CROMATOGRAFIA

Cromatografia este o metodă de realizare a

separărilor analitice.

Toate metodele cromatografice implică:

� fază staŃionară;

� o fază mobilă.

Componentele unui amestec sunt trecute peste faza

staŃionară cu ajutorul fluxului fazei mobile.

Separările se bazează pe diferenŃele dintre vitezele

de migrare ale componentelor probei.

Componentele ce urmează a fi separate trebuie să

fie solubile în faza mobilă, astfel incat în timpul separării

ele sunt distribuite între cele două faze.

Cromatografia pe coloană

• Faza staŃionară este depusă într-un tub îngust

de sticlă sau metal.

• Faza mobilă care poate fi lichid sau gaz, este

forŃată să treacă prin solid cu ajutorul presiunii

sau este lăsată să treacă (să se infiltreze)

datorită forŃei gravitaŃionale.

Cromatografia plană

• Faza staŃionară este depusă pe o placă de

sticlă sau plastic.

• Faza mobilă se deplasează prin solid, fie prin

acŃiune capilară, fie sub acŃiunea gravitaŃiei.

Clasificarea separărilor cromatografice

Denumire Tipul fazei

mobile

Tipul fazei staŃio nare

Metoda de fixare a fazei staŃionare

Gaz-lichid Gaz Lichid Adsorbită într-un solid poros fixat într-un tub, sau adsorbită pe suprafaŃa internă a unui tub

capilar. Gaz-solid Gaz Solid Fixată într-o coloană tubulară Lichidă sau de

repartiŃie

Lichid Lichid Adsorbită într-un solid poros fixat într-o coloană tubulară

AdsorbŃie Lichid Solid Fixată într-o coloană tubulară Hârtie Lichid Lichid Fixată în porii unei hârtii

groase Start

subŃire Lichid Lichid

sau solid

Solid fin divizat depus pe o placă de sticlă; lichidul poate fi

adsorbit pe particule Gel Lichid Lichid Fixat în interstiŃiile unui solid

polimeric Schimb

ionic Lichid Solid Răşină schimbătoare de ioni

fin divizată fixată într-o coloană tubulară

Toate separările cromatografice se bazează pe

diferenŃele de repartiŃie ale soluŃilor între faza mobilă şi

faza staŃionară.

Echilibrul implicat poate fi descris cantitativ cu

ajutorul coeficientului de repartiŃie K, care pentru

cromatografie este definit astfel:

K

C

CS

M

=

Unde:

CS este concentraŃia analitică a solutului în faza

staŃionară;

CM este concentraŃia sa în faza mobilă.

La concentraŃiile scăzute folosite în cromatografie,

K va fi aproximativ constant astfel încât va exista o

relaŃie liniară între CS şi CM.

Cromatografia realizată în aceste condiŃii se

numeşte cromatografie liniara.

În cromatografia de eluŃie, se introduce o singură

porŃiune a probei dizolvate în faza mobilă pe la capătul

coloanei în care componentele probei se vor distribui

între cele două faze.

Intoducerea unei faze mobile adiŃonale (eluentul)

forŃează solventul conŃinând o parte a probei în josul

coloanei, unde apare o repartiŃie suplimentară între faza

mobilă şi zonele "proaspete" ale fazei staŃionare.

Prin adăugarea unor noi porŃiuni de solvent se va

realiza trecerea moleculelor solutului în josul coloanei

printr-o serie continuă de tranziŃii între faza mobilă şi

faza staŃionară. Deoarece deplasarea solutului poate

avea loc doar în faza mobilă, viteza medie de migrare a

solutului depinde de fracŃia de timp pe care o petrece în

acea fază.

Viteza de deplasare a unui component, reprezintă o

fracŃiune din viteza de migrare a solventului.

Viteza frontală de migrare, caracterizată de factorul

Rf, se defineşte prin raportul:

Rviteza frontului adsorbit

viteza fazei mobilef = < 1

Reprezentare

schematică a eluŃiei

separării

cromatografice a

componentelor A şi

B ale unui amestec.

Separarea a doi componenŃi A şi B ai unei probe,

este cu atât mai bună cu cât raportul valorilor RfA/Rf

B

este mai diferit de unitate.

În cazul în care ambele valori RfA şi Rf

B sunt

apropiate de unitate, nu se pot realiza separări eficace,

deoarece compuşii vor migra într-un interval de timp

doar cu puŃin mai lung decât cel necesar deplasării fazei

mobile de-a lungul coloanei.

Procesul descris anterior în decursul căruia solutul

este "spălat" prin coloană prin adăugarea de solvent

proaspăt se numeşte eluŃie.

T i m p s a u V o l u m

S e m n a l

C o l o a n ă c uu m p l u t u r ă

A

B A

B

A

A

B

A + B

P r o b ă

S o l v e n t

D e t e c t o r

A B

Izotermele de repartiŃie sunt curbele ce redau

concentraŃia componentului cromatografic în faza

staŃionară (CSA) în funcŃie de concentraŃia aceluiaşi

component în faza mobilă (CMA). Ele sunt dependente de

temperatură.

Deoarece în cromatografia uzuală, afinitatea

componenŃilor faŃă de faza staŃionară este determinată

de adsorbŃie, aceste tipuri de curbe se numesc izoterme

de adsorbŃie.

Izoterme de repartiŃie

Deoarece procesul de adsorbŃie este exoterm,

creşterea temperaturii defavorizează fixarea

componentului, şi în consecinŃă izotermele vor avea

pante mai accentuate la temperaturi mai joase.

Fixarea componentului cromatografic este

reversibilă; prin urmare, la o valoare CMA =0 va

t1 < t2

CMA

CSA

t1

t2

a

CSA

CMA b

t1

t2

CMA

CSA

c

t2 t1

corespunde CSA =0, adică toate izotermele trec prin

origine.

O cromatogramă furnizează doar o singură

informaŃie calitativă despre fiecare specie din probă, şi

anume timpul său de retenŃie sau poziŃia sa în faza

staŃionară după o anumită perioadă de eluŃie.

Numărul datelor obŃinute pentru o specie chimică

prin cromatografie este mic în comparaŃie cu cele

furnizate dintr-o singură analiză de IR, RMN sau

spectroscopie de masă.

CROMATOGRAFIA PLANĂ

Există două tipuri de cromatografie plană:

cromatografia pe hârtie

cromatografia pe strat subŃire

În cromatografia pe hârtie, se foloseşte drept mediu

o foaie sau o bucată de hârtie de filtru groasă.

În cromatografia pe strat subŃire, separarea are loc

într-un strat de solid fin divizat care a fost fixat pe o

suprafaŃă suport plană.

Atât cromatografia pe hârtie cât şi cea în strat

subŃire oferă mijloace deosebit de simple şi ieftine

pentru separarea şi identificarea componentelor unor

mici probe complexe de substanŃe anorganice, organice

sau biochimice.

CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBłIRE

Prezintă unele avantaje faŃă de cromatografia pe

hârtie, deoarece se pot realiza separări mai nete şi mai

rapide, are o sensibilitate mai ridicată şi se poate adapta

şi la separarea unor amestecuri având concentraŃii mai

mari. Separările pe strat subtire sunt influenŃate de

procesele de adsorbŃie, repartiŃie, excludere (difuzie) şi

schimb ionic.

Stratul este o fază staŃionară subŃire depusă pe o

placă de sticlă, de plastic sau de metal.

Faza staŃionară

Solidele adsorbante (şi uneori absorbante) utilizate

pentru cromatografia pe strat subŃire sunt similare din

punct de vedere al compoziŃiei chimice şi a dimensiunii

particulelor cu cele folosite la realizarea diferitelor faze

staŃionare în cromatografia pe coloană.

Stratul subŃire este realizat dintr-un suport activ şi

un liant, ce conferă printre altele rezistenŃă stratului.

SubstanŃa cel mai des utilizată drept suport este

silicagelul. Acesta este frecvent folosit ca suport pentru

apă sau alŃi solvenŃi polari în separările lichid-lichid.

Un alt suport des utilizat este alumina.

Drept suporŃi, mai pot fi folosiŃi celuloza, diatomita

şi diverşi polimeri organici.

Două tipuri de dispozitive pentru cromatografia pe

strat subŃire:

a. flux ascendent; b. flux descendent;

S: poziŃia iniŃială

a probei (start); D: developator; C: suprafaŃa

cromatografică; B: împletitură de

bumbac.

C

S

S

B

Flux Flux D

a. b.

C

ALEGEREA SOLVENTILOR

CondiŃia generală impusă solvenŃilor cromatografici

este anhidritatea perfectă.

Aşezarea solvenŃilor uzuali în ordinea puterii de

eluare se numeşte serie eluotropică.

Seria eluotropică, după Trappe

1. eter de petrol 8. cloroform

2. hexan 9. eter etilic

3. ciclohexan 10. acetat de etil

4. tetraclorură de carbon

11. acetonă

5. toluen 12. alcool etilic

6. benzen 13. alcool metilic

7. clorură de metilen

14. apă

Valorile Rf depind de polaritatea fazei mobile,

crescând odată cu aceasta.

SolvenŃi utilizaŃi frecvent în cromatografia pe strat

subŃire

SolvenŃi Tipuri de amestecuri

hexan hidrocarburi,

compuşi carbonilici

hexan + eter etilic Alcooli

cloroform (85%) + metanol (14%)

+ amoniac (1%)

solvent universal

cloroform (70%) + metanol (25%)

+ amoniac (5%)

compuşi cu caracter

acid

cloroform (50%) + benzen (50%)

- saturat în NH3

compuşi cu caracter

bazic

Se depune o picătură de probă pe o placă

cromatografică, după care, peste spotul format se

pipetează puŃin eluent.

Test preliminar pentru alegerea solventului optim în cromatografia pe strat

subŃire

a. b. c.

Eluentul cel mai indicat va forma mai multe zone

inelare, separate şi suficient de apropiate de centru (a),

în timp ce un solvent ce conduce la o zonă punctiformă

nu are o putere de eluŃie suficientă (b), iar unul ce

formează un inel mare cu componenŃii plasaŃi spre

periferie arată o putere de eluare prea mare (c).

ANALIZA CANTITATIVA

Cantitatea unui component este caracterizată de

suprafaŃa şi intensitatea spoturilor.

O estimare semicantitativă a cantităŃii unui

component prezent, poate fi obŃinută prin compararea

ariei spotului cu cea a unui standard.

După vizualizarea spotului, se calculează imediat

valorile Rf, datorită posibilităŃii de apariŃie a fenomenului

de atenuare, mai ales în cazul relevării (vizualizării)

chimice. Zona este încercuită cu un creion (sau se

zgârie stratul subŃire), se măsoară distanŃele parcurse

de zone şi frontul de solvent, iar valoarea Rf se

calculează astfel:

R h hf s f=

hS - DistanŃa parcursă de solut.

hf - DistanŃa parcursă de solvent.

Evaluarea valorilor Rf poate fi utilizată şi în scopuri

calitative prin compararea cu valorile Rf ale unor

compuşi cunoscuŃi.

CROMATOGRAFIA PE HÂRTIE

Cromatografia pe hârtie este, în mod deosebit, o

cromatografie de repartiŃie. Această metodă poate fi

descrisă într-o manieră simplificată ca fiind trecerea

unei faze mobile lichide prin structura poroasă a hârtiei,

care conŃine faza staŃionară. Developarea se termină

hf

hS

Frontul desolvent

Linia de start

înainte ca faza mobilă să atingă marginea superioară a

hârtiei, astfel încât zonele sunt distribuite de-a

curmezişul hârtiei.

FaŃă de cromatografia pe strat subŃire, această

metodă are o serie de dezavantaje, cum ar fi: timpii de

developare mai lungi, delimitarea destul de slabă a

zonelor, exactitatea destul de slabă în analizele

cantitative, iar uneori dificultatea de reproducere a

condiŃiilor de developare.

FAZA STAłIONARĂ

În general, hârtia este compusă din fibre de

celuloză direcŃionate în mod dezordonat.

Se folosesc de obicei hârtii speciale de înaltă

puritate şi reproductibile din punct de vedere al

porozităŃii şi grosimii. Astfel de hârtii conŃin suficient de

multă apă, astfel încât să putem considera

cromatografia pe hârtie ca fiind de tip lichid-lichid.

Tipuri de faze staŃionare folosite în cromatografia

pe hârtie

Faza

staŃionară

SolvenŃi utilizaŃi

Apoasă apa; soluŃii tamponate + atmosferă saturată cu apă

Hidrofilă alcool metilic; formamida; glicolii; glicerolul

Hidrofobă dimetilformamida; hidrocarburi aromatice şi alifatice; kerosen; solvenŃi oxigenaŃi

FAZA MOBILĂ

Există o largă varietate de combinaŃii de faze

staŃionare şi mobile, nefiind neapărat necesar ca cele

două sisteme să fie nemiscibile. Faza mobilă utilizată

este formată de obicei din diferite combinaŃii de solvenŃi,

soluŃii de săruri şi soluŃii tampon

Alegerea optimă a condiŃiilor de eluŃie se face în

urma unor testări preliminare.

Tipuri de faze mobile utilizate în cromatografia pe

hârtie

Faza mobilă Tipuri de amestecuri separate

Apă - fenol SubstanŃe hidrofile

Izopropanol - amoniac - apă (9:1:2)

SubstanŃe hidrofile

n-Butanol - acid acetic - apă (4:1:5)

SubstanŃe hidrofile

Formamidă - benzen SubstanŃe intermediar hidrofile

Formamidă - benzen - ciclohexan

SubstanŃe intermediar hidrofile

Formamidă - cloroform SubstanŃe intermediar hidrofile

Formamidă - cloroform - benzen

SubstanŃe intermediar hidrofile

Dimetilformamidă – ciclohexan

SubstanŃe hidrofobe

Kerosen - izopropanol SubstanŃe hidrofobe

PROCEDEE CARACTERISTICE

CROMATOGRAFIEI PLANE

După obŃinerea hârtiei sau a stratului dorit,

procedeele experimentale pot fi împărŃite în cinci etape

de bază, şi anume:

• tratamentul pregătitor;

• aplicarea probei;

• developarea;

• vizualizarea;

• interpretarea datelor.

TRATAMENTUL PREGATITOR

Se realizează în funcŃie de tipul cromatografiei (de

repartiŃie sau de adsorbŃie) şi aplicarea finală.

AdsorbanŃii au poziŃii adsorbante cu activităŃi

diferite şi reŃin, mai puternic, apa. Pentru ca adsorbŃia să

fie folosită la capacitatea sa maximă, adsorbantul

trebuie să fie într-un anumit grad de uscare (să fie

activat).

AdsorbanŃii nu trebuie să fie supuşi la o temperatură

de uscare prea înaltă sau un timp de uscare prea

îndelungat, deoarece pot avea loc transformări chimice,

care vor conduce la un comportament adsorbant

modificat.

APLICAREA PROBEI

Înainte de aplicarea probei, pe hârtie sau pe placă se

trasează linia de start, care reprezintă locul unde va fi

aplicată proba, şi care trebuie să fie suficient de departe

de marginea hârtiei sau plăcii, astfel încât să nu fie

scufundată în sistemul de solvent utilizat pentru

developare.

Instrumentele cele mai utilizate la aplicarea probelor

sunt pipetele (micropipete), capilarele de precizie şi

microseringile.

DEVELOPAREA

În vederea realizării unei separări corespunzătoare,

este necesar ca procesul cromatografic să aibă loc într-

o cameră de developare saturată în fază mobilă.

De remarcat că asigurarea unei developări

corespunzătoare presupune o bună etanşare la aer a

camerelor de developare.

Developarea ascendentă presupune urcarea fazei

mobile din rezervor pe hârtie sau pe stratul subŃire, în

timp ce developarea descendentă are loc atunci când

faza mobilă coboară din rezervor. Datorită rezistenŃei

mecanice convenabile este preferată developarea

ascendentă în cazul cromatografiei pe strat subŃire, spre

deosebire de cromatografia pe hârtie când se preferă

developrarea descendentă ca urmare a unei rezistenŃe

mecanice slabe.

Camere de developare folosite în

cromatografia pe hârtie. a. Developare

ascendentă. b. Developare

descendentă. H - hârtie de filtru; P - probă;

S - solvent de

developare;

Flux - curgerea solventului.

H

H

S

Suport

Flux

Suport

a. b.

S Flux P

RELEVAREA

După terminarea developării, se procedează la

relevarea (vizualizarea) spoturilor.

Detectarea se poate face direct dacă compuşii sunt

coloraŃi sau fluorescenŃi.

O altă metodă des utilizată este aceea a pulverizării

unei soluŃii care să conducă la formarea unor compuşi

coloraŃi cu speciile prezente pe hârtie sau placă.

După vizualizarea spotului se calculează valoarea Rf.

Aceste valori Rf se pot utiliza în scopuri calitative, prin

compararea cu valorile Rf ale unor compuşi cunoscuŃi.

Cromatografia plană are numeroase aplicaŃii în

monitorizarea calităŃii mediului,biochimie, farmacie,

biologie.

CROMATOGRAFIA DE GAZE

Cromatografia de gaze este o variantă

cromatografică folosită pentru separarea amestecurilor

de gaze sau lichide volatile, bazată pe repartiŃia diferită a

componenŃilor amestecului de analizat între două faze: o

fază staŃionară solidă (cromatografia de adsorbŃie) sau

lichidă depusă pe un suport solid inert (cromatografia

de repartiŃie) şi o fază mobilă gazoasă (gazul purtător).

Ca urmare a repartiŃiei diferite a componenŃilor din

amestec între cele două faze şi a fenomenelor de

transfer de masă prin difuzie ce au loc în coloana

cromatografică, se realizează o deplasare cu viteze

diferite a acestora prin coloană, componenŃii părăsind

coloana eşalonat în timp.

Aceştia ajung apoi într-un sistem de detecŃie, dând

naştere unui semnal electric proporŃional cu

concentraŃia (masa) lor, care, ulterior este amplificat şi

înregistrat sub forma unei cromatograme.

Pentru un component "i" prezent în amestec,

constanta de distribuŃie între cele două faze este dată de

relaŃia:

Kconcentratie component in faza satationara

concentratie component in faza mobilai =

Cu cât componenŃii amestecului de analizat au

constante de distribuŃie mai diferite, cu atât separarea

cromatografică realizată este mai bună. Valorile acestor

constante de distribuŃie depind de natura componenŃilor

de separat, de ansamblul faza staŃionară - fază mobilă

ales şi de temperatura din coloană.

• rezervorul cu gaz purtator care joacă rol de faza mobilă (1);

• dispozitivul de măsurare şi reglare a presiunii

gazului purtător (2);

• dispozitiv de injectare a probei în coloană (3);

• coloana cromatografică (4);

• detector (5);

• termostat (6);

• amplificator (7);

• înregistrator (8).

D < <

2

1

3

4

5

6

7 8

Schema bloc a unei instalaŃii gaz cromatografice

Faza mobilă, care este de obicei un gaz inert (heliu

sau azot) trece continuu prin sistemul cromatografic

transportând proba aflată în stare de vapori. În coloană,

separarea are loc datorită adsorbŃiei sau respectiv,

repartiŃiei componenŃilor probei pe faza stationară solidă

sau lichidă.

După separare, fiecare component este detectat pe

masură ce părăseşte coloana cromatografică şi este

înregistrat sub forma unui pic cromatografic.

Gazul purtator utilizat drept fază mobilă trebuie să

fie un gaz inert, care să nu interacŃioneze cu proba, şi

care să permită o funcŃionare adecvata a detectorului

utilizat.

Presiunea şi debitul acestuia în coloană sunt

controlate cu ajutorul unui reductor de presiune şi a

unui debitmetru.

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE PE COLOANĂ

Cromatografia de lichide pe coloană este o variantă

cromatografică în care componenŃii amestecului de

analizat se separă datorită migrării lor diferenŃiale de-a

lungul unei coloane umplută cu o fază staŃionară solidă

sau lichidă pe suport inert sub influenŃa unei faze mobile

lichide.

Separarea are loc pe baza unui proces de adsorbŃie

(cromatografia solid - lichid, CLS) sau repartiŃie

(cromatografia lichid - lichid, CLL) al componenŃilor între

cele două faze, proces ce se produce în mod repetat

până la părăsirea coloanei cromatografice.

În funcŃie de modul de lucru există mai multe

tehnici de lucru care se deosebesc între ele prin modul

de realizare a separării cromatografice, şi anume:

(1) Cromatografia prin eluŃie

(2) Cromatografia frontală

(3) Cromatografia prin deplasare

Dintre aceste procedee, cel mai utilizat este primul.

În cromatografia prin eluŃie, proba se introduce cu

ajutorul unei micropipete sau al unei microseringi în

cantitate mică la capătul coloanei, după care se adaugă

lichidul ce funcŃioneaza drept fază mobilă, numit eluent.

ComponenŃii probei sunt antrenaŃi de faza mobilă de-a

lungul coloanei, realizându-se astfel separarea lor,

datorită constantelor de repartiŃie/adsorbŃie K =

[Ci]S/[Ci]M diferite.

La baza coloanei, componenŃii sunt colectaŃi sub

forma unor fracŃiuni şi analizaŃi, metoda permiŃând atât

determinarea calitativâ cât şi cantitativă a componenŃilor

dintr-un amestec.

Schema bloc a unui cromatograf de lichide sub presiune

R1 R2

1 2

3

4

5

6

8

7

D C

P

I

CF

a b

1 - rezervoare de solvenŃi (faze mobile);

2 - dispozitiv de pompare şi producere a gradientului de

faza mobilă;

3 - injector;

4 - coloana analitică (a) şi coloana de referinŃă (b);

5 - detector;

6 - înregistrator;

7 - calculator;

8 - colector de fracŃiuni.

În cromatografia de lichide sub presiune, coloanele

trebuie să reziste la presiuni ridicate, ceea ce impune

etanşeizari la capete.

Aceste coloane cromatografice sunt umplute cu

faze staŃionare solide sau lichide depuse pe suport solid

inert.

În cromatografia de adsorbŃie, ca faza staŃionară

solidă se folosesc diferite materiale pulverulente, dintre

care cele mai utilizate sunt alumina şi silicagelul.

Într-o măsură mai mică se folosesc, de asemenea,

silicatul de magneziu, pământul diatomitic, pulberea de

zahăr, precum şi o serie de adsorbenŃi modificaŃi.

În cromatografia de repartiŃie, ca suport se

foloseşte frecvent celuloza, silicagelul, pământul

diatomitic.

CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONIC

Cromatografia de schimb ionic este o metodă de

separare bazată pe echilibre de schimb ionic între o fază

staŃionară schimbătoare de ioni şi o fază mobilă lichidă

ce conŃine substanŃe ionizabile supuse procesului de

analiză.

ReacŃia de schimb ionic ce are loc în cazul unei

astfel de separări este o reacŃie reversibilă şi pe această

proprietate de reversibilitate se bazează posibilitatea de

regenerare a fazei staŃionare schimbătoare de ioni.

O astfel de reacŃie poate fi reprezentată prin

ecuaŃia:

RX + Y RY

+ X

schimb ionic

regenerare

unde X şi Y sunt specii ionice cu aceeaşi sarcină

electrică.

Schimbătorii de ioni utilizaŃi drept faze staŃionare

sunt materiale insolubile în cei mai mulŃi solvenŃi având

grefate grupe funcŃionale ionizabile a căror sarcină

electrostatică este neutralizată de ioni mobili

(contraioni) ce pot fi înlocuiŃi cu ioni de aceeaşi sarcină,

prezenŃi în soluŃia de analizat.

Dintre acestea, cel mai des utilizate sunt răşinile

sintetice schimbătoare de ioni, datorită proprietăŃilor lor

mecanice bune, a stabilităŃii lor chimice şi a uniformităŃii

lor granulometrice. Ele sunt constituite dintr-o reŃea

polimerică tridimensională (obŃinută printr-o reacŃie de

copolimerizare sau policondensare) pe care sunt grefate

grupările ionizabile ce le conferă proprietăŃi de

schimbători de ioni.

După semnul sarcinii purtată de gruparea

funcŃională ionizabilă fixată pe reŃeaua

macromoleculară, se disting două categorii de răşini

schimbătoare de ioni:

• răşini schimbătoare de cationi (cationiŃi) având

grefate grupări sulfonice - SO3-, carboxilice - COO-,

aminodiacetice - N(CH2COO-)2, fosforice - PO32-,

etc.

• răşini schimbătoare de anioni (anioniŃi) având

grupări de amoniu cuaternar - NR3+, amoniu terŃiar

- NHR2+, fosfoniu - PR3+, etc.