41273130 biotehnologie-curs

INTRODUCEREINTRODUCERE-acum 10.000 de ani - creşterea plantelor agricole şi a animalelor pentru a obţineacu 0.000 de a c eş e ea p a e o ag co e ş a a a e o pe u a obţ emâncare şi haine.-acum 6.000 de ani - în procesele biologice încep să se utilizeze microorganismele,pentru diversifica gama de produse alimentare (tipuri diferite de pâine, de brânză), şi

1. Ce este biotehnologia?1. Ce este biotehnologia?Bi ă tili l bi l i

pentru a conserva produsele alimentare pe o perioada mai lungă de timp-perioada ’60 – ’70 – utilizarea constituientilor celulari în procesele biotehnologice

Bio –sugerează utilizarea proceselor biologice;Tehnologie –sugerează realizarea produşilor prin utilizarea de diferite tehnici

definiţie de ansamblu utilizarea controlată sau deliberată a “agenţilor biologici”(celule vii sau moarte, sau componente ale acestora) încadrul unor operaţii tehnice, sau în cadrul unor procesetehnologice care duc la obţinerea unui produs finit

d i l d l li h i il bi l i ili î i l ă â ă ldomeniu larg de la totalitatea tehnicilor biologice utilizate în agricultură până lacele utilizate la prepararea mâncării

Federaţia Europeană de Biologie (1978) Utilizarea integrală a biochimiei microbiologiei şi ingineriei în scopulUtilizarea integrală a biochimiei, microbiologiei şi ingineriei în scopulobţinerii unei aplicaţii tehnologice (industriale), cu ajutorulmicroorganismelor, culturilor de celule şi a părţilor componente aleacestora

ExempleExemple::-biotehnologia fermentaţiei, cum este cunoscută astăzi, îşi are originea în introducereapentru prima oară în secolul al IX-lea a agenţilor microbiologici în anumite procesepe u p a oa ă seco u a ea a age ţ o c ob o og c a u e p ocesede fermentaţie şi nu în descoperirea vinului sau a verzei acre sau în înţelegereaproceselor biologice care au loc;-obţinerea de biomasă din noroiuri active, selecţia şi producerea la scară largă amicroorganismului Clostridia pentru obţinerea de acetonă şi butanol

-producerea de biomasă pentru hrana animalelor;a unor compuşi chimici utilizaţi în alimentaţie cum ar fi acidul citric acidul

Aplicaţii îAplicaţii în industrien industrie

- a unor compuşi chimici utilizaţi în alimentaţie cum ar fi acidul citric, acidulglutamic, unii aminoacizi, antibiotice şi vitamine;- în industria petrochimică, poate fi utilizată în obţinerea în cantitate mare a etanolului,acetonei butanolului acidului acetic etc;acetonei, butanolului, acidului acetic etc;-este utilizată în obţinerea de produşi celulari din plante şi animale, obţinerea de celulemicrobiene modificate pentru a produce antigene, anticorpi sau agenţi terapeuticidiverşi;ş ;-furnizează agenţi cheie pentru industria alimentară ca de exemplu culturi de celule şienzime care duc la o mai bună înţelegere a proceselor şi tehnicilor specifice acesteiindustrii;- are un rol deosebit în tratarea şi purificarea apelor, şi în volatilizarea substanţelorreziduale.

Definirea termenului din ce în ce mai greu de realizat

Principalele direcţii de dezvoltare a biotehnologiilor moderne sunt determinate:

d d i il- de descoperirilerecente din domeniulbiologiei moleculare;

de cerinţele- de cerinţelesocietăţii faţă deanumite aspecte cucare aceasta secare aceasta seconfruntă, cum ar fi:criza energetică,epuizarea rezervelorpde hrană de peplanetă, problemeecologice şi debioremediere.

Figura 1. Principalele aplicaţii ale biotehnologiei

IntroducereCClasificarea diferitelor tipuri de biotehnologiilasificarea diferitelor tipuri de biotehnologii

microbiene

1. în funcţie de tipul de celule cu care se lucrează:

microbienevegetaleanimale

2. în funcţie de domeniul în care-şi găseşte aplicaţie deosebim următoarele categorii de biotehnologii:

- industriale, includ obţinerea de produşi farmaceutici, de reactivi de laborator, deindustriale, includ obţinerea de produşi farmaceutici, de reactivi de laborator, deproduse alimentare;

- agricole, studiază aspecte privind rezistenţa plantelor la anumiţi factori patogenişi a toleranţei faţă de factorii de mediu defavorabili, implicarea în sistemeş ţ ţ psimbiotice la diferite specii de plante, multiplicarea speciilor horticole şiobţinerea de noi hibrizi sexuaţi;

- medical veterinare, se referă în special la nutriţia animală, creşterea rezistenţeianimalelor la atacul agenţilor patogeni, reproducere artificială şi predeterminarea sexului, conservarea resurselor genetice animale;

- ecologice, sunt incluse toate metodele şi tehnicile de epurare biologică a apelort l t l i l il d d t t ţi d i iuzate sau poluate, a aerului sau a solurilor degradate, extracţia de minereuri cu

ajutorul microorganismelor;- sănătate publică, crearea unor sisteme de diagnosticare.

IntroducereRolul cercetării fundamentaleRolul cercetării fundamentale

în viitor cea mai mare parte a industriei va utiliza procedeele desatisticsatisticaa globalăglobală v o cea a a e pa e a dus e va u a p ocedee e defermentaţie, inginerie genetică, biologie moleculară ceea ceimprimă un salt tehnologic covârşitor

s s cs s c g obg ob

nnatura interdisciplinarăatura interdisciplinară etapennatura interdisciplinară atura interdisciplinară 1. manipularea genetică a organismului gazdă

- o genă din ADN animal este clonată într-o celulă a unui microorganism.- se realizează în laborator de către cercetători specializaţi în domeniulse realizează în laborator de către cercetători specializaţi în domeniul

biologiei moleculare geneticii şi biochimie;- tehnicile utilizate sunt tehnici specifice de biologie moleculară, biochimie,

culturi de celule;- cercetarea se derulează până când se obţin tulpini recombinante stabile iar

nivelul de expresie este cel dorit2.cultivare- în vederea stabilirii parametrilor optimi - compoziţia mediului, pH,

temperatură, concentraţia oxigenului dizolvat- se porneşte de la cultivarea microorganismului la scară mică, în flacoane

de 250 – 1.000 ml, sub agitare;performanţele organism l i s nt apreciate prin calc larea ratei de- performanţele organismului sunt apreciate prin calcularea ratei decreştere, productivitatea specifică, randamentul de obţinere a produsuluifinit.

Introducere3. etapa pilot3. e apa p o

-un bioreactor de 1, 2 sau 5 litri echipat cu instrumente de măsurare a parametrilorce indică performanţele organismului; pot fi încercate diferite tipuri dep ţ g ; p pbioreactoare;

-În condiţiile creşterii culturii în bioreactor parametri sunt uşor modificaţi, darmonitorizarea lor este mai eficientă şi în plus se pot monitoriza parametri care numonitorizarea lor este mai eficientă şi în plus se pot monitoriza parametri care nufac obiectul creşterii în flacoane de cultură, ca de exemplu caracteristicile despumare ale mediului;

- se identifică limitările impuse de tipul bioreactorului (dacă bioreactorul nu este- se identifică limitările impuse de tipul bioreactorului (dacă bioreactorul nu esteaerat celulele mor prin înfometare, dacă agitarea nu este la o viteză optimă celulelese pot sparge şi astfel creşterea se realizează pe alte căi metabolice);se calculează diferiţi parametri cum ar fi: coeficientul de transfer de masă timpul-se calculează diferiţi parametri cum ar fi: coeficientul de transfer de masă, timpulde agitare, viteza de dizolvare a oxigenului, puterea de agitare, etc;

-se decide modul de cultivare cel mai avantajos – sistemul „batch” (discontinuu sausubmers) sau sistemul continuu;submers) sau sistemul continuu;

- se realizează un calcul economic de fezabilitate.

4. ridicarea la scară industrială - ingineriei bioproceselor;

bioreactoarele sunt mult mai sofisticate au un volum mult mai mare 100- bioreactoarele sunt mult mai sofisticate, au un volum mult mai mare 100 –1.000 l;

- rezultatele pot fi mai bune sau mai scăzute faţă de cele obţinute în faza pilot; sehotărăşte dacă se trece sau nu la producţia industrială;hotărăşte dacă se trece sau nu la producţia industrială;

- se proiectează întreaga instalaţie industrială de fabricare a produsului finit;- recuperarea produsului finit din mediul de producţie - izolarea şi purificarea

acestuia până la produsul finit;- etapă dificilă pentru produsele ADN recombinate;- costurile reprezintă 80-90% din costul total al procesului tehnologic, deoarece

metodele aplicate în laborator nu pot fi extrapolate la scară industrială;- filtrări, centrifugări, metode mecanice de distrugere a pereţilor celulari, extracţii

cu solvenţi, metode cromatografice cristalizări, uscări;- sunt mari consumatoare de energie şi timp.

5. Pregătirea pentru introducerea pe piaţă-ambalat şi vândut;-produsele farmaceutice noi - testarea pe animale şi apoi pe om;

d l li t t t ifi-produsele alimentare - teste specifice;-avize oficiale care sunt în conformitate cu standardele existente pentru fiecare tipde produs.

Operaţii biotehnologiceOperaţii biotehnologiceCinci aspecte majore care, în aproape toate instalaţiile industriale corespund

stadiilor de procesareMicrobiologie şi biologie celulară Procese (aspecte)

Sistemică Alegerea culturiiSistemică Alegerea culturii

Proces tehnologic

Genetică Cultivarea celulelor

Fiziologie Răspunsul dat de celule

Procesul tehnologicProcesul tehnologic

Chimie Recuperarea produsului

1. Alegerea culturii: selecţia, creşterea sau crearea de organisme sau populaţii g ţ , ş g p p ţcelulare

2. Cultivarea celulelor

3. Răspunsul dat de celulă

4. Procesul tehnologic

5. Recuperarea produsului

CARACTERISTICILE MICROORGANISMELOR CARACTERISTICILE MICROORGANISMELOR DE INTERES BIOTEHNOLOGICDE INTERES BIOTEHNOLOGICDE INTERES BIOTEHNOLOGICDE INTERES BIOTEHNOLOGIC

De ce microorganismele?De ce microorganismele?- diversitatea acestora este enormă;

i i l fi ili i (b iil )- microorganismele care pot fi utilizate - procariote (bacteriile);- eucariote (drojdiile şi fungi)

DrojdiileDrojdiilela producerea alcoolului etilic şi a dioxidului de carbon prin fermentaţie se foloseşte speciala producerea alcoolului etilic şi a dioxidului de carbon prin fermentaţie se foloseşte specia

Saccharomyces cerevisiae;pentru obţinerea vinului se folosesc specii de S. cerevisiae, şi ellipsoideus, fie sub formă de

tulpini selecţionate, fie prin fermentaţie spontană realizată cu drojdii epifite;la fabricarea berii se folosesc cereale germinate ca orzul în Europa, porumbul în America şi

sorgul în Africa. Cele mai utilizate tulpini sunt S. cerevisiae şi S. uvarum care au fostselecţionate treptat în diferite laboratoare;

la fabricarea pâinii se utilizează S cerevisiae care în timpul dospirii pâinii produce ola fabricarea pâinii se utilizează S. cerevisiae, care în timpul dospirii pâinii produce ofermentaţie alcoolică cu degajare de dioxid de carbon ce permite afânarea aluatului;

proteinele furajere se obţin prin cultivarea drojdiei pe subproduse industriale (alcani, metanol)şi reziduuri agricole (zer de lapte, melasă). Adăugate în furajele animalelor, proteinele aduc

d i i iun aport de aminoacizi.

FungiFungiiiMaterii prime :

subproduse ale industriei alimentare şi reziduuri agricole (zer, melasa de la fabricarea zahărului din sfecla de zahăr, drojdia de la distilării, paiele etc.);

multe specii saprofite, care se dezvoltă pe resturile organice animale şi vegetale desăvârşind astfel marele cicl biologic nat ral

în industria brânzeturilor fungii au un rol important în înmuierea şi aromatizarea pastei,tulpinile cele mai utilizate sunt: Penicillium roquofortii (brânză cu pastă verde)

astfel marele ciclu biologic natural.Aplicaţii

tulpinile cele mai utilizate sunt: Penicillium roquofortii (brânză cu pastă verde),Penicillium camembertii şi Geotrichium candidum (pastă presată);

în industria salamurilor folosirea unui strat alb de Penicillium nalgiovense pe suprafaţasalamurilor previne dezvoltarea microorganismelor care degradează produsul;

hidroliza amidonului din orez care precede fermentaţia se realizează cu amilaze biosintetice deAspergillus oryzae.

în industria chimică şi farmaceutică prin biosinteză se produc:Enzime – proteaze, amilaze cu tulpini din genul Aspergillus;Enzime proteaze, amilaze cu tulpini din genul Aspergillus;acizi organici - acid citric cu Aspergillus niger;antibiotice - penicilina cu tulpina Penicillium chrysogenum, cefalosporinele cu tulpini dingenul Cephalosporium;h ihormoni;biomasă în scopul obţinerii unei surse complementare de proteine pentru furaje animale.

BacteriiBacteriiBacteriile acetice (Gluconobacter, Acetobacter)

- fabricarea tradiţională a oţetului de vin, cidru, cartofi;- obţinerea de vitamină C (oxidarea sorbitolului la sorboză)

Bacteriile lactice (Lactobacillus, Lactococus, Treptococcus)- fermentează produsele lactate (iaurt, brânză dulce). Ele sunt prezente în mod obişnuit - în lapte şi au rolul de acidifia laptele (transformă lactoza în acid lactic);lapte şi au rolul de acidifia laptele (transformă lactoza în acid lactic);- în prepararea brânzeturilor participă la formarea cheagului şi la maturarea lui;- conferă untului gustul şi aroma specifice, prin producerea de acid diacetic;- producerea de acid lactic la scară industrială

B iil b i i (Cl idi b i )Bacteriile butirice (Clostridium butyricum) - intervin în înmuierea inului şi a cânepii deoarece distrug pectina şi astfel elibereazăfibrele textile

Genul Bacillus- Baccilul thuringiensis – în timpul sporulării produce substanţe toxice care sunt toxicepentru larve;- producerea de enzime: proteaze termostabile pentru ind. detergenţilor, α-amilaze,gl co o i omera ăglucozo izomerază

ActinomiceteleBacteriile din genul Corynebacterium şi Brevibacterium şi mutantele derivateBacteriile metilotrofe cultivate pe metan sau metanol PropionibacteriumBacteriile termofile metanogene

CăileCăile dede biosintezăbiosinteză aa constituienţilorconstituienţilor celularicelulari aiai microorganismelormicroorganismelorcreşterea microbiană

Etape:

- faza de creştere logaritmică;faza staţionară;- faza staţionară;

- faza de declin

Figura 2 Diferenţa dintre metabolismul primar şi secundar: a creşterea celulelor şi biosintezaFigura 2. Diferenţa dintre metabolismul primar şi secundar: a – creşterea celulelor şi biosintezaconstituienţilor are loc aproape simultan; b- după creşterea celulelor şi eliberarea metabolitului primar acestase transformă în metabolit secundar; c- substratul de creştere rămas după finalizarea creşterii celulelor estetransformat în metabolit secundar

Metaboliţii microbieni primari

Procesul microbian tipic în care în timpul fazei de creştere exponenţială (perioada de lag) se formează un metabolit primar se numeşte fermentaţie alcoolică

Exemplu:etanolul este metabolitul primar produs în fermentaţia alcoolică aerobă adrojdiilor sau a unor bacterii în acelaşi timp reprezentând şi un metabolitenergetic

Figura 3. Cinetica procesului de fermentaţie în timpul formării (a) metaboliţilor primari şi (b) a metaboliţilor secundari

Metaboliţii microbieni secundari

Metaboliţii care se formează în timpul fazei staţionare (de creştere sau trofofaza) saula finalul acesteia se numesc metaboliţi secundari

Caracteristici:Caracteristici:

• sunt sintetizaţi de un număr mic de microorganisme;• nu sunt importanţi pentru creşterea şi dezvoltarea microorganismului;• pentru sinteza lor necesită prezenţa unui număr mare de reacţii enzimatice;• formarea lor este dependentă de condiţiile de creştere şi de compoziţia mediului;• se prezintă sub forma unui amestec de compuşi cu structură chimică înrudită;p p ş ;• de obicei se obţin în cantitate mult mai mare decât metaboliţii primari .

Etape de obţinere:

• trofofaza - este faza de creştere (prefixul „trofo” în limba greacă înseamnă„creştere”);• idiofaza este faza în care se sintetizează metabolitul (prefixul idio” în limba• idiofaza – este faza în care se sintetizează metabolitul (prefixul „idio în limbagreacă înseamnă „ceva propriu”);

Interrelaţia dintre căile de biosinteză ale metabolitului primar (diferiţiacizi organici şi aminoacizi) şi a metaboliţilor secundari (o serie deantibiotice))

Figura 4. Relaţia dintre calea metabolică de obţinere a aminoacizilor şi a unor acizi

i i iorganici şi formarea unor antibiotice cu nucleu aromatic

Biosinteza şi creştereaBiosinteza şi creşterea

Figura 5. Prezentarea sintetică a principalelor căi anabolice şi catabolice. Sunt prezentate într-oversiune simplificată numai căile majore de biosinteză şi conexiunile acestora cu căile catabolice

Controlul metabolismuluiControlul metabolismuluiNecesarul de nutrienţi

Majoritatea nutrienţilor, cu excepţia oxigenului şi a câtorva surse de carbon, suntpreluate din mediul de cultură prin sisteme de transport specifice. Aceste procesepot fi controlate deoarece o dată ce celula şi-a luat nutrientul în cantitatea necesară

l d i fi î d ă di i l ă l f l î â ărestul de nutrient poate fi îndepărtat sau direcţionat pe o altă cale astfel încât să nufie în detrimentul celulei. Aceste sisteme de transport active necesită un aport deenergie.

Compartimentareareprezintă a doua formă de control metabolic

exemple:- mitocondria celulelor eucariote care separă reacţiile ciclului acizilor tricarboxilici dealte reacţii din citoplasmă;

î i i ă i d d ă i ii i i t t d

exemple:

- în peroxizomi se găsesc enzime care degradează acizii graşi şi care sunt separate deenzimele din citoplasmă care determină sinteza acizilor graşi. Separarea celor douăseturi de enzime previne reciclarea oricărui intermediar comun;- alte organite (vacuole nucleu cloroplaste etc ) controlează în mod similar alte- alte organite (vacuole, nucleu, cloroplaste etc.) controlează în mod similar altereacţii care au loc în celulă.

Figura 6. β-Oxidarea acizilor graşi

Controlul sintezei enzimaticeMulte dintre enzime sunt prezente în celulă indiferent de condiţiile de creştere ale

t i O t di i ” t i â d t fi d lacesteia. O parte din enzime „apar” atunci când este necesar cum ar fi de exempluizocitrat liaza din şuntul glioxilatului care apare numai atunci când celulele suntcrescute pe un substrat C2. Acest proces este denumit „inducerea” sintezei enzimei.

Figura 7. Ciclul glioxilatului.

Unele enzime pot să „dispară” atunci când nu mai sunt necesare. Deexemplu enzimele din calea de biosinteză a histidinei încetează a mai fi produseatunci când concentraţia de histidină din celulă este suficientă pentru a satisfacea u c câ d co ce aţ a de s d ă d ce u ă es e su c e ă pe u a sa s acenecesităţile celulei. Acest proces este numit represie. Astfel într-o celulă există unpermanent echilibru între procesele de inducţie şi represie a anumitor enzime cheie,în funcţie de necesităţile celulei. În sistemul de cultivare în suspensieÎn sistemul de cultivare în suspensie

(„batch”) celulele se multiplică într-un sistem închispână când se termină unii din nutrienţi sau pânăcând unii produşi acumulaţi determină efectecând unii produşi acumulaţi determină efecteinhibitorii asupra unor enzime reglatoare sau,numărul de celule formate au ocupat întreg spaţiulde cultivare şi astfel noile celule nu mai au spaţiu săş p ţcrească. În momentul în care în timpul creşteriicelulare unele din componentele celulare semodifică sau unii compuşi moleculari se consumă,celula îşi modifică forma – se alungeşte.

Figura 8. Reprezentarea schematică a schimbărilor ideale în ă i l l i ( ll i ht) ă l d l l t t lămărimea celulei (cell weight), numărul de celule, masa totală

uscată şi compoziţia chimică în timpul creşterii unei bacterii în sistemul de cultivare submers. În stânga este scală logaritmică

Controlul sintezei enzimatice

Eficienţa globală de creştere microbiană este discutată întermeni termodinamici. Empiric, este în mod uzual exprimată în termeni de:producţia de celule formate pornind de la o unitate masică de substrat de carbonconsumat.producţia molară de creştere (Ys) este producţia de celule per mol de substrat,

fi i t l d i b l i it i ăcoeficientul de conversie a carbonului care permite o mai uşoară comparareîntre numărul de moli de substratele diferite, este producţia de celule per gramde substrat de carbon.

ATENŢIE! valoare scăzută a producţiei de creştere atunci cândorganismele sunt transferate din sistemul de cultivare aerob în celorganismele sunt transferate din sistemul de cultivare aerob în celanaerob, fenomen care evident este direct legat de reducerea fluxuluienergetic şi astfel o producţie scăzută de ATP.

Substrat Organism Producţia molară de creştere (g organism uscat/g-mol substrat)

Coeficientul de conversie al carbonului (g organism

uscat/g carbon din substrat)Tabelul 3.Randamentul de

metan Methylomonasmethanooxidans

17,5 1,46

metanol Methylomonas methanolica 16,6 1,38

creştere a unormicroorganismecrescute pediferite substrate

etanol Candida utilis 31,2 1,30

glicerol Klebsiella pneumoniae(Aerobacter aerogenes)

50,4 1,40

glucoză Escherichia coli:aerobanaerobSaccharomyces cerevisiae:

95,025,8

1,320,36

aerobanaerobPenicillium chrysogenum

90,021,081

1,250,291,13

sucroză Kelbsiella pneumoniae (A.aerogenes)

173 1,20

xiloză Kelbsiella pneumoniae (A.aerogenes)

52,2 0,87

acidacetic

Pseudomonas sp.Candida utilis

23,521 6

0,980 90acetic Candida utilis 21,6 0,90

hexadecan

Saccharomycopsis(Candida) lipolyticaAcinetobacter sp

203251

1,061,31

RRandamentul de creştere a celulelor depinde de andamentul de creştere a celulelor depinde de următorii factoriurmătorii factori::

1. natura sursei de carbon;2. calea catabolică pe care o urmează substratul;3. proviziile de substrate complexe (îndeosebi unele căi anabolice);4 l d i t i il t i ţil î i l l t l i (4. necesarul de energie pentru asimilarea nutrienţilor în special al azotului (se

administrează mai puţin azot dacă se administrează aminoacizi şi mai multazot dacă sursa este reprezentată de ionii nitrat);

5 variaţia eficienţei reacţiilor generatoare de atp;5. variaţia eficienţei reacţiilor generatoare de atp;6. substanţele inhibitoare, contrabalansarea echilibrului ionic, sau alte

componente ale mediului care interacţionează cu sistemul de transport;7. statusul fiziologic al organismului – aproape toate microorganismele îşi7. statusul fiziologic al organismului aproape toate microorganismele îşi

modifică mecanismele de creştere în funcţie de condiţiile mediului de cultură(ca de exemplu formarea sporilor).

8. natura substratelor care limitează creşterea – cea mai eficientă este sursa decarbon care limitează creşterea , deoarece catabolizarea excesului de carbonpoate urma anumite căi metabolice care sunt din punct de vedere energeticutile biotehnologului deoarece opresc creşterea;

9. viteză de creştere prestabilită;10. înclinaţia microbilor de a creşte şi competenţa microbiologului.

BIOREACTOAREBIOREACTOAREIntroducereIntroducere

Procesul de bază în biotehnologie este „procesul biologic”, şi se realizează înbioreactor

“bioingineria” - se ocupă cu studiul bioproceselor din punctul de vedere al unui biolog, al unui chimist fizician şi al unui inginer

Bioreactorul - instalaţie tehnologică în interiorul căreia are loc transformareamateriilor prime cu ajutorul sistemului enzimatic pus la dispoziţie de microorganismelevii, celulele animale şi vegetale, sau de enzimele izolate din acestea.

CONDIŢIILE CREATE ÎN BIOREACTOR PENTRU CREŞTEREAORGANISMELOR

Randamentul cu care procesul biotehnologic are lorRandamentul cu care procesul biotehnologic are lor

Pe măsură ce celulele cresc ele se adaptează noilor condiţii de creştere şi-şi moduleazăactivitatea în funcţie de condiţiile de mediu.ţ ţ

Avantaj: monitorizarea permanentă a parametrilor creşterii

Etapa de prelucrare

fizică

Etapa de prelucrare biochimică

Etapa de prelucrare

fizico

Materii prime

fizică biochimică fizico-chimică Produs

• pregătirea mediului • biosinteza • separarea produsuluip gde cultură,

• sterilizarea utilajelor,• sterilizarea aerului

propriu-zisă• monitorizarea

parametrilor

• separarea produsuluiprincipal,

• concentrarea,• pregătirea pentru

Figura 9. Reprezentarea schematică a unui proces biotehnologic

introducerea pe piaţă

Etapa pilot Etapa industrială Modelul similitudinii

C i ii i l l i il fi i l i l i

- tipul de organism;

Criterii care permit calcularea mărimilor fizice ale sistemuluila scară mare, pe baza rezultatelor obţinute în etapa pilot

Alegerea bioreactorului

p g ;În funcţie de: - sistemul de cultivare;

- caracteristicile biochimice ale întregului proces

SistemeSisteme dede cultivarecultivare aa microorganismelormicroorganismelor2 sisteme majore: - sistem submers

- culturi de suprafaţăcu u de sup ţÎn sistem submers

mediul de cultură este lichid, agitat şi aeratalimentarea cu energie se realizează continuu în scopul menţinerii

i t f ţ i li hidtrei moduri de operare: discontinuu,

semicontinuu şicontinuu

interfaţei gaz – lichid

continuuOperarea în sistem discontinuuCultivarea - în şarje (sistemul batch);începe la t = 0 şi se termină la t = t’;p şla început, creşterea celulelor are loc în condiţii nelimitate; în timp se atingedensitatea maximă; începe creşterea în condiţii limitate de substrat şi acumularea produsului final.

se notează DC şi este reprezentată grafic astfel:

caracteristică - sistem de agitare performant omogenitatea ; uniformitateatuturor parametrilor

SistemeSisteme dede cultivarecultivare aa microorganismelormicroorganismelor

Operarea în sistem semicontinuureactorul este construit astfel încât concentraţia sustratului limitativ să fie păstrată constantă prin aprovizionarea continuă („fed batch”)

se notează SC şi se reprezintă graficse notează SC şi se reprezintă grafic astfel:

Operarea în sistem continuul i f l î â ă li i i i ăreactorul este construit astfel încât să se realizeze o aprovizionarea continuă

cu nutrienţi şi o evacuare permanentă a unei cantităţi echivalente de mediude cultură

două tipuri de bioreactoare ideale:

Figura 10. Reprezentarea schematică a bioreactoarelor tip R (cu recirculare) şi tip D (cudeplasare)


Bioreactoarele submerse pot fi:- cu agitare mecanică

Figura 11. Prezentarea sistemelor de operare continuă. S – substrat, C – celule

cu agitare mecanică, - cu convecţie forţată (cu pompă de recirculare a lichidului),- cu aer comprimat.


Culturi de suprafaţă

- au fost primele sisteme de fermentaţie folosite;

- mediul de cultură este solid, semisolid sau este reprezentat de starturi lichide aflate în repaus;- în sisteme omogene – compoziţia mediului de fermentaţie este uniformă înîn sisteme omogene compoziţia mediului de fermentaţie este uniformă în orice colţ al bioreactorului, în orice moment;- în sisteme heterogene – gradiente de celule sau substrat; microorganismele

t l dif it d d di- nu depind de sistemul exterior decât în mică măsură;sunt expuse la diferite cond. de mediu;

- sunt utilizate mai mult în laboratoar pentru întreţinerea culturilor, decât industrial pentru biosinteză.


microorganismele se dezvoltă la atât la suprafaţă cât şi în interiorulmicroorganismele se dezvoltă la atât la suprafaţă cât şi în interiorulmediului de cultură. În mediul nutritiv la care s-a adăugat un agentgelifiant şi s-a usucat la 45 – 500C, se inoculează microorganismulla temperatura ambiantă Coloniile formate după incubare permitla temperatura ambiantă. Coloniile formate după incubare permitselecţia microorganismelor dorite. Condiţiile de cultivare pot fistabilite prin schimbarea compoziţiei mediului. Aerarea se

li ă i i i t il D bi i l ă îrealizează prin aprovizionarea cu aer steril. De obicei se lucrează înincubatoare cu CO2.

tipuri de bioreactoare : cu tăvi, tip coloană cu umplutură,în strat fluidizat şi cu strat fixîn strat fluidizat şi cu strat fix

ConfiguraţiaConfiguraţia bioreactoarelorbioreactoarelor

Aspecte care trebuiesc urmărite la alegerea bioreactorului

configuraţia biorectorului;mărimea bioreactorului;condiţiile bioprocesului din interiorul bioreactorului;condiţiile bioprocesului din interiorul bioreactorului;sistem de operare utilizat (sistem submers/de suprafaţă;continuu/discontinuu);

l / l î i lt bi tcuplare/necuplare în serie cu alte bioreactoare.

În funcţie de natura procesului biotehnologic

bioreactoare biologice - un proces de fermentaţie (cu biomasă);- pot fi: pentru fermentaţii anaerobe,

aerobe;aerobe;bioreactoare biochimice - procesele enzimatice.

- Pot fi: cu enzime libere,cu enzime imobilizate şicu fază solidă

ConfiguraţiaConfiguraţia bioreactoarelorbioreactoarelor

Au forme constructive şi moduri de operare variate, funcţie de tipul procesului tehnologic

Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Clasificare:

după modul de introducere a energiei necesareamestecării fazei lichide (substrat şi microorganisme) şidispersării fazei gazoase (aer):

- cu amestecare mecanică;- cu pompă de recirculare;- cu aer comprimat

Figura 12. Bioreactoare cu agitare mecanică.(a) cu motorul aşezat la baza vasului; (b) cu motorul la baza vasului şi cu draft interior; (c) bioreactor cu agitator cu turaţie mare


Figura 13 Bioreactoare


Figura 13. Bioreactoarecu agitare mecanică cubarbotare cu aer (prinaxul agitatorului sauseparat).

(a,b) cubarbotare prin axulagitatorului; (c) cuagitatorului; (c) cubarbotator separat cuagitare pe sus; (d) cu tubde aspiraţie a aerului.


Figura 14.Figura 15. Bioreactor cu pompă de recirculare a fazei lichide.(a) cu recirculare externă; (b) cu buclă de recirculare; (c) curecirculare cu jet; (d) cu recirculare internă, inversată

Bioreactor cu agitare la mai multe nivele


Figura 16.Bioreactoare cu aer comprimat (a)comprimat. (a) bioreactor tip coloană cu bule; (b) bioreactor tip turn cu i f ( )site perforate; (c)

bioreactor tip „air –lift”; (d) bioreactor tip “air lift” cu pcoloană cu bule


Figura 17. Bioreactoare biochimicebiochimice.

(a) în sistem discontinuu, cu enzime libere;

(b) în sistem continuu, cu i libenzime libere;

(c) în pat fluidizat (cu enzime libere;

(d) cu enzime imobilizate (d) cu e e ob atepe suport


Figura 18.Alte tipuri constructive de bioreactoarebioreactoare. (a) cu film lichid; (b) pentru culturi de suprafaţă

BioreacBioreactoare cu agitare mecanicătoare cu agitare mecanică


Figura 19. Bioreactor cu agitare tip pentru culturi g p paerobe


Figura 20 Tipurile deFigura 20. Tipurile de rotoare utilizate la realizarea agitatoarelor pentru amestecarea mediului de cultură din bioreactor. (a) ancoră, (b) elice, (c) turbină cu palete plane (d) cupalete plane, (d) cu palete tip zbatură, (e) ancoră complexă, (f) şurub elicoidal


Caracteristicile bioreactorului:Ca acte isticile bio eacto ului:

Amestecarea şi dispersia bulelor de aer – agitare mecanică;Omogenizarea mediului – şicane;gDegajarea bulelor de aer – spărgător de spumă;Transferul de căldură – prin agitare şi turbulenţă,

o în timpul sterilizării (când se realizează în bioreactor)o în timpul sterilizării (când se realizează în bioreactor),o în timpul fermentaţiei (sterilizarea se realizează în alt vas);

Preluarea căldurii de reacţie degajată în timpul fermentaţiei

- sistem de răcire, cel mai des cu serpentine; dezavantaj – greu de spălat şi sterilizat, incomodează sistemul de agitare;

sistem de răcire cu schimbător de căldură exterior- sistem de răcire cu schimbător de căldură exterior

Utilizare

l l lib i bili t i- celule libere sau imobilizate şi- reacţii enzimatice cu enzime libere sau imobilizate

Bioreactoare pentru fermentaţii aerobeBioreacBioreactoare cu agitare mecanică toare cu agitare mecanică

şi cu draft interiorşi cu draft interior

creşte coeficientul de transfer de masă

şi cu draft interiorşi cu draft interior

circulaţia lichidului este modificată prin introducerea unui cilindru metalic axial fără fund şi capac numit draft”fără fund şi capac numit „draft

Figura 23. Circulaţia lichidului într-un g ţbioreactor cu draft. (a) complet imersat în lichidul de cultură, (b) cu revărsare (adaptat după Keitel, 1978)


BioreacBioreactoare cu aer comprimattoare cu aer comprimatBioreactoare tip „coloană cu bule”.Bioreactoare tip „coloană cu bule”.

i ă bi l i i ăvariantă a bioreactoarelor cu agitare mecanică

agitarea mediului de cultură se realizează exclusiv prin barbotare de aerexclusiv prin barbotare de aer

Caracteristicile hidrodinamice şi transferul de masă depind în totalitate de

l b l l lib dcomportamentul bulelor eliberate de barbotor

utilizată în industria drojdii de bere, în industria berii, a vinului şi în tratarea apelor reziduale

Figura 24. Bioreactor tip coloană cu bule


Si t b l l ă iSistem omogen - bulele urcă cu aceeaşi viteză şi nu se amestecă între ele, iar agitarea lichidului este limitată,

Sistem eterogen - viteza de barbotareeste mai mare; circulaţie haotică acelulelor; bulele şi lichidul tind să seridice prin centrul coloanei, curentul delichid coboară pe lângă pereţiibioreactorului, antrenează bulele,amestecarea aerului cu mediul decultură.

avantaj - cost de construcţie mic,transfer de masă şi căldură satisfăcătorprobleme d di l i Figura 25. Circulaţia fluidului într-o coloană

cu bule aflată în regim eterogen

probleme - de spumare a mediului


Pentru îmbunătăţirea caracteristicilor de curgere şi amestecare seconstruiesc bioreactoare tip coloană cu bule în mai multeconstruiesc bioreactoare tip coloană cu bule în mai multetrepte. Astfel întâlnim:- coloane cu bule divizate în câteva secţiuni prin site perforate şi

l b l t ă t it t l l- coloane cu bule care sunt prevăzute cu agitatoare locale.Introducerea sitei perforate sau a agitării locale reduce intensitateaamestecării axiale a lichidului şi creşte coeficientul de transfer demasă.

Datorită varietăţii mari de configuraţii de bioreactoare tipcoloană cu bule (diametrul găurilor, secţiunea transversală liberă,coloană cu bule (diametrul găurilor, secţiunea transversală liberă,numărul de site perforate, varietatea compoziţiei mediului) nu s-auelaborat relaţii generale de calcul şi control a parametrilor.

BioreacBioreactoare “air lift”toare “air lift”


formă de turnuri cu buclă;o „air lift” cu circulaţie internă

circulaţia lichidului se datoreazădiferenţei de densitate a fazei aerate din

o „air lift” cu circulaţie externă

diferenţei de densitate a fazei aerate dinturn şi a zonelor nearerate;

culturi de celule vegetale,utilizateculturi de celule animale,culturi de celule imobilizate biosinteza proteinelor microbienet t t l bi l i l ă l iltratamentul biologic al nămolurilor

Figura 26. Configuraţia bioreactoarelor „air lift”

BioreacBioreactoare toare cu membrancu membrană de dializăă de dializăMotivaţii: membranele de dializă sunt un mijloc eficient de îndepărtareotivaţii: e b a e e de d a ă su u j oc e c e de depă a e

continuă a inhibitorilor sau a produşilor toxici rezultaţi în timpulfermentaţiei

alimentarea cu substrat a culturii microbiane se realizează prinmembrană

se pot obţine concentraţii mari de microorganisme, deoarecesubstratul este separat de microorganism şi nu poate exercita efectei hibi iiinhibitorii

Utilizare: cultivarea sistemelor de două sau mai multe tipuri de microorganismecultivarea celulelor umane

Modele:Modele:Primul tip două vase între care schimbul de substrat sau produs se realizează

prin pomparea conţinutului printr-un modul de dializă situat între l d ăcele două vase.

dezavantaje – sterilizarea sistemului (sistem multi-component);

suspensia fermentată este pompată prin by pas- suspensia fermentată este pompată prin by-pas

BioreacBioreactoare toare cu membrancu membrană de dializăă de dializă

Figura 28. Reprezentarea schematică a bioreactoarelor cu membrană de dializă

Al doilea tipBioreacBioreactoare toare cu membrancu membrană de dializăă de dializă

două tuburi flexibile care sunt fixate în interiorul bioreactorului de oţel, de fund şi de capac Tubul mare care formează peretele fermentatorului este confecţionat dinde capac. Tubul mare, care formează peretele fermentatorului, este confecţionat din folie de poliamidă cu o grosime a porilor de 80µm, în timp ce tubul mic formează un cilindru în interiorul bioreactorului. Tubul mic este o membrană de dializă a căror pori au dimensiunea de 20µm. Bioreactorul este echipat cu două unităţi de agitare cu motoare separate ceea ce face ca turaţia motorului să poată fi controlată separat. Aeraţia se poate realiza în ambele incinte în acelaşi timp. Fermentatorul p ţ p ş ppoate fi sterilizat in situ ca un fermentator obişnuit, la 1210C, în timpul sterilizării pereţii din folie de poiamidă putând fi protejaţi de o manta din cilindri de oţel.

BioreacBioreactoare toare cu membrancu membrană de dializăă de dializă

Figura 29. Bioreactor cu dializă

BioreacBioreactoare toare cu cu tăvităvi

Aplicaţiile sunt limitate la microorganismele care se dezvoltă la suprafaţă şi formează peliculă

În industrie s-au construit bioreactoare cu mai multe tăvi, aşezate una deasupra celeilalte, astfel încât sterilizarea şi inocularea să poată fi efectuate automat. În interior se introduce aer steril. Bioreactorul este exploatat în regim discontinuu.

O variantă a acestui tip de bioreactor a fost descrisă de Kybal şi Vlcek (1976)care au propus utilizarea unor perne gonflabile de plastic, care pot fi umplutecu mediu nutritiv, inoculate şi aerate prin tubul de fixare.

BioreacBioreactoare toare cu cu tăvităvi

Figura 30 Bioreactor cuFigura 30. Bioreactor cu tăvi, sterilizabil, cu răcire, cu alimentare prin partea superioară

BioreacBioreactoare tip coloană toare tip coloană cu cu umpluturăumpluturăO coloană verticală, umplută cu granule de biocatalizator sau cu biocatalizatorimobilizat.Alimentarea cu mediu se face prin partea de sus - se formează o fază de lichidcontinuă printre particule. Datorită frecării particulelor, deteriorarea celulelor, este

i i ă i bi l iminimă comparativ cu bioreactoarele cu agitare.Transferul de masă dintre faza lichidă şi catalizatorul solid se realizează relativ uşordacă viteza de trecere a acestuia prin coloană este mare, iar pentru a fi îmbunătăţitmediul lichid este recirculatmediul lichid este recirculat.Aerarea mediului este bine să fie realizată separat. Dacă aerul este barbotat direct seproduce coalescenţa bulelor, apar canale prin umplutură şi distribuţia nu esteuniformă Din acelaşi motiv bioreactoarele cu umplutură nu sunt potrivite pentruuniformă. Din acelaşi motiv, bioreactoarele cu umplutură nu sunt potrivite pentrubioprocesele din care rezultă CO2 sau alte gaze. De obicei, aerul circulă încontracurent cu lichidul pentru a intensifica înlăturarea căldurii degajate în timpulfermentaţiei sau a reacţiei enzimatice.ţ ţ

Când se lucrează cu microorganisme acestea formează un „film biologic” în jurulparticulelor de umplutură.

Bioreactoarele cu umplutură se utilizează şi în cazul enzimelor sau celulelorimobilizate.

Figura 31. Bioreactor tip coloană cu umplutură cu recirculare a mediului

BioreacBioreactoare în strat fluidizattoare în strat fluidizat

Când bioreactorul cu umplutură este operat cu stratul în suspensie, atunci else numeşte „strat fluidizat”.

pentru prima oară, a fost descris de Moebus în 1981, şi a fost folosit lafermentaţia glucozei la etanol folosind un strat fluidizat format din granule dedrojdie.

Gazul de fluidizare păstrează în acelaşi timp granulele în mişcare şi le usucă.Aerul este introdus pe la partea inferioară a bioreactorului şi menţine în

i lt d l l i i bili t U i f l t i isuspensie cultura de celule sau enzime imobilizate. Uneori se foloseşte nisipsau un alt material care se amestecă cu celulele microbiene.

Procedeul este uneori folosit cu microorganisme floculate în fabricarea beriiProcedeul este uneori folosit cu microorganisme floculate, în fabricarea beriişi a oţetului.

BioreacBioreactoare în strat fluidizattoare în strat fluidizat

Figura 32.Bioreactor în pat fluidizatfluidizat

BioreacBioreactoare cu strat fixtoare cu strat fix

Reprezintă o variantă a bioreactoarelor cu umplutură, deosebirea constând în introducerea şi distribuirea mediului lichid prin partea superioară a bioreactorului

lichidul circulă în jos cu viteză mică, scurgându-se pe particulele de umplutură. Acest tip de bioreactor este mult mai utilizat în tratamentelor apelor reziduale, când configuraţia bioreactorului se modifică prin introducerea unor „biofiltre” (figura ).

A l ăt d i f t l d l t i f i ă bi t l iAerul pătrunde prin ferestrele de la partea inferioară a bioreactorului, se ridică prin convecţie naturală şi alimentează cultura de microorganisme cu oxigen.

Dezavantaje: utilizarea volumului reactorului în scopul creării uneiDezavantaje: utilizarea volumului reactorului în scopul creării unei interfeţe cât mai mari; repartizarea uniformă a lichidului peste umplutură pentru ca întreaga suprafaţă de lichid să lucreze uniform.


Figura 33. Bioreactor cu flux fix


Figura 34. Biofiltru utilizat la purificarea apelor reziduale

BioreacBioreactoare cu enzime imobilizatetoare cu enzime imobilizateavantaje la transformarea substanţelor în cataliză eterogenă :v je s o e subs ţe o c e e oge :

• permite utilizarea repetată a enzimei;• permite lucrul în instalaţii semicontinue şi continue (volumul micp ţ ş (ocupat de instalaţie permite automatizarea proceselor);• se elimină faza de inactivare termică deoarece enzima nu se regăseşteamestecată cu produsul;• se pot trata soluţii diluate de substrat (ape reziduale, subproduse);• scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produse;scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produse;•nu se formează produşi secundari.

Avantaje faţă de procesul de transformare a substratului cu ajutorulmicroorganismelor:

BioreacBioreactoare cu enzime imobilizatetoare cu enzime imobilizate

• se elimină faza de inactivare termică• se pot trata soluţii diluate de substrat•Scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produse

c oo g s e o :

• nu se formează produţi secundari•în procesul de transformare se utilizează întreaga cantitate de substrat (în cazul proceselor fermentative 1% din cantitatea de substrat este utilizată la d l i i l )dezvoltarea microorganismelor);•datorită existenţei unei singure enzime există posibilitatea efectuării unei singure reacţii enzimatice specifice (în cazul proceselor fermentative microorganismele produc un complex de enzime care pot duce la transformărimicroorganismele produc un complex de enzime care pot duce la transformări secundare);•costurile sunt reduse deoarece este eliminată faza de cultivare a microorganismelormicroorganismelor.

tehnici de imobilizare a enzimelor:Procedee fizice: Procedee chimice:

i l i l l- adsobţia pe suporturi solide;- includerea în structuri macromoleculare;- microîncapsularea;

- reticularea intramoleculară;- legarea covalentă pe suporturiinsolubile reactive

BioreacBioreactoare cu enzime imobilizatetoare cu enzime imobilizate

Cantitatea de enzimă care se cuplează la suport variază de la 1mg – 1gproteină/g preparat imobilizat

R i i l i bili i fl ă d ă ii f iReactivitatea preparatelor imobilizate este influenţată de următorii factori:

• granulometria –;• masa moleculară a substratului –masa moleculară a substratului• pH mediului de reacţie –• stabilitatea preparatelor enzimatice imobilizate -

Bioreactoarele conţinând preparate enzimatice imobilizate se clasifică în:Bioreactoarele conţinând preparate enzimatice imobilizate se clasifică în:

• Discontinue cu agitare;• Continue cu agitare;

C ti d ti l ă• Continue de tip coloană;• Continue în pat fluidizat

Alegerea tipului de bioreactor depinde de caracteristicile fizice aleg p ppreparatului imobilizat, de capacitatea de producţie a instalaţiei şi de naturasubstratului ce trebuie transformat.

ETAPE PRELIMINARE ÎNTRETAPE PRELIMINARE ÎNTR--UN UN PROCES BIOTEHNOLOGICPROCES BIOTEHNOLOGICPROCES BIOTEHNOLOGICPROCES BIOTEHNOLOGIC

totalitatea paşilor necesari în vederea recuperării produsului final în orice tip de industrie

Ex.: procesul de fermentatie clasicLa sfârşitul fermentaţiei - separarea fazei solide (de obicei celule, dar şi celule împreună cu enzime pe un

i i d l di l i d l ) d li hidanumit tip de suport, sau componente ale mediului de cultură) de cea lichidă care în 90% din cazuri este apoasă.

Proprietăţi Bacterii Drojdii Fungi

formă baghete, sfere, sfere, elipsoidice, filamente

Tabelul 4. Proprietăţile celulelor cu referire la procesul de separare

catene filamente

mărime 0.5µm – 3 µm 1 – 50 µm 5 –15 µm diametru50 – 500 µm lungime

greutate specifică

1,05 –1,1 1,05 – 1,1 1,05 – 1.1

greutatea celulei

10-12 g 10-11 g -

IntroducereIntroducere Principiul de separare

Metoda de separare Mărimea particulelor (µm)

mărimea particulelor

Filtrarea pe fibreMicrofiltrarea

>200 – 1020 – 0,5

ă i l fil 2 0 00

Tabelul 5.

Mărimea moleculei

UltrafiltrareHiperfiltrareGel cromatografieDializă

2 – 0,0050,008 – 0,00025

2 – 0,00030,002 – 0,00025

Clasificarea metodelor de separare

Temperatură Cristalizare <0,002

Solubilitate Adsorbţie <0,002Extracţie <0,002

Sarcina electrică

ElectroforezăElectrodializă

2 –0,020,02 – 0,00025

Cromatografie de schimb ionic

0,02 – 0,00025

Densitate Sedimentare >1000DecantareCentrifugareultracentrifugare

1000 – 51000 – 0,5

2 – 0,02

FiltrareaFiltrarea- separarea filamentelor de fungi şi bacteriilor filamentoase de bulionul de fermentatie- separarea floculelor de fungiîn toate cazurile se foloseşte vacuum sau suprapresiune.

Tipuri de filtrare:filtrare de suprafaţă,filtrare de adâncime,

separarea floculelor de fungiîn toate cazurile se foloseşte vacuum sau suprapresiune.

vacuum / suprapresiunefiltrare de adâncime,filtrare prin centrifugare;

Parametri filtrarii:1. Rata de filtrare –

p p

2. Rezistenţa filtrelor –Tipuri de filtre:

simple, plate, ansamblu de filtre

Exemple:1. Separarea microorganismelor din bulionul de fermentatie

b t i d filt t ti- baterie de filtre rotative2. filtrarea mediilor de biosinteza

- cu ajutorul adjuvantilor de filtrare:- în strat subţire pe materialul filtrant;- în strat subţire pe materialul filtrant;- amestecarea adjuvantului cu suspensia de filtrat;- raclarea stratului de adjuvant - in cazul filtrelor rotative

variantă - filtrarea sterilizantă.prefiltrare grosieră,filtrarea sterilizantă propriu-zisă.

se montează în filtru plăci din acetat de celuloză,b li i i i i di d l ilazbest sau polimeri sintetici cu diametru redus al porilor,

Avantaj: temp. scăzută, consum mic de energie, integrareafiltrării cu spălarea, îndepărtarea parţială a apei

Dezavantaj: contaminarea cu aer

Cel mai adesea pentru separarea microorganismelor de bulionul de

Dezavantaj: contaminarea cu aer

fermentaţie se utilizează o baterie de filtre rotative menţinute sub presiunea exercitată din interiorul reactorului – presiune constantă

Filtrele sub formă de centură - potrivite pentru precipitatele deja filtrateşi care necesită o spălare mai îndelungată. Dacă acest tip de filtrare serealizează într-o presă îndepărtarea apei se va realiza mai rapidrealizează într o presă îndepărtarea apei se va realiza mai rapid.

FiltrareaFiltrarea

Figura 34. Reprezentarea schematică a filtru rotativ menţinut sub vacuum

Filtrarea pe membraneFiltrarea pe membranemetodă versatilă - utilizată pentru separarea şi concentrarea diferitelor molecule sauparticule

Tabelul 7. Aplicaţiile filtrării pe membrane

particule.În ultrafiltrare membranele pot fi considerate ca o „sită” (membrane microporoase) acăror mărime a porilor guvernează separarea.

Tabelul 7. Aplicaţiile filtrării pe membraneTipul de filtrare

Aplicaţia Masa molecularărelativă a particulelor ce

pot fi separatemicrofiltraremicrofiltrare concentrarea bacteriilor şi

virusurilor>1 000 000(sau particule)virusurilor (sau particule)

ultrafiltrareaultrafiltrarea fracţionare;dializă;producerea de enzime;producerea de proteine;

>10 000(macromolecule)

producerea de proteine;producerea zerului

osmozaosmoza inversăinversă concentrarea produselorfarmaceutice;producerea lactozei;desalinizarea parţială a soluţiilor;

>200(compuşi organici)

electrodializaelectrodializa purificarea şi fracţionareasubstanţelor ionice;desalinizarea

>100(compuşi organici)

microfiltrarea – sistem închis- avantaj: se lucrează în condiţii sterile- se separă celule şi metaboliţi specifici

ultrafiltrarea - apare fenomenul de “polarizare a concentrării”

Filtrarea pe membraneFiltrarea pe membrane

Figura 39. Secţiune transversală printr-un modul de ultrafiltrare „plate and frame” (The Danish Sugar Co). 1 – grătar central; 2 – fereastră; 3 – membrană; 4 –hârtie de filtru; 5 – suport plat pentru membrană


Figura 40. Reprezentarea schematică a unui modul de ultrafiltrare „hollow-fibre” (romicon). 1 – hollow fibre; 2 –( )lagăr; 3 - suport pentru fibre.

Performanţa unei centrifugări poate fi caracterizată de expresia:

CentrifugareaCentrifugarea

Performanţa unei centrifugări poate fi caracterizată de expresia:Q = d2∆ρgZF/18η

şiZ R 2/ R 2/900Z = Rω2/g ≅ Rn2/900

unde: Q – rata de încărcare volumetrică;d – diametrul particulei;∆ dif ţ d d it t∆ρ - diferenţa de densitate;g – acceleraţia gravitaţională;F – volumul păstrat în centrifugă;η - vâscozitatea;η - vâscozitatea;R – radius;ω - viteza unghiulară;N – numărul de revoluţii/minutţ

Funcţia Σ = FZ, este utilizată în compararea diferitelor centrifugări. Deoarece F creşte cu lungimea axială a rotorului şi Z cu diametrul şi viteza rotorului, performanţele utilizării unor rotoare mai lungi (F), mai rapide sau mai largi (Z) sunt superioare. Valorile lui Z sunt limitate de natura materialului din care este construit rotorul.


Figura 35. Exemple de centrifugi solide: (1) scobitură tubulară, (2) scobitură solidă multicamerală, (3) centrifugă cu scobitură în formă de disc

Tabelul 6

Tipul de centrifugă Avantaje Dezavantaje Detalii tehnice

coş perforatcoş perforat bună îndepărtare a apei;uşor de curăţat;

capacitate limitată pentrusolide;

n – 500 – 2500 min-1

Z – 300 - 1500


Tabelul 6. Proprietăţile diferitelor tipuri de centrifugi

ş ţ ;posibila spălare a filtrelor

;recuperare laborioasă asolidelor;forţă centrifugă mică;funcţionare discontinuă

Σ - 900 – 1800

centrifugă cu centrifugă cu utilizată la separareasolidelor;

forţă centrifugă mică n – 500 – 1000 min-1

Z 300 1500sită rotativăsită rotativă solidelor;posibilă spălare a filtrelor;funcţionare continuă

Z - 300 – 1500

coş tubularcoş tubular bună îndepărtare a apei;forţă centrifugă mare;

capacitate limitată pentrusolide;

n - 13000 – 18000 min-1

d – 75 – 150 mmţ guşor de curăţat;uşor de îndepărtat coşul

recuperare laborioasă asolidelor;funcţionare discontinuă

Z – 13000 - 17000Σ - 1500 - 4000

coş coş multicameralmulticameral

capacitate mare pentrusolide;

i d fi i ţă â ă l

recuperare laborioasă asolidelor;f ţi di ti ă

n – 5000 – 10000 min-1

d – 125 – 530 mmZ 6000 11400multicameral multicameral

solidsolidnu pierde eficienţă până lacompleta încărcare acamerelor

funcţionare discontinuă Z - 6000 - 11400

centrifugă cu centrifugă cu descărcare descărcare

trecere rapidă simultan cuo concentrare mare;funcţionare continuă

forţă centrifugă mică n – 700 – 2500 min-1

Z – 350 – 1400Σ - 900 - 2300

rotativărotativăţ

centrifugă cu centrifugă cu scobitură în scobitură în formă de discformă de disc

funcţionare discontinuă;forţă centrifugă mare;eliminarea lichidului subpresiune;curăţare ieftină

îndepărtare slabă a apei;funcţionează numai cusolide mici în suspensie

n – 3000 – 10000 min-1

Z – 4000 - 7500Σ > 270000

curăţare ieftină

centrifugă cu centrifugă cu tub de elimitub de elimin.n.a sola sol.. apoaseapoase

funcţionare continuă;forţă centrifugă mare

îndepărtare slabă a apei; n - > 10000 min-1

Z > 14000Σ > 80000

Aducerea în suspensieAducerea în suspensieÎn cazul celulelor bacteriene cu dimensiuni miciMetode: - formarea de floculi

Dezintegrarea celulelorDezintegrarea celulelor- metoda de plutire

Microorganisme:

Figura 36. Metode de rupere a microorganismelor

Celule animale şi vegetale – metode mecanice- îngheţare rapidă şi tăiere – cel. anim.- liză enzimatică – cu celulaze şi hemicelulaze- cel. Veg.

Metode de extracţieMetode de extracţie

termenul de extracţie se referă atât la separare cât şi la concentraretermenul de extracţie se referă atât la separare cât şi la concentrareDistribuţia substanţei între cele două faze este guvernată de un coeficient de partiţie caracteristic, K:

K =Concentratia substantei in faza A

K Concentratia substantei in faza B

Figura 37. Procesul tehnologic de recuperare a antibioticelor

Metode de concentrareMetode de concentrare

- trebuie să nu afecteze structura şi activitatea produsului- printr-o etapă de separare sau extracţie-ca o ultimă etapă înainte de purificarea economică;p p ;-- tipuri:extracţia, evaporarea,

- procesarea pe membrane,- cromatografia de schimb ionic,- cromatografia de adsorbţie

EvaporareaEvaporarea

Se aplică la soluţiile obţinute în urma extracţiei cu solvenţi, caz în care evaporareaSe ap că a so uţ e obţ u e u a e acţ e cu so ve ţ , ca ca e evapo a easolventului este obligatorie.Evaporarea directă a mediului de cultură - în cazul produşilor secundari, de obiceiprin folosirea unui spray de uscare;Evaporarea în timp scurt (min.) – este continuă; permite concentrarea produselorinstabile cu ajutorul unor filme de evaporare;Evaporarea cu filme subţiri sub formă de peliculă – concentrarea amestecurilor

f fi l d d l ivâscoase, sau în faza finală de uscare a produsului.


Răşini schimbătoare de ioni şi de adsorbţieRăşini schimbătoare de ioni şi de adsorbţieRăşini schimbătoare de ioni: - concentrarea puternică într-o singură etapă.

Tabelul 8 Natura chimică a schimbătorilor de ioni solizi şi lichiziTabelul 8. Natura chimică a schimbătorilor de ioni solizi şi lichiziSchimbător de ioni

Matrix Grupări funcţionale

Răşini schimbătoare de

Stiren-divinil.benzen;Acrilat;

Carboxil;Acid sulfonic;schimbătoare de

ioni solidesolideAcrilat;Metacrilat;Poliamina;Celuloză;Dextran

Acid sulfonic;Amine primare, secundare şi terţiare;Amine cuaternare

Schimbători de ioni Solventul este folosit pentru Amine primare secundare şiSchimbători de ioni lichizilichizi

Solventul este folosit pentru transportul grupelor funcţionale

Amine primare, secundare şi terţiare;Monoesterul acidului fosforic;Diesterul acidului fosforic

Tabelul 9. Proprietăţile răşinilor de adsorbţieSuprafaţă 20 – 800 m2g-1

Răşini de adsorbţie: - sunt utilizate în locul procedeelor de extracţie

Proprietăţi fiziceVolumul porilor 0,5 – 1,2 ml g-1

Mărimea medie a porilor 5 – 130 nm

i i i i

Proprietăţi chimice

Nepolar: stiren-divinil benzen;Semipolar: ester acrilic;Polar: sulfoxid, amide, grupările N-O

PurificareaPurificarea şişi stabilizareastabilizarea amesteculuiamesteculuiÎn fiecare din etape se realizează o purificare a produsului finit. În final se ajunge cu un produs al cărui grad de puritate nu este întotdeauna satisfăcător motiv pentru care este necesară introducerea unei etape finale de purificare şi stabilizare. În prezent se utilizează două metode de purificare: cristalizarea şi

ficromatografia.

CristalizareaCristalizarea

Este folosită la purificare compuşilor cu masă moleculară mică cum sunt deEste folosită la purificare compuşilor cu masă moleculară mică, cum sunt de exemplu antibioticele.

La o scară mai mare cristalizarea este etapa finală de purificare a unor produşi p p p şca actinomiceina A, penicilina G, acidul citric, glutamatului de sodiu etc.

CromatografiaCromatografia

purificarea compuşilor cu masă moleculară mică care într-adevăr necesităparcurgerea unei astfel de etape (de exemplu antibioticele), a macromoleculelor, aenzimelor atunci când sunt însoţite de compuşi de aceiaşi natură.

Purificarea şi stabilizarea Purificarea şi stabilizarea amesteculuiamestecului

Figura 41. Izolarea şi purificare actinomicinei

Purificarea şi stabilizarea Purificarea şi stabilizarea amesteculuiamestecului

Echipamentul constăb i d lîntr-o baterie de coloane

cu diferite matrixuri,rezervoare, sisteme depompare a eluentului şipompare a eluentului şio serie de colectoare defracţii.

Figura 42. C=PHARMACIA 1501 segment de coloană din oţel: P –filt S S filt t il Fl flfiltru, S1, S2 - filtre sterile, Fl – flow-metru, UV – spectrofotometru UV

Purificarea şi Purificarea şi stabilizarea amesteculuistabilizarea amestecului

Figura 43. Procesul tehnologic de purificare a proteinelor plasmatice umaneproteinelor plasmatice umane (Curling, 1980)

Prin cromatografie de afinitate se purifică în special enzimele dintr-unamestec de proteine Folosindu-se o soluţie tampon cu pH diferit de cel al

Purificarea şi stabilizarea amesteculuiPurificarea şi stabilizarea amestecului

amestec de proteine. Folosindu se o soluţie tampon cu pH diferit de cel alenzimei, enzima poate fi eluată selectiv de pe coloană. Astfel de efectorispecific sau molecule complementare care pot fi separate prin acest procedeusunt: enzime/inhibitori enzimatice (sau vice-versa);enzime/inhibitori enzimatice (sau vice-versa);

anticorpi/antigene sau haptene (şi vice-versa);lectine/glicoproteine sau polizaharide;acizi nucleici/secvenţe de baze complementare;ţ p ;hormoni/receptori;vitamine/proteine transportoare etc.

exemplu:principiul de separare a dehidrogenazele se bazează pe interacţiile specifice

cu coenzima sa (NAD+). Ca matrix se foloseşte sepharoză la care este legat NAD+.Interferonul din leucocitele umane este recuperat prin cromatografie de

fi i d l ă d d l f l i l l lafinitate, de pe o coloană de dextran la care a fost legat anticorpul monoclonal împotriva interferonului.

Dezavantaj: cost mare al efectorilor imobilizaţiC t fi d fi it t d ifi î li t i l iCromatografia de afinitate de grup specific: în separarea glicoproteinelor şi nucleotidelorCromatografia covalentă: separarea proteineor care contin grupări -SH

UscareaUscarea

Este modalitatea prin care bioprodusul este adus în formă stabilă pentru a putea fiEste modalitatea prin care bioprodusul este adus în formă stabilă pentru a putea fimanipulat, ambalat, transportat. Deoarece majoritatea produşilor biologici suntsensibili se descompun uşor sau îşi pierd activitatea atunci când se găsesc latemperaturi înalte, singura metodă de uscare este îndepărtarea apei cu o creşteretemperaturi înalte, singura metodă de uscare este îndepărtarea apei cu o creştereminimă a temperaturii. În cazul enzimelor şi a produselor farmaceuticetermostabilitatea este asigurată prin adăugarea de zaharuri sau alţi stabilizatori inerţi.

Pentru a elimina apa sub formă de vapori, energia rezultată în urma încălziriitrebuie transferată prin convecţie, radiaţie, sau ambele procedee combinate şicontrolată strict pentru a nu permite depăşirea pragului de temperatură. Cele maip p p ş p g putilizate tehnici sunt:

• uscare la vacuum • uscare cu jet de gaz • uscare prin îngheţare rapidă

BIOMASA MICROBIANĂ CA SURSĂ BIOMASA MICROBIANĂ CA SURSĂ DE OBŢINERE A PROTEINELORDE OBŢINERE A PROTEINELORDE OBŢINERE A PROTEINELORDE OBŢINERE A PROTEINELOR

IntroducereIntroducere„single„single cellcell protein”protein” (SCP)(SCP) -- o singură proteină celulară -- termen utilizat şi„single„single cellcell proteinprotein (SCP)(SCP) o singură proteină celulară termen utilizat şiacceptat pentru materialul celular microbian folosit ca hrană şi furaj. Termenulnu este în totalitate corect - proteina obţinută ca produs al unui procesbiotehnologic nu este 100% pur. Termenul a fost atribuit ţinând cont de faptulcă o proteină se poate obţine dintr-o varietate de microorganisme mono – şimulticelulare, bacterii, drojdii, fungi filamentoase sau alge

Tabelul 10 Exemple de microorganisme care pot fi

Caracteristica Paecilomycesvarioti

Fusariumgraminearum

Candidautilis

Material uscat (%) 96 94,2 91

Tabelul 10. Exemple de microorganisme care pot fiutilizate ca sursă de obţinere a SCP

Material uscat (%) 96 94,2 91Proteină crudă (% N x 6,25) 55 54,1 48

Grăsimi (%) 1,0 1,0 1,35Cenuşă (%) 5 6,1 11,2Li ină (g/16g N) 6 5 3 5 7 2Lizină (g/16g N) 6,5 3,5 7,2Metionină (g/16g N) 1,9 1,23 1,0Cistină şi cisteină (g/16g N) 1,0 0,75 1,0

IntroducereIntroducereproducerea microorganismelor la scară industrială în vederea obţinerii unor

produse alimentare - în Germania, în timpul Primului Război Mondial -producerea de drojdie „Torula”.

SUA şi Marea Britanie -P i C f i ţă 1967 l I tit t l d T h l i di M h ttPrima Conferinţă - 1967 la Institutul de Tehnologie din Massachusetts;

majoritatea proiectelor prezentate au fost la nivel de cercetare. O singurăprezentare, cea a cercetătorilor de la „British Petroleum” (BP) a scos în evidenţă,aplicaţiile fermentaţiei SCP la scară industrialăaplicaţiile fermentaţiei SCP la scară industrială.

De ce să producem SCP?creşterea cerinţelor pieţei pentru hrană mai sănătoasăfuraje în compoziţia cărora intră proteine înalt purificate printr o tehnologiefuraje în compoziţia cărora intră proteine înalt purificate printr-o tehnologie

avansatăavantajele producerii la scară largă a biomasei microbiene:

rată mai mare de multiplicarerată mai mare de multiplicare,conţinut proteic ridicat (30 – 80% proteine în masă uscată),utilizarea unui număr mai mare de surse de carbon,sitele de cernere se pot construi din materiale mai bune şi relativ uşor,p ş ş ,instalaţiile de producţie ocupă suprafeţe mici şi duc la creşterea randamentului

de producţie,producţia microbiană este independentă de anotimp, variaţii climaterice.

Procesul de obţinere a SCPProcesul de obţinere a SCPEtapele procesului de obţinere a SCP se stabilesc în funcţie de substratul şi organismul utilizat

Figura 44. Reprezentarea schematică a unui proces general de producere a SCP

Procesul de obţinere a SCPProcesul de obţinere a SCPEtape de bază:pe de b :

combinarea fizică şi tratamentul chimic al materiilor prime de bază;prepararea mediului corespunzător care conţine surse de carbon, azot, fosfor, şialţi nutrienţi esenţiali;alţi nutrienţi esenţiali;prevenirea şi contaminarea mediului sau a plantelor;cultivarea microorganismului necesar;separarea biomasei microbiene de mediul consumat;

recuperarea biomasei –spargerea celulelor –

tratamentul final al biomasei cu sau fără etape de purificare finală,îndepărtarea excesului de substrat sau a componentelor acestuia –,reducerea concentraţiei ARN –reducerea concentraţiei ARNtratarea reziduurilor –

se recuperează între 18 şi 45 x 106 litri funcţie de substrat şi microorganism la o producţie de 100.000 t SCP/anp ţ

Selectarea microorganismelorSelectarea microorganismelorCaracteristici de bază ale microorganismul utilizat pentru obţinerea uneiC c e s c de b a e c oo ga s u u a pe u obţ e ea u eanumite proteine:

să nu fie patogenic pentru instalaţie, animal sau om;să aibă o valoare nutriţională bună;să fie acceptat pentru hrană şi furaje;să nu conţină compuşi toxici;producerea la scară largă să necesite costuri minime.

De reţinut: costul de producţie depinde de:viteza şi randamentul de creştere,conţinutul în proteina ţintăconţinutul în proteina ţintă,necesarul de nutrienţi suplimentari,utilizarea unui mediu avantajos,proprietăţile de uscare şi separarep p ţ ş p

Selectarea microorganismelorSelectarea microorganismelorTabelul 11. Compoziţia în aminoacizi a drojdiilor şi a unor alimente selectate

Aminoacid

Conţinutul de aminoacizi (g/16g N) în:

SCPProteine tradiţionale

din componente furajere

Proteine alimentare

T iT i P kilP kil S h iS h i Făi ăFăi ă E t tE t t didi OO R f i ţR f i ţToprinaToprina PekiloPekilo SacharomicSacharomiceses cerevisiaecerevisiae

FăinăFăinădedepeştepeşte

ExtractExtract dindinfasolefasole dede soiasoia

OuOu ReferinţeReferinţeFAOFAO

izoleucină 5,1 4,8 4,6 4,6 5,4 6,7 4,2

leucină 7,4 7,4 7,0 7,3 7,7 8,9 4,8, , , , , , ,

fenilalanină 4,3 4,0 4,1 4,0 5,1 5,8 2,8

tirozină 3,6 3,5 - 2,9 2,7 4,2 2,8

treonină 4,9 4,1 4,8 4,2 4,0 5,1 2,8

triptofan 1,4 1,1 1,0 1,2 1,5 1,6 1,4

valină 5,9 5,1 5,3 5,2 5,0 7,3 4,2

arginină 5,1 5,3 - 5,0 7,7 - -

histidină 2,1 1,9 - 2,3 2,4 - -

lizină 7,4 6,5 7,7 7,0 6,5 6,5 4,2

cisteină 1,1 1,0 - 1,0 1,4 2,4 2,0

metionină 1,8 1,9 1,7 2,6 1,4 5,1 2,8

aminoacizi cusulf

2,9 2,9 - 3,6 2,8 7,5 4,8

Selectarea microorganismelorSelectarea microorganismelor

Algele –genurile Chlorella, Scenedesmua sau SpirulinaAlgele genurile Chlorella, Scenedesmua, sau Spirulina.cresc prin procedee fotosintetice şi autotrofice sau heterotroficcultivare la scară largă - în eleştee deschise, la lumina soarelui.Probleme:Probleme:

Risc crescut de contaminare,densitate celulară mică,alge unicelulare → costuri ridicate pentru procedeele de recoltarealge unicelulare → costuri ridicate pentru procedeele de recoltare

compoziţia în proteineconţinutul total de proteine native (ntotal x 6,25) ≥60% → profilul în

aminoacizi al SCP este în general bunaminoacizi al SCP este în general bun.algele cu un conţinut bogat de pigmenţi fotosensibili → la producerea de SCPpentru furaje, dar nu şi pentru alimente.

i l l tili t t bţi d t i diti d î t ţimicroalgele- utilizate pentru obţinerea de proteine aditive, dar nu în concentraţiemare şi în anumite condiţii de calitate.incorporarea algelor Chlorella şi Scenedesmus în dieta umană → numeroase

bl S i li f d ili ăprobleme; Spirulina este foarte des utilizată


Bacteriile –rată mare de creştere,numărul de bacterii utilizate în producerea de SCP este în continuă creşterestandard ridicat de sterilitate în întreg procesul tehnologicrecuperarea bacteriilor prin centrifugare este o problemă - noi metode care săp p g ppermită omorârea acestora şi nu deversarea în mediuconţinut proteic de aproximativ 80%,conţinut ridicat de ARN care trebuie îndepărtatţ pprofilul în aminoacizi al SCP este în general bun; câteodată prezintă unconţinut mic de aminoacizi cu sulf


Drojdiile –genurile Saccharomyces, Torulopis şi Candidaviteza mare de creştere a culturilorviteza mare de creştere a culturilorrisc redus de contaminare cu agenţi patogenirecuperare – din reziduuri, uşor, prin centrifugare continuă.conţinutul în proteine este de aproximativ 55 60%conţinutul în proteine este de aproximativ 55-60%,conţinutul în acizi nucleici este >15% din greutatea de bază (este necesară oetapă de reducere a concentraţiei acestora)

fil l i i il di t t SC î l bprofilul aminoacizilor din structura SCp - în general bun

Selectarea microorganismelorSelectarea microorganismelorFungii filamentoşi –

sistem de cultivare - culturi în suspensie sub formă de filamente sau de pelete,viteză de creştere mai mică decât a bacteriilor şi drojdiilor; microfungii pot

atinge o viteză de creştere apropiată de cea a drojdiilorg ş p p jrisc redus de contaminare cu agenţi patogeni (cresc la un domeniu de ph mai

larg, între 3 şi 8 ceea ce permite cultivarea lor la ph 5)risc de contaminare cu drojdiijrecuperarea fungilor - filtrare.conţinutul în proteine variabil; 50 – 55% din total substanţă uscată.conţinut în ARN - până la aproximativ 15% din masa uscată,conţinut în ARN până la aproximativ 15% din masa uscată,conţinut în chitină - până la aproximativ 15% din masa uscatăprofilul aminoacizilor din structura SCP – bună (săracă în aminoacizi cu sulf)

Alegerea substratuluiAlegerea substratului

Sursele de compuşi cu conc. mici de carbond ă i “f il ”două grupuri: - “fosile”

- “reînnoite”


( )Hidrocarburi lichide –n-alcanii (saturaţi, cu catenă liniară) C9 - C180 -30 % în uleiurile naturale şi în kerosenbenzina - numai 10% fermentează, restul trebuie recuperat, separat de SCP, şi

returnat la rafinărie pentru o procesare ulterioară- posibilă contaminare cu policicluri aromatice

transferul n-alcanilor C10 – C18 în celulă –macro – emulsia care este transformată într-o micro – emulsie →

obţinerea agenţilor de emulsionare - surfactanţisursă de energie şi carbon -Compania „Britisch Petroleum” (BP) - două procese de producţie:

benzinan-alcanii puri.„Toprina” - produs omologat de BP şi comercializat

Instalaţie de cultivare a Candida utilizând ca substrat benzina


Hidrocarburile gazoase –cel mai des utilizat este metanulavantaje:

•disponibil la puritate mare;• uşor îndepărtat în urma procesului de fermentaţie• nu lasă reziduuri;• cultivare continuă → randament bun, productivitate ridicată

probleme de producţietransferarea a două gaze – metan şi oxigenformarea în mediu a unor produşi de inhibiţieexplozie dacă concentraţia de oxigen depăşeşte 12% (v/v)foarte costisitor

microorganisme capabile să utilizeze metanul ca substrat - bacteriilePseudomonas methanica, Methanomonas methanica, bacteriile termofileMethylococus capsulatus şi Pseudomonas methanitrificans.y p f


Metanol - alternativă a producerii de biomasă din metanse fabrică din metan prin conversie salvându-se astfel surplusul de gaz

natural, dar şi din alte surse cum ar fi cărbunele, motorina, lemnul şi naftalinaeste utilizat de bacteriile metanifere şi de Methylomonas methanolica,

Pseudemonas utilis, Pseudomonas extorquens, hydromicrobium sp;actinomicite: Streptomyces sp, drojdii Hansenula polymorpha, Candidaboidinii, Torulopsis glabatra.

avantaje:jperfect solubil în apă,puţine posibilităţi de explozie,numărul de microorganisme care poate fi cultivat este mareg p

produs de Imperial Chemical Industries Ltd (ICI) (UK) → bacteriaMethylophilus methylotrophus

P li h id hid li l l i id l


Polizaharide hidrolizate – celuloza şi amidonulhidoliza se poate realiza enzimatic sau prin tratament acidceluloza - hidroliza se realizează sub acţiunea celulazei din fungi, ca de exemplu

Trichoderma viride- proces scump

amidonul - procesul tehnologic este prea scump- Rank Hovis McDougall (RHM) → proces bazat pe hidroliza amidonului;

ca microorganism a fost selectat mucegaiul Fusarium graminearum- pus în fabricaţie sub denumirea de „Mycoprotein”- dezavantaj - se transformă în gelatină- se preferă creşterea microorganismului pe materiale solide, în absenţa

lichidelor - „fermentaţie semi-solidă”

DIGESTIA ANAEROBĂDIGESTIA ANAEROBĂ111. 1. IntroducereIntroducere

Definiţie: procesul anaerob de producere a metanului şi a dioxidului de carbondi t i l i i tili i t d i idin materiale organice prin utilizarea unui amestec de microorganisme.

Fermentaţia - proces catabolic anaerob în care energia se obţine în urmadegradării compuşilor organici care pot fi atât donori cât şi acceptori dedegradării compuşilor organici care pot fi atât donori cât şi acceptori deelectroni.

- microorganisme anaerobe şi facultativ anaerobe,- substraturi: polizaharidele (celuloză, amidon, chitină),substraturi: polizaharidele (celuloză, amidon, chitină),

dizaharidele (zaharoză, lactoză, manoză), hexozele (glucoză, fructoză,galactoză), pentozele, polialcoolii (glicerol, manitol), aminoacizi, aciziorganici, purine şi pirimidine.

- produşi: alcooli, acizi, esteri şi diferiţi compuşi în staregazoasă (H2, CH4, CO2).

- beneficii comerciale: producerea de energie, reducereapoluării şi controlul diferitelor mirosuri

2.2.Caracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobeCaracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobe2 1 Interacţii specifice2.1. Interacţii specifice

realizarea unui complex omogen interdependent de culturi bacteriene;formarea metanului, acetatului, H2 şi CO2:

b t ii tili ă ă li it t d b t t i• bacterii utilizează un număr limitat de substraturi• acţiunea bacteriile fermentative şi hidrolitice asupra deşeurilor organice → substratele metanogene;• producerea H :• producerea H2:

- bacterii fermentative- bacterii acetogenice → acetat + H2- bacterii metanogene → CH4 + CO2bacterii metanogene CH4 CO2

• avantajele metodei:- organismul introdus în bioreactor poate utiliza protonii sau acceptorii de electroni generând H22- H2 poate fi utilizat de bacteriile metanogene

• presiunea parţială scăzută a H2 permite creşterea bacteriilor pe substrate reduse

-Bryant (anii ’60) → cultură pură de methanobacillus omelianskii• probleme: dificil de identificat speciile de microorganisme din bioreactor

2.2.Caracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobeCaracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobeConcept: în toate procesele de digestie care utilizează ca substrat deşeuri complexe întâlnim toate grupurile de microorganisme troficeîntâlnim toate grupurile de microorganisme trofice

anii ’60: o cultură pură de metanogene poate utiliza ca sursă de energie unpoate utiliza ca sursă de energie un număr limitat de compuşi;anii ’80: McInerney şi col. -clasificarea taxonomică a metanogenelor - toate gspeciile pot obţine energie în urma reacţiei:4H2 + CO2→CH4 + 2H2O ∆G0’ = - 139 kJmol-1

Figura 47 Populaţia microbianăFigura 47. Populaţia microbiană prezentă în bioreactorul de digestie

3. 3. Tipuri de bioreactoare de digestieTipuri de bioreactoare de digestiedeşeurile produse într-o fermă obişnuită;i t l ţii b t t it di t i l l l t f ţiinstalaţii robuste, construite din materiale locale, care pot funcţiona

în sistem batch sau continuu, prin alimentare cu deşeuri o dată pe zi;nu sunt încălzite, sunt amestecate manual şi sunt izolate cu materiale

locale

Bioreactoare clasice:

locale

Bioreactoare batch:

bioreactorbioreactor cece funcţioneazăfuncţionează înîn sistemsistem continuu,continuu, cucu agitareagitare (CSTRCSTR ––„continuously„continuously stirredstirred tanktank reactor”reactor”)

este un sistem continuu în bioreactor va exista în permanenţă un amestecformat din deşeuri noi care se adaugă, material nedigerat şi câteva populaţiimicrobiene active;

i tăexistă:bioreactoare tubulare numite „plug flow”bioreactoare în care are loc reţinerea microorganismelor

este necesar un vas de stocare a gazului;este necesar un vas de stocare a gazului;întâlnit în tratamentul noroiurilor

4.4.Tipuri de Tipuri de deşeuri utilizate ca substratdeşeuri utilizate ca substrat

în funcţie de consistenţă: deşeuri de consistenţă joasă,medie şicrescută şi

d i lid

Clasificare

deşeuri solide.în funcţie de conţinutul în masă uscată de substanţe solide (TS):

0,2 –1%, 1 5% 5 12%1-5%, 5-12% 20-40% substanţă solidă.

Metode

determinare volatilităţii solidului (VS) care implică încălzirea materialului uscatla 500 0C pentru a îndepărta materialul organic ca CO2 şi

determinarea necesarului de oxigen (COD „chemical oxigen demand”) care înmod uzual se aplică deşeurilor cu o consistenţă mare şi implică o oxidare chimicăcantitativă a materialului organic.BOD5 „biochemical oxygen demand measused over a 5-day period”,TOC t t l i b ” tili tă t t i l l l bilTOC „total organic carbon” – utilizată pentru materialele solubile.

4.4.Tipuri de Tipuri de deşeuri utilizate ca substratdeşeuri utilizate ca substrat

Caracteristici: di d t b t l ţi i t i ţi d bi iCaracteristici: un mediu de creştere bun pentru populaţie şi nutrienţi - de obiceise utilizează un raport între atomii de C şi N de 40:1;

un pH care să varieze în jurul lui 7;trebuie notată concentraţia potenţialilor inhibitoritrebuie notată concentraţia potenţialilor inhibitori

industriale şi alimentare –Surse de deşeuri:

industriale şi alimentare –bălegarul animal –biomasa agricolă –deşeurile din apele reziduale orăşeneştideşeu e d pe e e du e o şe eş

5. 5. Parametri digestieiParametri digestieibacteriile mezofile : 20 – 250C şi 40 – 450Cbacterii termofile 50 – 550C şi 60 – 650C pentru,trecerea de la temperatura mezofilă la cea termofilă care poate fi

accidentală şi pentru o scurtă perioadă de timp poate duce lal i i l i d d l i â ă ă â i

Temperatura:Temperatura:prelungirea timpului de producere a gazului cu câteva săptămâni.

similar în cazul adaptării populaţiilor mezofile la condiţiile detemperatură termofile.

digestia termofilă este mai puţin stabilă;digestia termofilă este mai puţin stabilă;avantaj - distrugerea patogenilor şi a animalelor parazite

Timpul de reţinere a apeiTimpul de reţinere a apeiTimpul de reţinere a apeiTimpul de reţinere a apeiTimpul de reţinere hidraulică (HRT) = perioada de timp cât lichidul rămâne în bioreactor;

Volumul bioreactoruluiHRT =

Volumul de deşeuri adăugate zilnicIndicele de încărcare a bioreactorului Indicele de încărcare a bioreactorului --Acizii graşi volatiliAcizii graşi volatili -Digestia în două etape Digestia în două etape --

6. 6. Obţinerea acizilor organici şi a aminoacizilorObţinerea acizilor organici şi a aminoacizilor22 IntroducereIntroducere

Acizi organici: acidul citric, gluconic, itaconic, 2-cetogluconic,eritorbic, tartaric, lactic şi acetic şi acizii graşi volatili;Aminoacizi: acidul L glutamic L lizina acidul L aspartic LAminoacizi: acidul L-glutamic, L-lizina, acidul L-aspartic, L-triptofanul şi D-arilglicina (care este folosită în producereasemisintetică a penicilinei);cei mai importanţi sunt acidul citric acidul glutamic şi lizinacei mai importanţi sunt acidul citric, acidul glutamic şi lizina.

Produs Unităţi Producţia totală

Tabelul 12. Producţia mondială a principalilor acizi de fermentaţie

($/kg) (t/an)

Acid glutamic 3,5 – 4,0 300 000

Acid citric 1,5 300 000

Lizină 5,0 – 5,5 40 000

Acid lactic 1,0 – 1,5 40 000

IntroducereIntroducere

Aspecte de urmărit:

1. Procesele chimice de obţinere a unor astfel de compuşi competiţioneazăcu căile metabolice, ultimele fiind mai eficiente şi mai economice;

2 f i fi i ă ă l i2. pentru o fermentaţie eficientă este necesară alegerea cu atenţie aorganismului, a speciei sau a mutaţiei şi a căii de creştere în condiţiinutriţionale corecte, deoarece preţul de cost al procesului biotehnologicdepinde de costurile utilizării substratelor;

3. în cazul majorităţii proceselor fermentative de obţinere a produşilorchimici este necesar un control real al tuturor condiţiilor de fermentare şichimici este necesar un control real al tuturor condiţiilor de fermentare şide recuperare a produsului finit;

4. în toate cazurile un proces biotehnologic de succes este acela în cared l t bţi t î t ţi d ită l it t i ă i d ăprodusul este obţinut în concentraţia dorită, la puritatea maximă şi după

un proces de recuperare mai puţin laborios.

AplicaţiiAplicaţiiAcidul citric

este obţinut primordial din sucul de lămâie sau citrice;este obţinut primordial din sucul de lămâie sau citrice;o producţie mondială de 300 000 t/an;agent de acidulare a sucurilor şi produselor de

cofetărie,agent de complexare, de reducere a proceselor, g p , poxidative şi de decapare a metalelor. organism de fermentare- mucegaiul din rasa Aspergillus niger şi câteva rase dedrojdii;

substrate: melasa din sfeclă, sucroza, melasa din tulpină detrestie, sau sirop de glucoză purificat din porumb;

n-parafină şi rase de Candida sau alte drojdii -i d i ii l i d il li ineeconomice datorită creşterii preţului produşilor petrolieri;

nu au fost aplicate la scară largă

Mecanismul biochimic care stă la baza obţinerii acidului citric din AspergillusMecanismul biochimic care stă la baza obţinerii acidului citric din Aspergillusniger nu este pe deplin elucidat, dar se ştie că implică o versiune incompletă ametabolismului acizilor tricarboxilici.

AplicaţiiAplicaţii

Figura 48. Formarea acidului citric. Linia punctată indică punctele de control ale procesului


Figura 49. Reprezentarea schematică a unui proces tehnologic, submers de obţinere aacidului citric din melasă.


Acidul gluconic Aplicaţii:agent de complexareagent de complexare,medicina veterinară,eliberarea de lungă durată a acidului în procesul de coacere

Obţinere:Obţinere:oxidarea electrolitică a glucozeioxidare cu aer sau oxigen pe catalizator de platinăprocese fermentative - ca substrat A. Nigeroxidare catalitică a glucozei - glucozoxidază imobilizată

Etape:Obt. substratului:

glucozoxidazaGlc glucono –δ-lactonei ac.gluconicgluconolactonaza

Fermentaţia:mediulmediul: sol. de Glc monohidratată (amidon hidrolizat), nutrienţi (sursă de N, PO43-, Mn2+, elem.min), lichior moale de cereale (extract de drojdii)inoculinocul: spori de A.niger (inocul vegetal)t i d f t ţit i d f t ţi

acidul gluconic; gluconatul de calciu, glucono-δ-lactona

tancuri de fermentaţietancuri de fermentaţieRecuperarea


Acidul tartricAplicaţii:

acidifiant în industria alimentarăObţinere: acid tungstic

sinteză chimică: acidul maleic + apa oxigenată amestec racemicintermediar: formarea acid. cis-eposuccinic, stoparea reacţiei prin

controlul temperaturii.di id il l l d d i l i

g

din reziduurile acumulate în vanele de producere a vinuluimetoda fermentativă

specii de Acetobacter capabile să producă alături de 5 –cetoglutarat şicantităţi mici de acid tartric dar numai în anumite condiţiicantităţi mici de acid tartric, dar numai în anumite condiţii.

în anii ’80, Yamada şi colab. - mutanţi de Gluconobacter suboxydanshidroliza enzimatică - rezultatele nu au depăşit nivelul de staţie pilot

- hidroliza stereospecifică a cis-eposuccinatului (bacterii)hidroliza stereospecifică a cis eposuccinatului (bacterii)- trecerea celulelor spălate sau a extractului apos de celule peste unsubstrat de cis-eposuccinat

produs în soluţie: îndepărtarea celulelor sau a enzimei imobilizate.p ţ pRecuperare

sub formă de tartrat de calciu; fosfatul de calciu; săruri insolubile de calciu

AplicaţiiAplicaţiiAcidul lactic

A li ţiiAplicaţii:ind. alimentară – acidifiantmedicinăalte industriialte industrii

Obţinere:proces de fermentare anaerobă;

Procese fermentative heterolactice: produşi finali – lactat, etanol, dioxid deProcese fermentative heterolactice: produşi finali lactat, etanol, dioxid decarbon şi eventual acetat;

Figura 50. Calea fosfoketolazei

AplicaţiiAplicaţiiFosfoketolazaFosfoketolaza – Ba. heterofermentative Lactobacillus şi Acetobacter

- acţionează asupra glucidelor fosforilate C5 şi C6 acetil fosfat şiacţionează asupra glucidelor fosforilate C5 şi C6 acetil fosfat şi gliceraldehid 3 fosfat sau eritrozo 4 fosfat.

- se formează acetil fosfat etanol cu regenerarea NAD+;acetat printr-o reacţie care produce ATP;p ţ p

-gliceraldehid 3 fosfat piruvat lactat- este prezentă şi la drojdii: xiloza xilitol xiluloză xilulozo 5 P

- la Ba. care cresc pe xiluloză: xiloză xilulozăizomerazăp- calea C5-fosfoketolazei nu înlocuieşte glicoliza dar oferă

organismului o cale eficientă de convertire a pentozelor la unităţi C2 şi C3 pentru metabolizarea lor ulterioară

Procese fermentative homolactice - Lactobacillus bulgaricus şi L. delbrückii. - substrat: - lactoză (zer), glucoză (sirop), sucroză în stare pură sau din melasă de sfeclă;- proces clasic anaerob: dizaharidele hexoze piruvat acidul L(-) lactic-nutrienţi: carbohidraţi, nutrienţi anorganici, surse de azot (organic; anorganic –lichior din tulpină de cereale malţ de muguri extract de drojdii) vitaminelichior din tulpină de cereale, malţ de muguri, extract de drojdii), vitamine

AplicaţiiAplicaţiiEtape: - prima etapă: formarea suspensiei active de Lactobacillus care creşte până ajunge la faza de inoculum vegetativ- parametri fermentaţiei: proces continuu; vase mari din inox sau lemn; fără agitare; 6 – 7 zile; temp. diferite (Ba. L. Delbrückii – > 500C, Ba. L. bulgaricust < 440C) fă ă t ă li i ă d t ili di l i H [5 8 6 0]

P d fi l

temp < 440C) fără etapă preliminară de sterilizare a mediului; pH = [5,8 – 6,0]; η = 80 – 90g acid lactic/100g carbohidraţi.

Produs final;prin încălzirea şi concentrarea produsului final de fermentaţie se obţin doi produşi

secundari de condensare, acidul lactoillactic care este un produs liniar şi dilactida care este un produs ciclic Cei doi produşi împiedică formarea acidului lacticcare este un produs ciclic. Cei doi produşi împiedică formarea acidului lactic cristalin în formă pură;

Recuperarea acidului lactic -lactatul este tratat cu acid sulfuric; se precipităRecuperarea acidului lactic lactatul este tratat cu acid sulfuric; se precipităsulfatul de calciu împreună cu organismul microbian utilizat care sunt îndepărtateprin filtrare. Soluţia de acid lactic este tratată la temperatură înaltă cu cărbune activ,filtrată şi evaporată în vederea concentrării până la aproximativ 50%, sau este trecutăpe o coloană cu schimbători de ioni, sau extrasă cu solvenţi organici şi apoievaporată.

AplicaţiiAplicaţiiAcidul acetic şi alţi acizi volatili

se produce în principal din petrol; nu prin proces de vinificare ( oxidarei bi ă t l l i l id ti )microbiană a etanolului la acid acetic).anii ‘80 - noi procese de fabricare a acidului acetic şi a altor acizi alifatici

volatili (VFAs), prin fermentarea anaerobă a materialelor celulozice şi a altordeşeurideşeuri.

Mecanismul de acumulare a VFASubstratSubstrat - deşeurile celulozice sunt hidrolizate la glucoză de către celulaze

care sunt produse de bacteriile anaerobe. Din glucoză se obţine acid acetic şicare sunt produse de bacteriile anaerobe. Din glucoză se obţine acid acetic şiacid butiricun mol de glucoză trei moli de acid acetic

CulturaCultura - amestec de bacterii anaerobe (Clostridium thermocellum, C.(Thermoaceticum)

- amestec de organisme obţinute printr-un procedeu de selecţie dinape uzate (de ex. două tipuri de organisme unul care converteşte materialulorganic la VFA şi altul care converteşte VFA la metan şi dioxid de carbon)

MecanismMecanism – prezentat în figura 51InstalaţiaInstalaţia industrialăindustrială - tancuri cu deschidere mare, închise din care aerul sel d î ţă A t li ă j t l i it texclude în permanenţă. Amestecarea se realizează cu ajutorul unui agitator

mecanic. Procesul are loc continuu, recircularea parţială a organismelor fiind înavantajul creşterii vitezei de conversie şi a cantităţii de biomasă.


Figura 51. Calea de formare a VFA din glucoză (reprodusăglucoză (reprodusă după Zeikus, J. G., 1980, Ann. Rev.Microbiol., 34, 423-464)464)


L-lizina

diferite procedee chimice sau enzimatice;cel mai eficient d.p.d.v. economic – procesul de fermentaţie (Toray Industries -

L lizina

p p ţ ( yPatent englezesc 1334970 şi 1352860).

substratsubstrat - n-parafină, acizi alifatici şi alcooli;MecanismulMecanismul dede acumulareacumulare a L-lizinei.

Figura 52. Mecanismul de acumulare a L-lizine. Linia punctată reprezintă căile de

inhibiţie.


Fermentare aerobăFermentare aerobă, - reactor cu agitare aerat- pH sistemului este menţinut neutru,p ţ ,- temperatura -280C. - inocul – cantit. mică; creştere pe agar turnat în pantă, timp de 6 ore, într-un proces discontinuu, 40 – 45 g L-lizină/litru atunci când se pleacă de la o concentraţie de melasă de 200 g/l (100 g zahăr);

d l i fi lRecupereaRecuperea produsului final: - acidifiere cu HCl- trecere pe o coloană schimbătoare de ioni în care au fost grefate grupări amoniumgrefate grupări amonium- eluare cu HCl, - cristalizarea L-lizinei hidroclorice


Figura 53. Schema operaţiilorprincipale din procesul de izolare şiprincipale din procesul de izolare şipurificare a L-lizinei din mediile debiosinteză


Figura 54. Schema tehnologică deobţinere a L-lizinei de uz farmaceutic.1- vas preparare mediu, 2- pompăîncărcare, 3- vas de fermentaţie, 4,12-rezervor HCl 5- debimetru HClrezervor HCl, 5 debimetru HCl,6,9,15,17,19- pompă centrifugă, 7-filtru rotativ cu raclare, 8- vas tampon,10- rezervor lichid de fermentaţie, 11-

NH 13 d bi 14rezervor NH3, 13- debitmetre, 14-coloană schimbători de ioni, 16-concentrator, 18- vas dizolvare şipurificare, 20- cristalizor, 21- filtrup , ,Nutsche, 22- uscător

PRODUCEREA DE ANTIBIOTICEPRODUCEREA DE ANTIBIOTICEIntroducereIntroducereIntroducereIntroducere

cele mai importante produse comerciale obţinute prin biosinteză;substanţe chimice care sunt produse de microorganisme şi omoară sau inhibă creşterea altor

microorganisme.produşi secundari de metabolism, în majoritatea cazurilor, fiind produse prin fermentaţii

microbiene din tulpini bacteriene al căror potenţial de biosinteză este relativ scăzut.La început, erau produse din fungi filamentoşi sau bacterii din grupa actinomicetelor

Antibioticul Microorganismul producător Tipul de microorganism

Tabelul 13. Cele mai importante antibiotice comerciale şi tulpinile microbiene din care se produc

g p p g

Bacitracină Bacillus licheniformis Bacterii sporulate

Cefalosporină Cephalosporium sp. Fungi

Cloramfenicol Streptomyces venezuelae (nu se mai foloseşte)Sinteză chimică

-

Ci l h i idă St t i ti i tCicloheximidă Streptomyces griseus actinomicete

Cicloserină Streptomyces orchidaceum actinomicete

Eritromicină Streptomices erythreus actinomicete

Kanamicină S. lincolnensis actinomicete

Neomicină S. fradiae actinomicete

Nistatină S. noursei actinomicete

Penicilină Penicillium chrysogenum fungi

Streptomicină S. griseus actinomicete

Tetraciclină S. rimosus actinomicete

IntroducereIntroducereClasificare - în funcţie de structura lorClasificare în funcţie de structura lorchimică şi de proprietăţileantibacteriene

Tabelul 14. Clasificarea antibioticelor în funcţie de structura lor chimicăîn funcţie de structura lor chimică

Realizarea unui proces Realizarea unui proces de producţiede producţie Tipul operaţiei Etapele procesului Accesorii

i filiLiofilizareUscare pe silicagel în pantăStocare în N2 lichid

Stocarea culturiiImprovizarea instalaţieiDezvoltarea metodelor

< 10L

Tabelul 16. Reprezentareaschematică a etapelor cheie

< 10LFlaskuriVase de inox pentru inocul

Prepararea inocululuiTeste de contaminarePreparea mediului

Fermentatoare din inox Prepararea mediuluipdintr-un proces deproducţie de antibiotice

< 20m3

Etapa de fermentare

Derularea procesuluiTeste de contaminareMonitorizarea parametrilor biochimici şi icrobiologicg

Fermentatoare de inox de10 – 100 m3

Etapa finală de fermentare

Prepararea mediuluiDerularea procesuluiTeste de contaminareMonitorizarea parametrilor biochimici şi icrobiologic

FiltrareCentrifugareExtracţia din bulion

hrănirea

Teste de contaminareMonitorizarea parametrilor biochimici şiExtracţia din bulion parametrilor biochimici şi icrobiologic

Extracţia şi purificarea

Procedeul tipic utilizat la producerea unui antibiotic nou

i i lpre-necesitate esenţială • instalaţie performantă• creşterea eficienţei procesului de producţie• modificarea continuă a condiţiilor de lucru• modificarea continuă a condiţiilor de lucru• introducerea de noi tehnologii şi instalaţii de producţie

creşterea culturii•creşterea pe mediu de cultură solid sau lichidcreşterea pe mediu de cultură solid sau lichid •formarea inoculului•transferarea inoculului în mediul de fermentaţie• fermentatia•limitarea creşterii•adăugarea unui nutrient cheie care modifică calea metabolică•modificarea căilor metabolice obţinerea unei cantităţi mari de produs secundar•păstrarea culturilor:•pentru o eventuală inoculare

l i lt b t i l•se vor lua una sau mai multe probe pentru inoculare.

Procedeul tipic utilizat la producerea unui antibiotic nou

fermentaţia –• alimentare continuă•controlul permanent al condiţiile de cultivare şi de fermentaţiel fâ i l f i i b li l i ibi i l i i l•la sfârşitul fermentaţiei bulionul conţine antibioticul, microorganismul

utilizat şi un număr mare de alte componente chimice ale mediului decultură•antibioticul o componentă minoră din compoziţia bulionului ( între 3 şi•antibioticul - o componentă minoră din compoziţia bulionului ( între 3 şi35%)

recuperarea şi purificarea:•separarea de faza lichidă prin filtrare şi centrifugaresepararea de faza lichidă prin filtrare şi centrifugare• extragerea antibioticul direct din bulionul de fermentaţie• extracţia în solvenţi,•cromatografie de schimb ionic,g ,•ultrafiltrare,•osmoză inversă •precipitare•cristalizare• uscare

Producerea penicilineiRealizarea unui proces de producţieRealizarea unui proces de producţie

Penicilina G - primul antibiotic descoperit- activă faţă de Ba gram pozitive-structura de bază - acidul 6-aminopenicilanic (A-6-AP) format dintr-un inel

i lidi i d i l ltriazolidinic condensat cu un inel β-lactam- penicilinele naturale se formează prin fermentaţie- peniciline de biosinteză se formează prin adăugarea controlată în mediul a catenei laterale a nucleului β lactamlaterale a nucleului β-lactam - 100 de tipuri de peniciline de biosinteză- penicilina G şi V sunt comercializate

-producerea industrială: procesul fermentativ a fost cuplat cu un proces de sinteză chimică

-penicilina G obţinută prin fermentaţie scindată chimic sau p ţ p ţenzimatic (penicilinaza) La acidul 6-aminopenicilanic obţinut printr-un proces de condensare se adaugă catena laterală care diferă de cea a penicilinei G şi care în acest fel conferă penicilinei proprietăţi antibactericide noi- materia primă – lactoza, glucoza, ac. lacitc

Figura 55. Profilul tipic al producţiei de antibiotice prin fermentaţie cu indicarea concentraţie limită a unui nutrientd ca ea co ce t aţ e tă a u u ut e t

Prepararea inoculului• monitorizarea creşterii pentru realizarea unei transferări eficiente ainocululuiinoculului•transfer în timpul creşterii logaritmice• metode de apreciere a creşterii şi a activităţii metabolice• analizarea prezenţei altor organismeanalizarea prezenţei altor organisme• în cazul de contaminare inoculul este transferat în fermentator• când condiţiile de creştere sunt optime se realizează transferul unui volumcuprins între 0,1 şi 20% din volumul final de fermentare.p , ş

Fermentaţiaf i l l iformarea inoculului• aclimatizarea microorganismelor producătoare de antibiotice la noile condiţii dedezvoltare• cantităţi mici din linia celulară sunt amplificate prin creştere pe medii solide sau• cantităţi mici din linia celulară sunt amplificate prin creştere pe medii solide saulichide.• cultivare pe medii solide• în funcţie de proces, suspensia de spori trebuie să fie utilizată în câteva zile, înîn funcţie de proces, suspensia de spori trebuie să fie utilizată în câteva zile, încaz contrar este posibil să se formeze conglomeratele

Fermentaţia

•transferarea suspensiei din bioreactorîn container se realizează la o presiune

i l b i ă fimare containerul trebuie să fiemetalic

Figura 56. Sistem de transfer al suspensiei de spori din containerul de păstrare în bioreactorul de fermentare

suspensia de spori este trecută în bioreactorul de fermentare:

Instalaţia de fermentaţie

•prin tubulatură unde sterilizarea are loc cu aburi sub presiune•suflare în vasul de fermentaţie utilizând aer steril;•dacă tubul de transfer este suficient de larg iar vasul de fermentared i i d i fi lă ă ă i î l d f idepresurizat suspensia de spori poate fi lăsată să intre în vasul de fermentaţiesub propria forţă gravitaţională;•tubul trebuie un timp suficient pentru răcire•risc mic de contaminare a suspensiei de spori•risc mic de contaminare a suspensiei de spori

Deşi vasele de realizare a mediului şi de sterilizare nu sunt esenţiale în procesultehnologic, atâta timp cât mediul poate fi în condiţii submerse (batched) iarg p p ţ ( )sterilizarea se realizează direct în vasul de fermentare aceste vase sunt inclusepentru a obţine un preţ de cost mai mic prin asigurarea condiţiile optime defermentaţie. Un singur vas „batcheing” şi un sterilizator pot servi unui număr maimare de fermentatoare, permiţând astfel fiecărui fermentator să fie utilizat lamaximum pentru producerea antibioticului dorit. Scurtarea timpului între procesefermentative succesive permite realizarea unui număr mai mare de procesef t ti â d tf l tit t d tibi ti bţi di fifermentative pe an, crescând astfel cantitatea de antibiotic care se obţine din fiecarefermentator.


Criterii pentru alegerea fermentatoarelor:•trebuie să asigure transferul de gaz şi lichid;•un transfer al nutrientului între faze;f t t l t ă t i t•fermentatorul este prevăzut cu un sistem

de agitare performant;•fermentatorul trebuie să asigure un transfer bun de energie;transfer bun de energie;•este esenţial să ne asigurăm că organisme nedorite nu pătrund în vasul de fermentare, mai ales acum cândde fermentare, mai ales acum când organismele sunt modificate genetic şi prin natura lor pot deveni poluante sau pot afecta sănătatea lucrătorilor;p•pentru a asigura condiţiile aseptice fermentatorul trebuie să fie presurizat;

Figura 57. Reprezentarea schematică a unei instalaţii tipice de fermentare a antibioticelor


Fermentatoarele:•volum - 30 - 200 m3.•fabricate din oţel foarte bine finisat

i t ipe interior• înălţimea - de 2 - 4 ori mai maredecât diametrul• 4 – 6 sisteme de întârziere a• 4 – 6 sisteme de întârziere afermentaţiei, fixate de pereţi.•sistem de cuţite (BLANDERE)orizontale (Rushton) sau sistemul( )de agitare cu aer sub presiune.

Figura 58. Fermentatorul tradiţional utilizat la producerea de antibiotice

Etapa de creştere

ac m larea de biomasă miceliană•acumularea de biomasă miceliană•utilizarea intensivă a componentelor mediului de cultură;•necesarul de oxigen este maxim;•activitatea respiratorie (eliberarea de dioxid de carbon) este ridicată;activitatea respiratorie (eliberarea de dioxid de carbon) este ridicată;•pH optim de 4,5 – 5,0

Etapa de producere a antibioticului

Caracteristici:• încetinirea creşterii miceliului,• scăderea consumului de oxigen, •menţinerea pH la valoarea optimă,•acumularea de penicilină

miceliul foloseşte nutrientul şi produce energia necesară bioprocesului.•asigurarea necesarului de substanţe minerale

ţi t t ii ti•menţinerea temperaturii optime

Etapa de producere a antibioticului

Factori de care depinde gradul de acumulare al antibioticului:

•potenţialul productiv al tulpinii•potenţialul productiv al tulpinii•folosirea unor constituenţi adecvaţi şi a unui echilibru corect în proporţiile acestora•menţinerea pH în condiţii optimemenţinerea pH în condiţii optime•raport corect între diferitele surse de carbon•adăugarea de precursori care vor determina tipul de antibiotic ce urmează a se forma•asigurarea necesarului de substanţe minerale•menţinerea temperaturii optime

În practica industrială nu este permisă prelungirea fermentaţiei până la faza de autoliză!

Etapa autolitică

până la faza de autoliză!

• când microorganismul se epuizează ca urmare a activităţii metabolice prelungite sursele de carbon din mediu sunt consumate şi conţinutul de azotprelungite, sursele de carbon din mediu sunt consumate, şi conţinutul de azot scade. pH creşte peste valoarea optimă. În acest punct încetează producerea de antibiotic şi se induce procesul de hidroliză alcalină a antibioticului dejaformat.• Controlul fermentaţiei se realizează prin determinarea sterilităţii mediului, gradului de dezvoltare morfologică a microorganismului, pH mediului, concentraţiei deantibioticului din mediul de cultură şi a consumului de glucide. Probele se iau la intervale regulate de timp iar procesul se consideră terminat atunci când conţinutul în sursă de carbon al mediului ajunge la 0,2 –0,6% iar concentraţia soluţiei rămâne practic nemodificată.

C i ibi i l i î l i i ă d i d d i l l d i• Concentraţia antibioticului în soluţia nativă depinde de potenţialul productiv al tulpinii şi de respectarea condiţiilor optime de fermentaţie.

ENENZIMELE ŞI PRODUCEREA LA ZIMELE ŞI PRODUCEREA LA SCARĂ LARGĂ A ACESTORASCARĂ LARGĂ A ACESTORA

IntroducereIntroducere•fabricarea preparatelor enzimatice interes practic deosebit îl au microorganismele h t t fheterotrofe;•microorganism poate ataca un substrat natural şi-l metaboliza, dacă posedă enzimele capabile care să realizeze aceste căi metabolice, în condiţii de mediu proprii pentru dezvoltare;dezvoltare;•sunt enzime intracelulare care nu sunt secretate în mediul de cultură, în care microorganismele se dezvoltă;•drojdiile, bacteriile lactice, nu conţin decât enzime intracelulare eliberarea j , , ţenzimelor are loc în urma proceselor de autoliză metabolizează doar substraturi nutritive solubile;•bacteriile din genul Bacillus sau fungii din genul Aspergillus enzime intracelulare şi extracelulare; ex: hidrolaze şi au rolul de a degrada substratele insolubile sau solubile cu molecule mari la compuşi solubili uşor asimilabili•rol important: substratul (sursăd e carbon - aminoacizi, vitamine, diferiţi cationi)i d f i i ifi d d ii i l i b iinduce formarea enzimei specifice degradării respectivului substrat inductor

IntroducereIntroducereTipuri de enzime: enzime constitutive

enzime adaptativeEnzimele constitutivese sintetizează în celule în mod permanent;C i l î i fl dConcentraţia lor este însă influenţată de:

- prezenţa sau absenţa în mediul de cultură a substratelor pe care ele le metabolizează;

sursa de azot sursa de carbon factorii de creştere sărurile minerale- sursa de azot, sursa de carbon, factorii de creştere, sărurile minerale, temperatura, pH-ul etcBiosinteza are loc atunci când:

- este prezent substratul; biosinteza porneşte de la substanţe cu structurăeste prezent substratul; biosinteza porneşte de la substanţe cu structură simplă;

- decurge cu consum de energie se introduce şi o sursă de carbon(glucid);(g );

- are loc în timpul fazei logaritmice de creştere celulară, dar şi în faza staţionară, în prezenţa inductorului şi a substraturile de biosinteză;

- este inhibat de inhibitori specifici (cloramfenicolul) şi de metaboliţii rezultaţi (represie) procesul de biosinteză a unei enzime induse este rezultatul acţiunii antagoniste a inductorului şi a metaboliţilor

Tabelul 13. Cele mai importante enzime comerci

IntroducereIntroducere

Selecţia tulpinilor şi ameliorarea lorSelecţia tulpinilor şi ameliorarea lorAlegerea tulpinii producătoare

Trebuiesc avute în vedere următoarele aspecte:- este enzimă intra- sau extracelulară – de preferat acel tip de enzime care

sunt stabile, care nu necesită un mediu de cultivare complex şi care se eliberează uşor din celule în vederea purificării;din celule în vederea purificării;

- dacă produşii de sinteză reprezintă o ameninţare pentru tulpina producătoare;

- dacă există tulpini patogene sau cu toxine provenite de la microorganismul p p g p gproducător de enzime se preferă microorganismele care prin tradiţie sunt folosite în alimentaţia umană (tulpini din genurile Bacillus şi Aspergillus);

- microorganismul să fie capabil să crească în medii de cultură cu compoziţie simplă; ieftine; să nu necesite adăugarea de promotori de creştere scumpi; să fie stabilsimplă; ieftine; să nu necesite adăugarea de promotori de creştere scumpi; să fie stabil din punct de vedere genetic; să producă cantităţi mari din enzima dorită în cel mai scurt timp posibil; să fie uşor de separat din bulionul de ferementaţie.

•Surse de microorganisme:- din natură – ex: microorganismele care hidrolizează lactoza pot fi

izolate din produse lactate, iar microorganismele celulolitice din produse l t it t l d t j lt i î tităţi i ilemnoase putrezite natural dezavantaj: culturi pure în cantităţi mici;

- colecţiile de microorganisme avantaj: tulpinile sunt cataloage sunt trecute tulpinile şi se prezintă caracteristicile lor. Ex: ATCC, WFCC, IFO

Ameliorarea tulpinii producătoare•Pentru tulpinile izolate din natură ameliorare genetică în etapa de laborator p g pse stabilesc principalele caracteristici ale procesului de biosinteză a enzimei:

creşterea producţiei în enzima dorită;reducerea sau eliminarea enzimelor obţinute ca produşi secundari;produsul dorit să fie biosintetizat în cantităţi mai mari fără a se utilizaprodusul dorit să fie biosintetizat în cantităţi mai mari fără a se utiliza

inductori scumpi;producerea enzimei să se realizeze în condiţii normale de inhibiţie

enzimatică.•trei metode de ameliorare:

ameliorarea prin mutaţie şi selecţie –- ag. mutageni: radiaţii electromagnetice, mutageni chimici- supravieţuitorii sunt izolaţi şi separaţi pentru ameliorarea- supravieţuitorii sunt izolaţi şi separaţi pentru ameliorarea

caracterului dorit- ex: β-galactozidază, D-serindeaminază, ribitoldehidrogenază,

penicilinamidază, proteaze alcaline.ib idi difi ii l i ii d iHibridizarea – modificarea structurii ADN a tulpinii producătoare prin

transferarea unui fragment de ADN dintr-o altă tulpină. Tipuri:- conjugarea –- transformarea –transformarea - transducţia –- fuziunea protoplaştilor -

Tehnologia ADN-recombinant: manipulare directă a ADN-ului prin clonare moleculară -

Tabelul 14. Prezentarea unorgene manipulate genetic învederea obţinerii unor enzimede interes comercial

Creşterea producţiei de enzime prin ameliorarea tulpinilorPublicaţii rare - secrete de fabricaţie;

FermentaţiaFermentaţia•Sistem de cultivare “batch”Sistem de cultivare batch•Păstrarea culturii – în azot lichid, cu efectuare periodică de teste de viabilitate;•Inoculul – se transferă din flaskuri în fermentatorul din etapa pilor şi de aici în cel din etapa de de fermentare ppropriuzisă periodic;p pp p p ;

- în proporţie de 1 – 5% în volume•În etapa de propagare celulară – se utilizează un mediu îmbogăţit pentru a determina o creştere bună;Î•În etapa de creştere logaritmică - compoziţia mediului este ajustată în funcţie de

producţia dorită

Figura 56. Obţinerea computerizată a datelor din procesul tehnologic în urma controlului întregului sistem în vederea optimizării procesului de fermentaţie

AplicaţiiAplicaţiiEnzimele amilolitice

G lităţi•Utilizare: în procese fermentative sau în alte procese biochimice• hidroliza amidonul solubil şi granulele de amidon aflate în suspensie apoasă

Generalităţi

•hidroliza poate fi parţială sau totală – funcţie de gradul de hidroliză dorit se aleg diferite amestecuri de enzime amilolitice;•produşii finali rezultaţi exercită un efect de inhibiţie competitivă sau necompetitivă, sau inhibiţie exponenţială simplă;sau inhibiţie exponenţială simplă;•Enzime:

α-Amilaza [E.C.3.2.1.1] sau glicogenaza sau α(1,4)-D-glucan glucanohidrolază;glucanohidrolază;

- acţionează asupra glicogenului, oligo- şi polizaharidelor înrudite;- hidrolizează α(1,4)-D-glicozidice interioare

β-Amilaza [E.C.3.2.1.2] sau glicogenaza sau α(l,4)-D-glucan β [ ] g g ( , ) gmaltohidrolază

- hidrolizează α(1,4)-D-glicozidice marginalesurse de amilaze: - cartofi, cereale, fasole, soia, boabe de orez,

boabele de fasole germinate, pancreas şi la unele specii în salivă- microorganismele: Bacillus subtilis, bacterii,

drojdii, fungi

Modul de acţiune al enzimelor amilolitice

α-amilazaα(1,4)-glicozidică

β-amilazaα(1,3)-glicozidică

amiloglucozidaza(glucoamilază)(g )

α(1,6)-glicozidică

glucozidaza

hidroliza enzimatică a amidonului se efectuează practic în două etape:prima etapă – dextrinzarea - fragmentare rapidă a macromoleculelorprima etapă dextrinzarea fragmentare rapidă a macromoleculelor

de amiloză şi amilopectină până la fracţiuni cu greutăţi moleculare mai mici –dextrinele; amidonul se lichefiază

a doua etapă - zaharificare - dextrinele sunt hidrolizate complet la p poligozaharide şi apoi la maltoză şi glucoză în funcţie de compoziţia preparatului utilizat; dextrina se dizolvă în apă

Determinarea conţinutului în glucide reducătoare: după acţiunea α-amilazelor, concentraţia în glucide reducătoare este de aproximativ 1/3 din concentraţia iniţială a amidonului; după etapa a doua de hidroliză efectuată cu β-amilaze, dacă hid li t l tă t ţi î l id d ăt t lăhidroliza este completă, concentraţia în glucide reducătoare este egală cu cea a amidonului Biosinteza Biosinteza αα--amilazelor bacterieneamilazelor bacteriene: •α-amilazele bacteriene sunt enzime termostabile;•α-amilazele bacteriene sunt enzime termostabile;•speciile din genul Bacillus şi anume Bacillus subtilis şi B. amyloliquefaciens, B. lichenifonnis şi B. stearothennophilus;•gradul de hidroliză calculat prin determinarea cantităţii de glucide reducătoare g adu de d o ă ca cu at p dete a ea ca t tăţ de g uc de educătoa eobţinute în urma hidrolizei enzimatice raportate la cantitatea totală de substrat (amidon) utilizat, este aproximativ acelaşi (20-25%)

•cultivată în sistem discontinuu, submers•enzima este produsă în mod normal după ce a atins faza maxima de creştere şi începe faza staţionară;începe faza staţionară;•nivelul de producere a enzimei este limitat de concentraţia sursei de carbon datorită procesului de inhibiţie prin catabolit ) - demonstrat pe B. licheniformis.•Bacillus subtilis – producerea este influenţată de particularităţile morfo-fiziologiceBacillus subtilis producerea este influenţată de particularităţile morfo fiziologice corelate cu potenţialul productiv al tulpinii

Figura 59. Dinamica acumulării α-amilazei în culturi submerse de Bacillus subtilis. a) – dinamica acumulării de biomasă; b) – dinamica activităţii enzimatice; c) – evoluţia pH-ului

Parametrii digstiei:•starea fiziologică a microorganismului utilizat;•potenţialul productiv al tulpinii folosite;potenţialul productiv al tulpinii folosite;•compoziţia mediului de biosinteză;•parametrii de biosinteză (temperatură, pH, viteză de agitare, viteza de aerare, durata cultivării).Biosinteza α-amilazelor cu tulpini modificate genetic•studiile de inginerie genetică efectuate până în prezent au demonstrat posibilitatea transferării genelor de la o specie la alta;•cele mai des utilizate sunt bacteriile din genul B. subtilis ; se mai utilizează B. sterothermophilus în B. subtilis•atunci când genele α-amilazei sunt donate în E. coli, ele se exprimă, enzima acumulându-se în spaţiul periplasmatic;•biosinteza α-amilazelor este influenţată de compoziţia mediului nutritiv şi de condiţiile de cultivare a microorganismului

sursă de carbon - varietăţi de amidon, glicogenului, maltotetraozelor, maltotriozele, maltoza (de cinci ori mai slabe decât la glicogen)

sursele de azot - săruri de amoniu, aminoacizi, cazeină3 vitamine;7 aminoacizi

•mediul de reacţiefăină de peşte, şprot de soia – mai multă protează decât α-amilază

di b d id ilmediu pe bază de amidon - α-amilazamediu se adaugă glucoză - biosinteza α-amilazei este inhibată parţial sau

total•ionii de calciu şi amoniu

•temperatura de cultivare:variază de la o specie la alta:între 30 şi 370C pentru B. subtilisî 0 i 6 0C l i h h lîntre 50 şi 650C pentru B. coagulans şi B. stearothennophilus

•pH-ul optim:6,0 şi 7,5controlat şi menţinut constant pe toată durata biosintezei

i l î b ă ă i d di l iproteinele îmbunătăţesc capacitatea de tamponare a mediului•proces intens aerob:

oxigenul insuflat o data cu aerul sterilizat este utilizat numai ca oxigen dizolvat

i d i â i â i d dcantitatea de oxigen este cu atât mai mare cu cât perioada de creştere a unei generaţii este mai mică •Proprietăţile fizico-chimice ale mediului de cultură:

vâscozitateadi dtendinţa de spumare

Figura 60. Variaţia concentraţiei de O2 dizolvat pe parcursul biosintezei Figura 61. Influenţa logaritmică şi a debitului de aer

asupra biosintezei α-amilazei cu B. subtilis

41273130 biotehnologie-curs

Documents

Transcript of 41273130 biotehnologie-curs