Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1...

23
Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.) IOANA ISPAS Institutul de Genetică, Universitatea Bucureşti Introducere Floarea-soarelui (Helianthus annuus L.) este cultivată de aproape 3000 de ani în America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite ca sursă de ulei dar şi ca hrană. Iniţial floarea-soarelui a fost introdusă în Europa prin Spania, din Mexic şi ulterior s-a raspândit în toata Europa. Primele documente privind acest transfer datează din 1568 (Dodonaeus).Producţia de floarea -soarelui a crescut în Europa, în cursul primului şi al doilea razboi mondial când, practic a devenit plantă de cultură. Diversitatea genetică este extrem de importantă pentru dezvoltarea şi adaptarea la mediu a plantelor de cultură.Accentul în ceea ce priveşte ameliorarea florii-soarelui este pus în principal pe dezvoltarea hibrizilor cu creştere viguroasă (efect heterozis ) folosind sisteme CMS (citoplasmic male sterility ).Totuşi baza genetică a hibrizilor actuali de floarea-soarelui este extrem de ingustă.Cultivarea florii-soarelui se face aproape exclusiv pe baza hibrizilor ce au la baza sursa Leclercq de androsterilitate citoplasmatică. Prima sursă CMS a fost descoperită de Leclercq în 1969, în urma încrucişării interspecifice dintre H.petiolaris şi H.annuus. Datorită folosirii aproape exclusive a acestei surse CMS pentru obţinerea de seminţe hibride, toţi hibrizii din cultură sunt puternic inrudiţi, cel puţin în ceea ce priveşte citoplasma lor. Eforturile în domeniul ameliorării vizează mai ales creşterea variabilităţi genetice a hibrizilor de floarea-soarelui, prin dezvoltarea de noi sisteme CMS. Conceptul de androsterilitate citoplasmatică. Prezentare generală Androsterilitatea citoplasmatică a fost observată la peste 150 de specii de plante. Este o caracteristică transmisă matern şi constă în avortarea polenului, însoţită de menţinerea fertilităţii plantelor femele şi de o dezvoltare vegetativă normală. In limbaj agronomic liniile androsterile sunt denumite cu termenul de citoplasmă androsterilă urmată de o prescurtare a speciei din care provin. De exemplu : citoplasma PET1 este echivalentă ca terminologie cu linia androsterila PET1 (derivată de la H.petiolaris). Menţinerea liniilor androsterile în câmp necesită surse de restaurare a fertilităţii şi de menţinere a acestora din urmă. Sistemele CMS reprezintă excelente modele pentru studiul interacţiilor dintre nucleu şi citoplasmă întrucât restaurarea fertilităţii implică gene nucleare care suprimă disfuncţiile citoplasmatice. Plantele cu androsterilitate citoplasmatică se pot obţine prin tehnici conventionale (emascularea manuală a anterelor hibridizare interspecifică, backcross), 51

Transcript of Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1...

Page 1: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.)

IOANA ISPAS Institutul de Genetică, Universitatea Bucureşti

Introducere

Floarea-soarelui (Helianthus annuus L.) este cultivată de aproape 3000 de ani în

America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite ca sursă de ulei dar şi ca hrană. Iniţial floarea-soarelui a fost introdusă în Europa prin Spania, din Mexic şi ulterior s-a raspândit în toata Europa. Primele documente privind acest transfer datează din 1568 (Dodonaeus).Producţia de floarea -soarelui a crescut în Europa, în cursul primului şi al doilea razboi mondial când, practic a devenit plantă de cultură.

Diversitatea genetică este extrem de importantă pentru dezvoltarea şi adaptarea la mediu a plantelor de cultură.Accentul în ceea ce priveşte ameliorarea florii-soarelui este pus în principal pe dezvoltarea hibrizilor cu creştere viguroasă (efect heterozis ) folosind sisteme CMS (citoplasmic male sterility ).Totuşi baza genetică a hibrizilor actuali de floarea-soarelui este extrem de ingustă.Cultivarea florii-soarelui se face aproape exclusiv pe baza hibrizilor ce au la baza sursa Leclercq de androsterilitate citoplasmatică. Prima sursă CMS a fost descoperită de Leclercq în 1969, în urma încrucişării interspecifice dintre H.petiolaris şi H.annuus. Datorită folosirii aproape exclusive a acestei surse CMS pentru obţinerea de seminţe hibride, toţi hibrizii din cultură sunt puternic inrudiţi, cel puţin în ceea ce priveşte citoplasma lor. Eforturile în domeniul ameliorării vizează mai ales creşterea variabilităţi genetice a hibrizilor de floarea-soarelui, prin dezvoltarea de noi sisteme CMS.

Conceptul de androsterilitate citoplasmatică. Prezentare generală

Androsterilitatea citoplasmatică a fost observată la peste 150 de specii de plante. Este o caracteristică transmisă matern şi constă în avortarea polenului, însoţită de menţinerea fertilităţii plantelor femele şi de o dezvoltare vegetativă normală. In limbaj agronomic liniile androsterile sunt denumite cu termenul de citoplasmă androsterilă urmată de o prescurtare a speciei din care provin. De exemplu : citoplasma PET1 este echivalentă ca terminologie cu linia androsterila PET1 (derivată de la H.petiolaris).

Menţinerea liniilor androsterile în câmp necesită surse de restaurare a fertilităţii şi de menţinere a acestora din urmă. Sistemele CMS reprezintă excelente modele pentru studiul interacţiilor dintre nucleu şi citoplasmă întrucât restaurarea fertilităţii implică gene nucleare care suprimă disfuncţiile citoplasmatice.

Plantele cu androsterilitate citoplasmatică se pot obţine prin tehnici conventionale (emascularea manuală a anterelor hibridizare interspecifică, backcross),

51

Page 2: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

IOANA ISPAS

52

inginerie genetică (exprimarea enzimei barnaza folosind un promotor specific anterelor) sau prin biotehnologie (fuziunea de protoplaşti, embriogeneza somatică).

Fenotipul CMS (cytoplasmic male sterility) este în multe cazuri asociat cu mutaţii în genomul mitocondrial şi este sub controlul genelor nucleare, dominante, de restaurare a fertilităţii (Hanson,1991).La multe specii de plante, amelioratorii au identificat una sau mai multe gene nucleare, care conferă fertilitate, când plantele purtatoare ale acestor gene sunt încrucişate cu părinţi cu citoplasmă androsterilă.

Daca o linie CMS este încrucişată cu o linie fertilă, homozigotă pentru gena Rf (linie restauratoare) se obţin hibrizi F1 heterozigoţi, pentru alela Rf ( fertili). Menţinerea liniei CMS este realizată prin încrucişarea unei linii aproape izogene, lipsită de gena Rf (linia menţinătoare). Propagarea liniilor restauratoare şi menţinătoare are loc prin self-fertilizare.

Dacă această genă este introdusă la părintele producător de polen (prin liniile de restaurare a fertilităţii ) sterilitatea masculă este suprimată iar hibrizii obţinuţi în F1 sunt heterozigoţi pentru gena Rf, produc polen şi sunt masculi fertili. Liniile CMS inbred sunt reproduse prin încrucişarea unei varietăţi fertile izonucleare, lipsită de alele de restaurare (linia menţinătoare de fertilitate) cu linia CMS inbred. Liniile de restaurare şi de menţinere se pot apoi propaga prin self-fertilizare.

S-au descoperit prin experienţe de ameliorare noi surse CMS, în care s-au realizat backcrossuri, prin care s-au produs substituiri ale genomului nuclear de la o linie ameliorată cu background-ul citoplasmatic al altei linii. Plantele CMS în populaţiile rezultate în urma backcrossului au apărut fie datorită îndepărtării alelelor de restaurare prezente în genotipul original, fie datorită incompatibilităţilor citoplasmă-nucleu (Hanson,1991 ).

Plantele CMS apar spontan în populaţiile ameliorate din camp şi iniţial au fost induse prin încrucişări interspecifice şi mutageneză. În majoritatea cazurilor fenotipul CMS provine din rearanjări la nivelul genomului mitocondrial, de la progenitorii masculi fertili sau ca rezultat al evenimentelor de recombinare intra sau intermoleculare. Aceste mutaţii pot fi silenţioase fenotipic, în background-ul nuclear original. Totuşi dacă, sursa de androsterilitate citoplasmatică care conţine mutaţia este transferată într-un background diferit non-fertil, apare fenotipul steril mascul. Aceasta se datorează incapacităţii nucleului de a supresa sau compensa mutaţia în toate stadiile de dezvoltare ale plantei (Leaver,1991).

Principalele linii androsterile la floarea soarelui

Dupa 1999, s-au raportat cel puţin 62 de noi surse CMS la floarea-soarelui. Multe

din ele sunt derivate din încrucişări interspecifice, în timp ce altele au apărut spontan în populaţiile sălbatice de floarea-soarelui sau au fost obţinute prin mutageneză.

Toate sursele de androsterilitate citoplasmatică prezentate în tabelul 1 au fost caracterizate din punct de vedere al interacţiilor nucleu-citoplasmă.

În tabelul 1 este indicată originea speciei donor de citopalsmă şi codul FAO. După 1995 s-au descris 19 surse noi de CMS.: -9 surse CMS originare din H.annuus sălbatică,apărute spontan: PI432513: ANN2101 ,ANN2108, ANN2112, ANN2141 sau din forme cultivate de H.annuus: CMS G, CMS DP, CMS VL, CMS AN-126, denumite conform FAO: CMS-ANN14, ANN15, ANN17, ANN18, ANN19, ANN20, ANN21, ANN22. -7 surse CMS provenite din hibridizări interspecifice:

Page 3: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.)

53

• de la H.resinosus. Această linie CMS s-a descoperit la descendenţii rezultaţi din încrucişările între H. resinosus 243 şi floarea -soarelui cultivată. Generaţiile BC3 şi BC4 rezultate din încrucişarea între H.resinosus şi HA89, RHA271 şi RHA801 ca părinţi recurenţi a produs progeni masculi sterili (cod FAO: CMS-RES1). • de la H.mollis s-au obţinut prin hibridizări interspecifice ale plantelor mascule sterile cu linia HA89, hibrizi masculi sterili. Prin încrucişarea cu H.debilis vestitus, H.annuus RHA274 şi prin polenizare deschisă s-au obţinut 100% progeni masculi sterili. Sursa CMS a fost denumită CMS-MOL1. 3 alte surse CMS derivă din: • H.strumosus .Această linie androsterilă a fost obţinută prin încrucişările interspecifce dintre H.strumosus şi floarea –soarelui cultivată (cod: CMS-STR1). • H.argpophyllus (cod FAO: CMS-ARG4) • H.praecox sp. Praecox. Încrucişările interspecifice între H.praecox şi H.annuus produc în generatia F3, plante mascule sterile. Backcrossurile cu liniile B au generat în multe cazuri 100% plante mascule sterile. Noua sursă a fost denumită CMS-PRP2.

2 surse CMS derivă din : • H.praecox.Toate încrucişările care implică H.praecox cu H.annuus produc plante sterile (cod FAO: CMS-PRA I). • H.petiolaris.Toate încrucişările care implică H.petiolaris şi H.annuus produc plante sterile (CMS-PET5).

3 surse CMS au fost induse prin mutageneză (raze gamma): CMS MUT3, MUT4, MUT 5.

În tabelul 1 sunt prezentate speciile de origine ale câtorva linii CMS la floarea-soarelui.

Tabelul 1. Sursele CMS de la floarea-soarelui.

Denumirea uzuală a liniei CMS

Denumirea speciei Cod FAO

KOUBAN H.annuus lenticularis ANL1 INDIANA 1 H.annuus lenticularis ANL2 VIR 126 H. lenticularis ANL3 397 H.annuus salbatic ANN1 517 H.annuus salbatic ANN2 519 H.annuus salbatic ANN3 521 H.annuus salbatic ANN4 NS-ANN-81 H.annuus salbatic ANN5 NS-ANN-2 H.annuus salbatic ANN6 H.annuus salbatic ANN7 H.annuus salbatic ANN8 H.annuus salbatic ANN9 FUNDULEA 1 H.annuus texanus ANT1 AN-67 H.annuus ANN10 AN-58 H.annuus ANN11 AN-2-91 H.annuus ANN12 AN-2-92 H.annuus ANN13 H.annuus ANN14 CMS-G H.annuus ANN15 CMS-DP H.annuus ANN16

Page 4: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

IOANA ISPAS

54

CMS-VL H.annuus ANN17 H.annuus ANN18 HEMUS H.annuus MUT1 PEREDOVICK H.annuus MUT2 STADION H.annuus MUT3 ANOMALUS H.anomalus ANO1 ARGOPHYLLUS H.argophyllus ARG1 BOLANDERI H.bolanderi BOL1 DV-10 H.debilis DEB-1 EXILIS H.exilis EXI1 EXI2 H.exilis EXI2 CMG2 H.giganteus GIG1 CMG3 H.maximiliani MAX1 MOLLIS H.mollis MOL1 NEGLECTUS H.neglectus NEG1 CANESCENS H.niveus canescens NIC1 FALLAX H.petiolaris fallax PEF1 PET/PET H.petiolaris petiolaris PEP1 CMS clasica H.petiolaris Nutt. PET! CMG1 H.petiolaris Nutt. PET2 PETIOLARIS BIS H.petiolaris Nutt. PET3 PET34 H.petiolaris PET4 PRAECOX H.praecox PRA1 PHIR-27 H.praecox hirtus PRH1 PRAECOX H.praecox praecox PRP1 PRP-28 H.praecox praecox PRP2 RUN-29 H.praecox PRR1 RESINOSUS 243 H.resinosus RES1 VULPE H.rigidus RIG1 RIG-M-28 H.rigidus RIG2 STRUMOSUS H.strumosus STR1

Prima sursă stabilă de androsterilitate citoplasmatică a fost descoperită de

Leclercq, în 1968 prin încrucişări interspecifice între H.petiolaris Nutt. şi H.annuus. Identificarea genelor pentru restaurarea fertilitaţii în special din sursa T66006-2 descoperită de Kinman(1970) a permis obţinerea de seminţe hibride.

Primii hibrizi produşi prin sistemul CMS-restauratori de fertilitate au fost introduşi în SUA în 1972. Dupa 5 ani aceştia au reprezentat 80% din totalul hibrizilor. Ei se caracterizează printr-o productie cu 20% mai mare decât cea obţinută de la floarea-soarelui cultivată normal. Hibrizii au fost înalt self-compatibili, rezistenţi la mană şi uniformi ca înălţime şi mărimea inflorescenţei la maturitate. Hibridul 894 a fost unul dintre cei mai populari hibrizi obtinuţi prin această metodă.

Sursa de androsterilitate citoplasmatică descoperită de Leclercq (1969) este aproape exclusiv folosită ca sursă în ameliorarea curentă ca şi pentru producţia de seminţe. Sterilitatea controlată citoplasmatic nu are efecte adverse asupra caracterelor agronomice. Actualmente sunt disponibile peste 60 de surse CMS, dar nu toate prezintă restauratori de fertilitate iar câteva surse CMS au efecte negative asupra unor caractere agronomice (Havekes şi colab., 1991).

Page 5: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.)

55

Ipoteze privind mecanismele moleculare de apariţie ale CMS la plante

Membrana mitocondrială internă este o structură înalt specializată în care sunt localizate complexele enzimatice multimerice specifice fosforilării oxidative şi lanţului respirator.Aceste complexe enzimatice includ subunităţi codificate de genomul nuclear dar şi de cel mitocondrial.Distrugerea interacţiilor nucleu-citoplasmă şi mutaţiile mitocondriale sau nucleare pot afecta asamblarea sau funcţionarea complexelor enzimatice multimerice.

Analiza CMS la numeroase specii de plante arată că fenotipul CMS este înrudit cauzal cu :

prezenţa unor polipeptide noi, himere, variabile, codificate de mitocondrii. Aceste polipeptide pot conţine secvente noi de aminoacizi (figura 1) sau secvenţe care blochează homologia cu aminoacizii din polipeptidul normal (codificat de secvenţa de DNA din care au derivat). Domeniile proteinei pot conferi polipeptidului diferite caractere structurale sau functionale ale proteinelor progenilor sau caractere noi care se pot manifesta la nivelul membranei mitocondriale interne unde pot competiţiona cu polipeptidele native inrudite sau pot fi asociate specific cu un complex enzimatic. Prezenţa polipeptidelor adiţonale sau modificate poate impune constrângeri asupra biosintezei şi funcţiei complexelor multimerice ale membranei mitocondriale interne. Acestea pot fi tolerate în cursul creşterii normale vegetative dacă complexele enzimatice native sunt capabile să producă suficientă energie pentru a susţine dezvoltarea celulară, ceea ce poate conduce la insuficienţă mitocondrială în cursul creşterii (în ceea ce priveşte activitatea mitocondriei în cursul formării polenului). O ipoteză alternativă sugerează că secvenţele promotor care sunt

comune genelor noi dar şi genelor progenilor normali, competiţionează pentru factorii limitativi care controlează exprimarea polipeptidelor noi şi variabile. În acest fel apare un dezechilibru în ceea ce priveşte cantitatea de subunităţi enzimatice individuale ceea ce conduce la imperfecţiuni în biogeneza sau funcţiile mitocondriilor, care astfel devine un factor limitant în dezvoltarea polenului. Aceste ipoteze sunt argumentate de CMS-T la porumb şi de CMS de la petunie. Genele himere T-urf13 şi pcf prezintă secvenţe promotor similare cu genele mitocondriale normale. Acestea, în plus, codifică diferite polipeptide cu caracteristici structurale şi funcţionale noi. Un alt model molecular care explică degradarea funcţiilor

mitocondriale asociate cu fenotipul CMS implică editarea incorectă a ARN, a transcriptului genei mitocondriale din linia androsterilă. Iwabuchi şi colab., 1993, au demonstrat că transcriptul atp6 la orez nu este editat eficient şi a fost translatat într-un polipeptid alterat. O cantitate mare de polipeptid alterat (atp6) poate cauza CMS prin competiţionarea cu proteina normală atp6, pentru a reduce activitatea ATP-azică. Nu este clara relaţia dintre CMS spontan si scăderea editării ARNm. Totuşi s-a raportat ca editarea completă a genei atp6 poate restaura fertilitatea CMS la orez. Baza teoriei diferenţiale a editării ARN este realizată de Hernould (1992) care a identifcat proteina atp9 alterată translată din atp9ARN

Page 6: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

IOANA ISPAS

56

needitat şi polipeptidul normal derivat din atp9ARN editat în mitocondriile plantelor de tomate. Formele needitate ale subunităţii proteice 9 determină prezenţa a 50% din polenul steril, în ciuda existenţei subunităţii 9 endogene a proteinei.

Figura 1. Regiuni himere din ADN mitocondrial de la diferite plante, asociate cu androsterilitatea

citoplasmatică .

Page 7: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.)

57

În concluzie se poate aprecia ca androsterilitatea citoplasmatică este determinată de scăderea capacităţii mitocondriei de a furniza energie celulei, ceea ce generează disfuncţii mitocondriale cu diferite grade de severitate, în celulele tapet.

Caracterizarea moleculară a liniei androsterile PET1

Studiile asupra androsterilităţii citoplasmatice efectuate la o serie de plante precum: porumb, petunia, sorg, floarea-soarelui, arată că în genomul mitocondrial rearanjările au generat secvenţe de DNA mitocondrial himere, ce se exprimă ca polipeptide noi sau modificate, care determină alterări în cee ce priveşte funcţile mitocondriilor. Aceste alterări constau în disfuncţionalităţi la nivelul ţesuturilor, care se traduc prin incapacitatea de a produce polen viabil.

Structura genomului mitocondrial la linia androsterila PET1 de la floarea-soarelui

Figura 2. Localizarea orf522 in genomul mitocondrial la plantele cu androsterilitate citoplasmatica de H.annuus-linia PET1.

atpA: subunitate ă F1-ATP-aza :cob : Apocitocrom b ndh1 : NADH/H+ Dehidrogenaza 1 rps13 : proteina ribozomală S13 ,: ARNr18S ; ARNr26S

atp6: subunitatea 6 a F0 ATPaza atp9 subunitatea 9 a F0 ATPaza coxI-III Citocrom b Oxidaza I-III

Page 8: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

IOANA ISPAS

58

Linia androsterilă PET1 este foarte răspândită si intens studiată,în câmp, fiind utilizată pentru producerea de seminţe hibride la floarea-soarelui.

S-a analizat DNA mitocondrial de la linii fertile, androsterile PET1 şi hibrizi restauratori de fertilitate folosind tehnicile RFLP şi Southern blotting. S-a constatat că genomul mitocondrial PET1 conţine rearanjări unice în cel puţin 5 loci: atp6, atp9, atpA, nad1+5 şi cox III. Cu ajutorul unor gene sondă s-a aratat că aceste molecule de DNA sunt coliniare, cu o regiune cadru între atpA şi gena cob (figura 2). Analiza detaliată a acestei arii, cu ajutorul hărţii fizice şi a metodelor de secvenţiere a demonstrat că organizarea DNA mitocondrial din liniile androsterile, diferă de cea din liniile fertile, inclusiv la H. Petiolaris (Kohler si colab., 1991), printr-o inversie de 11kb şi o inserţie de 5 kb (Leroy şi colab., 1985, Crouzillat şi colab., 1987, Kohler şi colab., 1991).

Figura 3. Organizarea unei regiuni din ADN mitocondrial situată între atpA şi cob la liniile fertile de H.annuus (Baso ), H.petiolaris (fertile ) şi linii mascule sterile de H.annuus (BASO-CMS)(după Horn,1991

).

La hibrizii restauratori de fertilitate ai BASO (CMS) şi HA89(CMS) organizarea DNA mitocondrial între gena atpA şi cob este aceeaşi ca şi în linile CMS ceea ce arată că restaurarea fertilităţii nu induce rearanjări în această regiune a DNA.

S-a constatat că regiunea rearanjată a DNA mitocondrial este flancată de repetiţii inverse de 261pb (Kohler si colab., 1991). Repetiţia inversă este de asemenea prezentă în amonte de gena coxIII la hibridul Gloriasol (Qugliariello şi colab., 1990). La nivelul locusului atpA repetiţia constă din 64 de nucleotide în regiunea 3’ a regiunii codificatoare atpA şi se extinde cu 30 de nucleotide în regiunea 5’ a orf H522 care este localizată în aval de gena atpA.Repetiţiile inverse prezente în marginile regiunii rearanjate a DNA mitocondrial pot fi implicate în inversia unei secvenţe de 11kb între genele atpA şi cob. Datorită acestei inversii orf H873 este translocat din poziţia sa, în aval de gena atpA la formele fertile de H. annuus şi H. petiolaris şi de gena cob în linile

Page 9: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.)

59

mascule sterile BASO (CMS) şi HA89(CMS). Prezenţa a 57 de nucleotide de la orfH708 în aval de gena atpA, ca parte a orf H522 în liniile androstrile şi a 223 pb din secvenţa codificatoare a regiunii 3’ a orf H708 de o parte şi de alta a inserţiei de 5kb indică faptul că inserţia a avut loc în orfH708 după inversia acestei regiuni. Datorită evenimentelor de recombinare , cea mai mare parte a orf H708 a fost deletată sau mutată în altă regiune din genomul mitocondrial (Zetsche si Horn, 1993).

Figura 4. Harta detaliată a inserţiei de 5kb situată în aval de gena atpA la liniile mascule sterile Baso (CMS) ce prezintă citoplasma PET1.

Ipoteza inversiei, anterioară inserţiei, este susţinută de faptul că, în câteva cazuri

clare, orfH708 intact este localizat în aval de gena atpA. Inversia pare să existe într-o serie de subpopulaţii minore ale DNA mitocondrial.

În linile androsterile inserţia de 5 kb crează un nou orf de 522 nucleotide (orfH522) începând cu nucleotidul 164 în aval de codonul stop al atpA. Acest ORF specifica fie folosirea singurului codon start, o proteină de 19,5kDa, sau o proteină de 14,5kDa (Kohler si colab., 1991). Primele 57pb ale orfH522 sunt homoloage cu cele ale orfB de la Oenopthera (Hiesel şi colab., 1987). Această parte a orf H522 prezintă de asemenea homologie cu secvenţa 5’a orfH708 localizat mai jos de gena cob în liniile fertile. Secvenţele rămase ale orfH522 nu prezintă homologie cu o anumită genă mitocondrială cunoscută sau cu alte secvenţe din libraria EMBO. Nu s-a reuşit obţinerea de semnale de hibridizare folosind sonde din această regiune cu DNA mitocondrial sau cu DNA plastidial din plantele fertile. Totuşi o secvenţă situată la 11 nucleotide în aval de orfH522, este homoloagă cu partea de început a genei atp 9 la floarea-soarelui (Kohler si colab., 1991, Recipon, 1990).

Page 10: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

IOANA ISPAS

60

Originea inserţiei de 5kb la linia androsterilă PET1

S-a studiat (Horn, 1991), inserţia de 5kb prin hibridizare cu ajutorul metodei Southern, cu sonde ce acoperă întreaga inserţie, la nivelul DNA mitocondrial , nuclear şi cloroplastic , pentru a obţine informaţii despre originea secvenţei ce formează inserţia de 5kb.

Sonda Ins1 ce prezintă secvenţe homoloage cu regiunea atp9 a insertului, a generat semnale in cazul experimentelor cu DNA mitocondrial şi nuclear, la liniile fertile de H.annuus şi H.petiolaris.Analiza secvenţelor a arătat că regiunea, din zona de inserţie de 5kb homoloagă cu DNA mitocondrial de la liniile fertile, constă dintr-o secvenţă de circa 1kbz, localizată în liniile fertile între gena coxI şi cox III. Totuşi sondele Ins 2 şi Ins 3 ce acoperă restul secvenţelor de inserţie de 5kb nu produce semnale de hibridizare cu DNA mitocondrial, DNA nuclear din plantele fertile (Horn, 1991, Zetsche şi Horn, 1993) şi nici cu DNA plastidial. S-a ajuns la concluzia că atât orfH522 cât şi inserţia par să fie compuse din secvenţe diferite parţial homoloage cu DNA mitocondrial şi cu DNA nuclear şi parţial cu secvenţe de origine necunoscută.

Un fragment de 1,7kb ce reprezintă o parte din insert a fost folosita ca sondă. S-a constatat că o secvenţă de 9kb ce acoperă o parte din Dna mitocondrial MAX1 prezintă homologie cu orfH873 ca şi cu orfH522. Totuşi această ultimă secvenţă nu prezintă homologie cu gena atpA şi gena cob.

Populaţia investigată la H. petiolaris a arătat o organizare identică a ADN mitocondrial din regiunea de flancare a genei atpA şi a genei cob în liniile fertile de H.annuus.Dacă subpopulaţia de molecule DNA ce prezintă inversia, reprezintă organizarea iniţială a DNA mitocondrial în H.petiolaris, atunci se pare că încrucişarea interspecifică a cauzat evenimente de recombinare care au condus la organizarea specifică a PET1.

Linia androsterilă MAX1 conţine o regiune homoloagă cu secvenţa de inserţie de 5kb din PET1 (Hahn şi Friedt, 1992, Hahn şi Friedt, 1994). Cercetările au fost realizate pe 5 populaţii sălbatice de H. maximilliani (MAX30 , MAX40, MAX42, MAX44, MAX 1654). S-a constatat ca populatia MAX30 a aratat aceeaşi homologie şi o organizare identică a DNA mitocondrial ca şi MAX1 (Hahn, 1993).

Aceste rezultate pot fi interpretate astfel: inserţia de 5 kb poate fi datorată fie unor noi evenimente de recombinare, induse de încrucişările interspecifice ale H. petiolaris cu H.annuus, fie de secvenţa de inserţie originală, care a fost deja prezentă în populaţia iniţială de H.petiolaris.

O altă ipoteză legată de apariţia liniei androsterile PET1 este aceea că, zona rearanjată a locusului atpA observată în PET1 este deja prezentă ca “sublimon “în DNA mitocondrial de la liniile fertile (Laver şi colab., 1991, Moneger şi colab., 1994 ). Orf H522 se pare că are originea în molecule de ADN substoechiometrice, care rezultă din evenimente aberante de recombinare. Sublimonul se pare mai degrabă, că a fost amplificat în cursul primei încrucişări ,decât că a fost rezultatul unei noi recombinări în linia masculă sterilă, indusă de incompatibilitatea citoplasmă-nucleu. Această teorie este argumentată de amplificarea unui fragment din DNA mitocondrial de la linia fertilă, cu primeri aleşi pentru zona rearanjată a PET1, ceea ce corespunde cu analiza Southern, in care s-a observat că zona rearanjată a locusului atpA apare la un nivel redus în linia fertilă şi invers (Laver şi colab., 1991).

Pattern-ul transcripţional al genei atpA

Page 11: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.)

61

Pentru a detecta diferenţele în patternul transcripţional al zonelor rearanjate de la plantele fertile şi sterile, s-au folosit sonde DNA ce acoperă locusul atpA, inserţia de 5kb, zonele de flancare a inversiei şi gena cob (Kohler, 1991).

S-au observat alterări, în ceea ce priveşte patternul transcripţional între liniile BASO şi BASO (CMS), la nivelul locususlui atpA. Diferenţele aparente analizate, cu sondele corespunzătoare ale regiunilor de flancare 3’ale genei cob, au apărut ca rezultat al hibridării interspecifice, datorită prezenţei unei repetiţii inverse de 261pb la locusul atpA.

S-a identificat transcriptul genei atpA de aproximativ 1700 nucleotide, în plantule etiolate, de la linia fertilă BASO, ( în extracte de RNA total ). La nivelul liniei androsterile BASO(CMS), cu o sondă ce acoperă capătul 5’al genei atpA, s-a constatat că există un transcript de 2500 de nucleotide.S-a mai detectat un transcript adiţional de circa 1200 de nucleotide (cu sonde homoloage cu capătul 3’ al atpA şi cu orfH522 la linile androsterile). Cu o sondă ce conţine o secvenţă localizată în amonte de orfH522 cu 465pb, care este homoloagă cu capăul 5’ al genei atp9 (Recipon, 1990) s-au detectat transcripţi adiţionali de 250 nucleotide, 500 nucleotide, 3100 nucleotide. Aceste semnale detectate sunt datorate hibridizării acestor sonde cu transcripţi ai genei atp9.

Prezenţa transcripţilor de 1700 nucleotide şi 1200 nucleotide din RNA-ul plantelor androsterile se explică prin faptul că fie cei doi transcripţi se obţin prin scindarea unui transcript primar prin procesare, fie transcripţia se opreşte în aval de gena atpA şi este iniţiată mai apoi în amonte de orfH522. Explicaţia nu este însă valabilă pentru secvenţe cu o lungime de 250 de nucleotide.

Hibridizarea cu RNA total izolat din H. petiolaris folosind sondele DNA menţionate anterior, generează acelaşi transcript atpA ca şi RNA de la plantele fertile de H. annuus (Kohler şi colab., 1991).

Moneger şi colab., 1994, folosind linii diferite de floarea-soarelui, au obţinut un pattern similar al transcripţilor locusului atpA pentru liniile fertile şi androsterile. Patternul transcripţional, obţinut sub forma unui extract nuclear brut de HA89 este însă mult mai complex (Horn şi colab., 1991, Sicullela şi Palmer, 1988).

În transcriptul orfH522 s-au identificat 2 situsuri de editare a RNA, ambele fiind conversii C-----U (Moneger, 1994). Prima, la pozitia 16, conduce la înlocuirea serinei cu leucina şi reprezintă un situs de editare conservat care este de asemenea prezent în orf B de la Oenthera (Schuster si colab., 1991) şi la floarea-soarelui (Quggliariello si colab., 1990). Al doilea situs de editare, la poziţia 38, determină înlocuirea argininei cu cisteina, este localizat în regiunea orfH522 şi nu arată homologie cu altă parte a ADN mitocondrial (Moneger şi colab., 1994).

Un mecanism ce conduce la restaurarea fertilităţii mascule poate fi cel care acţionează prin modificarea exprimării orf-urilor asociate cu androsterilitatea citoplasmatică (Laver şi colab., 1991). S-a analizat transcripţia la nivelul locusului atpA, în cazul a doi hibrizi ce restaurează fertilitatea : RHB4 şi RHB5, liniilor androsterile PET1 şi conţin gene restauratoare nucleare. S-a arătat că cei doi hibrizi prezintă co-transcripţi ai atpA şi orf H522 de 2500 de nucleotide. Nu s-au inregistrat efecte cantitative şi calitative ale genelor de restaurare asupra patternului transcripţional al hibrizilor restauratori de fertilitate (Kohler şi colab., 1991). Totuşi, in antere s-a observat o reducere ţesut specifică a nivelului steady-state al transcriptului mare, ce conţine orfH522 şi care poate fi observat la hibrizii restauratori de fertilitate, în timp ce nivelul transcriptului de 1700 de nucleotide rămâne constant (Moneger şi colab., 1994). Produsul genei nucleare de restaurare la nivel post-transcripţional destabilizează noul transcript mitocondrial, într-un mod ţesut specific. Nu s-a observat editarea diferenţială

Page 12: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

IOANA ISPAS

62

a orfH522 ca rezultat al restaurării fertilităţii de către genele de restaurare (Moneger şi colab., 1994).

Translaţia “in organello” a produşilor mitocondriali din plantele de floarea-soarelui fertile şi androsterile

La floarea-soarelui, analiza liniei androsterile citoplasmatice PET1 arată o

singură diferenţă, în ceea ce priveşte produşii translaţiei mitocondriale “in organello”. Astfel în linia CMS s-a identificat un polipeptid de 16kD, (Horn şi colab., 1991, Laver şi colab., 1991) sintetizat în toate backgroundurile nucleare investigate cu sursa de androsterilitate citoplasmatică PET1 (HA89, BASO, RHA1G, RHA2G, RPA842). Acest fenomen contrastează cu situaţia de la porumb (Zea mays) şi Petunia, unde s-a observat o reducere a proteinelor asociate cu CMS, în ţesuturile somatice (Dewey şi colab., 1987, Nivisin şi Hanson, 1989). Totuşi în florile mascule de floarea-soarelui, nivelul sintezei polipeptidului de 16 kD este de două ori mai redus, la formele restauratoare de fertilitate, comparativ cu linia androsterilă (Moneger şi colab., 1994). Această reducere în exprimarea proteinei de 16kDa, după restaurarea fertilităţii, poate fi privită ca un argument, în favoarea ipotezei că polipeptidul de 16kD, asociat cu CMS, este cel mai probabil responsabil pentru disfuncţia mitocondrială ce conduce la avortarea microsporilor.

Mărimea polipeptidelor codificate de orfH522 coincide cu mărimea estimată a noii proteine de 16kDa sintetizate în urma translaţiei in organello, în mitocondriile din linia androsterilă (Horn şi colab.,1991, Laver şi colab.,1991). Prin folosirea anticorpilor policlonali faţă de proteinele de fuziune derivate din secvenţa orfH522, s-a observat că aceştia precipită doar cu proteina de 16kDa, din mitocondriile plantelor androsterile. Aceste rezultate stabilesc că orfH522 codifică proteina de 16kDa. Folosind anticorpi faţă de 2 oligopeptide sintetice deduse din secvenţa proteică prezisă a orfH522 (Moneger şi colab., 1994) au obţinut aceleaşi rezultate.

În urma tratamentului cu carbonat de sodiu (Fujiki şi colab., 1982) s-a arătat că proteina de 16kDa este membranară ca şi cea de 13kDa de la porumb (Hack şi colab., 1991). Totuşi aceasta nu pare a fi o trăsătură generală a proteinelor asociate cu CMS, pentru că la Petunia, o proteină de 25kDa este prezentă şi în membrană şi în fracţia solubilă (Nivison şi Hanson, 1989).

S-a investigat prezenţa proteinei de 16kD de la PET1, şi în alte linii CMS. Din 26 de linii CMS (Horn, 1994), 9 au exprimat proteina de 16 kDa. Aceste linii CMS s-au obţinut fie prin încrucişări interspecifice ale speciilor H.argophyllus ,H.exilis, H.neglectus,H.petiolaris,2 subspecii de H.praecox fie prin mutageneza de la 2 menţinători ai citoplasmei PET1.

Exprimarea subunităţii alfa a F1-ATP-azei se modifică datorită patternului transcripţional al atpA şi co-transcripţiei genei atpA cu orfH522. Cei 2 transcripţi ai locusului atpA sunt prezenţi în fracţia polisomală totală din liniile androsterile şi hibride astfel încât subunitatea alfa a F1-ATP-aza poate fi translată din transcriptul normal ca şi din transcriptul adiţional asociat cu orfH522 (Moneger şi colab., 1994). În acest fel, exprimarea subunităţii alfa a F1-ATP -azei poate fi afectată de translaţia orfH522.

Subunitatea alfa a F1-ATP-azei reprezintă cel mai mare produs de translaţie “in organello” de la liniile fertile şi androsterile. Nivelul subunităţii alfa, din liniile fertile şi sterile, ca şi cel din restauratorii de fertilitate este similar, prezentând o masa moleculară identică, cu cea obţinută în urma digestiei cu proteaza V8, de la Staphyllococcus (Horn şi colab.,1991). Prin teste imunologice (ELISA indirectă ) s-a arătat că nu există nici o diferenţă între cantitatea de subunitate alfa a F1-ATP-aza de la

Page 13: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.)

63

linia fertilă BASO, de la linia CMS BASO şi restauratorii de fertilitate. Deci modificările în nivelul subunităţii alfa prezente în mitocondrii (Hustedt şi colab., 1992) nu par să aibă vreun rol în generarea CMS la plantele cu linia androsterilă PET1.

Studiul efectelor androsterilităţii citoplasmatice asupra principalelor caractere utile agronomic, la floarea-soarelui

Întrucât au fost identificate numeroase surse CMS este important pentru

amelioratori să cunoască avantajele genetice şi sau agronomice ale acestora, pentru a le putea exploata cu eficienţă maximă în programele de ameliorare.

Christov (1998) a evaluat performanţele agronomice pentru 9 genotipuri hibride, provenite din 13 surse CMS (PET1, PET4, ANN10, ANN14, ARG1, ARG3, ARG4, PRH1, PRR1, DEB1, PII4, GVL) şi a stabilit importanţa efectelor nucleare şi citoplasmatice pentru caracteristicile biologice studiate: înălţimea plantelor, diametrul capului şi conţinutul în ulei.

Principalele concluzii confirmă prevalenţa efectelor nucleare asupra celor citoplasmatice şi puternicele interacţii nucleu-citoplasmă.

1. Cantitatea de sămânţă. Nu s-au înregistrat efecte citoplasmatice semnificative asupra acestei însuşiri. S-au observat o serie de efecte pozitive pentru anumiţi hibrizi, combinaţii ale surselor CMS: ANN2 şi GIG1. Efecte negative s-au înregistrat în cazul folosirii liniilor CMS: ANN2, ANN4, PET2, MAX1, PET 1. 2. Inălţimea plantelor. La sursele ANN1, ANN2, PET2, PET1,s-a constatat că androsterilitatea citoplasmatică determină creşterea plantelor în înălţime. 3. Conţinutul în ulei. Nu s-au detectat efecte pozitive ci mai degrabă efecte negative în cazul hibrizilor ce au ca părinţi liniile CMS: ANL2, PET2, PET1. 4. Perioada de inflorire. Tendinţa noilor surse CMS este de a creşte durata înfloririi (hibrizii proveniţi din liniile CMS: ANL2, ANN1, ANN4, ANO1, BOL1, MAX1 şi PET1 sunt cu înflorire târzie). Prin analiza varianţei s-a aratat că interacţiile nucleu-citoplasmă sunt mai mari, în

cazul BOL1 , MAX1, ANO1, decât în cazul liniilor CMS GIG1 sau PET1. Efectele liniilor androsterile asupra unor caractere de importanţă agronomică

sunt în general reduse, rar sunt semnificative şi în multe cazuri au tendinţa de a determina efecte negative. O posibilă explicaţie este aceea că liniile inbred bazate pe citoplasma androsterilă PET1 au beneficiat de o ameliorare lungă, eforturile amelioratorilor conducând la o relaţie optimă între genotipul nuclear şi cel mitocondrial la H.petiolaris. Totuşi unele combinaţii nuclearo-citoplasmatice exprimă un potenţial ridicat pentru caracterele agronomice majore, dar în majoritatea cazurilor acestea sunt greu de prevăzut.

Aspecte generale privind conceptul de restaurare ă fertilităţii

Sistemele de restaurare a fertilitaţii sunt de două tipuri : sporofitice (care restaurează fertilitatea în ţesuturile sporofitice sau în alte ţesuturi, înainte de meioză ) şi gametofitice (care restaurează fertilitatea după meioză, la nivelul microsporilor sau la nivelul grăuncioarelor de polen). Aceste diferenţe antrenează modalităţi diferite de transmitere. Astfel: o plantă diploidă, heterozigotă pentru un restaurator dat, cu androsterilitate citoplasmatică, va produce două tipuri de grăuncioare de polen: cu şi

Page 14: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

IOANA ISPAS

64

fără restaurator. În cazul restaurării sporofitice, ambele clase de grăunciori vor fi funcţionale, în timp ce în cazul restaurării gametofitice, doar gameţii ce prezintă şi gena de restaurare vor fi funcţionali. Sistemele de restaurare sunt extrem de diferite, în principal în funcţie de numărul de gene de restaurare implicate. De exemplu: pentru porumbul androsteril T, citoplasma androsterilă PET1 de la floarea-soarelui şi citoplasma T de la ceapă restaurarea completă este asigurată de 2 gene de restaurare independente.

Se cunosc o serie de sisteme de restaurare care implică loci de restaurare duplicaţi. De exemplu: la porumb, gena Rf8 poate substitui parţial Rf1 pentru restaurarea fertilităţii citoplasmei T. O situaţie similară apare şi la citoplasma PET1 de la floarea-soarelui, citoplasma T de la ceapă şi CMS de la Phaseolus. Aceste funcţii suprapuse pot fi o consecinţă a duplicării funcţiilor genelor sau o indicaţie că restaurarea poate fi indusă de mecanisme extrem de diferite.

Restaurarea fertilităţii la floarea-soarelui

Folosirea liniilor androsterile în lucrarile de ameliorare la floarea-soarelui necesită

utilizarea unor restauratori de fertilitate întrucât hibrizii rezultaţi din combinaţiile liniilor androsterile cu alte linii sunt sterili.Prin experienţe în câmp agronomii au descoperit diferite linii capabile să restaureze parţial sau total fertilitatea hibrizilor.

O linie de restaurare a fertilităţii poate acţiona asupra uneia sau mai multor linii androsterile. S-a constatat astfel că : liniile CMS pot fi clar diferenţiate pe baza comportamentului lor faţă de liniile restauratoare de fertilitate. De exemplu: pentru linia androsterila GIG1 s-au identificat 2 linii de restaurare a fertilităţii din care una a fost derivată de la linia inbred obţinută prin încrucişarea dintre: HA89 (CMS) X MAX40. S-au obţinut seminţe de calitate bună, deşi polenul era galben şi uneori alb. În alte cazuri s-au format antere de mărime variată, cu o producţie moderată de polen.

Restaurarea fertilităţii polenului este din punct de vedere genetic expresia interacţiunilor dintre citoplasmă şi nucleu, întrucât la nivel molecular restaurarea fertilităţii este sub controlul genelor nucleare. În funcţie de linia de restaurare şi de sursa CMS, în acest proces sunt implicate una sau mai multe gene dominante, eventual complementare.

Determinismul genetic al restaurării fertilităţii la floarea-soarelui

În tabelul 2 sunt prezentate principalele date privind genetica restaurării fertilităţii la floarea-soarelui (H.annuus L).

Tabelul 2. Gene implicate în restaurarea fertilităţii la floarea-soarelui.

Codul FAO pentru liniile CMS

Gene implicate în restaurarea fertilităţii

Sursa sau modul de acţiune al genei

PET1 Rf1 T66006-2-1 o singură genă

dominantă Acc(MO)1338

Rf2 MZ-1398 Msc1 H.petiolaris

Page 15: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.)

65

Rf2 prezentă la părinţii femeli

Rf1,Rf2 2 gene complementare 4 gene 2 gene complementare,

dominante 2 gene complementare

dominante 3 gene complementare

dominante 2gene nonalelice, cumulative o genă dominantă soiul Progres 2 gene duplicate, dominante 2 gene complementare ANL1 o gena dominantă 2 gene 2 gene complementare 3 gene 3 gene independente PET2 2 gene dominante RPET2, CMG1 2 gene complementare CMG1 GIG1 o gena dominantă RGIG1, CMG2 MAX1 2 gene complementare RMAX1, CMG3 1 genă dominantă RHA274 (Rf1) ANT1 2 gene complementare Rf-ANT ANN2 o genaădominantă P21, RMAX1, PPI413178 ANN3 o genă dominantă P21, RPET2, PI

413180,RHA280 RIG1 2 gene complementare RPET2 PEF1 2 gene complementare Zaria, HA60.

Ipoteze privind modul de acţiune al alelelor restauratoare Pentru a explica acţiunea alelelor retauratoare nucleare au fost emise următoarele ipoteze:

Daca apariţia CMS este determinată de disfuncţii mitocondriale, atunci restauratorii compensează sau înlocuiesc funcţia genei mitocondriale distruse. Bonnett şi colab. (1991) sugerează că restaurarea nucleară de la formele cultivate ce au CMS provenită de la Nicotiana, poate declanşa introducerea în celule, a produşilor genelor mitocondriale astfel încât instrucţiunile nucleare proprii sunt folosite pentru a corecta deficienţele în funcţionarea mitocondriilor. Daca CMS apare ca rezultat al achiziţiei unor gene noi şi care generează o

substanţă toxică, genele nucleare implicate în restaurarea fertilităţii afectează abundenţa genei ce codifică substanţa toxică sau chiar exprimarea acestei gene. Acest utim model coincide cu datele obţinute la Petunia (Pruitt şi Hanson,1991), porumb (Zea mays) (Dewey şi colab.,1987, Wise, 1987), orez (Kadowaki şi colab.,1990).La porumb şi petunie, acţiunea genelor nucleare implicate în restaurare se traduce prin reducerea exprimării genelor de la locusurile himerice la nivelul tuturor ţesuturilor. La linia CMS Petiolaris de la floarea-soarelui,

Page 16: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

IOANA ISPAS

66

analiza restaurării fertilităţii sugerează că abundenţa redusă a transcriptului este specifică celulelor mamă, premeiotice ale polenului (Smart şi colab., 1993).

• O altă ipoteză este corelaţia dintre genele de restaurare şi genele implicate în controlul recombinării DNA mitocondrial, al amplificării sau menţinerii moleculelor substoechiometrice. Introducerea genelor de restaurare ale fertilităţii poate determina alterări ale genomului mitocondrial sau amplificarea preferenţială a moleculelor substoechiometrice preexistente. • Editarea RNA în mitocondriile plantelor (Covello şi Gray, 1989, Gualberto, 1989, Hiesel, 1989) reprezintă un alt mecanism potenţial care explică acţiunea genelor de restaurare a fertilităţii întrucât editarea diferenţială la plantele restaurate va permite obţinerea de transcripţi cu structură primară şi secundară alterată.

La fasole, prezenţa alelelor restauratoare este determinată de deleţia DNA mitocondrial la nivelul unei regiuni specifice (Mackenzie şi colab.,1988, Mackenzie şi Chase, 1990, Johns şi colab., 1992). Alterarea genomului mitocondrial începe în generaţia F1 şi determină o fertilitate parţială a polenului.Restaurarea incompletă a fertilităţii se pare că este generată de heteroplasmie. În generaţia F2 se observă deja pierderea segmentului mitocondrial. Prezenţa regiunii modificate din DNA mitocondrial este asociată cu sterilitatea în ţesuturile verzi ale plantelor F2 şi cu restaurarea fertilităţii şi absenţa secvenţei mitocondriale deletate din polenul F2 restaurat (Johns şi colab., 1992 ). Aceste date sugerează că segementul din DNA mitocondrial este pierdut înainte sau în cursul meiozei şi al microgametogenezei. Observarea semisterilităţii la plantele F1 şi la un numar mic de plante F2 reprezintă un model al schimbărilor graduale ce afectează mitocondria în cursul dezvoltării plantei. Nu este clar modul în care genele de restaurare afectează structura genomului mitocondrial în diferite stadii ale dezvoltarii plantei.

Un model alternativ care să explice acţiunea genelor de restaurare ale fertilităţii este cel realizat pentru Brassica polima -linia androsterilă. Organizarea genei mitocondriale atp6 din linia androsterilă de la ridiche (Raphanus sativus) (Makaroff, 1989) şi de la Brassica napus şi Polima napus (Singh şi Broun, 1991) este diferită. La ridichi şi în liniile androsterile de la Brassica napus, regiunea 5’ a genei atp6 din ADN mitocondrial, respectiv a genei RNAt şi a pseudogenei RNAt sunt localizate şi modificate în DNA mitocondrial din citoplasma de la Polima. Capătul 5’ al moleculelor RNAm corespunzatoare atp6 normale, la Raphanus sativus (ridiche) şi la Brassica napus este probabil format prin procesarea RNAt.

Obţinerea CMS de la Polima este aparent limitată de rearanjări care au loc mai sus de situsul de procesare. Deci produşii genelor de restaurare ale fertilităţii pot fi cauza alterării subtile a specificităţii maşinăriei de procesare ca şi schimbări în configuraţia transcriptului, care pot fi recunoscute şi procesate local.

Iwabuchi şi colab. (1993) au propus un model de restaurare a fertilităţii prin care procesarea urmată de editarea completă a RNA alterat din mitocondrie antrenează restaurarea fertilităţii la liniile androsterile de orez. Ei au demonstrat că procesarea RNA influenţează editarea post-transcripţională. Genele nucleare implicate în restaurarea fertilităţii care codifică enzime ce procesează RNA post-transcriptional, promovează producerea de proteine funcţionale. Deci interacţiile dintre procesarea şi editarea RNA

Page 17: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.)

67

au un rol esenţial în controlul exprimării androsterilităţii citoplasmatice şi în restaurarea fertilităţii la plante.

S-a demonstrat experimental că în mitocondriile plantelor are loc poliadenilarea RNAm (figura 6). Astfel s-a izolat RNAm din mitocondriile plantelor fertile, sterile şi restauratoare care a apoi fost reverstranscris folosind un primer oligo(dT)18. DNA complementar obţinut a fost amplificat prin reacţia PCR cu ajutorul unui primer adaptor corespunzător şi al unui primer specific pentru secvenţa orf de interes. Produşii PCR obţinuţi aveau dimensiuni de 190pb. După clonare şi secvenţiere s-a constatat că toate clonele aveau secvenţa poliA de 17-21nucleotide care corespunde aproximativ cu lungimea oligo(dT) primerului folosit pentru sinteza ADN complementar.

La floarea- soarelui linia sterilă este caracterizată prin prezenţa RNAm dicistronic aferent atpA-orf522 .Nivelul acestui transcript este redus după restaurarea fertilităţii într-un mod dependent de tipul de ţesut. Astfel fenomenul se observă doar în florile mascule ale plantelor hibride restaurate dar nu şi în ţesuturile vegetative ale acestora. S-a demonstrat că transcripţii atpA-orf522 pot fi poliadenilaţi in vivo la capătul lor 3’ terminal, procesul având loc în cotiledoane şi flori mascule.

Figura 4. Sitususri de poliadenilare identificate la nivelul ADN mitocondrial de la plantele sterile şi restauratori.

Page 18: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

IOANA ISPAS

68

Restauratori de fertilitate la floarea-soarelui

La floarea-soarelui, seminţele sunt recoltate si folosite în câmp şi de aceea hibrizii F1 trebuie să fie fertili. Fertilitatea liniilor mascule poate fi restaurată prin introducerea prin incrucişare a genelor nucleare denumite Rf (restorer fertility). Pentru a conferi fertilitate liniilor CMS sunt necesare una sau mai multe gene de restaurare a fertilităţii, în funcţie de sursa CMS. Restaurarea şi transmiterea genelor de restaurare a fertilităţii la floarea-soarelui, pentru linia PET1 ca şi pentru noile surse CMS este prezentată de Miller (1992).

Kinman(1970) a raportat pentru linia de floarea-soarelui T66006-2-1 prezenţa unei singure gene de restaurare a fertilităţii, gena dominantă Rf1. Plecând de la aceasta linie, folosind seminţe hibride, s-au obţinut pentru uz agronomic diferite linii de restaurare ale fertilităţii. În 1971 Vrânceanu şi Stoenescu au iniţiat o serie de cercetări privind prezenţa diferiţilor factori de restaurare ai fertilităţii în unele backgrounduri geografice.

S-a observat că, doar sursa MZ-1398, derivată din populaţia locală Mezehedeshy are restauratori de fertilitate. S-a determinat prezenţa unei singure gene dominante ce controlează restaurarea: Rf2. Enns şi colab. (1970) care au lucrat pe linii canadiene, derivate din încrucisarea între floarea-soarelui cultivată şi floarea-soarelui salbatică, au raportat că restaurarea fertilităţii este controlată de către o singură genă dominantă. Fick şi colab(1974) au încrucişat liniile de restaurare ale fertilităţii Acc(Mo) 1338 din Canada şi bcl-17-2-2 din Franţa cu o linie derivată de la T66006-2-1. S-a ajuns la concluzia că linia canadiană poartă gena Rf1 de restaurare a fertilităţii, în timp ce sursa franceză de restaurare poartă o genă sau mai multe, diferite de Rf1.

Kinman (1974) a arătat că, pentru ca fenomenul de restaurare a fertilităţii să se exprime complet, este necesară şi o a doua genă dominantă, complementară cu Rf. El a descoperit în populaţia F2, (rezultată în urma încrucişării CMS PET1 cu o linie compozită R1970), un raport de segregare de 9:7(fertil/steril), şi a denumit această genă Rf2.Astfel au fost obţinute o serie de plante homozigote Rf2Rf2, mascule şi femele sterile, cu citoplasmă PET1. Întrucât a fost prezentă doar gena Rf2, plantele parentale femele au exprimat o sterilitate completă.

Vranceanu şi Stoenescu (1978) au determinat relaţiile alelice între diferite surse de gene de restaurare ale fertilităţii. Încrucişările între sursele MZ1398 şi T66006-2-1B au indicat că MZ-1398 are o genă de restaurare diferită, alta decât Rf1 din T66006-2-1B. Ei au confirmat că T66006-2-1B şi MO-1338 din Canada au aceeaşi genă Rf1.Controlul genetic al restaurării fertilităţii polenului pare să fie dat de acţiunea cumulativă a 2 gene dominante non-alelice, ce dau un raport de segregare de 9:6:1 (fertil/parţial fertil /steril). Acest studiu şi datele prezentate de Fick şi colab. (1974) au indicat că factorul de restaurare derivat din aceste linii este codificat de o genă diferită de Rf1 sau de Rf2.

Dominguez-Gimenez şi Fick (1975) au raportat prezenţa a 4 gene de restaurare ale fertilităţii printre descendenţii de tip sălbatic H.annuus şi H.petiolaris, şi a presupus că cel puţin 2 alele dominante trebuie să fie prezente la unul din cei patru loci, pentru a se exprima complet restaurarea fertilităţii.

Una dintre genele care par a fi prezente la părinţii femeli din liniile androsterile de HA89(PET1), confirmă concluziile lui Kinman (1970), Fick şi Zimmer (1974b) şi anume că majoritatea liniilor CMS au factori de restaurare.

Artemenko (1987) a arătat că o singură genă dominantă a controlat restaurarea liniei CMS OD2625. Gena de restaurare descoperită îşi are originea în linia Progress (derivată din încrucişarea interspecifică între H.tuberosus L. şi H.annuus ). Această genă

Page 19: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.)

69

ca şi cea care codifică restaurarea fertilităţii la H.petiolaris au fost localizate pe cromozomi homologi(nu s-au observat fenomene de crossing-over între ele ).

Kukosh (1984) a raportat prezenţa unei singure gene dominante Rf1, responsabilă de restaurarea fertilităţii mascule pentru linia androsterilă derivată de la H.annuus ssp. Lenticularicke ,sau citoplasma CMS ANL1. S-au descoperit totuşi câteva linii menţinătoare ale PET1, ce pot restaura CMS ANL1. Aceste gene se disting funcţional de Rf1 şi Rf2, prin aceea că plantele purtatoare prezintă antere normale dar sterile, când sunt prezente în genomul plantelor cu citoplasma PET1. Acest studiu confirmă prezenţa factorilor de restaurare Rf, la părinţii CMS PET1.

Cercetări ample întreprinse de Anashchenko şi Kukosh (1984) şi Anashchenko şi Duka (1985 ) au confirmat controlul genetic al restaurării fertilităţii mascule la floarea-soarelui. Ei au studiat 40 de linii de restaurare a fertilităţii, din punct de vedere al controlului genetic, la nivelul citoplasmei androsterile PET1. S-a constatat că 5 dintre ele controlează restaurarea prin 2 gene dominante independente, în timp ce 4 linii controlează restaurarea prin 2 gene dominante complementare. CMS ANL1 a fost restaurată de 11 din cele 27 de linii, printr-o singură genă dominantă. În schimb, alte linii au controlat restaurarea prin: 3 gene non-alelice dominante, 2 gene dominante complementare şi 3 gene dominante complementare. La o linie s-a constatat că controlul genetic al restaurării fertilităţii s-a realizat prin 2 gene non-alelice cu efecte cumulative iar în generaţia F2 s-au observat 3 clase fenotipice în raportul 1:2:1(fertil/parţial fertil/steril). Anaschchenko şi colab. (1974) au observat că restaurarea fertilităţii la liniile androsterile ANL1 este mai complexă decât la liniile androsterile PET1, fiind implicate mai mult de 3 perechi de gene ce controlează restaurarea fertilităţii. Lucrând cu linii de restaurare a fertilităţii pentru liniile androsterile ANL1 şi PET1 Anaschchenko şi Duka (1986) au descoperit linii care au 2 gene non-alelice ce controlează restaurarea fertilităţii, la liniile androsterile ANL1 şi PET1.

Liniile BC8, CMS HA89 (PET2), CMS HA89 (GIG1) şi CMS HA89(MAX1) au apărut prin substituiri la nivelul ADN din genomul HA89 cu secvenţe de ADN de la plantele cu androsterilitate citoplasmatică CMG1, CMG2, şi CMG3 (Miller&Wolf, 1991). Plantele fertile au fost apoi încrucişate, pentru a produce linii de restaurare RPET2, RGIG1 si RMAX1 (Miller si Wolf,1991).Pentru a studia modul în care se transmite restaurarea cele 3 surse CMS, liniile respective au fost apoi încrucişate cu liniile corespunzătoare de restaurare a fertilităţii (Kurai şi Miller,1992). Analiza descendenţilor BC1F1 din F2, a indicat că au fost necesare 2 gene dominante pentru restaurarea completă a fertilităţii la RPET2. Această concluzie a fost diferită de cea a lui Whelan (1980), care în studiile sale preliminare a indicat că restaurarea completă a necesitat 2 gene dominante complementare. O genă dominantă din RGIG1 şi 2 gene dominante complementare din RMAX1 controlează restaurarea citoplasmei respective. Linia RHA274(Rf1) nu a fost eficientă în restaurarea fertilităţii la liniile androsterile PET2 şi GIG1, deşi o genă dominantă din RHA274 a controlat restaurarea fertilităţii la linia androsterilă MAX1.

Iuoras şi colab.(1992) au descoperit o nouă sursă CMS, stabilă la diferite condiţii de mediu: CMS ANT1, derivată de la H.annuus ssp texanus Heiser. În studii pe plante fertile provenite din încrucişarea CMS ANT1 cu H.annuus ssp. Texanus, s-a descoperit că o singură genă dominantă, controlează restaurarea fertilităţii la liniile androsterile. Linia restauratoare a fost denumită Rf-ANT.

Plante androsterile au fost descoperite şi la liniile de H.annuus: PI 413178 şi PI 413180 (Jan, 1988). Aceste surse de CMS stabile au fost denumite ANN2 şi ANN3.

Page 20: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

IOANA ISPAS

70

Sursele CMS au fost încrucişate cu testere de restaurare şi cu plante fertile rezultate de la PI413178 şi PI 413180 (Jan,1991). Liniile P21, RMAX1 şi linia fertilă 413178 au restaurat linia CMS ANN2 (controlată de o singură genă dominantă ), în timp ce P21, RPET2 şi linia fertilă 413180 au restaurat linia CMS ANN3 (controlată de o singură genă dominantă) iar linia RHA280 a restaurat CMS ANN3 (controlată de 2 gene complementare dominante).

Restaurarea fertilităţii la liniile androsterile de floarea-soarelui este controlată de aranjamente complexe de gene ce reacţionează variabil faţă de liniile CMS. Studiile de transmitere a restaurării fertilităţii sunt complicate de genele complementare existente în câteva linii parentale femele ca şi de genele prezente în liniile de restaurare a fertilităţii.

Sunt necesare în viitor studii complexe, la nivelul genelor alele, pentru a se face distincţie între genele implicate în restaurarea fertilităţii liniilor androsterile şi a determina corelaţiile existente între genele corespunzătoare aflate in liniile androsterile respective.

Perspective

Actualmente se studiază corelaţiile dintre apoptoză la plante şi cea de la mamifere din punct de vedere al căilor moleculare de semnalizare. De exemplu s-a analizat modul de eliberare al citocromului c, ceea ce antreneză casacada de enzime proteolitice care determină degradarea specifică a DNA nuclear şi moartea celulară. Analiza imunocitochimică a arătat că citocromul c a fost eliberat din mitocondrii în celulele tapet înainte de evenimentele morfologice asociate cu moartea celulară. Cercetările cu markeri biochimici şi morfologici specifici apoptozei, efectuate pe citoplasma PET1 de la floarea-soarelui (Baker, 2001) au indicat că aceasta sursă determină apoptoza prematură a celulelor tapetului care se extinde ulterior si în alte ţesuturi ale anterelor. Bibliografie selectivă

BINO, R. J. (1985). Histological aspects of microsporogenesis in fertile, cytoplasmic male sterile and restored fertility Petunia hybrid.Theor.Appl.Genet.,69,423-428. BLUM, B., SIMPSON, L. (1992). Formation of guideRNA/mRNA chimeric molecules in vitro, the initial step of RNA editing is dependent on an anchor sequence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 89: 11944-11948. BRAUN, C. J., SIEDOW, J. N., WILLIAMS, M. E., LEVINGS III, C. S. (1989). Mutations in the maize mitochondrial T-urf 13 gene eliminate sensitivity to a fungal pathotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 86, 4435-4439. BRAUN, C. J., SIEDOW, J. N., WILLIAMS, M. E.,LEVINGS III, C. S (1990). Fungal toxins bind to the urf 13 protein in maize mitochondria and E.coli.Plant Cell,2,153-161. BURLOV, V. V. (1974). Utilization of male sterility in sunflower breeding for heterosis p.353-360.In Proc.6th. Int.Sunflower Conf. Bucharest, Romania.22-24 July, 1974.Int. Sunflower Assoc.Paris, France. CONNETT, M. B., HANSON, M. R., (1990).Differential mitochondrial transport through the cyanide-sensitive and cyanide insensitive pathway in isonuclear lines of cytoplasmic male sterile ,male fertile and restored Petunia. Plant Physiol., 93, 1634-1640. COVELLO, P. S., GRAY, M. V. (1989). RNA editing in plant mitochondria. Nature, 341, 662-666.

Page 21: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.)

71

CROUZILLAT D., LEROY, P. PERRAULT A., LEDOIGT G. (1987).Molecular analysis of the mitochondrial genome of Helianthus annuus in relation to cytoplasmic male sterility and phylogeny. Theor. Appl. Genet. 74:773-780.. DEWEY, R. E., LEVINGS III, C. S., TIMOTHY, D. H. (1986). Novel recombinations in the maize mitochondrial genome produce a unique transcriptional unit in the Texas male sterile cytoplasm. Cell, 44, 439-449. DEWEY, R. E., LEVINGS III, C. S., TIMOTHY, D. H (1987). A mitochondrial protein associated with cytoplasmic male sterility in the cytoplasm T of maize. Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 84, 5374-5378. FAURON, C. M., CASPER, M., GESTELAND, R., ALBERTSEN, M. (1992). A multi recombination model for the mitochondrial rearrangements seen in maize CMS-T regenerated plants. The Plant J., 2, 949-958. FOLKERTS, O., HANSON, M. R. (1991). The male sterility-associated pcf gene and the normal atp9-1 gene in Petunia are located on different mitochondrial DNA molecules. Genetics, 129, 885-895. FUJIKI Y., HUBBARD AL., FOWLER S., LAZAROW PB. (1982). Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate tratment: application to endoplasmatic reticulum. J. Cell Biol. 93, 97-102. GEORGIANA -TODOROVA J. (1984). Interspecific hybridisation in the genus Helianthus L. Z. Planzenzuchtg. 93:265-279. GERSTEL, D. U. (1980). Cytoplasmic male sterility in Nicotiana. Tech. Bull. N. C. Agr. Res. Ser., 2635, 1-31. HAHN, V., FRIEDT, W. (1992). Molecular analysis of the mitochondrial DNA of cytoplasmic male sterile sunflower cytoplasm MAX1. In: Proc.13 th International Sunflower Conf. Pisa, Italy, pp. 1466-1471. HAHN, V., FRIEDT, W (1994). Molecular analysis of the CMS-inducing MAX1 cytoplasm in sunflower. Theor. Appl. Genet. (in press). HAKANSSON, G., GLIMELIUS, K., BONNETT, H. T. (1990). Respiration in cells and mitochondrial of male fertile and male sterile Nicotiana species. Plant Physiol., 93, 367-373. HANSON, M. R. (1991). Plant mitochondrial mutations and male sterility. Annu.Rev. Genet., 25, 461-486. HERNOLD, M., SUHARSONA, S., LITVAK, S., ARAYA, A. (1992). Male sterility induction in transgenic tobacco plants with non-edited atp9 mitochondrial gene from wheat. In Book of poster abstracts XIII th Eucarpia Congress, pp. 85-86. HORN, R., KOHLER, R. H., ZETSCHE K. (1991). A mitochondrial 16kDa protein is associated with cytoplasmic male sterility in sunflower. Plant Mol. Biol. 17, 29-36. HORN R. (2001) . Molecular diversity of male sterility inducing and male fertile cytoplasms in the genus Helianthus. Theor. Appl. Genet. (im Druck). HORN, R., HUESTEDT J. E. G., HORSTMEYER A. (1996). The CMS-associated 16 kDa protein encoded by orfH522 is also present in other male sterile cytoplasms of sunflower. Plant Mol. Biol. 30: 523-538. KOHLER R.H., HORN R., LOSSL A.,ZETSCHE K. (1991). Cytoplasmic male sterility in sunflower is correlated with the co-transcription of a new open reading frame with the atpA gene. Mol. Gen. Genet. 227: 369-376. HORN R., FRIEDT W. (1998) .CMS mechanisms in sunflower – How many are there? In: Plant Mitochondria: From Gene to Function, eds. IM Moller, P Gardestrom, K Glimelius, E Glaser, Backhuys Publishers, Leiden, S. 79-82.

Page 22: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

IOANA ISPAS

72

IWABUCHI, M., KYOZUKA J., SHIMAMOTO, K. (1993). Processing followed by complete editing of an altered mitochondrial atp6 RNA restores fertility of cytoplasmic male sterile rice. EMBO J., 12, 1437-1446. JOHNS, C., LU, M., LYZNIT, A., MACKENZIE, S. (1992). A mitochondrial DNA sequence is associated with abnormal pollen development in cytoplasmic male sterile bean plants. The Plant Cell, 4, 435-449. KADOWAKI, K. I., SUZUKI, T., KAZAMA, S. (1990), A chimeric gene containing the 5’ portion of atp6 is associated with cytoplasmic male sterility of rice. Mol. Gen. Genet., 224, 10-16. KAUL, M. L. H. (1988). Male sterility in higher plants. In:Monographs an theoretical and Applied Genetics, Springer -Verlag, Berlin Heidelberg, New York, vol10, pp. 758-775. KINMAN, M. L. (1970). New developments in the USDA and state experiment station sunflower breeding programs, p.181-183. In Proc. 4th. Int. Sunflower Conf. Memphis, T. N. 23-25 June (1970). Int. Sunflower Assoc.Paris France. KOHLER, R., HORN, R., LOSSL, A., ZITSCKE, K. (1991). Cytoplasmic male sterility in sunflower is correlated with the co-transcription of a new open reading frame with the atp A gene. Mol. Gen. Genet., 227, 369-376. KURAL A., J. F., MILLER (1992). The inheritance of male fertility restoration of the PET2, GIG1 and MAX1 sunflower cytoplasmic male sterility sources p.1107-1112.In Proc.13 th Int.Sunflower Conf. Pisa Italy 7-11 Sept.,1992.Int. Sunflower Assoc. ,Paris , France. LEAVER, C. J. (1991). Mitochondrial Genetic Information In: Huang A. H. C. (ed). Molecular Approaches to Compartimentation and Metabolic Regulation.American Society of Plant Physiologists. pp. 48-58. LECLERCQ P. (1966). Une sterilite male utilisable pour la production d’hybrids simples de tournesol. Ann. Amelior. Plant, 16, 135-144.. LEROY P., BAZETOUX S., QUETIER F., DELBUT, J., BERVILLE A. (1985). A comparison between mitochondrial DNA of an isogenic male sterile (S) and male fertile (F) coryle (HA 89) of sunflower. Curr. Genet 9, 245-251. LU, B., HANSON, M. R. (1992). A single nuclear gene specifies the abundance and extend of RNA editing of a plant mitochondrial transcript. Nucleic Acids Res., 20, 5699-5703. MACKENZIE S. A., CHASE PR, D. R., BASSETT, M. J. (1988). Mitochondrial DNA rearrangement associated with fertility restoration and cytoplasmic male sterility in Phaseolus vulgaris L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 2714-2717. MARIANI C., GOSSELE, V., DE BEUCKELEER, M., DE BLOCK ., M. GOLDBERG, R. B., DE GREEF, W. (1992). A chimeric ribonuclease inhibitor gene restores fertility to male sterile plants. Nature, 357, 384-387. MILLER J. F., S. L.,WOLF (1991). Registration of three cytoplasmic male sterility and three restorer sunflower germoplasm lines. Crop Sci., 31, 500. MONEGER F., SMART, C. J., LEAVER, C. J. (1994). Nuclear restoration of cytoplasmic male sterility in sunflower is associated with tissue -specific regulation of a novel mitochondrial gene. EMBO J., 13, 8-17. NIVISON H., HANSON T., M. R. (1989). Identification of a mitochondrial protein associated with cytoplasmic male sterility in Petunia. Plant Cell, 1, 1121-1130. RECIPON H. (1990). The sequence of the sunflower mitochondrial ATP-ase subunit 9 gene. Nucl. Acids Res. 18, 1644.

Page 23: Caracterizarea moleculara a citoplasmei androsterile PET1 ...ebooks.unibuc.ro/biologie/biotehnologie/articolul5.pdf · America de Nord. În principal, seminţele sale sunt folosite

Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.)

73

SAMALL, I., SUFFOLK, R., LEAVER, C. J. (1989). Evolution of plant mitochondrial genomes via substoechiometric intermediates. Cell, 58, 69-76. .SCHEIKE, R., GEROLD, E, BRENNICKE A., MEHRING -SEMPLER, M.,WRICKE, G. (1992). Unique patterns of mitochondrial genes transcripts and proteins in different male sterile cytoplasms of Daucus carota. Theor. Appl. Genet., 83, 419-427. SICULELLA L., PALMER JD. (1988). Physical and gene organization of mitochondrial DNA in fertile and male sterile sunflower CMS-associated alterations in structure and transcription of the atpA gene. Nucleic Acids Res., 16, 3787-3799. SKORIC, D. (1988). Sunflower breeding. Uljarstvo, 25 (1), 1-90. SMART, C. J., LEAVER,C. J. (1993). Cell specific regulation of the mitochondrial genome during male flower development in sunflower. Journal of Cellular Biochemistry.Keystone Symposia and Molecular and Cellular Biology, pp.24. SNEEP J., HENDRIKSEN, A. J. T. (1979). Plant Mitochondria. Publication of Kouinklijk Kweekbedrijf en Zaadhandel D. J. von der Have 1879-1979, Pudoc,Wageningen, pp. 127-130. SPASSOVA. M., MONEGER, F., LEAKER, C. J., CRISTOV M., ATANASSOV, A. NYKAMP, H. J. J., HILLE, J. (1993). Molecular analysis of three independently selected cytoplasmic male sterile sunflower sources.Mol.Gen.Genet.,submitted. WHELAN, E. D. P. (1978). Hybridzation between annual and perennial diploid species of Helianthus. Can. J. Genet. Cytol. 20, 523-530. WHELAN, E. D. P., W. DEDIO (1980). Registration of sunflower germoplasm composite crosses CMS 1,CMS2,CMS3. Crop Sci. 20, 832. YOUNG, E., G., HANSON, M. R. (1987). A fused mitochondrial gene associated with cytoplasmic male sterility is developmentally regulated. Cell, 50, 41-49. ZABALETA, E., MOURAS A., HERNOULD, M., SUHARSONO AND ARAYA A. (1996). Transgenic male-sterile plant induced by an unedited atp9 gene is restored to fertility by inhibiting its expression with antisense RNA. Proceedings of the National Academy Sciences of the USA 93: 11259-11263.