas: se face ca mai sus.

4) Antrenarea NH3 cu vapori de apă : Se efectuează după modul descris la dozarea

azotului total, cu excepţia faptului că amoniacul pus în libertate se va capta în 10 ml

H2SO4 N/100.

5) Titrarea: Excesul de H2SO4 se titrează cu o soluţie de NaOH N/100 în prezenţa

indicatorului Groak.

Calcul :

1 ml sol. H2SO4 N/100 ................. 0,14 mg N

a F b FH SO NaOH⋅ − ⋅2 4 .................. x

x = ( a F b FH SO NaOH⋅ − ⋅2 4 ) × 0,14 mg N/0,4 ml ser

a = 10 ml H2SO4 N/100

b = volumul NaOH N/100 consumat la titrare

Rezultatul se exprimă în mg N neprot./100 ml ser.

Având în vedere că 50% din azotul neproteic este reprezentat de azotul ureic,

interpretarea ese aceeaşi cu cea de la uree.

Valori normale : 20 - 40 mg N neprot./ 100 ml ser

113

Valori crescute: se întâlnesc în afecţiuni renale ca insuficienţa renală cronică sau

în obstrucţii ale căilor urinare. Aceste valori se mai întâlnesc în arsuri, hemoragii

digestive, boala Addison.

Dozarea ureei din ser prin metoda cu urează

Principiu:

Ureea din ser este hidrolizată sub acţiunea unei enzime specifice, ureaza, şi se

descompune în amoniac şi dioxid de carbon. Amoniacul eliberat este determinat apoi pe

baza reacţiei pe care o dă cu fenolul şi hipocloritul de sodiu în mediu alcalin. (Reacţia

Berthelot).

parachinoncloroimina formată astfel, reacţionează cu o altă moleculă de fenol pentru a

forma indofenol care dezvoltă în mediu alcalin o intensă culoare albastră. Reacţia este

catalizată de nitroprusiatul de sodiu.

NO O-

Reactivi:

- urează tamponată: se dizolvă 1 g EDTA în 80 ml apă bidistilată şi se

ajustează, pH-ul la 6,5 cu NaOH diluat. Se adaugă apoi 150 mg urează şi se

completează volumul la 100 ml cu apă bidistilată. Se agită bine şi se păsrează

într-un vas de plastic.

- soluţie etalon de uree: 40 mg uree pură, uscată în prealabil în exicator, se

dizolvă în apă bidistilată aducându-se la 100 ml.

- reactiv fenolic. Se dizolvă 25 g fenol chimic pur în 400 ml apă bidistilată.

Separat se dizolvă 125 mg nitroprusiat de sodiu în 50 ml apă distilată. Se

amestecă cele două soluţii şi se aduce volumul la 500 m1.

- reactiv hipoclorit. Într-un balon de 500 ml se dizolvă 12,5 g NaOH în 400 ml

apa bidistilată. Se adaugă apoi un volum de hipoclorit comercial conţinând

1,10 g hipoclorit de sodiu (de regulă 20 ml soluţie). Se aduce volumul la 500

ml.

114

ClO- +OH NH3 Cl+ O N

Modul de lucru:

Se pipetează 0,2 ml suspensie urează într-o serie de eprubete. Se adaugă apoi cu o

pipetă câte 0,02 ml ser în probele de analizat, 0,02 ml apă distilată pentru proba oarbă şi

0,02 ml soluţie de uree 40 mg% pentru proba standard. Se incubează eprubetele la 37°C

pe baia de apa timp de 15 minute. Se scot eprubetele de la incubat şi se adaugă 1 ml

reactiv fenolic, se agită uşor şi se adaugă 1 ml reactiv hipoclorit alcalin. Se incubează din

nou la 37°C timp de 15 minute pentru dezvoltarea culorii. Se scot din baie eprubetele şi se

diluează prin adăugarea a 10 ml apă distilată. Se amestecă continuu eprubetele şi se

citeşte extincţia la 630 nm fată de proba oarbă.

Calcul: uree mg% = (E probei / E standardului )• 40

Dozarea ureei din ser prin metoda Kowarski

Principiu: Ureea este descompusă în mediu alcalin cu ajutorul soluţiei de

hipobromit de sodiu rezultând azot molecular, dioxid de carbon şi apă. Soluţia de

hipobromit de sodiu se prepară din Br2 şi NaOH .

Br2 + 2NaOH → NaOBr + H2O

O CNH2NH2

+ 3NaOBr + CO2 + 3 NaBr + 2 H2ON2

Dioxidul de carbon este fixat de către NaOH, aflat în exces în soluţia de

hipobromit de sodiu, sub formă de Na2CO3 conform reacţiei:

CO2 + 2NaOH → Na2CO3 + H2O

Azotul molecular degajat este măsurat volumetric în aparatul Kowarski.

115

116

Aparatură : Aparatul Kowarski are forma unui tub în formă de "U". Ramura

stângă (A) este prevăzută în partea superioară cu un robinet (a) şi este gradată atât

deasupra cât şi dedesubtul robinetului. Ramura dreaptă (B) nu este gradată şi are în partea

inferioară un robinet (b) cu trei căi în formă de T. De aici se ramifică şi tubul de scurgere

(C). Pe robinetul cu trei căi (b) direcţia căii verticale a T-ului este evidenţiată de obicei ca

o umflătură sau adâncitură (semn). Prin răsucirea acestui robinet se obţin trei poziţii în

funcţie de poziţia umflăturii robinetului: 1) semnul în spate : comunică A cu B. 2)

semnul în jos : comunică A cu C. 3) semnul în sus : comunică B cu C. 4) semnul în faţă :

comunică A şi B cu C

117

Reactivi: - Acid tricloracetic 10 %.

- Soluţie Kowarski : 350 g NaCl şi 150 g K2SO4 se dizolvă la

fierbere în 1000 ml H2O, se răceşte şi se filtrează.

- Soluţie NaOBr : se prepară proaspăt, adăugând sub nişă, sub

agitare, 12 picături de brom la 6 ml NaOH 33 %. Se păstrează la

gheaţă cel mult o săptămână.

Modul de lucru:

Deproteinizarea serului: într-un flacon Erlenmayer se pipetează 2,5 ml ser şi 2,5

ml acid tricloracetic 10 %. Se agită şi după 10 minute se filtrează.

Manipularea aparatului : Se umple aparatul cu soluţie Kowarski. Pentru aceasta se

stabileşte legătura între ramurile A şi B, se deschide robinetul "a" şi se toarnă soluţia

Kowarski în aparat prin ramura B până când lichidul depăşeşte nivelul robinetului "a" cu

1-2 ml. Dacă rămâne aer în aparat, el se îndepărtează prin tubul de scurgere C (semnul în

jos), apoi se completează lichidul până la nivel. Se închide robinetul "a", se îndepărtează

cu o pipetă lichidul de deasupra şi se usucă cu o fâşie de hârtie de filtru. Robinetul "b" se

aşează cu semnul în jos. În ramura A se toarnă aproximativ 3,5 ml filtrat. Se lasă să

pătrundă în aparat, prin deschiderea robinetului "a", exact 2,5 ml filtrat. Excesul de soluţie

Kowarski se va scurge prin tubul C. Se îndepărtează cu o pipetă restul filtratului, se spală

cu H2O distilată şi se usucă din nou cu hârtie de filtru. Se introduc apoi, prin ramura A, 6

ml soluţie de NaOBr. Se lasă să intre în aparat cca. 5 ml. Degajarea azotului începe

imediat împingând în jos soluţia Kowarski care se scurge prin tubul C. După 10 minute se

aduce la nivelul ramurei A soluţia din ramura B, lăsând să curgă din ramura B lichidul în

exces (semnul în sus). Apoi se stabileşte comunicarea între ramurile A şi B (semnul în

spate). În acest fel azotul din aparat va avea aceiaşi presiune cu cea a mediului

înconjurător. Se citeşte volumul azotului degajat (vN2) precum şi temperatura şi presiunea

atmosferică. După dozare aparatul Kowarski se goleşte şi se spală cu apă distilată pentru

a evita blocarea robinetelor.

Calcul:

v FN2100× × = mg uree/100 ml ser

vN2 - volumul de azot degajat

F - factor de conversie din ml N2 în mg uree

Se caută în tabelul Kowarski factorul F care corespunde temperaturii şi presiunii

barometrice din timpul determinării. Această valoare se introduce în formula de mai sus.

118

Baro-

metru10º C 12º C 14º C 16º C 18º C 20º C 22º C 24º C 25º C

710 1,91 1,90 1,88 1,86 1,84 1,83 1,81 1,80 1,79720 1,94 1,92 1,91 1,89 1,87 1,85 1,84 1,82 1,80725 1,95 1,93 1,92 1,90 1,89 1,87 1,85 1,83 1,82730 1,97 1,94 1,93 1,91 1,90 1,88 1,87 1,85 1,83735 1,98 1,96 1,94 1,93 1,91 1,89 1,88 1,86 1,84740 1,99 1,97 1,96 1,94 1,92 1,90 1,89 1,87 1,86745 2,01 1,99 1,98 1,96 1,94 1,92 1,91 1,89 1,87750 2,02 2,00 1,99 1,97 1,95 1,93 1,92 1,90 1,88755 2,04 2,02 2,00 1,98 1,96 1,95 1,93 1,92 1,90760 2,05 2,03 2,01 2,00 1,98 1,96 1,95 1,93 1,91765 2,06 2,05 2,03 2,01 1,99 1,97 1,96 1,94 1,92770 2,08 2,06 2,04 2,02 2,00 1,98 1,97 1,95 1,93

Valori normale : 21 - 54 mg uree/100 ml ser sau 3,5 – 9,0 mmoli/l

Valori crescute : Patologic creşterea ureei poate fi de origine renală sau

extrarenală.

Cauze de origine renală: insuficienţă renală acută sau cronică; (eliminare scăzută),

glomerulonefrită acută sau cronică, nefroangioscleroză

benignă sau malignă, tuberculoză renală, tumori renale,

rinichi polichistic, calculoză.

Cauze de origine extrarenlă: stări de exsicoză şi şoc provocate de hemoragii, arsuri,

traumatisme;

Valori scăzute : - insuficienţă hepatică gravă (ciroză)(sinteză scăzută)

Dozarea acidului uric din ser

Principiu:

Acidul uric (catabolitul final al nucleotidelor purinice) reduce în mediu alcalin

reactivul fosfowolframic până la un produs de culoare albastră. Intensitatea culorii este

proporţională cu concentraţia acidului uric în proba de analizat.

Reactivi: - Acid tricloracetic 20%

- Reactiv fosfowolframic: într-un balon de 1000 ml prevăzut cu

refrigerent cu reflux, se introduc 50 g wolframat de sodiu, 40 ml

H3PO4 85% (d = 1,71 g/cm3) şi 350 ml apă bidistilată. Se fierbe

lent aproximativ 6 ore. Se răceşte balonul şi conţinutul său se

trece cantitativ într-un balon cotat de 500 ml. Se aduce la semn

119

cu apă bidistilată. Dacă reactivul este verde se adaugă 1-2

picături de brom şi se fierbe câteva minute fără refrigerent

pentru îndepărtarea excesului de brom. Reactivul are culoarea

galben-verde deschis, păstrat în sticlă brună, el nu se alterează.

Reacţia este următoarea:

12 Na2WO4 + 9 H3PO4 = P(W2O7)6H7 + 8 Na3PO4 + 10 H2O

- Na2CO3 crist 22%

- Soluţie stoc de acid uric: se introduc în aproximativ 60 ml apă

bidistilată caldă (60°C) 100 mg acid uric, 200 mg fosfat disodic,

100 mg fosfat monosodic şi se agită până la dizolvare completă.

După răcire se completează la 100 ml cu apă bidistilată într-un

balon cotat. Soluţia stoc, închisă ermetic prin parafinare (după

adăugare de 3-4 picături de cloroform) se poate păstra 4-5 luni la

temperatura de +4°C.

- Soluţia standard de acid uric se prepară prin diluarea soluţiei

stoc: 1 ml se aduce la 100 cu apă bidistilată.

Modul de lucru:

a) Deproteinizarea serului: Într-un balon Erlenmeyer se introduc 2 ml ser, 4 ml apă

bidistilată si 2 ml acid tricloracetic 20%. Se agită puternic şi după 10 minute se

filtrează.

b) Reducerea reactivului fosfowolframic se realizează efectuând următoarele amestecuri

în eprubete care apoi se agită energic:

Probă Standard BlancFiltrat, ml 2,0 - -Sol. standard, ml - 2,0 -Apă distilată, ml - - 2,0Na2CO3 22%, ml 0,9 0,9 0,9Reactiv fosfowolframic, ml 0,1 0,1 0,1

Se lasă eprubetele în repaus 10 minute la temperatura camerei, apoi se măsoară

extincţia probei şi a standardului faţă de blanc la λ=610 nm în cuva de 1 cm.

Observaţie: În cazul că proba prezintă opalescenţă, ea se centrifughează înainte de

măsurarea estincţiei.

120

Calcul:

concentraţia standardului = 1 mg%

2 ml filtrat corespunde la 0,5 ml ser ( diluţia serului= 2/0,5 = 4)

Ep/Es x 1 x 4 = mg acid uric/100 ml ser iar mg % x 60 = µmoli/l

Valori normale: 2-8 mg acid uric/100 ml ser ( 119 - 476 µmoli/l )

Valori crescute: fiziologic: după efort fizic accentuat sau după ingestia unor

cantităţi crescute de alimente bogate în acizi nucleici (ficat,

testicule).

patologic: a) hiperuricemie primară (biosinteză crescută sau

eliminare renală scăzută)

b) hiperuricemie secundară, destrucţie celulară

accentuată în tumori maligne, anemie hemolitică,

pneumonie severă etc.; eliminare renală scăzută

(insuficienţă renală, acidoză metabolică si

respiratorie)

Hiperuricemia de durată determină acumularea acidului uric în organism şi apariţia gutei.

Valori scăzute: mai rar întâlnite, apar în urma administrării unor medicamente, defecte

enzimatice (xantinurie ereditară), afecţiuni hepatice grave.

Dozarea creatininei din ser prin metoda Folin

Principiu:

Creatinina reacţionează cu acidul picric (galben) în mediu alcalin dând naştere

unui produs a cărui coloraţie poate fi de la orange la roşu aprins. Intensitatea coloraţiei

roşii este proporţională cu concentraţia creatininei din probă. Coloraţia se datorează

formării unor tautomeri coloraţi ai creatininei, unul din ei fiind stabilizat prin complexare

de un mezomer al acidului picric (reacţia Jaffé).

121

Complex roşu portocaliu de titrat de creatinină

Reactivi: - Wolframat de sodiu 10%.

- H2SO4 2/3N.

- Soluţie saturată de acid picric.

- NaOH 10%.

- Soluţie picrat alcalin; se prepară înainte de utilizare prin

amestecarea unui volum de soluţie de acid picric cu 2 volume

NaOH 10%

- Soluţie stoc de creatinină: se dizolvă în HCl 0,1N 100 mg

creatinină pură sau 160,2 mg clorură de zinc creatinină şi se aduce

volumul la 100 ml cu HCl 0,1N

- Soluţia standard de creatinină se obţine diluându-se 1 ml din

soluţia standard stoc la 100 ml cu apă bidistilată. Această soluţie

conţinând 0,01 mg creatinină/ml trebuie reînnoită săptămânal.

Modul de lucru:

Într-un balon Erlenmeyer se introduc 2 ml de ser şi 6 ml acid picric saturat şi se

agită energic. Se introduce balonul pentru 15-20 secunde într-o baie de apă fierbinte.

După răcire se filtrează într-o eprubetă iar din filtrat se măsoară 5 ml. Se adaugă 0,25 ml

soluţie de NaOH 10% se agită şi peste 15 minute se citeşte extincţia probei (Ep) faţă de

martor la λ = 530 nm. Martorul este soluţia de picrat alcalin, căreia în loc de ser i s-au

adăugat 2 ml apă bidistilată. În paralel se efectuează aceleaşi operaţii, în locul serului

folosindu-se soluţie standard de creatinină. Extincţia obţinută este Es.

Calcul:

Ep/Es = mg creatinină/100ml ser.

Valori normale: 0,6-1,8 mg/100ml ser sau 53-159 µmoli/l.

Variaţii fiziologice: nivelul seric al creatininei suferă doar foarte mici variaţii în

condiţii fiziologice. El poate creşte în condiţiile unei diete foarte bogate în proteine.

Clearance-ul endogen de creatinină (fără aport exogen de creatinină) este un indicator al

filtrării glomerulare la subiecţii normali.

Valori patologice crescute: se întâlnesc în insuficienţă renală cronică (este ultima

substanţă azotată care creşte în sânge în aceste condiţii, ca şi în condiţiile fiziologice),

distrofia musculară progresivă, eclampsie, acromegalie.

122

Dozarea bilirubinei din ser prin diazorecţia van den Bergh

Principiu:

Bilirubina reacţionează cu diazo-reactivul Ehrlich (acid sulfanilic diazotat) şi

formează azopigmenţi, care au culoare roşie în mediu slab acid sau neutru (reacţia van

den Bergh). Azopigmentul A este un fragment de bilirubină cuplată cu sarea de diazoniu a

acidului sulfanilic iar azopigmentul B este un fragment de bilirubină conjugată cuplată cu

aceiaşi sare de diazoniu. Intensitatea coloraţiei este proporţională cu concentraţia

bilirubinei din ser.

Bilirubina + 2 NN SO3

Azopigmnet A (B)

CH3

2

CHO N NH H

CH=CH2 CH3 CH2 CH2 COOH(R)

N=N SO3

+

H

R: radical de acid glutaric

Ionul de diazoniu

Reactivi:

- Soluţie HCl 1N;

- Soluţie de cofeină-benzoat-acetat: se cântăresc şi se amestecă 20 g

cofeină pură, 30 g benzoat de sodiu, 50 g acetat de sodiu. Se adaugă 400

ml apă bidistilată şi se dizolvă încălzind uşor. După răcire se filtrează.

- Reactiv diazo: Sol.A: se măsoară 0,5 g acid sulfanilic într-un balon cotat

de 500 ml, se adaugă 125 ml HCl 1N şi se completează până la semn cu

apă bidistilată

Sol.B: NaNO2 0,5%

Înainte de întrebuinţare se amestecă 10 ml soluţie A cu 0,3 ml soluţie B.

- NaCl 0,9%

Bilirubina neconjugată (bilirubina indirectă) în stare liberă nu este hidrosolubilă,

este menţinută în soluţie apoasă prin legarea sa strânsă pe albumină. Această bilirubină nu

reacţionează direct cu reactivul diazo ci doar în prezenţă de acceleratori (alcooli inferiori,

cofeină, etc.), care o eliberează din legătura cu albumina şi o menţin în soluţie. Nu se

filtrează la nivel glomerular, deci în mod normal nu apare în urină.

Bilirubina conjugată (bilirubina directă) hidrosolubilă reacţionează direct cu

reactivul diazo. Se filtrează la nivel glomerular şi apare în urină.

123

Se dozează paralel bilirubina totală (directă + indirectă) si bilirubina directă.

Modul de lucru: Se lucrează în trei eprubete după tabelul de mai jos:

Bilirubina totală Bilirubina directă Blancreactiv Ehrlich ml 0,5 0,5 -sol. de cofeină ml 3,5 - -NaCl 0,9% ml - 3,5 4,0ser ml 1,0 1,0 1,0

După amestecarea reactivilor se agită energic eprubetele iar după 5 minute se

citesc extincţiile la λ = 530 nm, în cuva de 1 cm faţă de blanc.

Calcul:

Rezultatul se calculează cu ajutorul coeficientului de extincţie specific procentual

(a) al azopigmentului la λ = 530 nm:

1g% 1mg% a = E1cm = 943, de unde E1cm = 0,943

Volumul final (Vf ) = 5,0 ml; volumul probei (Vp) = 1,0 ml; diluţia probei = Vf/Vp

= 5

Ep = extincţia citită

Concentraţia bilirubinei (bilirubinemia) se calculează cu formulele:

mg bilirubină/100 ml ser = 3,5×× p1mg%1cmp Esau 5/EE

µmoli bilirubină/l ser = Ep x 91 ştiind că Mbilirubină = 584

Se calculează separat valoarea bilirubinemiei totale şi a celei directe iar diferenţa

între aceste două valori reprezintă bilirubinemia indirectă.

Valori normale: Circa 1 mg% (cca.17 µmoli/l) bilirubină totală, din care bilirubina

directă cca. 0,25 mg% (4,3 µmoli/l).

Valori crescute: Bilirubina se va infiltra determinând apariţia unei coloraţii gălbui

a scleroticelor şi a tegumentelor (icter) la valori de peste 3 mg% (51µmoli/l).

Hiperbilirubinemiile pot fi cauzate de:

- creşterea vitezei de formare a bilirubinei în urma degradării excesive a

hemoglobinei (hemoliză) în icterul hemolitic;

124

- scăderea capacităţii de conjugare a ficatului cauzează

hiperbilirubinemia indirectă (10-40mg%) la homozigoţi (sindromul

Crigler-Najjar de tip I);

- scăderea capacităţii de eliminare a bilirubinei de către ficat (boala

Gilbert);

- perturbarea eliminării prin bilă a bilirubinei în urma blocării căilor

biliare (calculi, tumori cum ar fi neoplasmul de cap de pancreas) în

icterul mecanic;

- deficitul intrahepatic de eliminare activă a bilirubinei conjugate de la

nivelul microsomilor hepatici în canaliculele biliare (sindrom Dubin-

Johnson) determină hiperbilirubinemie directă (2-10 mg%);

- icterul neonatal , datorat imaturităţii sistemelor de epurare a bilirubinei

la nou născut când bilirubinemia este crescută (4-5 mg%) temporar (1-

2 zile) după care revine la normal.

Glucoza

Determinarea glicemiei prin metoda Hagedorn-Jensen (titrimetrică)

Glucoza este repartizată în mod inegal şi variabil între plasmă şi eritrocite, de

aceea dozarea ei se face din sângele total, recoltat pe florură de sodiu. Aceasta previne

coagularea sângelui şi inhibă glicoliza.

Principiu:

Glucoza prezentă în filtratul de sânge (deproteinizat), reduce cantitativ fericianura

de potasiu în ferocianură de potasiu.

K3[Fe(CN)6] + glucoză K4[Fe(CN)6] + acid gluconic

Excesul de fericianură eliberează iodul din iodura de potasiu în mediu acid.

2 K3[Fe(CN)6] + 2 KI CH3COOH 2 K4[Fe(CN)6] + I2

125

Această reacţie fiind reversibilă, deplasarea ei spre dreapta se realizează prin

precipitarea ferocianurii sub formă de sare dublă de zinc şi de potasiu. Acelaşi rol are şi

asigurarea mediului acid (CH3COOH).

2 K4[Fe(CN)6] + 3 ZnSO4 K2Zn3[Fe(CN)6] ↓ + 3 K2SO4

Iodul pus în libertate se titrează cu tiosulfat de sodiu, în prezenţa amidonului ca

indicator.

2 Na2S2O3 + I2 Na2S4O6 + 2 NaI

Reactivi: - NaOH N/10

- ZnSO4 0,45 % (se păstrează aproximativ trei săptămâni)

- K3[Fe(CN)6] N/200 (într-un balon cotat de 1000 ml se măsoară

1,65 g fericianură de potasiu pură, 10,6 g carbonat de sodiu pur

anhidru şi apă distilată până la semn)

- ZnSO4 - NaCl (se măsoară 100 g sulfat de zinc, 500 g clorură de

sodiu şi apă distilată până la 1600 ml)

- KI 2,5 %

- CH3COOH 3 % (3 ml acid acetic glacial, H2O distilată până la

100 ml)

- Reactivul KI – ZnSO4 – NaCl: 5 ml KI 2,5% + 20 ml sol. ZnSO4

– NaCl

- Amidon 1%

- KIO3 N/200 F KIO3= 1,000

- Na2S2O3 N/200 (factorul soluţiei se verifică prin titrare cu soluţia

de KIO3 N/200)

Modul de lucru:

Se lucrează cu 4 eprubete, din care primele două vor fi pentru probe, celelalte

două pentru blancul reactivilor.

126

Deproteinizarea: În fiecare eprubetă se măsoară1 ml NaOH N/10 + 5 ml ZnSO4

0,45 %. Se formează un precipitat gelatinos de hidroxid de zinc care serveşte la

deproteinizarea prin adsorbţie a proteinelor coagulate ale sângelui. Se adaugă apoi numai

în primele două eprubete, pentru probe câte 0,1 ml sânge. În continuare nu există nici o

deosebire între prelucrarea probelor şi a blancului. După agitare se pun toate eprubetele

pe un stativ, se introduc într-o baie de apă clocotind şi se fierb 5 minute. După fierbere se

filtrează conţinutul eprubetelor prin filtrele pregătite în prealabil, în tuburi Hagedorn (sau

baloane Erlenmeyer de 50 ml). Pentru a evita pierderi de glucoză se spală eprubetele, de 2

ori cu câte 3 ml apă distilată fiartă trecând şi această apă distilată prin filtru.

Reducerea fericianurii: Se adaugă la filtratul din fiecare balon câte 2 ml

fericianură de potasiu N/200 (măsuraţi foarte exact). Se agită uşor şi se introduc baloanele

pentru 15 minute într-o baie de apă în fierbere. După răcirea baloanelor într-un curent de

apă, se introduc câte:

- 2 ml din reactivul KI - ZnSO4 - NaCl.

- 2 ml acid acetic 3 %

- 2 picături amidon 1 %.

Se titrează soluţiile din tuburile Hagedorn (baloane Erlenmeyer) cu tiosulfat de

sodiu N/200 până la dispariţia culorii albastre.

Calcul:

Calculul se face cu ajutorul unui tabel care dă echivalenţa dintre numărul de ml de

tiosulfat folosit la titrare şi concentraţia glucozei în mg/100 ml. Se ia media probelor

paralele şi cifra obţinută se înmulţeşte cu factorul tiosulfatului. Se procedează la fel şi în

cazul blancurilor, care ne oferă o măsură a impurităţilor reducătoare din reactivi. Se caută

în tabelul dat concentraţiile de glucoză corespunzătoare. Din "glicemia" probei se scade

"glicemia" blancului. Diferenţa obţinută exprimă concentraţia de glucoză în mg/100 ml de

sânge analizat.

TABEL

Relaţia dintre ml de Na2S2O3 N/200 consumat la titrare şi glicemia în mg %

Na2S2O3 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,090,0 385 382 379 376 373 370 367 364 361 3580,1 355 352 350 348 345 343 341 338 336 333

127

0,2 331 329 327 325 323 321 318 316 314 3120,3 310 308 306 304 302 300 298 296 294 2920,4 290 288 286 284 282 280 278 276 274 2720,5 270 268 266 264 262 260 259 257 255 2530,6 251 249 247 245 243 241 240 239 236 2340,7 232 230 228 226 224 222 221 219 217 2150,8 213 211 209 208 206 204 202 200 199 1970,9 195 193 191 190 188 186 184 182 181 1791,0 177 175 173 172 170 168 166 164 163 1611,1 159 157 155 154 152 150 148 146 145 1431,2 141 139 138 136 134 132 131 129 127 1251,3 124 122 120 119 117 115 113 111 110 1081,4 106 105 102 101 99 97 95 93 92 901,5 88 86 84 83 81 79 77 75 74 721,6 70 68 66 65 63 61 59 57 56 541,7 52 50 48 47 45 43 41 39 38 361,8 34 32 31 29 27 25 24 22 20 191,9 17 15 14 12 10 8 7 5 3 2

Exemplu: media volumelor soluţiei de tiosulfat întrebuinţată pentru titrare celor

2 probe să o presupunem 1,53. Aceasta se înmulţeşte cu factorul pe care îl presupunem

0,9660.

1,53 × 0,9660 = 1,47798 ≈ 1,48 ml tiosulfat N/200

Media probelor în alb (blancuri) să fie 1,85 care se înmulţeşte cu factorul, adică,

1,85 × 0,9660 = 1,7871 ≈ 1,79 ml tiosulfat N/200.

La 1,48 ml tiosulfat corespund în tabel 92 mg glucoză/100 ml, iar la 1,79 ml, 36

mg %.

Rezultatul este dat de diferenţa: 92 - 36 = 56 mg/100 ml.

Mmoli/l = (mg/100 ml) × 10/180 = (mg/100 ml) × 0,055; (M glucoză = 180)

În condiţiile de mai sus, mmoli/l = 56 x 0,055 = 3,08. Valoarea obţinută indică

hipoglicemie.

Valori normale: 4,4 - 6,6 mmoli/l (80 - 120 mg %)

Dozarea glucozei prin metoda enzimatică (glucozoxidază)

Principiu:

Glucoza, sub acţiunea glucozoxidazei, se transformă în acid gluconic. H2O2

rezultată va fi descompusă de peroxidază, în urma reacţiei la care participă şi indicatorul

Trinder (fenol şi 4-aminoantipirină), rezultând un produs de condensare colorat în roşu cu

128

absorbţie maximă la λ = 505 nm. Extincţia este direct proporţională cu concentraţia

glucozei. Reacţiile care stau la baza metodei sunt următoarele:

glucozoxidazăGlucoză + O2 + H2O acid gluconic + H2O2

peroxidază

2 H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina Chinonimină + 4 H2O (roşu)

Reactiv i: 1). Reactiv 1 conţine: tampon TRIS-Cl sau Sörensen 90 mmoli/l şi fenol

0,3 mmoli/l (pH = 7,5 ).

2). Reactiv 2 conţine: glucozoxidază 10000 U/l, peroxidază 1000 U/l şi

4-aminoantipirină 2,6 mmoli/l

3). Reactiv 3 conţine: standard de glucoză 5,56 mmoli/l (1g/l sau 100 mg

%)

Probe: ser nehemolizat, plasmă heparinată, sânge deproteinizat, LCR

(lichid cefalorahidian).

Modul de lucru:

Se amestecă conţinutul unei sticluţe de reactiv 2 cu conţinutul unei sticluţe de

reactiv 1, obţinând astfel reactivul de lucru. Stabilitatea soluţiei la 20 - 25 oC este 2

săptămâni, iar la 2 - 8oC este de o lună.

Se prepară următoarele soluţii:

Blanc Standard ProbăH2O distilată 10 µl - -

Standard - 10 µl -Probă - - 10 µl

Reactiv de lucru 1 ml 1 ml 1 ml

Se agită conţinutul eprubetelor şi se incubează timp de 10 minute la 37 oC sau 30

minute la temperatura camerei (20 - 25 oC). Se măsoară extincţia probei faţă de blanc la

505 nm (490 - 550 nm). Culoarea formată este stabilă 30 minute.

Calcul:

E probă

129

Cprobă = × Cstandard E standard

Cstandard este 5,56 mmoli/l, sau 100 mg %, în funcţie de unităţile de măsură folosite

la exprimarea concentraţiei glucozei din soluţia standard.

Linearitate: Extincţia este direct proporţională cu concentraţia glucozei până la

22,22 mmoli/l (sau 400 mg %). Dacă concentraţia glucozei depăşeşte această valoare, se

diluează proba cu ser fiziologic şi se repetă determinarea. La calcularea rezultatului se ia

în considerare diluţia.

Valori normale: ser, plasmă: 3,9 - 5,8 mmoli/l (70,2 – 104,45 mg %)

LCR: 2,8 - 3,9 mmoli/l (50,4 – 70,2 mg %)

Teste rapide pentru determinarea glicemiei

În practica medicală curentă se folosesc tot mai des glucometrele (aparate mici,

asemănătoare cu un calculator de buzunar), care determină glicemia prin metodă

enzimatică specifică pentru glucoză. Determinarea se face cu ajutorul unor stripsuri

(kituri, benzi de hârtie impregnate cu reactivi).

Mod de utilizare:

Efectuăm pregătirile pentru prelevarea sângelui din pulpa degetului, apoi pornim

aparatul, care începe numărătoarea inversă. Înţepăm un deget şi punem o picătură de

sânge pe strips. Peste un minut, la semnalul sonor al aparatului, înlăturăm prin tamponare

cu hârtie excesul de sânge de pe banda cu reactivi. Introducem kitul în aparat şi, la unele

tipuri, apăsăm butonul de măsurare. Peste câteva momente apare pe ecran valoarea

glicemiei în unitatea de măsură folosită de aparatul respectiv.

Avantajele metodei: - Este o metodă rapidă, precisă şi specifică pentru glucoză

- Se poate folosi în dispensare medicale şi la domiciliu,

fiind foarte utilă în monitorizarea glicemiei la bolnavii diabetici

- Unele aparate au şi memorie în care sunt păstrate ultimele

valori ale glicemiei

- Necesită o cantitate foarte mică de sânge (o picătură).

Valori normale: 70 - 110 mg % (3,89 - 6,11 mmoli/l)

Valorile obţinute la determinarea glicemiei depind de metoda folosită.

130

În sânge, alături de glucoză, sunt şi alte substanţe reducătoare (glutation, acid

ascorbic, acid uric, cisteină). Din acest motiv valorile glicemiei obţinute prin metode

chimice, care se bazează pe proprietatea reducătoare a glucozei (metoda Hagedorn-

Jensen, colorimetrie cu reactiv arseno-molibdenic) sunt mai ridicate decât cele obţinute

prin metoda enzimatică specifică cu glucozoxidază. Metoda colorimetrică cu o-toluidină

dă rezultate mai apropiate de valorile obţinute prin metoda enzimatică.

Interpretarea medicală a valorilor glicemiei

Valori crescute: Hiperglicemia trecătoare poate fi de origine alimentară sau în

legătură cu stări emoţionale. Postprandial glicemia creşte uşor, în cazul consumului

excesiv de glucide chiar până la instalarea unei glicozurii.

Hiperglicemia de durată este caracteristică în primul rând pentru diabetul zaharat

(diabetes mellitus). În formele de diabet asimptomatic (diabet chimic) glicemia este

adesea normală şi tulburările metabolice (insuficienta de insulină) pot fi stabilite numai

prin proba de încărcare cu glucoză (proba hiperglicemiei provocate).

Proba numită test oral de toleranţă pentru glucoză (TOTG) constă din

administrarea orală la pacient a unei cantităţi de aproximativ 70 g glucoză (1 g/kg corp).

Se urmăreşte din jumătate în jumătate de oră variaţia glicemiei faţă de valoarea iniţială

măsurată pe nemâncate (vezi schema). În cazuri fiziologice, creşterea maximă a glicemiei

după încărcare nu depăşeşte valoarea de 8,8 mmoli/l (160 mg %) în prima oră, iar după 2

ore revine sub 6,6 mmoli/l (120 mg %), şi atinge nivelul iniţial la cca. 3 ore .

În cazurile uşoare de diabet, când glicemia nu depăşeşte valoarea de 180 mg %

(10 mmoli/l), glicozuria este absentă. În cazuri de gravitate medie valoarea glicemiei este

de 200-300 mg %, iar în cazuri grave poate creşte până la 39 mmoli/l (702 mg %) sau mai

131

mult, fiind însoţită de glicozurie masivă. Evidenţierea accidentală a glicozuriei este uneori

semnul care atrage atenţia asupra unui diabet asimptomatic.

Sarcina este o stare care scade toleranţa la glucoză şi produce diabet gestaţional la

aproximativ 3 % din gravide, uneori cu repercusiuni grave asupra fătului. Monitorizarea

glicemiei şi glicozuriei este foarte importantă în aceste cazuri pentru stabilirea dozelor de

insulină.

Informaţii suplimentare asupra valorilor retroactive ale glicemiei ne furnizează

nivelul hemoglobinei glicozilate. Valorile crescute ale acesteia se corelează bine cu

nivele mari de glicemie pe perioade lungi.

Creşteri ale glicemiei apar în diferite disfuncţii endocrine cum ar fi hipersecreţia

de adrenalină, glucagon, ACTH (hormon adrenocorticotrop), STH (hormon somatotrop),

cortizol - hormonii enumeraţi având acţiune antagonistă cu cea a insulinei. Ei stimulează

adenilat ciclaza cu formare de AMP ciclic, care intensifică glicogenoliza şi

gluconeogeneza. Persoanele care sunt tratate timp îndelungat cu corticosteroizi (astm

bronşic, poliartrită reumatoidă) pot dezvolta aşa numitul diabet steroid. Hormonii

tiroidieni (T3, T4) au acţiune hiperglicemiantă prin creşterea absorbţiei glucidelor la nivel

intestinal, stimularea gluconeogenezei şi a secreţiei de adrenalină.

Valori scăzute ale glicemiei survin în primul rând după administrarea de doze

excesive de insulină. La valori sub 40 mg % apar simptome hipoglicemice manifestate

prin stări convulsive în urma deficienţei de aport glucidic la nivelul celulelor cerebrale.

Hipoglicemie apare şi în cazul insulinomului (adenomul insulelor Langerhans), tumoră

care secretă cantităţi mari de insulină. Disfuncţii endocrine cum ar fi insuficienţa

hipofizară, tiroidiană, corticosuprarenală precum şi afecţiunile hepatice grave şi tulburări

de absorbţie pot induce stări hipoglicemice. O uşoară şi trecătoare hipoglicemie poate să

fie de origine alimentară.

Alte tehnici de determinare a glicemiei în laborator

Metoda cu o-toluidină

Principiu:

Glucoza, în mediu de acid acetic, formează la cald cu o-toluidină un produs

colorat în verde, care se fotometrează.

132

Metoda Nelson-Somogyi

Principiu:

Glucoza reduce la cald soluţia bazică a complexului cupri-tartric. Ionii cuproşi

formaţi reduc în mediu acid ionul complex arsenomolibdenic cu formarea de substanţe de

culoare albastră fotometrabilă.

Metoda enzimatică cu hexokinază şi glucozo-6-fosfat dehidrogenază

Principiu:

hexokinază

Glucoză + ATP Glucozo-6-fosfat + ADP

G-6-P DH

Glucozo-6-fosfat + NADP+ Gluconat-6-P + NADPH + H+

Se măsoară extincţia în UV a probei şi a soluţiei standard cu concentraţie

cunoscută, şi se calculează glicemia.

Dozarea beta-lipoproteinelor după Burstein

Principiu:

Beta-lipoproteinele din ser sunt precipitate selectiv de heparinatul de calciu în

soluţie de clorură de calciu cu forţă ionică joasă. Se măsoară turbiditatea soluţiei şi se

exprimă în unităţi arbitrare.

Reactivi: - Clorură de calciu 0,025 M

- Sol. heparină 0,2%

Modul de lucru:

Se pipetează în două erubete, proba (P) şi blanc (B), următoarele soluţii:

P BClorură de calciu ml 5,0 5,0H2O bidistilată ml - 0,1Sol. de heparină ml 0,1 -Ser ml 0,1 0,1

Se agită şi se lasă în repaus 5 minute la temperatura camerei. Apoi se măsoară

extincţia probei (EP) şi a blancului (EB), faţă de H2O bidistilată la λ = 6 45 nm în cuva de

133

1 cm. Turbiditatea serului depinde de numărul de chilomicroni şi de conţinutul în grăsimi

neutre. Din această cauză serul trebuie să provină din sânge recoltat pe nemâncate.

Determinarea trebuie să se facă în ziua recoltării sângelui.

Calcul:

Rezultatele sunt exprimate direct în unităţi de extincţie:

1) Turbiditatea serului: E = EB ⋅ Vfinal/Vser = EB ⋅ 52

2) Conţinutul în beta lipoproteine:

E = (EP - EB) ⋅ 52

Valori normale: 1) Turbiditatea serului: 0-0,1 U. extincţie

2) Beta-lipoproteine: 4,0-10,0 U. extincţie

Fracţionarea electroforetică a lipoproteinelor în gel de agaroză produce

următoarele fracţiuni care sunt în următoarea corespondenţă aproximativă cu fracţiunile

separabile în câmp centrifugal: chilomicronii corespunzători alfa2 – lipoproteinelor şi care

rămân pe linia de start, beta-lipoproteinele care corespund LDL, pre-beta lipoproteinele

care corespund VLDL şi alfa1-lipoproteinele care corespund HDL.

Tipurile de dislipidemie: Pe baza modificărilor cantitative ale fracţiunilor

lipoproteice şi ale conţinutului acestora în colesterol, fosfolipide şi trigliceride,

Fredrickson a stabilit 5 fenotipuri de dislipidemie:

Tipul I.: chilomicronemie şi hiper-VLDL, cu creşterea trigliceridelor şi cu

ser lactescent datorate deficitului de lipoproteinlipază sau de apoCII. Se mai numeşte

hipertrigliceridemie familială.

Tipul II.a: creşterea colesterolului şi a LDL, cu ser clar datorată deficitului

în receptori apoB100. Se mai numeşte hipercolesterolemie familială.

Tipul II.b: creşterea concomitentă a colesterolului şi a trigliceridelor, ser

clar, sau opalescent. Cresc concomitent LDL şi VLDL. Se mai numeşte hiperlipidemie

combinată familială.

Tipul III.: anomalie ereditară rar întâlnită (boala "betei late") cu creştera

concomitentă a colesterolului şi a trigliceridelor, ser lactescent. Se datorează deficitului de

clarificare hepatică a IDL şi chilomicronilor remanenţi. Este cauzat de lipsa de apoE şi de

lipoproteinlipază hepatică.

Tipul IV.: creşterea trigliceridelor endogene (VLDL), ser clar sau

opalescent.

134

Tipul V.: creşterea chilomicronilor endogeni şi exogeni, a colesterolului,

cu LDL şi VLDL crescute, HDL scăzute, ser opalescent sau uneori lactescent.

Dozarea colesterolului total din ser prin metoda enzimatică

Principiu:

Kit-ul enzimatic conţine următoarele enzime care catalizează reacţiile indicate mai

jos:

Colesterol esteraza catalizează reacţia de hidroliză a esterilor de colesterol

rezultând colesterol liber şi acizi graşi:

colesterol-estează

esteri de colesterol + H2O <-----------------> colesterol + acizi graşi

În prezenţa colesterol oxidazei colesterolul suferă o reacţie de oxidare cu formarea

a 4-∆ colestenonei şi a apei oxigenate:

colesterol-oxidază

colesterol + O2 --------------> 4-∆ colestenona + H2O2

Sub acţiunea peroxidazei apa oxigenată reacţionează cu fenolul şi 4-amino

antipirina formând un compus chinonic de culoarea roşie, fotometrabilă:

peroxidază

2 H2O2 + fenol + 4-amino-antipirină ----------------> compus chinonic + 4H2O

Reactivi: Reactivul pentru colesterol conţine în soluţie tampon: colesterol

esteraza, colesterol oxidaza, peroxidaza, fenol, 4-amino-antipirină.

Mod de lucru:

Se pregătesc 3 eprubete în care se pipetează:

P S BReactiv pt. colesterol 2 ml 2 ml 2 mlH2O bidistilată - - 20 µlSol. standard de colesterol (200 mg%) - 20 µl -Ser 20 µl - -

Se agită şi se incubează 5 minute la 37°C. Apoi se citeşte extincţia probei (P) şi a

standardului (S) faţă de blanc (B) la λ = 500 nm în cuva de 1 cm.

Calcul: mg colesterol/100 ml ser = Ep/Es ⋅ 200

Valori normale: 150-250 mg%

135

Dozarea colesterolului total şi liber

Principiu:

Colesterolul liber din ser se extrage cu etanol şi apoi se precipită cu digitonină.

Diferenţa dintre colesterolul total şi colesterolul liber reprezintă colesterolul esterificat.

Reactivi: - Soluţie de clorură ferică: se prepară din 2,5g FeCl3. 6H2O în urma

adăugării a 100ml H3PO4 85%.

- Reactivul de culoare: 4ml soluţie de clorură ferică se dizolvă în

50ml H2SO4 concentrat.

- Soluţie de digitonină 1%: se dizolvă 1g digitonină în 50ml etanol

95% şi se aduce la 100ml cu apă bidistilată. Se păstrează la

întuneric max. timp de 6 luni.

- Standard de colesterol (0,2%): se dizolvă 2000mg colesterol pur

în 100ml acid acetic glacial şi se diluează de 10 ori (1ml în 10ml)

cu acid acetic glacial.

Observaţii: 1. Eprubetele şi pipetele trebuie să fie perfect curate şi uscate,

reacţia fiind influenţată de urmele de apă.

2. Puritatea acidului sulfuric şi a acidului acetic este o condiţie

indispensabilă pentru dozare. În particular, acidul acetic nu trebuie

să conţină acid glioxilic. Pentru îndepărtarea acidului glioxilic,

eventual prezent, se recomandă distilarea acidului acetic în

prezenţa anhidridei cromice.

Dozarea colesterolului total

Modul de lucru:

Proba: Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 6ml acid acetic glacial şi 0,1ml

ser. Se agită. Se adaugă 4ml reactiv de culoare şi se agită bine. Se citeşte extincţia probei

după 10 min. de aşteptare la λ = 550 nm în cuva de 1 cm faţă de blanc (prepararea

acestuia apare mai jos). Rezultă extincţia Ep.

Soluţia standard: Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 6ml acid acetic glacial

şi 0,1ml standard de colesterol. Se agită. Se adaugă 4ml reactiv de culoare şi se agită bine.

Se citeşte extincţia standardului la λ = 550 nm în cuva de 1 cm faţă de blanc. Rezultă

extincţia Es.

Blanc: Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 6ml acid acetic glacial şi 0,1ml

apă bidistilată. Se agită. Se adaugă 4ml reactiv de culoare şi se agită bine.

136

Calcul: mg% colesterol total = (EP/ES) x conc. standard

Dozarea colesterolului liber

Se pipetează în eprubete de centrifugă o probă P, un standard S şi un blanc B.

P S BSer ml 0,1 - -

Standard de colesterol ml - 0,1 -Apă bidistilată ml - - 0,1

Acetonă-95% etanol (1:1,v/v) ml 1 - -Sol. digitonină ml 1 1 1

Se amestecă, se lasă în repaus 10min şi apoi se centrifughează (la 3000 rpm,

5min). Se aruncă supernatantul. Se usucă precipitatul timp de 5 min. în curent de N2.

Resuspendarea rezidiului se face cu 4 ml acetonă, apoi se agită cu Vortexul. Se

centrifughează, se decantează (cu grijă) supernatantul, se usucă precipitatul timp de 5min.

Precipitat + + -CH3COOH glacial ml 6 6 6

Se agită, se adaugă 4ml reactiv de culoare şi se agită energic cu Vortexul.

După 10 minute de repaus se citeşte extincţia probei la λ = 550 nm în cuva de 1 cm faţă

de blanc. Blancul constă doar din 6 ml CH3COOH glacial.

Calcul:

mg% colesterol liber = (EP/ES) x conc.standard

mg%colesterol esterificat = mg% colesterol total - mg% colesterol liber

Valori normale: 60-80% din colesterol total. Prin urmare, raportul colesterol

esterificat/colesterol total se încadrează în mod normal în intervalul 0,60-0,80.

Variaţii fiziologice: Colesterolemia este strâns corelată cu lipidemia şi prezintă, în

mare, aceleaşi variaţii fiziologice. Valoarea nivelului colesterolului seric la naştere este

scăzută, începe să crească în câteva ore sau zile şi variază în funcţie de vârstă, sex, rasă,

alimentaţie, echilibru neuro-endocrin, profesie.

Există diferenţe ale colesterolemiei în funcţie de sex şi de vârstă. De exemplu: la

bărbaţi valoarea medie este de 250mg/100ml la vârsta de 50 de ani, după care scade uşor;

la femei valorile cresc odată cu vârsta atingând valoarea maximă de 280 mg/100ml în

jurul vârstei de 50 ani, după care scad uşor.

Cea mai mare parte a colesterolului seric este de origine endogenă, aportul de

colesterol exogen influenţând în mică măsură colesterolemia.

137

Variaţii patologice: Acest raport este scăzut în afecţiuni hepatice grave (comă

hepatică).

Raportul dintre colesterolul esterificat/colesterolul total permite diferenţierea şi

diagnosticul icterelor şi este:

- normal în icterele obstructive

- moderat scăzut în icterele catarale

- scăzut în icterele parenchimatoase grave.

Valori crescute (hipercolesterolemii) se întâlnesc în: hipercolesterolemie esenţială,

hiperlipemie esenţială, hipotiroidism, diabet zaharat, obezitate, sindrom nefrotic (nefroze

lipoidice), ateroscleroză, intoxicaţii cu fosfor, CCl4, alcool, morfină, icter obstructiv

(calea de excreţie a colesterolului fiind cea biliară), pancreatite, alcoolism.

Valori scăzute (hipocolesterolemii) se întâlnesc în: afecţiuni genetice ca:

analfalipo proteinemia (boala Tangier), abetalipoproteinemia; hepatite acute, hepatite

cronice şi ciroze decompensate (numai colesterolul esterificat), hipertiroidism; infecţii

bacteriene: pneumonie, tuberculoză, difterie, lepră; hemopatii severe: leucemii.

Obţinerea, purificarea şi identificarea lecitinei (gălbenuş de ou)

Obţinerea lecitinei purificată

Reactivi: 1 gălbenuş de ou

75 ml acetona (reactiv)

75 ml cloroform (reactiv)

Modul de lucru:

Se separă într-un mojar gălbenuşul de ou în aşa fel încât să nu se amestece cu

albuşul. Se adaugă peste gălbenuş amestecând 25 ml acetonă. Solventul deshidratează

gălbenuşul şi dizolvă grăsimile cu excepţia lecitinei. După ce a rămas în repaus câteva

minute acetona se decantează sau se filtrează. Se repetă operaţia de trei ori, ultima

cantitate de acetonă adăugată nu se mai lasă în contact cu materialul din mojar şi este

rapid decantată. Reziduul obţinut se întinde pe o hârtie de filtru. Pudra obţinută după

uscare se trece într-un balon Erlenmeyer şi se agită cu 25 ml amestec cloroform şi alcool

metilic ( 2:1). Se filtrează lichidul. Pudra rămasă pe hârtia de filtru este reluată cu aceiaşi

cantitate de amestec cloroform-alcool, repetându-se operaţia anterioară. Se obţine astfel o

soluţie cloroformică-alcoolică de lecitină. Pentru obţinerea substanţei pure filtratul se

concentrează prin încălzirea amestecului la 63°C. Produsul obţinut în urma extracţiei cu

138

solvenţi organici se prezintă ca o masă galbenă de consistenţă moale care poate fi uscată

prin evaporare în vid.

Purificarea lecitinei se face prin cromatografie pe coloană de celuloză pentru

îndepărtarea impurităţilor azotate nelipidice, urmată de cromatografia pe alumină, care

reţine cefalinele, şi apoi pe coloană de Silicagel, echilibrată cu soluţia CHCl3-CH3OH

(2:1; v:v), pentru separarea lizofosfatidelor şi sfingolipidelor.

Caracterizarea fizico - chimică a lecitinei

Lecitina formează o masă alb-gălbuie, higroscopică, alterabilă, se brunifică după

păstrare. Este solubilă în eter, cloroform, uleiuri, alcool concentrat. ( 1p. lecitina: 20 p.

alcool concentrat; 1p. lecitină; 9,8p. eter de petrol).

Identificarea lecitinei

Identificarea lecitinei se face astfel:

- adăugarea 2 ml de acid sulfuric concentrat la 2 ml de soluţie de molibdat de

amoniu 0,1% care conţine câteva picături de soluţie eterică de lecitină, la încălzire

determină formarea unei zone de separaţie colorată în albastru;

- o soluţie alcoolică de lecitină la care se adaugă o soluţie alcoolică de aloxan se

colorează în roz, apoi în roşu şi în final formează un precipitat de culoare roşie.

- dacă se adaugă cu precauţie la 2 ml de acid sulfuric concentrat, 2 ml alcool

conţinând urme de lecitină şi 4 picături de soluţie alcoolică 0,01% de benzaldehidă,

furfurol sau vanilină, apare la suprafaţa de separare a lichidelor o coloraţie roşie-brună.

Hidroliza lecitinei şi observarea microscopica a cristalelor de colina

Lecitinele prin hidroliză se descompun într-o moleculă de glicerol, 2 molecule de

acid gras, o molecula de acid fosforic şi o moleculă de colină.

Reactivi: - soluţie de hidroxid de sodiu 10%

- soluţie de acid acetic 10%

- soluţie de iod 5% ( 1 g iod, + 2 g KI, + 20 ml apă)

- hârtie de turnesol

Modul de lucru:

Lecitina obţinută din gălbenuşul de ou se trece într-un pahar Erlenmeyer, se

tratează cu 20 ml NaOH 10%. Se fierbe 10 min. Lichidul obţinut se neutralizează în

prezenţa hârtiei de turnesol cu acid acetic. Se adaugă apoi în exces o picătură de acid. Se

răceşte, se filtrează. Pe o lamă de sticlă se ia o picătură din soluţia obţinută, se adaugă o

139

picătură de iod, se acoperă cu lamela. Se observă apariţia cristalelor de periodură de

colină (cristale Florence).

Imaginea la microscopul optic a cristalelor de colină (desen).

Stabilitatea lecitinei

Stabilitatea lecitinei include determinarea indicelui de aciditate, a indicelui de

peroxid, şi a indicelui de iod.

1. Determinarea indicelui de aciditate (Ia): Prin indice de aciditate se înţelege numărul de

miligrame de hidroxid de potasiu necesare pentru neutralizarea acizilor graşi liberi

conţinuţi într-un gram de lecitină

Modul de lucru:

5 g lecitină se dizolvă în 50 ml amestec preparat în părţi egale din alcool şi eter

neutralizat în prezenţa fenolftaleinei ca indicator (0,1g fenolftaleină dizolvate în 100 ml

alcool din care se folosesc 3 picături) şi se titrează cu KOH 0,1 N până la coloraţie roz

care trebuie să persiste minimum 30 de secunde.

Ia = 5,61 v / G unde v = ml KOH 0,1 N folosiţi la titrare şi G = grame substanţă

luată în lucru

2. Determinarea indicelui de peroxid (Ip): Indicele de peroxid reprezintă numărul de

miliechivalenţi oxigen activ din 1000 g lipid (lecitină), respectiv numărul de mililitri de

tiosulfat de sodiu 0,01 N oxidaţi de iodul eliberat din acidul iodhidric prin acţiunea

peroxizilor din 1g lipid.

Modul de lucru:

5 g lecitină (G) se dizolvă într-un flacon cu dop rodat într-un amestec de 18 ml

acid acetic şi 12 ml cloroform. Se adaugă o soluţie proaspăt preparată dintr-un gram de

iodură de potasiu şi un ml apă şi se agită puternic. După un minut se adaugă 30 ml apă, 2

140

ml soluţie de amidon 0,1% şi se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,01 N (v2). În paralel se

efectuează titrarea unui martor fără lecitină (v1).

Ip = 10 ( v2 - v1 )/ G

3. Determinarea indicelui de iod: Indicele de iod reprezintă numărul de grame de iod

fixat de 100g lipid nesaturat.

Modul de lucru:

Intr-un flacon cu dop rodat de 300 ml se întroduc 0,15 g de lecitină (G) şi se

dizolvă în 20 ml de cloroform, se adaugă 25 ml soluţie monobromură de iod 0,2N, se

închide flaconul şi se lasă la întuneric 30 min, agitând din 5 în 5 minute. Se adauga 15 ml

iodură de potasiu 10% ,10 ml apă şi se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1N (v1) până la

decolorare adăugând 2 ml soluţie de amidon spre sfârşitul titrării. Se face o probă martor

cu aceleaşi cantităţi de reactivi în aceleaşi condiţii, fără lecitină, care se titrează (v2).

Indice de iod = (v1 - v2) 1,269 / G

Hemoglobina

Dozarea hemoglobinei in sânge ( metoda Drabkin)

Principiu:

Fericianura de potasiu oxidează Fe2+ din hemoglobina la Fe3+. Astfel hemoglobina

se transformă în methemoglobină. Methemoglobina în prezenţa cianurii de potasiu trece

în cianmethemoglobină, derivat de hemoglobină stabil, fotometrabil la λ = 540 nm.

Materiale: - pipetă de hemoglobină de 0,02 ml.

Reactiv Drabkin: - 50 mg KCN, 1 g NaHCO3 şi 200 mg fericianură de potasiu se

dizolvă în apă bidistilată şi se aduce volumul la 1000 ml cu apă bidistilată. Atenţie!

Reactivul Drabkin este extrem de toxic.

Modul de lucru:

În două eprubete se pipetează câte 5 ml de reactiv Drabkin. În una din eprubete se

pipetează cu o micropipetă 0,02 ml soluţie standard de hemoglobină (preparat comercial),

iar în cealaltă se pipetează 0,02 ml sânge în prealabil agitat pentru resuspendarea celulelor

sanguine. Se omogenizează eprubetele prin agitare, apoi după 20 de minute se citeşte

141

extincţia probei de analizat şi a probei standard faţă de apă distilată la λ = 540 nm în

cuvă de 1 cm.

Calcul:

g hemoglobină/100 ml sânge=Ep/Es x Cst (Cst = concentraţia standardului în g%)

Observaţie: Metoda cu cianmethemoglobină detectează toate formele de

hemoglobină şi permite determinări foarte precise.

Dozarea hemoglobinei sub formă de oxihemoglobină

Principiu:

În prezenţă de amoniac globulele roşii se hemolizează şi hemoglobina se

transformă în oxihemoglobină care prezintă un maxim de absorbţie la λ = 540 nm.

Reactivi şi materiale: - soluţie de amoniac 0,1%

- pipetă de hemoglobină de 0,02 ml

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se măsoară 5 ml de soluţie de amoniac. În acesta se introduc cu

pipeta de hemoglobină 0,02 ml de sânge în prealabil agitat. După agitare se citeşte

extincţia probei faţă de apă distilată la λ= 540 nm în cuva de 1 cm.Rezultatul se

raportează la o curbă de calibrare obţinută cu diluţii dintr-o probă de concentrat de

eritrocite cu concentraţia hemoglobinei cunoscută.

Valori normale: femei: 14-17 g/100 ml sânge

bărbaţi: 15-20 g/100 ml sânge

Dozarea hemoglobinei din sângele total prezintă importanţă pentru diagnosticul unor

forme de anemii.

Observaţie: Ca metodă de referinţă (pentru obţinerea unei curbe de calibrare în

absenţa unui standard de hemoglobină) se poate folosi metoda bazată pe dozarea ferului

eritrocitar.

Analiza urinei

Urina este un produs de filtrare, reabsorbţie şi excreţie, reprezentând exercitarea

funcţiei renale. Este un lichid biologic uşor accesibil, care dă multe informaţii utile în

diagnostic.

142

Urina "de dimineaţă" serveşte la determinări calitative (albumină, glucoză, pH,

acetonă şi sediment urinar). Se goleşte vezica de urina acumulată în timpul nopţii şi se

colectează urina proaspătă de dimineaţă, care este mai concentrată.

Urina de 24 ore se foloseşte la determinările cantitative. Este necesar să se

măsoare volumul diurn de urină fiindcă rezultatele dozărilor se raportează la acest volum.

Se goleşte vezica de urina "de dimineaţă" şi se începe la oră fixă recoltarea urinii în

intervalul de 24 de ore.

Pentru prevenirea contaminării probelor de urină cu microorganisme se

recomandă efectuarea analizelor în cel mult 2-3 ore de la recoltare. Păstrarea nealterată se

poate realiza la rece (+4oC) sau prin tratare cu substanţe conservante, de preferat cu timol

(0,1 g la 100 ml de urină). Nu se recomandă folosirea de cloroform, fenol, formol fiindcă

acestea falsifică rezultatele obţinute.

Examenul fizic al urinei

Volumul. Cantitatea de urină emisă în 24 ore depinde de ingestia de lichide, de

pierderile de apă (piele, intestin, plămâni) şi de cantitatea de substanţe excretate prin

urină. Volumul se măsoară cu cilindrul gradat.

Valori normale: 1500 - 2000 ml/24 ore (bărbaţi); 1000 - 1500 ml/24 ore (femei).

Valori patologice: - sub 200 ml/24 ore (anurie)

- între 200-800 ml/24 ore (oligurie)

- peste 2000 ml/24 ore (poliurie)

Oligo-anuria este semnul cel mai important al insuficienţei renale acute. Cauzele

acesteia se pot clasifica în trei grupe:

- Cauze prerenale: hipovolemie (diaree severă, stare de şoc cu prăbuşirea

presiunii arteriale), insuficienţă cardiacă stângă - în aceste cazuri nu se

realizează presiunea hidrostatică necesară funcţiei de filtrare a rinichiului.

- Cauze renale: boli inflamatorii ale rinichiului (glomerulonefrită acută),

necroză tubulară acută (ischemică, toxică), boli autoimune cu afectare renală.

143

- Cauze postrenale: obstrucţia mecanică a căilor urinare (calculi, malformaţii).

Se formează urină, dar nu se poate elimina.

Poliuria se întâlneşte în: diabet zaharat, diabet insipid (se constată o poliurie

extremă de 5-20 l/24 ore, cauza fiind lipsa secreţiei de hormon antidiuretic-ADH; poliuria

este însoţită de polidipsie, adică consumul excesiv de lichide), alcoolism cronic (inhibarea

secreţiei de ADH), hiperparatiroidism (se elimină cantităţi mari de calciu prin urină care

antrenează eliminarea unui volum mare de lichid), insuficienţă renală cronică (capacitatea

de concentrare a rinichilor este alterată).

Alte noţiuni patologice legate de distribuţia volumului urinar sunt:

- Polakiurie: micţiuni dese cu eliminarea unor cantităţi mici de urină (apare în

cistită, hipertrofie de prostată, tumori ale vezicii urinare). Deseori este însoţită

de disurie (durere sau senzaţie de arsură la emisia de urină).

- Nicturie: urinare nocturnă (diabet insipid, insuficienţă cardiacă dreaptă -

semnalează evoluţia spre decompensare).

Aspectul. În condiţii fiziologice urina proaspătă este limpede şi transparentă. Urina

tulbure în momentul emisiei poate fi datorată conţinutului excesiv de săruri

(uraţi, fosfaţi, carbonaţi), mucusului, puroiului, celulelor epiteliale, grăsimilor

sau microbilor. Dacă într-o urină clară în momentul eliminării după un timp se

formează un depozit în formă de nor, el se datorează unui proces de descuamare

epitelială a căilor urinare. Acest depozit nu are nici o valoare diagnostică.

Situaţiile patologice se diferenţiază în felul următor:

a). Dispariţia tulburării prin încălzire indică prezenţa uraţilor, oxalaţilor şi a

acidului uric.

b). Dispariţia tulburării care a devenit mai abundentă în urma încălzirii, prin

adăugare de acid acetic 10 % indică prezenţa fosfaţilor şi carbonaţilor (dacă se produce

efervescenţă).

c). Dacă tulburarea apare la cald şi se intensifică prin adăugare de acid acetic,

urina conţine albumină.

d). Dispariţia tulburării numai la adaus de HCl 12,5 % după încălzire prealabilă,

indică prezenţa oxalatului de calciu.

e). Din urina tulbure, chiar în momentul emisiei, puroiul, hematiile sau celulele

epiteliale se pot îndepărta prin centrifugare.

f). Dispariţia tulburării după adăugarea unui amestec de etanol-eter (1:1; v:v)

indică prezenţa grăsimilor.

144

Culoarea. Urina normală are culoare galben-deschisă până la galben-aurie. Urina din

timpul nopţii fiind mai concentrată, are o culoare mai închisă. Culoarea urinii

poate fi modificată de diferite substanţe pe care le conţine.

Substanţe endogene: sângele imprimă urinii culoare roşie, brună sau maronie; porfirinele

dau o culoare roşie sau brun-roşcată; pigmenţii biliari conferă culoare galben

verzuie; alcaptonul (compus apărut în urină datorită dereglării catabolizării Phe

şi Tyr) dă în contact cu aerul o culoare brună-neagră.

Substanţe exogene: albastrul de metilen colorează urina în verde-albăstrui; piramidonul în

roşu-cărămiziu; fenolul îi dă o coloraţie brună.

Mirosul. Mirosul urinii proaspete se datorează acizilor volatili din compoziţia sa. În

urinile concentrate mirosul este mai accentuat. În cazurile de acidoză apare un

miros de fructe sau cloroform. Urinile infectate au un miros amoniacal datorită

descompunerii ureei de către ureaza bacteriană. Mirosul fecaloid al urinii poate

atrage atenţia asupra existenţei unei fistule (comunicare patologică între tubul

digestiv şi urinar). Miros fecaloid apare şi în infecţiile cu Escherichia coli (E.

coli este o componentă a florei intestinale saprofite, dar poate cauza frecvent

infecţii urinare).

Densitatea. Greutatea specifică sau densitatea urinii se măsoară cu un densimetru special

numit urodensimetru, format dintr-un tub de sticlă care se termină la partea

inferioară printr-un rezervor cu mercur. În partea superioară se află o tijă pe care

este înscrisă scara gradată pentru intervalul 1,000 - 1,040 g/cm3 la 15 oC, fiind

anexată şi o scală termometrică, pentru că densitatea urinii variază în funcţie de

temperatură. Densitatea depinde de substanţele dizolvate: sărurile în general şi

ureea la indivizi sănătoşi; glucoza şi albumina în cazurile patologice. Densitatea

este de obicei invers proporţională cu diluţia urinii şi direct proporţională cu

intensitatea culorii. Excepţie face diabetul zaharat, când, cu toate că volumul

urinar este mare, ceea ce ar determina o diluţie mare, densitatea este mare

datorită prezenţei glucozei.

Modul de lucru:

Urina de 24 ore se amestecă pentru omogenizare, apoi se toarnă într-un cilindru

gradat, evitându-se formarea spumei. Se introduce urodensimetrul care trebuie să

plutească fără a atinge pereţii cilindrului. Se citeşte diviziunea care este tangentă la

meniscul inferior al suprafeţei urinii. Valoarea citită trebuie corectată prin mărire cu 0,001

145

pentru fiecare depăşire cu 3oC respectiv prin micşorare cu 0,001 pentru fiecare scădere cu

3oC sub 15oC. Când urina conţine cantităţi mari de proteine, peste 7 g%, se vor scădea

câte 0,03 pentru fiecare gram de proteină în plus.

Valori: 1,015 - 1,025 g/cm3, putându-se modifica fiziologic la valori extreme de

1,001 - 1,035 g/cm3 în funcţie de aportul sporit sau de eliminarea abundentă de lichide.

Scăderea densităţii urinare se întâlneşte în diabet insipid (se elimină o cantitate mare de

urină foarte diluată), insuficienţă renală cronică (datorită incapacităţii de concentrare a

rinichiului). Creşterea densităţii urinare apare în diabetul zaharat, nefroză (boală renală în

care se elimină o cantitate mare de proteine prin urină).

Examenul chimic al urinei

pH-ul urinei. Valoarea pH-ului urinei normale depinde de dietă. O alimentaţie

bogată în proteine produce aciditate urinară, pe când un regim vegetarian determină

alcalinizarea urinei. Aciditatea urinei provine din acizi organici (uric, hipuric, citric,

acetic, oxalic) şi din sărurile acide (fosfaţi primari de Na+, K+, NH4+). Regimul carnat

determină o creştere a acidităţii urinei datorită eliminării crescute de acid uric, uraţi şi

fosfaţi acizi. Un regim alimentar vegetarian determină o alcalinizare a urinei prin excesul

de săruri minerale şi organice.

Măsurarea pH-ului se face prin folosirea benzilor de hârtie indicator universal sau

cu pH-metrul.

Modul de lucru:

Se introduce în urina proaspătă, pentru câteva secunde, o bucată de hârtie

indicator. Se stabileşte valoarea pH-ului după 30 de secunde comparând culoarea hârtiei

cu cea a scalei de culori care însoţeşte fiecare pachet de hârtie indicator.

Prin metoda potenţiometrică (cu pH-metrul), după calibrarea aparatului cu soluţii

standard de pH, se introduc cei doi electrozi (de pH şi de referinţă) într-un volum adecvat

de urină a cărei temperatură se cunoaşte şi se citeşte valoarea pH-ului.

Valorile: pH-ul urinei este slab acid, cu variaţii în jurul valorii de 6 (4,8 - 7,4) la

un individ cu alimentaţie mixtă. Urini puternic acide se produc în cursul proceselor

maligne datorită distrugerii crescute de proteine, în febră, diaree abundentă şi acidoză

metabolică. pH puternic alcalin se constată în infecţii urinare (prin fermentare

microbiană) şi în alcaloză metabolică. pH-ul se măsoară din urina proaspăt emisă,

146

deoarece în timp se produce contaminarea produsului cu bacterii, care determină

schimbarea reacţiei în sensul alcalinizării urinei.

Analiza compuşilor patologici din urină

Identificarea proteinelor urinare

Urina normală conţine doar urme de proteine (albumine şi globuline provenite din

plasmă), în cantitate de 20-40 mg%o, care nu se pot decela prin tehnici uzuale.

Proteinurii apar în stări patologice cum ar fi:

- afecţiuni renale: filtrul renal lezat nu mai poate reţine moleculele proteice şi

acestea ajung în urină în cantitate mare. Proteinuria poate fi selectivă (numai

albuminurie) de exemplu în glomerulonefrite, sau neselectivă în cazuri mai grave

(albuminurie şi globulinurie) cum ar fi glomerulonefrozele. În afară de bolile inflamatorii

renale enumerate, leziuni ale nefronului pot apare şi în intoxicaţii sau în rinichiul de şoc.

Proteinuria este pusă în evidenţă şi în leziuni mai grave ale filtrului glomerular, caz în

care se pune în evidenţă chiar hematuria.

- afecţiuni postrenale: leziuni ale mucoasei căilor urinare (litiază, inflamaţie,

tumori, etc). În aceste cazuri proteinuria se asociază obligatoriu cu hematurie (apariţia

sângelui în urină).

- afecţiuni prerenale: stări febrile, boli cardiace, ictere, leucemie, apariţia în urină

a proteinelor Bence-Jones (provenite din imunoglobuline patologice) în mielomul

multiplu (plasmocitom). Datorită hiperproteinemiei (creşterea cantităţii proteinelor în

sânge), se saturează capacitatea maximă de transport a celulelor mucoasei tubulare renale,

şi proteinele care nu s-au reabsorbit se elimină prin urină.

În mod fiziologic, în cursul efortului fizic are loc o creştere a proteinuriei care

poate atinge de 5 ori valoarea normală. Cantitatea de proteine eliminată variază în timpul

zilei, de aceea trebuie să se facă analiza pe urina de 24 ore (valori normale: 30-40

mg/1500 ml).

Procedeul cu acid acetic la cald

Principiu:

Proteinele precipită prin încălzirea şi acidularea urinei îmbogăţite cu săruri de

sodiu.

Reactivi: - Acid acetic 10%

- NaCl cristale

147

Mod de lucru:

În 10 ml de urină filtrată se adaugă câteva cristale de NaCl şi se încălzeşte

eprubeta în flacără pentru aducerea la fierbere doar a părţii superioare a coloanei de

lichid. Se adaugă câteva picături din soluţia de acid acetic. Apariţia unui precipitat

persistent indică prezenţa albuminei.

Aprecieri semicantitative asupra cantităţii de albumină:

- opalescenţă, urmată de sedimentare la câteva minute . . . . cca 10 mg%

- precipitare şi sedimentare imediată . . . . . . . . . . . . . . . . . . cca 50 mg%

Înălţimea coloanei de precipitat raportată la înălţimea coloanei de urină după

staţionarea amestecului timp de 30 secunde:

- 1 : 4 . . . . . . . . . . . . cca 250 mg%

- 1 : 3 . . . . . . . . . . . . cca 500 mg%

- 1 : 2 . . . . . . . . . . . . cca 1000 mg%

Proba cu acid sulfosalicilic la rece

Principiu:

Proteinele sunt precipitate în mediu de acid sulfosalicilic.

Reactiv: Sol. acid sulfosalicilic 20%

Mod de lucru:

La 5 ml urină filtrată se adaugă 10-15 picături din soluţia de acid sulfosalicilic. Se

agită şi se apreciază reacţia ţinând eprubeta pe un fond negru. Rezultatele posibile sunt:

- urina rămâne limpede . . . . . . . albumină absentă

- uşoară opalescenţă . . . . . . . . cca 15 mg% albumină

- opalescenţă apreciabilă . . . . . cca 20 mg% albumină

- floculare abundentă . . . . . . . . > 20 mg% albumină

Reacţii fals pozitive se observă în terapia diabetului cu antidiabetice orale

(tolbutamid), după administrare de antibiotice din familia cefalosporinelor, etc.

Reacţia cu acid azotic (proba Heller)

Reactiv: Acid azotic concentrat

Mod de lucru:

În cca. 1-2 ml acid azotic concentrat se lasă să se prelingă pe peretele eprubetei 1-

2 ml urină. Apariţia unui precipitat sub formă de inel la zona de contact dintre cel două

soluţii indică prezenţa proteinelor.

148

Reacţii fals pozitive pot fi date de urina conservată cu timol sau care conţine uree

şi uraţi în cantitate mare. Mucoproteinele secretate de mucoasa căilor urinare pot da

numai o tulbureală care nu este delimitată sub formă de inel.

Proba cu acid tricloracetic

Reactiv: Acid tricloracetic 15%

Mod de lucru:

La 5 ml urină se adaugă 1 ml acid tricloracetic. Formarea unui precipitat alb

floconos arată prezenţa proteinelor.

Evidenţierea proteinelor Bence-Jones (termosolubile)

Principiu:

În urina slab acidă proteinele Bence-Jones precipită între 45-55 oC şi se redizolvă

în apropiere de 100 oC.

Reactiv: Tampon acetat 2 N (pH=4,9)

Mod de lucru:

Se lucrează din urinele la care am obţinut rezultat pozitiv la reacţiile de precipitare

a proteinelor. Într-o eprubetă se pun 4 ml de urină, se adaugă 1 ml tampon acetat şi se

incubează în baie de apă la 56 oC până la apariţia unui precipitat. Apoi se introduce

eprubeta în apă la fierbere timp de 3 minute. Descreşterea cantităţii de precipitat,

clarificarea tulburării, confirmă prezenţa proteinelor Bence-Jones. Prin răcire la 56 oC

reapare precipitatul iniţial.

Proteinele Bence-Jones sunt lanţurile uşoare ale imunoglobulinelor. Ele apar în

60% din cazurile cu mielom multiplu (multiplicarea canceroasă a unei clone de

plasmocite care produce imunoglobuline) şi ocazional în alte boli care afectează măduva

osoasă: leucemii, osteosarcoame (tumori canceroase ale ţesutului osos), metastaze osoase,

unele disproteinemii.

Test rapid pentru detectarea proteinelor urinare

Principiu:

Hârtia reactivă impregnată cu albastru de tetra-bromfenol este colorată în galben

deschis în mediu acid (pH ≈ 3). În prezenţa proteinelor urinare, culoarea virează spre

verde, verde-albăstrui, albastru sau violet, nuanţa depinzând de tipul de proteină şi de

concentraţia acesteia în urină.

Mod de lucru:

Se înmoaie capătul benzii în urina de analizat. După 2 minute se apreciază

prezenţa proteinelor urinare prin compararea culorii obţinute cu o scală de etalonare.

149

Cantitativ urmele de proteine corespund la aproximativ 5-20 mg% de albumină. Testul

are valoare orientativă.

Evidenţierea puroiului

Proba Donné

Principiu:

Cu ajutorul NaOH se lezează membrana leucocitară din care astfel se eliberează

mucină, care măreşte vâscozitatea urinei şi împiedică ridicarea imediată a bulelor de aer.

Reactiv: Sol. NaOH 20%

Mod de lucru:

Se iau într-o eprubetă 5 ml urină, se adaugă câteva picături de NaOH 20%, se

astupă eprubeta şi se răstoarnă brusc, apoi se readuce în poziţia iniţială. Apariţia unor

bule de aer în lichid, care rămân mai mult timp în suspensie şi se ridică încet la suprafaţă

denotă prezenţa puroiului.

În cazul în care bulele de aer se ridică rapid, testul este negativ. Dacă toate bulele

de are se ridică încet la suprafaţă rezultatul se notează cu +. În cazul în care bulele mici

rămân pe fundul eprubetei, rezultatul este ++. Dacă nici bulele mai mari nu se ridică

datorită prezenţei unei cantităţi mari de mucină, proba se notează cu +++.

Interpretare: Puroiul este constituit din leucocite degenerate care apar în urină în

urma proceselor inflamatorii ale tractului urinar (pielonefrită, cistită, uretrită). Probe fals

pozitive pot apare în albuminurie masivă, datorită prezenţei polizaharidelor, a mucinei,

etc. Testele pozitive trebuie întotdeauna verificate prin examenul microscopic al

sedimentului urinar.

Identificarea glucidelor urinare

În mod normal, urina nu conţine decât cantităţi mici de glucide. În mod patologic

însă, glucoza poate apărea în cantităţi apreciabile, prezenţa ei în urină fiind denumită

glicozurie şi este caracteristică diabetului zaharat. În anumite stări patologice particulare,

urina mai poate conţine în afară de glucoză şi alte glucide: fructoză, galactoză, lactoză,

maltoză şi pentoze.

Fiziologic poate apare glicozurie după ingerarea unor cantităţi mari de glucide. De

asemenea, lăuzele şi 40% din gravidele în a doua jumătate a sarcinii prezintă lactozurie.

Evidenţierea glucidelor urinare se face pe baza proprietăţii reducătoare a acestora

faţă de sărurile unor metale (Cu, Bi). Pe lângă glucide, în urină pot exista şi alte substanţe

reducătoare care pot da rezultate fals pozitive (cantităţi mari de creatinină, acid ascorbic,

150

acid uric, fenoli, etc.). Unele medicamente eliminate prin urină cum ar fi penicilina,

streptomicina, dextranul pot reduce sărurile metalice. Din acest considerent, înaintea

cercetării calitative a diferitelor tipuri de glucide urinare, se efectuează operaţia de

defecare - adică înlăturarea substanţelor reducătoare neglucidice din urină.

Defecarea urinii

Defecarea urinii se efectuează cu reactivul Courtonne, care se prepară în felul

următor: se dizolvă 100 g acetat de plumb în apă distilată, se neutralizează cu acid acetic

glacial (control cu hârtie indicator), se filtrează într-un balon cotat de 1000 ml şi se

completează cu apă distilată până la semn.

Mod de lucru:

Se iau într-un cilindru 45 ml urină şi 5 ml reactiv Courtonne, se amestecă cu o

baghetă, se lasă să se depună precipitatul şi se filtrează.

Majoritatea reacţiilor de reducere nu sunt considerate suficient de specifice pentru

a fi utilizate pentru depistarea glicozuriei. Mai specifice sunt reacţiile Nylander şi

Benedict, ultima având avantajul de a da indicaţii orientative asupra cantităţii de substanţă

reducătoare din urină. O metodă specifică de evidenţiere a glucozei este metoda cu

glucozoxidază.

Reacţia Nylander

Principiu:

Glucidele reducătoare reduc în mediu bazic ionii de Bi3+ la Bi metalic.

Reactivi: 20 g azotat de bismut, 40 g sare Seignette (tartrat dublu de sodiu şi

potasiu) şi 100 g NaOH se dizolvă în apă până la 1000 ml soluţie.

Mod de lucru:

Într-o eprubetă, la 5 ml urină se adaugă 1 ml reactiv Nylander şi se încălzeşte la

flacără timp de 4 minute.

În prezenţa glucozei apare un precipitat brun până la negru. Reacţii fals pozitive

pot exista în proteinurie masivă, când apare un precipitat brun de sulfură de bismut

datorită reacţiilor de reducere date de unele grupări funcţionale ale radicalilor

aminoacizilor.

151

Reacţia Benedict (semicantitativă)

Principiu: Gruparea carbonil din glucidele reducătoare reduce la cald Cu2+ din

reactivul Benedict la Cu+ (menţinerea în soluţie a Cu2+ se face prin complexare cu citrat

de sodiu). În urma reacţiei se formează Cu2O de culoare roşie-cărămizie. Reacţia este

pozitivă pentru toate glucidele reducătoare. Reactivul Benedict are compoziţia prezentată

la pag. ??

Mod de lucru:

Se pun într-o eprubetă 0,5 ml urină şi 5 ml reactiv Benedict. Se amestecă şi se

pune într-o baie de apă la fierbere timp de 5 minute. Se răceşte la temperatura camerei şi

se interpretează rezultatul astfel:

Culoare Rezultat Substanţe reducătoare g‰albastru - absente

albastru-verzui urme urmeverde + cca 0,5

brun-verzui ++ cca 1,0galben +++ cca 1,5

roşu-cărămiziu ++++ cca 2,0

Reacţia Barfoed

Principiu:

Reacţia de reducere a Cu2+ la Cu+ din Cu2O în mediu slab acid este pozitivă numai

în prezenţa monozaharidelor şi ea serveşte la identificarea acestora în prezenţa

dizaharidelor reducătoare (lactoză, maltoză), pentru care această reacţie este negativă în

condiţiile de lucru. În mediu slab acid viteza reducerii Cu2+→ Cu+ este mult mai mică

decât în mediu alcalin (se formează un precipitat roşu-cărămiziu), totuşi mecanismul

reacţiei Barfoed încă nu este pe deplin cunoscut.

Reactiv: Reactiv Barfoed: 13,3 g acetat de cupru se dizolvă în 200 ml apă

distilată, se filtrează şi se adaugă 1,8 ml acid acetic glacial.

Mod de lucru:

Se pun într-o eprubetă 2 ml urină şi 2 ml reactiv Barfoed. Se amestecă şi se

încălzeşte eprubeta la fierbere timp de 5 minute. Pozitivitatea acestei reacţii, adică apariţia

pulberii roşii de Cu2O la suprafaţa şi la fundul eprubetei, indică existenţa

monozaharidelor reducătoare.

152

Reacţia Wöhlk

Se foloseşte tot în scopul diferenţierii glucozei de lactoză.

Principiu:

Urina care conţine lactoză, încălzită la 60 oC în prezenţa NH3 şi KOH, se

colorează în roşu.

Reactivi: - Sol. NH3 25%

- Sol. KOH 20%

Mod de lucru:

Într-o eprubetă, la 5 ml urină, se adaugă 3 ml soluţie NH3 şi 5 pic. soluţie KOH.

Eprubeta se agită şi se introduce în baie de apă la 60 oC, 30 minute. Prezenţa lactozei

determină apariţia coloraţiei roşii. Galactoza produce culoare galben deschisă, iar glucoza

în concentraţii ridicate dă o coloraţie brună.

Interpretare: Lactozuria este un fenomen inofensiv care poate apare în ultimele

luni de sarcină sau la începutul alăptării.

Reacţia Seliwanoff

Se foloseşte pentru identificarea fructozei urinare.

Principiu:

Monozaharidele în prezenţa acidului clorhidric concentrat reacţionează cu

rezorcina (sau alţi polifenoli) formând produşi de condensare coloraţi. Reacţia este mai

rapidă şi intensă în prezenţa cetozelor, când se obţin produşi coloraţi în roşu. În prezenţa

aldozelor, în aceleaşi condiţii, coloraţia este slab roză. Această reacţie serveşte la

diferenţierea aldozelor de cetoze.

Reactivi: - Reactivul Seliwanoff: 0,15 g rezorcină şi 100 ml acid clorhidric

concentrat se dizolvă în apă distilată până la 200 ml.

- Soluţie fructoză 1%

Mod de lucru:

Se pun într-o eprubetă 0,5 ml urină şi 5 ml reactiv Selivanoff. În paralel se

execută doi martori, unul cu 0,5 ml urină normală şi celălalt cu 0,5 ml urină normală care

conţine fructoză 1%. Se aduc la fierbere cele trei eprubete.

153

Prezenţa fructozei este indicată de apariţia unei coloraţii roşu intens. Prin răcire se

poate depune un precipitat roşu care se dizolvă în alcool.

Interpretare: Fructozuria esenţială este o boală ereditară rară datorată blocării

conversiei normale a fructozei în glucoză în ficat (deficit de fructokinază). Se poate

produce o fructozurie alimentară în diabet şi în unele boli hepatice.

Reacţia Bial

Se foloseşte pentru identificarea pentozelor urinare.

Principiu:

În mediu puternic acid pentozele dau reacţie de culoare cu orcina

(metilrezorcina).

Reactivi: - reactivul Bial: 6 g orcină se dizolvă în 200 ml alcool etilic 96% şi

se adaugă 40 picături sol. FeCl3 10%

- HCl conc.

- soluţie 1% de fructoză, arabinoză, glucoză

Mod de lucru:

Se iau într-o eprubetă 5 ml reactiv Bial şi 0,5 ml urină. Se execută în paralel doi

martori, unul cu urină normală şi altul cu o urină normală la care se adaugă 1 ml soluţie

de pentoze 0,1% (arabinoză sau xiloză). Se aduc la fierbere cele trei eprubete, apoi se lasă

în repaus 15-20 minute. Pentozele dau culoare verde, sau dacă sunt prezente în cantităţi

mari, un precipitat de culoare verzuie. Culoarea poate fi extrasă prin agitare în alcool

amilic.

Interpretare:

Pentozuria alimentară apare după un consum substanţial de fructe bogate în

pentoze. Pentozele sunt adesea excretate în urina diabeticilor. Pentozuria esenţială (în care

se elimină xiluloza) este o boală ereditară rară în care apar cantităţi considerabile de L-

xiluloză în urină datorită deficitului de reductază care converteşte pentoza în xilitol.

Reacţia cu fenilhidrazina

În laboratorul clinic formarea glucosazonei şi a lactosazonei este utilizată ca test

pentru diferenţierea glucozei de lactoză în urina femeilor gravide.

Reactivi: - Soluţie fenilhidrazină în acid acetic glacial 10%;

- Soluţie acetat de sodiu 25%;

154

- Acid acetic glacial;

- Reactiv Patein: se dizolvă 200 g acetat de mercur în 600 ml apă

distilată, se alcalinizează (indicator hârtie de turnesol) cu soluţie de

hidroxid de sodiu 10%. Se trece într-un balon cotat de 1000 ml şi

se completează cu apă distilată la semn. Reactivul nu se alterează.

Mod de lucru:

Într-o eprubetă se pipetează 1 ml soluţie fenilhidrazină, 1 ml acid acetic glacial şi

1 ml soluţie acetat de sodiu 25%, apoi se adaugă 10 ml urină defecată cu reactiv Patein.

Prin defecare se elimină celelalte substanţe reducătoare pe care le-ar putea conţine urina

trecând în filtrat numai glucidele. Se filtrează şi eprubeta cu filtrat se ţine o oră în baia de

apă la fierbere, apoi se filtrează imediat la cald într-o altă eprubetă care se lasă să se

răcească.

În prezenţa glucozei (în cantitate mai mare de 4 g%o) se obţine glucosazonă

insolubilă la cald care rămâne pe al doilea filtru şi care examinată la microscop, se

prezintă sub formă de ace galbene aurii dispuse în snopi (vezi pag. 49). Fructosazona are

aspect asemănător. Dacă urina conţine şi lactoză sau maltoză, osazonele acestora se vor

cristaliza în ultima eprubetă, la rece. Cristalele de lactosazonă apar la microscop sub

formă de rozete, iar cele de maltosazonă au formă de lame aproape rectangulare unite prin

una din extremităţi.

Identificarea corpilor cetonici urinari

Corpii cetonici (acetona, acidul acetoacetic şi acidul β-hidroxibutiric) sunt

implicaţi în metabolismul lipidic. În condiţii patologice de dereglare a catabolismului

acizilor graşi se excretă prin urină în special acidul β-hidroxibutiric şi acidul acetoacetic,

ultimul fiind convertit în acetonă prin decarboxilare dacă urina este păstrată la

temperatura camerei.

Reacţia Legal

Serveşte la identificarea acetonei. În scop diagnostic este suficientă identificarea

acesteia, fiindcă acetona, acidul acetoacetic şi β -hidroxibutiratul sunt întotdeauna prezenţi

împreună.

Reactivi: - Sol. nitroprusiat de Na 10% (proaspătă)

- Acid acetic glacial

155

- NaOH 10%

Mod de lucru:

Se iau într-o eprubetă 3 ml urină, se adaugă 5 picături de soluţie de nitroprusiat de

Na 10% şi 2-3 pic. de NaOH 10% până la reacţie alcalină. Apariţia unei culori roşii sau

portocalii se datorează acetonei sau creatininei urinare. Se adaugă apoi 1-2 ml acid acetic

glacial. Dispariţia culorii indică absenţa acetonei, iar intensificarea culorii cu virare spre

roşu-violet indică prezenţa acetonei. Intensitatea culorii variază în raport direct cu

concentraţia corpilor cetonici din urină.

Reacţia poate fi dată şi de unele medicamente (salicilaţi - de ex. aspirina).

Diferenţierea se face fierbând în prealabil câteva minute urina, operaţie prin care acetona

se îndepărtează. O reacţie pozitivă iniţială, care nu mai apare după fierberea unei alte

probe din urina respectivă, indică prezenţa acetonei.

Reacţia Lieben

Principiu:

În reacţia dintre acetonă şi iod în mediu alcalin, ia naştere iodoformul care poate fi

recunoscut prin miros.

H3C - CO - CH3 + 3I2 + 3NaOH CH3 - CO - CI3 + 3NaI + 3H2O

CH3 - CO - CI3 + NaOH CH3 - COONa + CHI3

tri-iod-acetona iodoform

Reactivi: - Sol. de iod - iodură de potasiu 0,1 N

- Sol. NaOH 10%

Mod de lucru:

Într-o eprubetă se iau 5 ml urină, se adaugă 1-2 ml NaOH 10% şi 1-2 ml iod 0,1

N. Apariţia unui precipitat galben şi a mirosului de iodoform indică prezenţa acetonei.

156

Interpretare: Corpii cetonici apar în urină în diabetul zaharat netratat (datorită

lipsei de insulină, celulele nu pot internaliza glucoza din sânge. Acizii graşi vor fi

principala sursă de energie, ceea ce intensifică exagerat cetogeneza hepatică. Ficatul

exportă mari cantităţi de corpii cetonici care sunt folosiţi în scop energetic de ţesuturile

extrahepatice). Acetonurie apare în toate cazurile în care aportul de glucide sau utilizarea

lor este deficitară: înfometare, regim alimentar dezechilibrat (bogat în lipide şi proteine,

sărac în glucide), diaree, vărsături (accentuate de sarcină), malabsorbţie intestinală, boli

metabolice.

Teste rapide pentru identificarea corpilor cetonici

Corpii cetonici se pot evidenţia cu pulbere reactivă sau cu tablete "Acetotest" sau

baghete "Ketostix" care conţin nitroprusiat de sodiu şi substanţe alcalinizante, care se

colorează în roşu în cazul reacţiei pozitive. Aceste teste rapide se bazează pe reacţia Legal

clasică. Cu ajutorul lor putem detecta corpii cetonici chiar în concentraţii de 0,5-1 mmol/l,

prin apariţia culorii roşii la 15 secunde de la contactul urinei cu bagheta cu reactivi.

Identificarea acizilor biliari

Eliminarea acizilor biliari în urină se mai numeşte colalurie. Apare în special în

caz de icter mecanic (din cauze obstrucţiei tubului coledoc, sărurile acizilor biliari nu mai

sunt excretate în bilă. Datorită presiunii ele trec în curentul sanguin şi se elimină în urină).

Colaluria mai apare în ictere date de hepatită, când celula hepatică bolnavă nu mai poate

excreta acizii biliari.

Proba Hay

Principiu:

Sărurile acizilor biliari scad tensiunea superficială a urinei permiţând

sedimentarea florii de sulf.

Reactiv: Sulf sublimat (floare de sulf).

Mod de lucru:

Se presară floarea de sulf pe suprafaţa urinei pusă într-o eprubetă. Dacă urina

conţine acizi biliari, sulful sedimentează în 5 minute. În absenţa acizilor biliari sulful

pluteşte câteva ore.

Reacţia Pettenkoffer

Principiu:

Acidul sulfuric transformă glucidele în derivaţi furfurolici care se condensează cu

acizii biliari dând produşi coloraţi.

157

Reactivi: - Acid sulfuric concentrat

- Zaharoză 10%

Mod de lucru:

Într-o eprubetă se iau 1 ml apă distilată, 1-2 ml urină, 5-6 picături zaharoză 10% şi

se agită. Se adaugă cu grijă, prelingându-se pe peretele eprubetei ţinută într-o poziţie

înclinată, 1-2 ml acid sulfuric. Apariţia unui inel roşu-violet la limita de separaţie a

reactivului cu proba indică prezenţa acizilor biliari. În paralel se execută o probă martor în

aceleaşi condiţii, înlocuind urina cu apă. Inelul obţinut are o nuanţă brună cărămizie.

Identificarea pigmenţilor biliari urinari

Pigmenţii biliari sunt derivaţi pirolici care provin din catabolismul hemului.

Principalii reprezentanţi sunt biliverdina, bilirubina, urobilinogenul, urobilina,

stercobilinogenul, stercobilina. Urobilinogenul şi stercobilinogenul, rezultaţi prin

reducerea bilirubinei, sunt compuşi incolori, care în contact cu aerul se oxidează parţial,

trecând în urobilină, respectiv stercobilină, care sunt compuşi coloraţi.

Identificarea bilirubinei

După cantitatea de bilirubină eliminată, culoarea urinei variază între galben şi

brun-închis, cu nuanţă verzuie. Bilirubina eliminată în urină, fiind instabilă, reacţiile de

identificare trebuiesc făcute în timp cât mai scurt de la emisie. Bilirubina fiind

fotosensibilă, urina trebuie conservată la întuneric.

Urina normală conţine doar urme de bilirubină, care nu dă reacţia de identificare

pozitivă. Creşterea eliminării urinare a bilirubinei apare, ca şi în cazul acizilor biliari, în

icterele prin obstrucţia căilor biliare şi în icterele prin hepatită.

Proba Popper

Principiu:

Oxidarea bilirubinei în biliverdină (de culoare verde) cu ajutorul iodului.

Reactivi: - Reactiv Popper: Se amestecă 525 ml apă distilată, 125 ml alcool 95o,

3,5 ml tinctură de iod 10% şi se adaugă 12 g KI şi 27 g NaCl.

Mod de lucru:

Se pun 5 ml urină într-o eprubetă. Se adaugă cu precauţie, cu o pipetă, 2 ml

reactiv, astfel ca cele două lichide să nu se amestece. Reactivul fiind mai dens, se

158

introduce la fundul eprubetei. În prezenţa bilirubinei apare un inel verde la suprafaţa de

contact dintre coloanele celor două lichide.

Reacţii fals pozitive: după consum de antipirină (analgetic) şi piramidon.

Testele rapide de determinare a bilirubinei din urină au la bază reacţia de

condensare a bilirubinei cu un alt compus în mediu puternic acid, cu apariţia unei coloraţii

maronii de intensitate diferită. Reacţia completă necesită 20 de minute.

Identificarea urobilinogenului şi stercobilinogenului

Urobilinoizii sunt derivaţii hidrogenaţi ai bilirubinei: urobilinogenul,

stercobilinogenul, urobilina şi stercobilina. Reducerea bilirubinei se produce în intestin

sub influenţa bacteriilor. O parte din urobilinoizi este reabsorbită şi ajunge din nou la ficat

prin vena portă (circuitul hepatoenterohepatic al pigmenţilor biliari). Cea mai mare parte

este metabolizată, în timp ce 35-140 mg sunt excretate în urina de 24 de ore.

Identificarea urobilinoizilor urinari

Reacţia Ehrlich

Principiu:

În prezenţa p-dimetilaminobenzaldehidei în mediu puternic acid, urobilinogenul şi

stercobilinogenul dau o coloraţie roşie intensă prin formarea unui compus chinoid.

Reactivi: - Reactiv Ehrlich: se dizolvă 2 g p-dimetilaminobenzaldehidă în 100

ml HCl 20%.

- Cloroform

Mod de lucru:

La 3 ml de urină se adaugă 2-3 picături reactiv Ehrlich. Se lasă în repaus un

minut. Apariţia unei coloraţii roşii intense la temperatura ambiantă denotă o eliminare

crescută de urobilinogen. Colorantul se poate extrage în cloroform. Porfobilinogenul

intermediar al sintezei hemului, care apare în urină în porfiria intermitentă acută, dă o

coloraţie asemănătoare. El nu este însă solubil în cloroform. Dacă după agitare cu

cloroform acesta rămâne incolor, reacţia pozitivă se datoreşte prezenţei

porfobilinogenului.

159

Observaţie: Urina de analizat trebuie să fie rece. În urina caldă indolul eliberat în

condiţiile de reacţie poate da şi el culoare roşie cu reactivul Ehrlich. Sulfamidele dau o

coloraţie galbenă care poate masca reacţia bilinogenilor.

Interpretare: Eliminarea crescută a urobilinoizilor apare în următoarele situaţii:

1). Hemoliză exagerată: funcţia hepatică este în general intactă, dar posibilităţile

de glucuronoconjugare ale ficatului sunt depăşite.

2). Tulburarea funcţiei hepatice: ictere hepatocelulare, hepatite, ciroză sau

intoxicaţii chimice cu cloroform şi în special cu tetraclorură de carbon.

3). Icter prin obstrucţie, în stadiile precoce, de obstrucţie incompletă.

Identificarea sângelui

În urină apare fie hemoglobina liberă (hemoglobinurie), fie hematii (hematurie).

Diferenţierea se poate face numai prin examenul microscopic al sedimentului urinar, şi

anume în primul caz în sediment nu se observă hematii.

Se foloseşte urina proaspătă fiindcă majoritatea testelor se bazează pe acţiunea

pseudoperoxidazică a hemoglobinei: leucoderivatul unui colorant (benzidina,

fenolftaleină redusă în mediu alcalin, etc.) este oxidat cu apă oxigenată, în prezenţa

hemoglobinei, în colorantul respectiv. Întrucât leucocitele dau o reacţie peroxidazică

adevărată (enzimatică) este necesar să se fiarbă urina câteva minute, după acidularea

prealabilă cu acid acetic.

Reacţia cu benzidină

Reactivi: - Sol. benzidină: 5 g benzidină se dizolvă în 50 ml acid acetic

glacial şi se completează cu apă distilată la 1000 ml.

- Apă oxigenată 3%

Mod de lucru:

Se iau 3 ml urină, 2-3 pic. sol. benzidină şi 2 ml apă oxigenată 3%. Se agită,

reacţia pozitivă prezintă o culoare albastră. Ordinea de adăugare a reactivilor este

esenţială.

Interpretare:

Hematuria macroscopică (vizibilă cu ochiul liber) apare în caz de: calculi renali,

tumori renale sau ale căilor urinare (cancerul renal deseori are ca primă manifestare

hematuria), tuberculoză urogenitală, traumatisme, chisturi renale, diateză hemoragică

(sângerări multiple, în diferite ţesuturi), cistită hemoragică. Hematuria microscopică,

160

deseori renală apare în caz de: calculi ureterali care produc leziuni ale mucoasei,

pielonefrită, nefrită interstiţială, în colagenoze (boli autoimune cu frecventă afectare

renală), de însoţire în boli infecţioase, efort fizic, glomerulonefrită (lezarea gravă a

filtrului glomerular face posibilă traversarea lui de către hematii) .

Teste rapide de diagnostic din urină

Stripsurile pentru analiza urinei sunt plăci de celuloid care conţin mai multe benzi

de hârtie impregnate cu reactivi. Parametri cei mai importanţi care se analizează sunt:

densitatea, pH-ul, bilirubina, urobilinogenul, proteinele, glucoza, corpii cetonici,

leucocitele, nitriţii şi sângele. Stripsul se introduce în proba de urină pentru câteva

secunde, timp în care au loc reacţiile corespunzătoare. Culoarea se compară cu o scală de

culori care arată aproximativ cantitatea de substanţe conţinute, pH-ul, etc, sau se

introduce stripsul într-un aparat special care citeşte rezultatele.

Test rapid de sarcină

Se bazează pe determinarea hormonului coriogonadotrop uman (hCG). Dacă

acesta se găseşte în urină în cantitate mare (peste 800 U/l), testul este pozitiv, iar la valori

sub 500 U/l testul este negativ. Principiul de determinare se bazează pe latex-aglutinare,

hemaglutinare, sau o metodă imunoenzimatică, în funcţie de testul folosit.

La metoda de latexaglutinare elementele de latex ale plăcii de reacţie a kitului sunt

acoperite cu hCG. Antiserul folosit conţine anticorpi monoclonali specifici pentru beta-

hCG. În caz pozitiv (dacă este sarcină) hCG din urină în concentraţie de peste 800 U/l se

leagă de anticorpii monoclonali ai antiserului, împiedicând astfel aglutinarea elementelor

de latex acoperite cu anticorpi. În caz negativ, dacă nivelul hCG în urină este sub 500 U/l,

atunci hCG de pe suprafaţa elementelor de latex se poate lega de anticorpii monoclonali

cu locusurile de legare libere, astfel se produce aglutinarea.

În cadrul metodei imunoenzimatice în prima etapă se adaugă într-o eprubetă proba

de urină la anticorpul anti-hCG legat de o enzimă, apoi acest amestec este pus pe o placă

de reacţie. Dacă proba conţine hCG, acesta se leagă de anticorpul monoclonal şi

complexul se leagă de un alt anticorp (anti-hCG) legat de placa de reacţie. În a doua etapă

se adaugă un substrat care este transformat de către enzima din complex într-un compus

colorat. Această reacţie este foarte sensibilă, fiind pozitivă peste valoarea de 25 U/l hCG.

161

Analiza de laborator a urinei

Analiza de rutina evidenţiază: Aspect: clar. Cilindri: absenţi, eventual prezenţa

cilindrilor hialini. Culoare: galben pai. Cristale: prezente. Celule epiteliale: absente.

Miros: uşor aromatic. pH: 4,5-8,0. Densitate: 1,025-1,030g/cm3. Glucide: absente.

Hematii: 2-3/câmp vizual. Leucocite: 0-4/câmp vizual.

Proba de concentrare pune în evidenţă: Densitatea: 1,025-1,032g/cm3.

Osmolaritatea: > 800 mOsm/kg apă

Proba de diluţie pune în evidenţă: Densitatea: < 1,003. Osmolaritatea: < 100

mOsm/kg apă.

Determinări în urina din 24 de ore.

Dozarea clorurilor din urină (metoda Mohr)

Principiu.

Azotatul de argint precipită cantitativ ionul clor din urină sub formă de clorură de

argint, iar excesul de azotat de argint dă cu cromatul de potasiu folosit ca indicator,

cromat de argint de culoare roşie, care indică sfârşitul reacţiei.

NaCl + AgNO3 → AgCl + NaNO3

K2CrO4 + 2AgNO3 → Ag2CrO4 + 2KNO3

Reactivi: - soluţie de acid acetic 10% ;

- carbonat de calciu pulbere ;

- soluţie cromat de potasiu10%;

- soluţie azotat de argint 0,1N.

Modul de lucru:

Într-un vas Erlenmeyer se pipetează 10 ml urină de analizat, se adaugă 5 picături

din soluţia de acid acetic 10% pentru a dizolva precipitatul de fosfaţi neutri care ar

împiedica observarea sfârşitului reacţiei şi 1 g de carbonat de calciu pulbere pentru

neutralizarea completă a amestecului deoarece cromatul de argint care se formează şi care

indică sfârşitul reacţiei este solubil în mediu acid.

La acest amestec se mai adaugă 50 ml de apă distilată şi 5-6 picături din soluţia de

cromat de potasiu. Se titrează cu soluţia de azotat de argint 0,1 N până la apariţia unei

coloraţii roşu-cărămiziu a precipitatului.

162

Calcularea rezultatelor

1 ml AgNO3 0,1 N corespunde la 0,00585 g NaCl

g/l NaCl = n x 0,00585 x 100

n = ml soluţie AgNO3, 0,l N folosiţi la titrare.

Variaţii patologice

Rezultatul se poate raporta la cantitatea de urină emisă în 24 de ore. În mod

normal urina din 24 de ore conţine 9-12 g NaCl.

- valori crescute: regim hiperclorurat, insuficienţă suprarenală, nefropatii tubulare sau

interstiţiale:

- valori scăzute: retenţii tisulare, nefrite, transpiraţii excesive, vomă, maladii cardiace,

dietă fără sare.

Persoana la care se face analiza clorurilor în urină nu trebuie ca înaintea analizei

să consume bromuri sau ioduri, deoarece şi acestea precipită cu azotatul de argint şi

rezultatele nu vor fi concludente.

Analiza chimică a urinei evidenţiază:

- Amilază: 10-80 UI/oră

- 17 cetosteroizi: - bărbaţi: 6-21 mg/24 ore

- femei: 4-17 mg/24 ore

- Clearance de creatinină: - bărbaţi (20 ani): 90 ml/min/1,73 m2

- femei (20 ani): 84 ml/min/1,73 m2

- Proteine: < 150 mg/24 ore. Acid uric: 250-750 mg/24 ore. Glucozoxidază: negativ.

Corpi cetonici: negativ

- Calciu: - bărbaţi: < 275 mg/24 ore

- femei: < 250 mg/24 ore

- Fosfat: < 1000 mg/24 ore. Sodiu: 30-290 mEq/24 ore. Clor: 110-250 mEq/24 ore

Dozarea acidului uric din urină

Recoltarea urinii de 24 ore se face într-un recipient de sticlă cu 10 ml NaOH 5%

pentru a preveni precipitarea uraţilor.

Modul de lucru:

În loc de 2 ml filtrat se lucrează cu 2 ml urină diluată 1:100.

Calcul:

Ep/Es x 100 x 15 = mg acid uric/1500 ml urină (pe 24 de ore)

163

Valori normale:

0,25 - 1,00 g acid uric eliminat/24 h

Valori crescute: În gută (după puseuri), tumori maligne

Valori scăzute: în gută (înainte si în cursul puseurilor), boli renale

Dozarea creatininei din urină

Principiu şi reactivii: acelaşi ca pentru ser

Modul de lucru:

Se diluează urina de 50 ori. Din această soluţie se pipetează 1,5 ml, se adaugă 4,5

ml acid picric saturat şi se introduce vasul pentru 15-20 secunde în baie de apă fierbinte.

Dacă soluţia rămâne limpede, după răcire se scot 5 ml de probă la care se adaugă 0,25 ml

NaOH 10%. După 15 minute se citeşte extincţia probei faţă de martor la 530 nm.

Martorul va conţine 2 ml de apă bidistilată, 6 ml acid picric saturat şi 0,25 ml NaOH 10%.

În paralel se execută aceleaşi operaţii folosind în locul urinei diluate o soluţie standard de

creatinină de concentraţie cS = 10 µg/ml pentru care se obţine extincţia Es.

Calcul: 1000

150c

EE

creatinină mg SS

urină ⋅⋅⋅=

Determinarea de clearance (coeficientul de epurare) renal

Pornind de la faptul că constituenţii urinii provin din sânge, cunoscând cantitatea

lor în sânge şi în urină, putem calcula volumul de sânge epurat de aceste substanţe. Pentru

orice substanţă din sânge, care se elimină în urină, putem scrie formula: mp = mu unde:

mp = cantitatea absolută a substanţei dintr-un volum de plasmă care va fi epurată de aceea

substanţă. mu = cantitatea absolută a substanţei ajunse prin epurare în urină.

mp = Vp ⋅ cp/100. mu = Vu ⋅ cu/100. Vp ⋅ cp = Vu ⋅ cu

cp, cu = concentraţiile plasmatică şi urinară a substanţei. Vu = volumul de urină eliminat în

ml/min. Vp = C (clearance = coeficient de epurare) = acel volum virtual de plasmă care

este epurat într-un minut de această substanţă (ml/min) pe cale renală. Deci coeficientul

de epurare este exprimat prin raportul dintre debitul urinar al unei substanţe pe minut şi

concentraţia sa în plasmă:

cu

164

C = ---- ⋅ Vu cp

La nivelul nefronului au loc 3 procese importante: filtrarea glomerulară,

reabsorbţia tubulară şi secreţia tubulară. Clearance-ul este egal cu volumul filtrării

glomerulare pe minut în cazul substanţelor care se filtrează liber, adică nu sunt

reabsorbite şi secretate la nivel tubular, nu se transformă, nu se depozitează, nu

influenţează funcţia renală, nu sunt toxice. Astfel de substanţe pot fi endogene

(creatinină) şi exogene (inulină, manitol-polizaharide cu masă moleculară mare etc.).

Astfel determinarea clearance-ului de creatinină endogenă permite explorarea filtrării

glomerulare. Clearance-ul de creatinină endogenă este egal cu 120 ml/min pentru o

suprafaţă corporală medie de 1,7 m2 şi o greutate medie de 70 kg.

Fiecare substanţă din plasmă are un coeficient de epurare indiferent de

concentraţia sa în urină. Majoritatea constituenţilor obişnuiţi ai urinei au un coeficient de

epurare mai mic de 120 ml/min, datorită reabsorbţiei tubulare parţiale sau totale (de ex.

Cglucoză = 0). O altă categorie de substanţe au un clearance superior filtratului glomerular,

deoarece ele ajung în urina finală şi printr-un proces de secreţie tubulară. Determinarea

clearance-ului de creatinină permite deci explorarea capacităţii de filtrare glomerulară.

Calcul:

Calculul clearence-lui de creatinină (C) se poate face cu următoarea formulă

C = Eurină/Eser ⋅ 50 ⋅ 1500/24 ⋅ 60

unde: Eurină şi Eser sunt extincţiile optice citite pentru probele de urină, respectiv ser

în metodele de dozare descrise la pag. 121.

Valori normale: 80-120 ml/min

Analiza calculilor urinari

Calculii urinari se formează prin precipitarea unor substanţe organice şi

anorganice des întâlnite în sedimentul urinar: oxalat de calciu, acid uric, uraţi, fosfaţi de

calciu şi magneziu, xantina, colesterolul. Acestea se depun sub formă de straturi

alternante în jurul unui nucleu sau sunt amestecate intim. Calculi omogeni se întâlnesc

rar.

165

Identificarea unor componenţi prin reacţii specifice:

1) CO 32- : Pulberea de calcul urinar se dizolvă cu efervescenţă în soluţie de HCl 2N la

cald.

2) PO 43- : Într-o eprubetă se introduce un vârf de cuţit de pulbere de calcul, se adaugă

câteva picături de HNO3 concentrat (d = 1,42 g/ml) şi 1-2 ml soluţie de molibdat de

amoniu 5%. Se încălzeşte şi se lasă în repaus. Apariţia unei coloraţii sau precipitat

galben de fosfomolibdat de amoniu indică prezenţa fosfatului.

3) (COO) 22-: Într-o eprubetă se introduc un vârf de cuţit de pulbere de calcul, 1 ml H2SO4

5% şi 2 picături KMnO4 1%o. Se încălzeşte eprubeta. Dacă oxalatul este prezent, va

reduce KMnO4 producând decolorarea soluţiei.

4) Cistină : Într-o eprubetă se introduc un vârf de cuţit de pulbere, 1 ml soluţie de NaOH

10% şi 2-3 picături soluţie de Pb(CH3COO)2 saturată. Eprubeta se încălzeşte la

fierbere 1-2 minute. Prezenţa cistinei duce la formarea PbS (precipitat negru).

5) Urat (reacţia murexidului): Într-o capsulă de porţelan se introduce un vârf de cuţit de

pulbere care apoi se umectează cu 2-3 picături HNO3 concentrat (d = 1,42 g/ml) şi se

evaporă pe flacără la sec. Apariţia unei culori roşii indică formarea acidului purpuric

prin oxidarea acidului uric de către HNO3. Adăugând o picătură de soluţie NH3 25%

şi o picătură soluţie NaOH 10% apare o culoare violetă datorită murexidului (purpurat

de amoniu).

6) Xantina : Se face reacţia cu HNO3 concentrat ca şi în cazul evidenţierii uratului.

Prezenţa xantinei determină un reziduu galben care nu-şi schimbă culoarea la

adăugarea soluţiei de NaOH. Adăugând soluţie de NH3 culoarea virează spre roşu.

7) Colesterolu l: (reacţia Liebermann-Burchardt): Într-o eprubetă se introduc 1 vârf de

cuţit de pulbere, 1 ml cloroform, 4 picături H2SO4 concentrat (d = 1,92 g/ml) şi 2

picături anhidridă acetică.

Prezenţa colesterolului determină formarea dicolestendienei de culoare ce variază de la

roz la verde, extractibilă în cloroform.

Calculii urinari apar în litiaza urinară cu următoarea frecvenţă relativă: Oxalat de

Ca 34,2%. Oxalat de Ca + fosfat de Ca 26,2%. Acid uric 18,8%. Fosfat de Ca 9,7%.

Oxalat de Ca + acid uric 4,5%. Fosfat amoniaco-magnezian 2,2%. Carbonat de Ca

2,2%. Cistină 1,7%.

166

Analiza salivei

Identificarea unor componenţi ai salivei

Saliva – reprezintă produsul de secreţie al glandelor salivare. Este un lichid

incolor, transparent, insipid, având densitatea între 1,002-1,006g/cm3 şi pH în jur de 6,8 în

momentul secreţiei, devenind mai alcalin în timpul masticaţiei.Volumul salivar mediu

zilnic este de aproximativ 800 ml.

Compoziţia salivei diferă în funcţie de următorii factori: perioada de zi în care se

face recoltarea; înainte sau după mese; alimentele consumate; igiena bucală; stimulul

aplicat la recoltare.

Compoziţia chimică a salivei este următoare:

- apă: 99,4%

- substanţe anorganice 0,2%: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, HCO3-, Cl-, SCN-, PO4

2-

- substanţe organice 0,4%: proteine, enzime salivare (amilază, lizozim), mucine

(glicoproteine), micromolecule azotate (uree, creatină, etc.), micromolecule

neazotate (acid lactic, acid citric).

Reactivi: - CH3COOH 5%.

- NaOH 5%.

- Reactivul biuret - Soluţia A: 4,5 g tartrat de sodiu şi potasiu se

dizolvă în 40 ml NaOH 0,2 N. Se adaugă sub agitare 1,5 g CuSO4•5H2O dizolvat în 10 ml

apă, apoi se adaugă 0,5 g KI şi se completează cu NaOH 0,2 N până la 100 ml. Se

conservă în sticlă brună timp nelimitat.

- Soluţia B: se dizolvă 5 g KI în 1000 ml de

NaOH 0,2 N. Se conservă timp nelimitat, în sticla brună.

- Soluţia de lucru: se dizolvă 1 volum soluţie A

cu 4 volume soluţie B. Se poate utiliza o săptămână, păstrându-se în sticlă brună.

- HCl 5%.

- Na2CO3 20%.

- Reactivul Benedict ( 173 g citrat de sodiu şi 100 g carbonat de

sodiu anhidru se dizolvă în 800 ml apă distilată fierbinte, se filtrează şi se aduce volumul

la 850 ml. Se dizolvă apoi separat 17,3 g sulfat de cupru cristalizat în 100 ml apă distilată,

167

se adaugă sub agitare în prima soluţie şi se completează volumul soluţiei finale la 1000

ml.

- HNO3 5%.

- AgNO3 5%.

- HNO3 concentrat.

- (NH4)2MoO4 5%.

- BaCl2 5%.

- (COO NH4)2 5%.

- FeCl3 5%

Identificarea mucinei: Mucinele au ca grupare prostetică compuşi din clasa

glucidelor ce derivă de la aminozaharuri.

a) Precipitarea mucinei : la 5 ml salivă se adaugă 1 ml acid acetic 5%. Mucina

precipită, se filtrează. Filtratul se păstrează pentru identificarea altor componenţi,

iar din precipitat se pune în evidenţă partea proteică şi cea glucidica a mucinei.

b) Identificarea părţii proteice : o parte a precipitatului se dizolvă în 1 ml NaOH 5%

şi se adaugă 1 ml din reactivul biuret. Datorită componentei proteice se formează

complexul de culoare violetă.

c) Identificarea părţii glucidice : partea ce rămâne din precipitat se fierbe câteva

minute în 5 ml HCl 5%. Se răceşte, se alcalinizează cu Na2CO3 20% şi se

efectuează reacţia Benedict. Reacţia va fi pozitivă datorită apariţiei glucidelor

reducătoare în urma hidrolizei părţii glucidice.

Identificarea Cl-: La porţiunea de filtrat de salivă (lipsită de mucină) se adaugă

HNO3 5% ş AgNO3 5%. Formarea unui precipitat alb de clorură de argint indica prezenţa

ionilor Cl-

Identificarea PO43-: Filtratul de salivă se acidulează cu HNO3 conc., se adaugă

câteva picături de molibdat de amoniu 5% şi se încălzeşte. Prezenţa ionilor de PO43- este

indicată prin apariţia unui percipitat galben sau o coloraţie galbenă.

Identificarea SO42-: Se acidulează filtratul de salivă cu HCl 5% şi se aduga BaCl2

5%. În prezenţa ionilor SO42- apare un precipitat alb de sulfat de bariu.

Identificarea Ca2+: Se adaugă la filtratul de salivă oxalat de amoniu 5%. În

prezenţa ionului de Ca2+ apare un precipitat alb de oxalat de calciu.

168

Identificarea SCN-: La filtratul de salivă se adaugă 1-2 picături de HCl 5% şi 1-2

picături FeCl3 5%. În prezenţa ionilor de SCN- se formează Fe(SCN)3 de culoare roşie. La

fumători, în general, concentraţia ionului SCN- este mai mare ca la nefumători.

Determinarea pH-ului şi a capacităţii tampon a salivei

Determinarea pH-ului: Se face cu hârtie de indicator universal sau mai exact

prin metoda electrometrică. În mod normal, pH-ul salivei (salivă proaspătă) este de 6,5-

7,0 deci neutru.

Scăderea pH-ului salivei (până la valori slab acide 6,0), ca şi creşterea (până la

valori slab bazice 7,9) poate apărea în anumite stări fiziologice

- scăderi în timpul nopţii

- scăderi după mese

- scăderi la gravide

cât şi în unele stări patologice - tulburări sanguine acido-bazice

- leziuni ale cavităţii bucale

În timpul păstrării salivei recoltate, pH-ul iniţial neutru devine alcalin, din cauza pierderii

de CO2.

Determinarea capacităţii tampon:

Principiu: Saliva dispune de un important efect tampon exercitat de următoarele

sisteme tampon: dicarbonat, fosfat şi proteină (mucină)

Capacitatea sistemelor tampon se exprimă prin numărul de echivalenţi de acid sau

bază care schimbă pH-ul unui litru de soluţie tampon cu o unitate. În scopuri practice

capacitatea poate fi exprimată şi prin numărul mililitrilor de acid sau bază de concentraţie

cunoscută, tamponate de un anumit volum de soluţie tampon.

Reactivi: - HCl 0,01 N;

- NaOH 0,01 N;

- Metilorange (soluţie de indicator) 0,1%;

- Fenolftaleină (soluţie de indicator) 0,1% în alcool.

Modul de lucru:

6 ml salivă se diluează cu 14 ml apă distilată. Saliva diluată se împarte în două

probe de câte 10 ml. Într-una din probe se pune 3 picături de metilorange, iar în cealaltă 3

picături de fenolftaleină. Cu ajutorul microbiuretei se adaugă primei probe HCl N/100 iar

169

celei de-a doua probă NaOH N/100, până la virajul indicatorilor. Se notează volumul de

HCl N/100 şi de NaOH N/100 consumate. Aceste volume se înmulţesc cu factorii

soluţiilor respective şi se raportează la 1000 ml salivă.

Analiza sucului gastric

Determinarea acidităţii gastrice

Sucul gastric provine din secreţia unui mare şi variat număr de celule ale

mucoasei gastrice. Zona glandelor fundice elaborează secreţia primară acidă (secreţie

parietală) care este de fapt o soluţie apoasă de acid clorhidric. Zona antropilorică

elaborează secreţia primară alcalină (secreţia neparietală), care este un amestec de

proteine, mucus, ioni de sodiu, potasiu, calciu, clorură şi bicarbonat. Secreţia alcalină are

rolul de a reduce aciditatea gastrică prin neutralizare şi diluţie.

Sucul gastric rezultă deci din amestecul celor două secreţii parietale şi neparietale

din care rezultă lichidul intens acidulat (pH = 1-2).

Principiu:

În laborator se determină aciditatea totală, liberă şi legată. Aciditatea liberă

reprezintă concentraţia ionilor de hidroniu proveniţi din acidul clorhidric liber. Aciditatea

legată reprezintă concentraţia ionilor de hidroniu legaţi de proteine, fosfaţi acizi, acizi

carboxilici şi alte substanţe. Aciditatea totală este dată de însumarea celor două acidităţi

(liberă şi legată) şi se poate defini ca fiind suma ionilor de hidroniu titrabili cu NaOH 0,1

N.

Sucul gastric filtrat se titrează cu NaOH 0,1 N în prezenţă de indicator Tőpfer.

170

Figura redă curba de titrare (variaţia pH-ului în funcţie de NaOH 0,1N adăugat) în

cazul unui suc gastric normal.

Indicatorul Tőpfer este un indicator universal preparat din p-dietilaminoazobenzen

şi fenolftaleină. În tabel este prezentat virajul indicatorului Tőpfer în funcţie de pH (vezi

curba de titrare de mai sus).

Indicator Tőpfer pH Culoarea

p-dimetilaminoazobenzen0 - 2,9

2,9 - 4,14,1 - 14

roşuportocaliu

galben

fenolftaleină0 - 88 - 1010 - 14

incolorrozroşu

Reactivi: - Indicatorul Tőpfer : p-dimetilaminoazobenzen 0,25 g

fenolftaleină 2 g

alcool etilic 96%. 100 ml

- Sol. NaOH 0,1 N cu factorul FNaOH

Modul de lucru:

În trei flacoane Erlenmeyer de 100 ml se măsoară câte 10 ml suc gastric şi se

adaugă 1-2 picături de indicator Tőpfer. Soluţia se titrează cu NaOH 0,1 N până la

portocaliu şi se notează cantitatea de NaOH 0,1 N folosită. Această cantitate reprezintă

volumul folosit pentru dozarea acidităţii libere şi se notează cu v. Se continuă titrarea

trecând prin culoarea galbenă până la apariţia culorii roşii. Totalul mililitrilor de NaOH

0,1 N consumaţi de la începutul titrării se notează cu v' şi vor fi luaţi în considerare pentru

calculul acidităţii totale.

Calcul: Rezultatul se exprimă în unităţi clinice (UC, numărul de ml de NaOH 0,1

N folosiţi la titrarea a 100 ml suc gastric).

aciditatea liberă = v × FNaOH × 10 UC

aciditatea totală = v' × FNaOH × 10 UC

Valoarea acidităţii legată se obţine făcând diferenţa dintre aciditatea totală şi cea

liberă.

Valori normale: aciditatea liberă = 30 UC; aciditatea totală = 50 UC.

Valori patologice:

Valori crescute: Hiperaciditate se întâlneşte în stări de stres (stimulul simpatic

induce creşterea secreţiei de HCl în mucoasa gastrică), în gastrite hiperacide, ulcer gastric

171

şi duodenal. În tumori pancreatice secretoare de gastrină (gastrinoame), se produc

ulceraţii multiple datorită hiperstimulării secreţiei de HCl de către gastrină (sindromul

Zollinger-Ellison).

Valori scăzute: Hipoaciditatea apare în unele tipuri de gastrită. Aclorhidria, lipsa

totală de HCl se datorează atrofiei mucoasei gastrice sau proliferării ei tumorale (celulele

canceroase îşi pierd funcţiile fiziologice). O stare şi mai gravă este aclorhidria histamino-

refractară, când nici la stimulare cu histamină nu se secretă HCl. În afară de HCl, celulele

parietale ale mucoasei gastrice mai secretă şi o glicoproteină numită factor extrinsec care

leagă vitamina B12 şi o transportă la celulele intestinale pentru a se absorbi. În cazul

atrofiei mucoasei sau proliferării ei canceroase, nu se secretă acest factor intrinsec şi

apare anemia pernicioasă (prin deficitul de absorbţie a vitaminei B12).

Analiza lichidului cefalorahidian

Componentele lichidului cefalorahidian (LCR) provin din plasmă prin difuzie

liberă şi printr-un proces de secreţie. Aceasta se observă comparând compoziţia chimică a

lichidului cefalorahidian cu aceea a plasmei:

Componente LCR (mg%) Plasmă (mg%)sodiu 325 325potasiu 10 20calciu 5 10magneziu 3 3Cl- 449 360HCO3

- 40 60HPO4

2- 2 1SO4

2- 0,5 1proteine 30 7000uree 24 30acid uric 0,5-2,6 4glucide reducătoare 72 90bilirubină 0,2 0,8acizi organici urme urme

Recoltarea lichidului cefalorahidian se face prin puncţie lombară, suboccipitală

sau ventriculară, în eprubete perfect curate şi sterilizate. După recoltare, în primul rând se

efectuează examenul microbiologic şi citologic, iar restul probei se foloseşte pentru

examenele fizice şi chimice.

172

Examenul fizic

Culoarea: LCR normal este incolor şi limpede. În unele afecţiuni este colorat în

galben, roz sau verzui. Această culoare se datorează prezenţei bilirubinei sau biliverdinei

şi este indiciul unei hemoragii la nivelul sistemului nervos central. LCR poate fi colorat în

roşu datorită sângelui care poate proveni fie în mod accidental datorită unei puncţii greşit

efectuate, fie datorită unei afecţiuni.

Transparenţa: În mod normal, LCR este transparent. În unele afecţiuni poate fi

opalescent datorită prezenţei în cantitate mare a leucocitelor, albuminei sau

microorganismelor. LCR este tulbure în meningitele purulente. Un aspect particular îl

prezintă în cazul meningitei tuberculoase când probele vor forma o peliculă de fibrină la

suprafaţă.

Densitatea: Densitatea normală a LCR este foarte apropiată de aceea a apei:

1,006-1,008 g/cm3. Densitatea creşte în unele afecţiuni patologice. Ea se determină cu

areometre speciale de dimensiuni mici.

Examenul chimic al lichidului cefalorahidian

Examenul chimic se face numai pe un LCR centrifugat. Cele mai frecvente

determinări care se efectuează pe lichidul cefalorahidian şi care prezintă interes pentru

diagnostic sunt: determinarea proteinelor, a glucozei, a clorurilor, al ureei, a

permeabilităţii faţă de nitraţi (această reacţie este utilizată pentru decelarea unei

permeabilităţi menigiene alterate). Dintre aceste metode vom descrie doar o metodă de

determinare orientativă a hipo- şi hiperglicorahiei.

Cercetarea hipo- şi hiperglicorahiei:

Principiu:

Alegând în mod convenabil diluţiile LCR şi ale reactivului Fehling se poate obţine

o reducere uşoară sau nulă a reactivului. La aceste diluţii LCR cu concentraţii scăzute,

normale şi crescute de glucoză se comportă diferit.

Modul de lucru:

În două eprubete (I pentru cercetarea hipoglicorahiei şi II pentru cercetarea

hiperglicorahiei) se măsoară:

173

I IIL.C.R. ml 2,0 0,6H2O dist. ml - 2,0Reactiv Fehling ml 0,2 1,0

Fierbere 5 minute în baie de apă

Interpretarea: - I şi II negativ (albastru) - hipoglicorahie

- I negativ (albastru) şi II pozitiv (roşu) - normoglicorahie

- I şi II pozitiv (roşu) - hiperglicorahie

Dozarea glucozei din LCR se poate efectua prin metoda enzimatică cu glucozo-oxidază.

Valorile fiziologice ale glicorahiei: 55-70 mg/100 ml, sunt valoari cuprinse între

jumătate şi 2/3 din glicemie. Acest raport, în cazuri normale, rămâne constant, iar

variaţiile glicorahiei sunt aceleaşi cu ale glicemiei.

Valori patologice: Valori crescute numai pentru glicorahie se întâlnesc în tumori,

encefalite, abcese cerebrale. Glicorahia scade mult în meningita tuberculoasă.

Analiza scaunului

Identificarea sângelui din scaun (Proba Gregersen)

Reactivi: - acid acetic glacial;

- eter etilic;

- H2O2 10%.

- soluţie de benzidină 2% în acid acetic glacial.

Mod de lucru:

Se zdrobeşte o bucată din scaunul de analizat cu puţină apă, se adaugă acid acetic

glacial (raport 2:1) şi se agită cu cantitate egală de eter într-o pâlnie de agitare. După

scurgerea fazei apoase (inferioare) se lucrează mai departe cu faza eterică (superioară): se

adaugă câteva picături de soluţie de H2O2 la 2 ml soluţie de benzidină şi în această soluţie

punem o cantitate din extractul obţinut. În caz pozitiv proba se va colora în verde.

Identificarea se poate efectua şi fără etapa de extracţie eterică. Se toarnă un

amestec de soluţie de benzidină în acid acetic glacial cu apă oxigenată peste scaunul de

analizat. Lichidul care se scurge de pe probă este verde în caz de prezenţă a sângelui.

174

Această analiză se efectuează după trei zile de regim strict: pacientul trebuie să

evite carnea şi alimentele bogate în clorofilă, deoarece această probă este pozitivă şi în

cazul prezenţei mioglobinei şi clorofilei.

Există şi un test specific care identifică doar hemoglobina umană din scaun prin

latexaglutinare. Acest test imunologic nu necesită dietă specială.

Patologie: Sângele apare în scaun cel mai frecvent datorită lezării hemoroizilor în

timpul defecării. Tumorile colonului (benigne şi maligne) pot determina o sângerare de

obicei ocultă (invizibilă cu ochiul liber), care se poate decela cu această probă. Uneori

chiar sângerările gastrice se pot exterioriza pe cale fecală prin sânge proaspăt (când

tranzitul intestinal este accelerat sângele nu are timp să fie digerat), dar cel mai frecvent

în caz de hemoragie digestivă superioară apare melena (scaun negru, ca păcura).

Semnele de malabsorbţie/maldigestie în scaun

Evidenţierea glucidelor din scaun

- În scaun pot apare glucide reducătoare (glucoză, fructoză, lactoză) detectabile cu

reacţiile Benedict, Barfoed, etc. (v. cap. Analiza glucidelor). Aceste glucide sunt

eliminate prin scaune diareice în caz de malabsorbţie glucidică.

- Se pot detecta şi polizaharidele nedigerate din materiile fecale.

Mod de lucru:

Se adaugă câteva picături de soluţie Lugol (cu conţinut de iod) la scaunul proaspăt

eliminat. Amidonul nedigerat dă o coloraţie albastră cu iodul, iar în caz de digestie

incompletă compuşii intermediari de degradare (dextrinele) dau o coloraţie roşie.

Patologie: În cazul secreţiei deficitare de amilază pancreatică apar amidonul şi

dextrinele în materiile fecale.

Evidenţierea lipidelor din scaun

În condiţii normale materiile fecale conţin o cantitate foarte mică de lipide. Dacă

creşte această cantitate (steatoree), scaunul capătă un luciu caracteristic şi, prin

amestecarea fecalelor cu apă, apar pete de grăsime pe suprafaţa apei.

Mod de lucru:

Scaunul proaspăt eliminat se colorează cu Sudan III (roşu Sudan). Cu acest

colorant se pot evidenţia lipidele nedigerate, deoarece trigliceridele şi esterii

colesterolului se colorează în roşu.

175

Patologie:

În scaun apar lipide nedigerate în secreţia insuficientă de lipază pancreatică şi în

deficitul de acizi biliari datorat obstrucţiei cailor biliare sau incapacităţii hepatice de

secreţie a acestora, stări care au consecinţă malabsorbţia lipidică.

Evidenţierea proteinelor din scaun

Mod de lucru:

Se examinează la microscop preparatul nativ (fără coloraţie) al probei de scaun.

Se pot recunoaşte uşor mai ales fibrele musculare nedigerate, care arată deficitul digestiei

proteice.

Patologie: Maldigestia proteică este datorată secreţiei insuficiente de proteaze

pancreatice.

Metode fizice de analiză folosite în laborator

Fotometria

Principiu:

Fotometria se bazează pe excitarea luminoasă a electronilor moleculelor

substanţei.

După lungimea de undă, exprimată în nanometri (nm) sau în Ångströmi (Å),

spectrul undelor electromagnetice folosite în fotometrie se împarte în 3 regiuni:

- ultraviolet 200 - 450 nm,

- vizibil 400 - 800 nm,

- infraroşu 800 - 20000 nm,

Metoda spectrofotometrică de analiză se bazează pe determinarea extincţiei unui

strat de soluţie colorată cu grosimea de 1 cm, la diferite lungimi de undă

Pentru obţinerea radiaţiilor de diferite lungimi de undă spectrofotometrele conţin

trei tipuri de monocromaoare: prisme, reţele de difracţie sau filtre.

Lungimile de undă corespunzătoare diferitelor culori sunt redate în tabelul de mai

jos:

176

Culoarea Domeniul lungimilor de undăViolet 400 - 450 nmAlbastru 450 - 500 nmVerde 500 - 570 nmGalben 570 - 590 nmPortocaliu 590 - 620 nmRoşu 620 - 760 nm

Efectuarea analizelor prin metoda colorimetrică prezintă avantajul că necesită

cantităţi mici de substanţă şi un timp relativ redus în comparaţie cu analizele chimice.

Legea Bouguer-Lambert-Beer, lege fundamentală a colorimetriei

În condiţii similare, straturile de substanţă colorată de aceeaşi grosime absorb

aceeaşi cantitate de lumină incidentă, absorbţie ce se exprimă matematic prin ecuaţia:

lKeII ⋅−⋅= 0

în care I este intensitatea fluxului luminos după trecerea prin soluţie; I0 - intensitatea

fluxului luminos incident; e - baza logaritmilor naturali; l - grosimea stratului; K -

coeficient de absorbţie optică.

Dacă se ia ca bază zecimală de logaritmare, rezultă ecuaţia:

I = I0 • 10 –k•l

Din această ecuaţie, în care coeficientul k reprezintă coeficientul de extincţie, rezultă că:

a. Raportul între intensitatea luminii care a trecut prin stratul de soluţie şi

intensitatea luminii incidente nu depinde de intensitatea absolută a luminii incidente.

b. Când grosimea stratului de soluţie se măreşte în progresie aritmetică, intensitatea

luminii care trece prin aceasta descreşte în progresie geometrică.

c. Coeficientul de extincţie k, depinde numai de natura substanţei dizolvate şi

lungimea de undă a luminii incidente şi este valabilă numai pentru lumină

monocromatică. Această lege a fost stabilită de către P.Bouguer şi I.Lambert.

Beer a stabilit că, coeficientul de extincţie k este liniar proporţional cu concentraţia

substanţei absorbante, adică :

k = ε • C

în care C este concentraţia substanţei colorate iar ε este un coeficient care nu depinde de

concentraţie.

Legea lui Beer stabileşte dependenţa absorbţiei luminii de către stratul cu grosime

constantă de concentraţia substanţei colorante.

Din ultimele două ecuaţii rezultă ecuaţia legii fundamentale a colorimetriei - legea

Bouguer-Lambert-Beer:

177

I = I0 • 10 –ε•C•l

Raportul dintre intensitatea luminii, I, care a trecut printr-o soluţie şi intensitatea

luminii incidente, I0, poartă denumirea de transparenţă sau transmisie şi se notează cu

litera T:

T = I/I0 = 10 –ε•C•l

Valoarea T pentru un strat de 1 cm grosime se numeşte coeficient de transmisie.

Logaritmul mărimii inverse transmisiei se numeşte extincţie, E, sau densitate

optică, D.O.:

E = D.O. = lg 1/T = lg I0/I = ε • C • l

Din această ecuaţie rezultă că extincţia E este liniar proporţională cu concentraţia

substanţei colorate din soluţie.

Spectrofotometru Spekol

Spectrofotometrul Spekol constă dintr-un monocromator, care este o reţea de

difracţie, un fotoelement şi echipamentul de măsurarea fotocurentului (amplificator +

galvanometru).

Lumina emisă de sursa (1) după colimare cade pe reţeaua de difracţie optică

reflectantă (2) şi formează spectrul de difracţie care, în planul fantei de ieşire (3), se poate

plimba cu ajutorul dispozitivului micrometric (4), gradat în nm ce corespund lungimii de

undă a luminii emergente.

Aceasta trece prin cuva (5, 5') ce conţine lichidul de măsurat şi cade pe

fotoelementul (6). Fotocurentul obţinut este amplificat de amplificatorul (7) şi este indicat

de instrumentul (8). Calea luminii monocromatice se poate deschide sau închide cu

ajutorul obturatorului (9). Cuvele cu soluţia de compensare şi cea de măsurat se pot

introduce alternativ în calea luminii cu ajutorul port-cuvei glisante (10). Punctul 0 şi

sensibilitatea amplificatorului se reglează cu butoanele 0 şi 100. Aparatul se alimentează

de la reţea prin transformatorul (11).

178

Schema de principiu al unui spectrofotometru

Spectrofotometru Spekol

Îndreptar pentru folosirea aparatului

1) Se verifică dacă maneta obturatorului (9) se găseşte în poziţia 0.

2) Aparatul se conectează la reţea cu ajutorul întrerupătorului (12). Se aşteaptă

aproximativ 10 min. până la prima citire.

3) Se alege lungimea de undă prevăzută în metodă prin rotirea tamburului

micrometrului (4).

4) Se aşează cuvele în glisorul (10).

5) Cuva cu proba martor se va muta în dreptul fantei.

6) Acul galvanometrului se aduce în poziţia 0 pe scara inferioară cu ajutorul

butonului 0. Pentru a evita eroarea de paralaxă, capul se aduce în poziţia în care

acul şi imaginea lui în oglinda instrumentului se suprapun.

179

7) Obturatorul se va aduce în poziţia I (deschis). Indicatorul galvanometrului se

va mişca spre dreapta.

8) Cu ajutorul butonului 100 acul galvanometrului se potriveşte la diviziunea 100

a scării inferioare.

9) Se închide fanta (obturatorul în poziţia 0). Acul indicator trebuie să revină la

poziţia 0. În caz contrar se repetă operaţiile de la punctul 6-9.

10) Se va muta proba în faţa fantei şi se deschide obturatorul.

11) Se citeşte extincţia (E) pe scara superioară. Se apreciază şi fracţiunile de

diviziune.

12) Se închide obturatorul.

Recomandări:

• Fotoelementul îşi pierde din sensibilitate dacă este expus luminii timp îndelungat. De

aceea timpul de iluminare a fotoelementului va fi redus la minimul posibil.

• Pentru a evita spargerea cuvelor se va lucra cu ele exclusiv deasupra mesei, la mică

înălţime.

• Suprafeţele optice ale cuvelor trebuie să fie perfect curate, de aceea se va evita

atingerea pereţilor transparenţi.

• Umplerea cuvei se va face ţinând cuva înclinată la aproximativ 45º şi turnând lichidul

până la circa 2/3 din înălţime.

• Cuva se va goli prin răsturnare bruscă în poziţia cu gura în jos şi păstrând această

poziţie se va aşeza pe o hârtie de filtru curată.

• După folosirea cuvelor se spală cu apă distilată şi se aşează cu gura în jos pe o hârtie

curată.

Spectrofotometrul de absorbţie atomică

Principiu:

O parte din atomii speciei ce urmează a fi analizaţi sunt excitaţi în fllacără la un

nivel energetic superior emiţând apoi prin revenirea la nivelul iniţial o radiaţie

corespunzătoare liniei de rezonanţă. Dar majoritatea atomilor rămân în starea

fundamentală. În spectroscopia de absorbţie atomică se trece prin flacără o radiaţie având

frecvenţa liniei de rezonanţă. Atomii rămaşi în starea fundamentală absorb această

180

radiaţie (pe care ar emite-o dacă ar fi excitaţi) şi absorbţia este proporţională cu

concentraţia atomilor în flacără şi grosimea stratului străbătut de radiaţia monocromatică.

Spectrofotometrul de absorbţie atomică

Spectrofotometrul de absorbţie atomică se compune din:

1. Sursa de radiaţie care emite linia de rezonanţă a elementului de determinat. Emisia

lămpii este modulată pentru ca detectorul să înregistreze doar lumina emisă de lampă nu

şi cea emisă din flacără (de către atomii excitaţi). Se folosesc în general lămpi de,

descărcare cu catod tubular. Catodul trebuie să fie făcut din elementul pe care vrem să-l

determinăm. Sunt şi lămpi care au catozi făcuţi din aliaje astfel că pot fi folosite pentru

determinarea tuturor elementelor din care este făcut aliajul.

2. Atomizorul are rolul de a trece elementul de analizat sub formă de atomi. Se folosesc

atomizoare de flacără sau cu cuptor de grafit.

a) Atomizoarele de flacără sunt alimentate cu amestecuri de gaze cum ar fi:

aer-acetilenă; aer-hidrogen; aer-propan; N2O-acetilenă etc. Proba de analizat este

introdusă în atomizor prin aspirare şi pulverizare.

b) Atomizorul cu cuptor de grafit este încălzit cu curent electric după un program

reglabil. Pentru a feri cuptorul (tubul de grafit), de ardere se folosesc gaze de protecţie. În

general, ca gaz de protecţie se foloseşte argonul sau azotul. La aparatele dotate cu

atomizor cu cuptor de grafit se pot analiza probe lichide sau solide. Probele lichide se

introduc cu ajutorul unor seringi iar probele solide cu ajutorul unor pensete.

3. Monocromatorul izolează linia de rezonanţă şi o focalizează asupra detectorului.

4. Fotomultiplicatorul detectează şi amplifică intensitatea luminii care cade asupra sa.

Practic, aparatul este ajustat la extincţia zero când o soluţie martor este vaporizată

în probă şi lumina lămpii ajunge la fotomultiplicator. Când se introduc soluţii conţinând

specii absorbante o parte din lumină este absorbită şi rezultă o diminuare a intensităţii

luminii ce ajunge la fotomultiplicator. Se determină extincţiile obţinute cu soluţii standard

ale elementului de analizat cu care se construieşte o curbă de etalonare a aparatului. Se

introduc apoi probele de analizat prelucrate în mod corespunzător iar din compararea

extincţiilor probelor cu curba de etalonare se calculează concentraţia elementului de

analizat.

181

Flamfotometria

Fotometrul cu flacără (flamfotometrul)

Principiu:

Soluţia de analizat este pulverizată automat într-un dispozitiv, numit pulverizator

şi se introduce sub formă de aerosoli in flacăra unui arzător special (Brenner). Soluţia, sub

formă de aerosoli, ajunsă în flacără suferă diferite transformări: apa în care este dizolvată

sarea se evaporă, componentele dizolvate sunt excitate de temperatura ridicată a flăcării,

reîntoarcerea electronilor din starea excitată pe un nivel energetic inferior eliberează

energia absorbită sub formă de lumină cu lungime de undă caracteristică elementelor

chimice ai cărui atomi sunt excitaţi.

Prin excitarea în flacără a acestui amestec complex iau naştere diferite spectre de

emisie. Radiaţia emisă este focalizată pe o celulă fotoelectrică, după ce au trecut prin

filtre optice de selecţie. Ia naştere astfel un fotocurent care se măsoară cu ajutorul unui

galvanometru. În cazul determinării unui anumit element (sodiu, potasiu, calciu etc.),

intensitatea fotocurentului este proporţională cu concentraţia elementului respectiv din

soluţie.

Pulverizatorul pulverizează automat în picături foarte fine soluţia de analizat. El

este confecţionat din sticlă, cuarţ sau material plastic. Pulverizarea se realizează în felul

următor: gazul purtător comprimat, care iese cu viteză mare în apropierea tubului cu

soluţie, antrenează soluţia de analizat şi o pulverizează în particule foarte fine. Soluţia

pulverizată ajunge in flacăra arzătorului, unde se vaporizează iar ionii absorbiţi se excită.

Pentru ca analiza să se desfăşoare în condiţii optime este necesară menţinerea unei

presiuni constante atât pentru aer cât şi pentru gazul de ardere. Reglarea presiunii se

realizează cu ajutorul unor reductoare de presiune şi se măsoară cu manometrul. Gazul

purtător poate fi aerul sau oxigenul.

182

În figura de mai sus apar principalele componente ale unui flamfotometru.

Arzătorul este dispozitivul cu flacără în care substanţa de analizat se vaporizează

şi se excită, emanând radialii luminoase. Pentru întreţinerea flăcării, care se aprinde

automat, se utilizează diferite amestecuri de gaze în funcţie de temperatura necesară

pentru excitarea substanţei de analizat.

Amestec de gaze Temperatura flăcării măsurată în ºCGaz de iluminat – aer 1700 –1840Propan – aer 1925Hidrogen – aer 2000 – 2045Acetilenă – aer 2125 – 2397Hidrogen – oxigen 2550 – 2660Propan – oxigen 2850 (calculată)Acetilenă – oxigen 3100 – 3137

În tabelul de mai sus sunt redate câteva amestecuri de gaze folosite în

flamfotometrie precum şi temperaura flăcării acestora. În funcţie de potenţialul de

ionizare al elementului care urmează a fi determinat se alege şi temperatura dorită şi deci

gazul combustibil capabil să o realizeze. Pentru a fi activaţi, sodiul şi potasiul necesită o

temperatură relativ joasă cum ar fi cea a amestecului: propan-aer (1925°C), iar calciul şi

magneziul o temperatură mult mai ridicată (flacără de acetilenă-oxigen).

Determinarea cantitativă a elementelor din soluţia de analizat se face după mai

multe metode: metoda curbei de calibrare, metoda soluţiilor limitative, metoda

adaosurilor, etc.

183

Soluţiile de analizat şi standardele respective (soluţiile etalon) trebuie să posede,

pe cât posibil, aceleaşi proprietăţi fizice, în aşa fel încât condiţiile de pulverizare sa fie

identice.

Potenţiometria cu electrozi cu electroni ioni - selectivi

Măsurarea pH-ului cu electrodul de sticlă

Metoda necesită un pH-metru şi doi electrozi: unul selectiv pentru ionii de

hidroniu - electrodul de sticlă şi unul de referinţă. Acesta din urmă este un electrod

metalic de speţa a II-a în contact cu o soluţie saturată a anionului sării metalice,

Ag/AgCl/KClsat. sau, în cazul celui de calomel, Hg/Hg2Cl2/KClsat. Electrodul de sticlă este

confecţionat din sticlă specială care se comportă ca o membrană permeabilă pentru ionii

de hidroniu. Acest electrod în formă de balonaş sferic este umplut cu o soluţie tampon cu

pH dat care nu-şi schimbă compoziţia (pH-ul) în timpul măsurătorilor. El se cufundă în

soluţia probă cu pH necunoscut. Diferenţa de potenţial dintre aceste soluţii este dată de

relaţia lui Nernst. Rescrisă în termeni de pH această relaţie devine:

RT

∆E = ——— ( pHelectrod – pHprobă )

2,303 F

Această diferenţă de potenţial este, cum se vede, într-o relaţie lineară cu pH-ul soluţiei

probei, deoarece pHelectrod = constant. Ea se poate măsura cu pH-metrul. Acesta este un

milivoltmetru cu impedanţă de intrare mare, datorită rezistenţei electrice mari a

electrodului de sticlă, cu scală de pH, numit pH-metru. Pentru măsurarea pH-ului unei

soluţii necunoscute este necesară în prealabil calibrarea pH-metrului cu ajutorul a două

soluţii tampon cu pH cunoscut.

Avantajele pe care le prezintă metoda potenţiometrică faţă de cea colorimetrică

sunt:

- exactitate mare, ± 0,01 în cazul pH-metrelor obişnuite ca de exemplu

cel de tip MV-84, sau chiar ± 0,001 în cazul pH-metrelor performante

ca de exemplu cel de tip Radiometer-Copenhagen.

- pot fi analizate soluţii colorate, vâscoase, cu proprietăţi redox

- timp de măsurare foarte scurt (1-2 minute)

184

Schema de principiu al unui pH – metru

Valori patologice de laborator care ameninţă viaţa

Na seric sub 120 mmol/l peste 160 mmol/lK seric sub 3 mmol/l peste 8 mmol/lCa seric sub 1 mmol/l peste 4 mmol/lCl seric sub 80 mmol/l peste 120 mmol/lHCO3

- seric sub 10 mmol/l peste 40 mmol/lpH sub 7,00 peste 7,7PCO2 sub 20 mmHg peste 80 mmHgPO2 sub 40 mmHg peste 400 mmHgGlicemie sub 2,5 mmol/l peste 56 mmol/lHematocrit sub 20% (pierdere acută)Indice de protrombină sub 20%

Limitele valorilor normale

St – sânge total U - urină

185

Pl – plasmă SG – suc gastricSe – ser FBG - fibrinogenL – LCR GC – greutate corporală

Acid uric Se Bărbaţi 4,3 – 8 mg/100 ml (256 – 476 µmol/ l)Femei 2,3 – 6 mg/100 ml (137 – 357 µmol/ l)

2 - 8 mg/100 ml (119 –476 µmol/ l)U 400 – 1000 mg/ 24 ore (2,4 – 6 mmol/24 h) L 0,5 – 2,6 mg/100 m (29 – 155 µmol/ l )

Aminoacizi Se 35 – 55 mg N /l (3,5 – 5,5 mg N/100 ml)U 0,5 g/24 ore

Amoniac Se 50 – 80 µg/100 ml (29 – 47 µmol/l)U 0,3 – 1,2 g/24 ore (17,6 – 71 mmol/24 ore)

Bilirubina Se totală cca. 1mg/100ml (17µmol/l);

directă cca. 0,25 mg/100ml (4,3µmol/l)Calciu (total) Se Copii 7 – 14 mg/100ml (1,8 - 3,5 mmol/l; 3,5–7 mEq/l)

Adulţi 9– 11 mg/100ml (2,2 - 2,8 mmol/l; 4,5-5,5 mEq/l)U Sugari 0,01 - 0,14 g/24 ore (0,25 - 3,5 mmol/24 ore)

Copii 0,10 - 0,14 g/24 ore (2,5 - 3,5 mmol/24 ore)Adulţi 0,10 - 0,40 g/24 ore (2,5 - 10,0 mmol/24 ore)

L 4 – 6 mg/100ml (1 - 1,5 mmol/l)Clor St 280 – 320 mg/100ml (79 – 90 mmol/l)

Se 340 – 390 mg/100ml (96 – 110mmol/l)L 410 – 460 mg/100ml (115 – 130mmol/l)U 600 – 900 mg/100ml (169 – 254mmol/l)SG 300 – 530 mg/100ml (85 – 149mmol/l)

Colesterol Se total 150 – 250 mg/100ml (3,9 - 6,5 mmol/l)esterificat 60 – 80% din colesterolul total saucolesterol esterificat / colesterol total = 0,6 - 0,8

Creatinină Se Bărbaţi 0,8 - 1,8 mg/100ml (71 –159 µmol/l)Femei 0,6 - 0,9 mg/100ml (53 –80 µmol/l)

0,6 – 1,8 mg/100 ml (53 - 159 µmol/l)U Bărbaţi 26 mg/kg GC (230 µmol/kg GC)

Femei 22 mg/kg GC (190 µmol/kg GC)Fer Se Bărbaţi 90 – 160 µg/ 100ml (16,1 – 28,6 µmol/l)

Femei 80 – 130 µg/ 100ml (14,3 – 23,3 µmol/l)Fosfatază alcalină Se Sugari 3 – 10 UB/100 ml (25 – 83 UI/l)

Copii 2 – 8 UB/100 ml (16,6 – 66,4 UI/l)Adulţi 2 – 4 UB/100 ml (16,6 – 33,2 UI/l)

Fosfatază acidă

totală

prostatică

Se

4,5 – 13,5 UI/l

0,05 – 3,6 UI/l Glucoză St Iodo-

metric

80 –120 mg/100ml (4,4- 6,6 mmol/l)

186

o-tolu-

idină

70 –100 mg/100ml (3,9- 5,5 mmol/l)

Se

Pl

Glocoz-

oxidază

70 –104 mg/100ml (3,9 - 5,8 mmol/l)

L 50 - 70 mg/100ml (2,8 – 3,9 mmol/l)U <30 mg/100ml (<1,7 mmol/l)

GOT Se adulţi 2 - 20 UI/lcopii sub

3 luni

→ 40 UI/l

GPT Se Adulţi 2 – 16,5 UI/l Copii sun

5 ani

10,2 – 13 UI/ l

Hemoglobină St Bărbaţi 15 – 20 g/100ml (9,3 - 12,4 (Hb/4) mmol/l)Femei 14,0 – 17,0 g/100ml (8,7 - 10,5 (Hb/4) mmol/l

Potasiu Se 13– 21mg/100ml (3,3 -5,4 mmol/l)L 8 – 11 mg/100ml (2,0 -2,8 mmol/l)U 1,9 – 3,9 mg/100ml (0,5 –1,0 mmol/l)

Lipide Se totale 400 – 700 mg/100ml fosfolipide 150 – 250 mg/100ml trigliceride 80 – 200 mg/100ml

Magneziu St 3,7- 4,7 mg/100ml(1,5-1,9 mmol/l; 3,0-3,9 mEq/l)Se Nou

născuţi 1,6-2,3mg/100ml(0,66-0,95mmol/l; 1,3-1,9mEq/l)Adulţi 1,9-2,9 mg/100ml (0,8-1,2 mmol/l; 1,6-2,4 mEq/l)

L 2,5 mg/100ml (1,0 mmol/l; 2,0 mEq/l)Azot neproteic Se 20 – 40 mg/100ml (14,3 - 28,6 mmol/l)

L 15 – 18 mg/100ml (11 - 13 mmol/l)Sodiu Se 315-350mg/100ml(137-152mmol/l)

L 300-340mg/100ml(130-148mmol/l)U 4 – 6 g/24 ore (174 – 261 mmol/24 ore)

Fosfor anorganic St 30 –50 mg/100ml (9,7 – 16,1 mmol/l)Se Copii 4 –6 mg/100ml (1,3 – 1,9 mmol/l)

Adulţi 2,5 –4,5 mg/100ml (0,8 – 1,15 mmol/l)L 1 –1,8 mg/100ml (0,3 – 0,6 mmol/l)

Proteine totale Se 6,5 - 8,2 g/100ml Pl Copii 5 – 7,5 g/100ml

Adulţi 6,5 - 8,5 g/100ml L 10 – 30 mg/100ml

Fracţiuni proteice Se Alb. 3,50-4,20 g/100ml α1 0,25-0,40 g/100ml α2 0,50-0,65 g/100ml β1+ β 2 0,80-1,02 g/100ml γ 1,10-1,40 g/100ml

FBG 0,2 – 0,4 100 g/100 ml

187

Uree Se 21 – 54 mg/100ml (3,5 – 9 mmol/l)U 20 – 30 g/24 ore (0,33 - 0,50 mol/24 ore)L 20 – 60 mg/l (0,33 - 1,00 mmol/l)

Sistemul internaţional de unităţi

Cantitatea fizică Unitatea de măsură Simbol

lungime metru m

masă kilogram kg

timp secundă s

intensitatea c. electric amper A

intensitate luminoasă candelă cd

cantitate de subst. mol mol

temp. termodinamică Kelvin K

188