METODA BACTERIOLOGICĂ DE DIAGNOSTIC

Conținutul tematic:

Metoda bacteriologică de diagnostic Condițiile şi metodele de cultivare a bacteriilor

Mediile de cultură şi cerințele fată de ele. Clasificarea mediilor de cultură.

Caracterul creșterii microbilor pe medii lichide, solide, semilichide.

1. Metoda bacteriologică de diagnostic Condițiile şi metodele de cultivare a bacteriilor

Metoda bacteriologică de cercetare reprezintă un sistem de investigații îndreptate la izolarea

culturilor pure de microorganisme, cultivarea şi cercetarea proprietăților. Cultura pură

reprezintă cultura alcătuită din microorganismele aceleiași specii, ce sunt necesare la

diagnosticarea bolilor infecțioase, cu determinarea apartenenței specifice a

microorganismelor, cu scopul obținerii produselor activității vitale a microorganismelor

(toxinelor, antibioticelor, vaccinurilor, etc.).

Izolarea bacteriilor în cultură pură necesită:

Un mediu de cultură repartizat în recipiente adecvate cultivării;

Instrumentar pentru însămânțarea bacteriilor și manipularea culturii;

Incubatoare care asigură temperaturile și atmosfera optime cultivării.

Un rol în creșterea și multiplicarea bacteriilor revine condițiilor de temperatură. După

atitudinea lor față de regimul de temperatură se împart: psihrofile (0-200 C), mezofile (20-

450 C), termofile (45-700C).

2. Mediile de cultură şi cerințele fată de ele. Clasificarea mediilor de cultură.

Pentru cultivarea microorganismelor (creșterea în condițiile artificiale, in vitro) sânt

necesare substraturi deosebite, numite medii de cultură pe care microorganismele își

realizează toate procesele vitale (se alimentează, respiră, se înmulțesc, etc.).

Mediile de cultură sunt substraturi care asigură nutrienţii şi condiții fizico-chimice necesare

creșterii şi multiplicării bacteriilor.

Mediului de cultură ideal i se cer următoarele calități:

să asigure bacteriilor condiții de dezvoltare cât mai apropiate celor din mediul lor natural

(organismul uman, animal, sol etc.);

să nu conțină substanțe inhibitoare pentru bacteriile urmărite;

să faciliteze observarea apariției şi dezvoltării culturii (omogenitate, transparență, luciu al

suprafeței etc.);

să faciliteze izolarea bacteriilor în culturi pure (pH, osmolaritate etc.);

să fie sterile.

Clasificarea după proveniența nutrienţilor.

Se disting: medii empirice (naturale) şi medii sintetice.

Mediile empirice au la bază extracte apoase obținute fie la cald, prin infuzare, prin digestia

cărnii, cordului, creierului sau ficatului de vită ai căror nutrienţii (hidrocarbonat, baze azotate,

săruri minerale, factori de creștere etc.), fiind completate cu aminoacizi şi peptide de diferite

sorturi de peptonă (produși de hidroliză enzimatică ai proteinelor animale sau vegetale).

Mediile sintetice includ ingrediente chimic pure. Au compoziție minimă, riguros controlată

şi se folosesc pentru studiul necesitaților nutritive şi al metabolismului bacterian.

Clasificarea după consistenta

medii lichide ( extracte apoase);

solide gelificarea cu 2% agar-agar;

mediile semisolide se obțin prin gelificare cu numai 0,4-1% agar.

Clasificarea după compoziție

Mediile simple, conțin numai ingrediente de bază (bulionul nutritiv, apa peptonată, agarul

nutritiv), permit creșterea bacteriilor nepretențioase nutritiv.

Medii compuse prin adăugarea unor componente la mediile de bază, permit cultivarea

bacteriilor pretențioase nutritiv cu adăugarea sângelui, ser sanguin, glucoză, extract de

levură.

După destinație

Medii de îmbogățire sunt medii lichide ce favorizează înmulțirea anumitor bacterii și inhibă

dezvoltării florii de asociație dintr-un proces patologic.

Mediile speciale de izolare permit izolarea anumitor microbi patogeni din prelevate hiper

contaminate (materii fecale, exsudat faringian etc.). Se utilizează medii de diferențiere ce

conțin substratul pentru o enzimă. ce servește ca indicator cu caracter metabolic de

diferențiere acesteia. Medii selective conțin substanțe inhibitorii asupra altor bacterii

decât acelea a căror izolare urmărește.

Medii de transport conțin substanțe ce inhibă creșterea tuturor speciilor timp de 24 ore,

necesare transportului produselor patologice la laboratorul microbiologic.

3. Caracterul creșterii microbilor pe medii lichide, solide, semilichide.

Algoritmul investigației microbiologice constă din examene complexe ce determină cultura

pură de microorganisme, cultivarea și cercetarea proprietăților specifice:

Însămânțarea este depunerea în sau pe suprafața mediului de cultură a materialului

bacterian, inoculum cu instrumentar pentru însămânțarea bacteriilor în vederea cultivării

bacteriilor.

Incubarea constă în menținerea mediilor însămânțate în condițiile necesare dezvoltării

culturilor. Incubatoarele (termostat, anaerostat) asigură temperaturile și atmosfera optimă

cultivării. Majoritatea bacteriilor patogene sunt mezofile, temperatura optimă fiind 37°C

au creștere rapidă (12-18 ore); cu creștere lentă cultura poate fi observată abia după câteva

zile sau săptămâni de incubare.

Bacteriile strict aerobe se dezvoltă numai pe suprafața mediului unde au asigurat contactul

cu oxigenul. Bacteriile facultative sunt indiferente la pH, ele se dezvoltă de la suprafața

până la fundul coloanei de mediu. Bacteriile strict anaerobe se dezvoltă numai în

profunzimea coloanei de mediu, impune o reducere corespunzătoare potențialului de

oxidoreducere al mediilor şi prezervarea culturii de contactul cu oxigen. Bacteriile

microaerofile se dezvoltă numai într-o bandă relativ îngustă sub suprafața mediului.

Repicarea este însămânțarea într-un mediu de cultură proaspăt a unei bacterii dintr-o altă

cultură fie în scopul purificării ei, fie pentru studiul activității biochimice.

Izolarea este operația prin care o bacterie este obținută în cultură pură. Cultură pură este

constituită din indivizi ce aparțin aceleiași specii, constituită din descendenții unui singur

individ prin înmulțire vegetativă.

Testele biochimice reprezintă activitatea fermentativă a microorganismelor ce diferențiază

specific și tipic microorganismele (scindarea glucidelor, proprietățile proteolitice,

hemolitice) determinând patogenitatea (toxinogeneza, capacitatea enteroinvazivă).

Antibiograma prezintă testarea microorganismelor în condiții standart (medii de cultură,

inoculum, incubare etc.) în prezența unui gradient de medicament antimicrobian,

determinând spectrul de sensibilitate la antibiotice.

Depistarea antigenelor solubili, determinarea la o anumită structura antigenică a tulpinii

(marcher), identificată prin reacții antigen-anticorp cu seruri imune de referință (metoda

serologică). Lizovar – spectru de sensibilitate la bacteriofag.

4. O colonie este o aglomerare de bacterii care se dezvoltă dintr-o singură celulă sau grup de

celule de același fel (unitate formatoare de colonie, abreviat U.F.C.) şi este vizibilă cu ochiul

liber pe suprafața mediului solid. O colonie este o clonă bacteriană, deci o cultură pură.

Schimbările morfologice, culturale a microorganismelor sunt condiționate de acțiunea

factorilor mediului înconjurător. În urma variabilității proprietăților culturale a

microorganismelor a fost evidențiată o formă deosebită de disociere a bacteriilor în

culturi. Pe medii compacte bacteriile se împart în colonii:

S (neted) – colonii netede, rotunde, lucitoare, mărgini regulate.

R (rugoase) – colonii plate, in transparente, formă neregulată, mărgini zimțate.

M (mucozitare) – forme intermediare

G – pitice

Caracteristica formelor S şi R ale coloniilor

Forma S Forma R

Colonii netede, lucitoare, de formă regulată

bombată.

Colonii opace, rugoase, de formă neregulată

La creșterea în bulion formează suspensie

uniformă.

În bulionul nutritiv cresc în formă de

sediment.

Bacteriile mobile conțin flageli. La bacteriile mobile flagelii pot lipsi.

La bacteriile capsulare se întâlnesc capsule. Capsulele lipsesc.

Sânt active din punct de vedere biochimic. Proprietățile biochimice sunt exprimate slab.

Pot fi agenți patogeni ai bolilor infecțioase. Majoritatea speciilor de bacterii sunt mai

puțin patogene.

Se înregistrează mai frecvent în perioada

acută a bolilor infecțioase.

Se înregistrează, de regulă, în cazul bolilor

cronice.

Caracterele de cultură ale bacteriilor = exigențele nutritive (medii, temperatură, pH, aerare,

etc), viteza şi manifestarea creșterii pe medii lichide şi solide.

În funcție de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting:

Culturi discontinue (Faza Lag, logaritmică, staționară, de declin)

Culturi continue (material încontinuu reînnoit)

Culturi sincrone (culturi în care bacteriile se divid în același timp)

Culturile discontinue se obțin la cultivarea bacteriilor în volum limitat de mediu. Astfel de

culturi sunt obținute şi utilizate în laboratorul microbiologic

Aspectul coloniilor variază între bacterii fără a permite însă diferențieri de specie categorice.

Se urmăresc :

• Dimensiunea : colonii mari 2-3 mm , mici 1 – 2, mijlocii 1-2mm.;

• Conturul: circular cu margini întregi, lobat, zimțat, dendritic, geografic.

• Relieful: plat, bombat, acuminat, papilar;

• Suprafața: lucioasă sau granulară, umedă sau uscată, rugoasă;

• culoarea: ne pigmentate sau pigmentate cu sau fără irizații;

• opacitatea: opace sau transparente;

• consistența: untoasă, mucoasă, friabilă, pieloasă;

• aderența la mediu: neaderente sau puternic aderente de suprafața mediului, astrate;

• hemoliza: capacitatea de a liza eritrocitele, se cercetează pe mediile de sânge cu apariția

zonei transparente în jurul coloniei.