5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelora. Vectori liniari minimalib. Vectori cu secvenţe repetitivec. Transpozonid. Vectori retroviralie. Vectori episomali

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelorSunt utilizați pentru a crește frecvența integrării sau menținerea transgenelor ca minicromozom în celula gazdăa. Vectori liniari minimaliSe utilizează:• fragmente de genom (1-2 gene)• constructe geniceVectorii - se linearizează înainte de integrare Vectorii circulari distrug transgena asociată lor, dacă este scurtăVectorii care conţin fragmente lungi de ADN – puţin sensibili la silenţierea de către secvenţele procarioticeIntegrarea genelor în cele mai multe din cazuri - rată scăzută de integrare unele transgene conţin secvenţe care favorizează replicarea lor şi menţinerea în embrion

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelorb. Vectori cu secvenţe repetitiveIntegrarea – implică o recunoaştere între gena străină ce trebuie inserată şi genomul gazdăRecunoaşterea - capetele genei străine trebuie să conţină secvenţe repetitive similare cu ale genomului gazdăExempleVacă – o secvenţă prezentă din abundenţă în centromeri adăugată genei de inserat crește frecvenţa integrăriiŞoarece – secvenţele Alu (200-300 nucleotide) sunt prezente în genomul mamiferelor, în vecinătatea sau în regiunile transcrise

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelorc. Transpozoni• secvenţe scurte (2 pb)• copii multiple prezente în situsuri aparent aleatorii• transcrişi în ARN şi retranscrişi în ADN dublu catenar, care se integrează foarte eficient în genom• integrarea – realizată de o transpozază, codificată de transpozon, şi prezența unor secvenţe repetitive inversate(ITR), de la capetele transpozonului• pentru a funcţiona ca vectori, se îndepărtează gena transpozazei şi se înlocuieşte cu gena de interes• transpozaza (împreună cu un plasmid) se coinjectează odată cu transpozonul care conţine gena străinăRata integrării – 1-5%

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelorUtilizarea transpozonilor ca vectori pentru transferul ADN străin.Gena transpozazei este înlocuită cu gena de interes. Transpozonul recombinant se injectează în celule. Odată cu transpozonul se coinjecteaza un vector care conține gena pentru integrază (transpozaza). Transpozonul se integrează folosind secvenţele ITR.

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelorc. TranspozoniEx. “sleeping beauty” – utilizaţi pentru generarea şoarecilor transgeniciGăină – protocol modificat transpozonii se introduc în embrionul în stadiul de o celulă şi apoi în gălbenuşul unui ou care nu adăpostește un embrionTranspozonii pot adăposti fragmente de ADN cu lungime limitatăDezavantaje limitează expresia unui construct genic sofisticat mecanismele care inactivează transpozonii pot inhiba expresia transgenei

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelor

Transpozon sleeping beauty. Transpozonul sleeping beauty, care poartă o genă de interes, este “tăiat” (cut) din plasmid de către transpozază şi apoi “lipit” (paste) direct în cromozomul gazdă.

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelord. Vectori retroviraliSe folosesc în special pentru generarea puilor de găină transgenici (conţin o anvelopă care recunoaşte celulele embrionare de pui)Se injectează în ouăle proaspăt ouate, care conțin încă celule pluripotenteMetoda – ineficientă. Doar un număr foarte mic din

cele 60 000 de celule embrionare pot fi infectate. Puii sunt extrem de mozaicați pentru transgenă

La vacă şi maimuţă se foloseşte un vector cu proteina G a VSV (vesicular stomatitis virus) în anvelopă, care recunoaşte fosfolipidele de membrană injectarea se face între zona pellucida şi membrana oocitului, în perioada în care lipseşte membrana nucleară

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelorUtilizarea vectorilor retrovirali pentru generarea de animale transgenice. Genomul viral care adăposteşte gena străină se introduce în celule transcomplementare, care sintetizează proteinele virale lipsă. Particulele virale se folosesc pentru a infecta oocite mamaliene (vacă, maimuţă), celule germinale primordiale de la păsări sau celule embrionare de şoarece.

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelord. Vectori retroviraliLentivirusurile – subpopulaţie de retrovirusuri (ex. HIV)• Le lipsesc enhancerii• Conţin un element reglator care favorizează expresia genelor • Fie se injectează în celulele embrionare, fie se incubează cu

embrioni la care se îndepărtează zona pellucida• Randament foarte bun la şoareciLimite• Trebuie preparate cantităţi mari de virusuri• Metoda trebuie foarte strict standardizată• Nu pot fi introduse fragmente mai mari de 7-9 kb• Au loc integrări independente ale vectorilor în acelaşi embrion

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelore. Vectori episomaliDezavantajele vectorilor• integrarea se face cu o rată scăzută• gena integrată este supusă acţiunii mediului, care modifică expresia transgenei• numărul copiilor integrate este limitat (max. 10)Episomii Reprezintă echivalentul eucariotic al plasmidelor bacteriene Rezultă din degradarea parțială a cromozomilor Adăpostiţi în special de bacterii şi celulele tumorale Au genom circular sau linear Cei lineari trebuie să conţină telomeri Cei utilizaţi în transgeneză sunt mici, conţin doar elementele necesare replicării şi transmiterii celulelor fiice

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelore. Vectori episomaliYAC• Conţin telomeri, originea replicării, un centromer, o genă de selecţie şi un situs de clonare• Sunt compacţi şi ușor de manipulat• Pot conține până la 1000 kb• Dezavantaj – instabiliBAC Pot adăposti până la 250 pb Pot fi obţinuţi în bacterii prin recombinare homoloagă Sunt cei mai eficienţi dintre vectori

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelor

Structura unui vector YAC (yeast artificial chromosome).Vectorul conţine originea replicării ADN (ARS 1), un centromer (CEN 4), care face posibilă distribuirea vectorului în celulele-fiice, telomeri, două gene de selecţie (TRP 1 şi URA 3) şi un situs de clonare în care pot fi introduse până la 1000 pb.

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelore. Vectori episomaliVirusul Epstein-Barr (EBV)• Are propria origine a replicării (ori P) şi un sistem pseudocentromeric• Pentru replicare, are nevoie de ori P şi EBNA 1 (Epstein-Barr nuclear antigen)Ori P O regiune de replicare (activă doar la câine şi primate), care poate fi îndepărtată şi înlocuită cu fragmente ADN de la om sau alte mamifere A doua regiune – pentru transmiterea genomului viral celulelor fiice Ambele regiuni se leagă la EBNA 1

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelorStructura unui vector episomal, bazat pe genomul unui virus de tip Epstein-Barr (EBV).Proteina EBNA 1, codificată de genomul EBV, se leagă la o altă regiune a genomului EBV. EBNA 1 se leagă de o proteină a celulei gazdă, EPB 2, care se poate asocia nespecific de elemente ale cromatinei. Acest sistem asemănător centromerului permite vectorului să fie transmis celulelor-fiice. Originea replicării EBV este activă numai în celulele primatelor și a câinelui.

5. Vectori utilizaţi pentru inserţia genelore. Vectori episomaliHAC Conţin originea replicării, un centromer şi telomeri Se obţin prin mutaţii aleatorii care elimină o mare parte a cromozomului, dar păstrează minimum de elemente pentru a forma un sistem autonom Sunt greoi de manipulat, iar genele se introduc cu dificultate Fragmentele genomice lungi pot interfera cu fiziologia animalului sau cu gena de interes

Nu există deocamdată disponibili vectori episomali satisfăcători

6. Vectori utilizaţi pentru înlocuirea genelor ţintă Pentru a fi posibilă recombinarea a două fragmente de ADN, secvenţa comună a ADN trebuie să conțină• câteva sute de pb la bacterii• 20-50 pb drojdii• câteva mii pb în celulele animaleDacă există o singură regiune homoloagă – integrare ţintită a ADN străinDacă există două regiuni homoloage – recombinările se petrec independent şi duc la o înlocuire specifică a unui domeniu genomicSecvenţa (transgena) străină• poate întrerupe gena ţintită, care devine inactivă (knock-out)• poate fi o genă activă (knock-in)

6. Vectori utilizaţi pentru înlocuirea genelor ţintăa. Knock-out

6. Vectori utilizaţi pentru înlocuirea genelor ţintăa. Knock-out• Celulele în care genele străine se integrează prin recombinare homoloagă se selectează cu vectori de tipul neo şi TK (sau DT)• Vectorul conţine o genă care oferă rezistenţă la neomicină - neo; aceasta se află sub controlul unui promoter mamalian. Gena conferă celulelor rezistenţa la G 418 (geneticină)• Gena se inserează între două secvenţe homoloage• Gena de selecţie (TK) se adaugă la periferia regiunilor homoloage. Timidinkinaza transformă gancyclovir în molecule citotoxiceDubla selecţie generează clone în care gena ţintă a fost înlocuită de către secvenţa vectorului păstrează totuşi şi clone în care gena TK nu a fost eliminată corespunzător prin rearanjare PCR sau Southern blotting

6. Vectori utilizaţi pentru înlocuirea genelor ţintăSelecţia dublă, pozitivă şi negativă, de izolare a celulelor în care s-a petrecut o recombinare homoloagă.(A) Recombinarea homoloagă implică integrarea genei neo şi eliminarea genei TK(B) Dacă integrarea vectorului s-a făcut într-un situs aleator, celulele devin rezistente la G418, dar sensibile la gancyclovir

6. Vectori utilizaţi pentru înlocuirea genelor ţintăDacă înlocuirea genei se face în celule embrionare animale himerice Transmiterea genomului celulelor embrionare la urmaşi generează animale heterozigote pentru mutaţie Animale homozigote se pot obţine ulterior prin reproducere convenţionalăDacă înlocuirea genei are loc în celule somatice, pentru generarea animalelor cu gena înlocuită, este necesară clonarea animalelor prin transfer nuclear Recombinarea homoloagă – se petrece mai frecvent în celulele embrionare comparativ cu cele somatice. Ipoteze: Probabil mecanismele de reparare a ADN sunt mai active în aceste celule Celulele embrionare se divid cu o rată mai mare Multe gene sunt transcrise în celulele embrionare. Din această cauză, probabil cromatina are configuraţie deschisă, care favorizează recombinarea homoloagă

6. Vectori utilizaţi pentru înlocuirea genelor ţintăb. Knock-inGena înlocuită poate fi: genă funcțională nouă genă mutantă (studiul activităţii mutantului) alelă mutant inexistent în natură genă neînrudită (studiul efectelor mediului

asupra cromatinei)

6. Vectori utilizaţi pentru înlocuirea genelor ţintăTehnica 1Locul inserţiei – capacitate mare de a exprima gena străină•Prin recombinare homoloagăse inserează gena mutantă•Recombinarea homoloagă a genei originale şi mutantului duce la înlocuirea genei originale

Înlocuirea unei gene de către un variant mutant utilizând recombinarea homoloagădublă (proces spontan, dar care se petrece cu frecvență redusă)

6. Vectori utilizaţi pentru înlocuirea genelor ţintăb. Knock-inTehnica 2• Se folosesc celule embrionare lipsite de gena pentru HPRT

(hypoxantine phospho-ribosyl transferase)• Acestea nu pot supravieţui în mediu HAT (cu hipoxantină, aminopterină, timidină)• Gena HPRT se introduce prin recombinare homoloagă dublă• Celulele se selectează pe mediu HAT suplimentat cu ganciclovir• Se realizează a doua recombinare homoloagă dublă cu un vector care conţine gena exogenă• Recombinarea are loc când se elimină gena HPRT• Celulele în care a avut loc înlocuirea genei se selectează cu 6-tioguanozină (la care sunt rezistente), pe mediu HAT (la care sunt sensibile)

6. Vectori utilizaţi pentru înlocuirea genelor ţintă

Înlocuirea unei gene de către un variant mutant utilizând recombinarea homoloagă dublă şi selecţia de către gena HPRT. Celulele care poartă gena HPRT sunt rezistente la mediul HAT, iar cele lipsite de această genă sunt sensibile la HAT, dar rezistente la 6-tioguanozină

6. Vectori utilizaţi pentru înlocuirea genelor ţintăb. Knock-inTehnica 3 • Primul vector de recombinare conţine transgena care trebuie

inserată şi gena neo, mărginită de două secvențe LoxP• Celulele în care s-a petrecut prima recombinare se selectează pe baza rezistenţei lor la G 418 şi ganciclovir• Gena neo este apoi eliminată prin introducerea recombinazei Cre(sau a genei care codifică această enzimă) în celule• Recombinarea secvențelor LoxP declanşează eliminarea genei neo, lăsând doar o secvență LoxP care conţine 34 nucleotide• Eliminarea genei neo se poate realiza în celulele embrionare înainte de a fi utilizate pentru generarea şoarecilor himerici sau în embrionul în stadiu de o celulă a generaţiei următoare

6. Vectori utilizaţi pentru înlocuirea genelor ţintă

Mutaţia genică ţintită prin recombinare homoloagă, cu eliminarea genei selectate. Gena neo, înainte mărginită de două secvenţe LoxP, este eliminată de către recombinaza Cre.

7. Vectori utilizaţi pentru rearanjarea genelor ţintăSe folosesc două sisteme care nu se găsesc în mod normal în organismele animale:1. Derivă din bacteriofagul P1• Genomul conţine secvenţe LoxP, formate din 34 nucleotide • Secvenţele LoxP se recombină cu mare eficienţă în prezenţa recombinazei Cre• Cel mai popular sistem• O regiune ADN mărginită de două LoxP - floxed2. Derivă din drojdii• Secvenţele FRT se recombină foarte eficient şi specific în prezenţa recombinazei Flp• Mutant al LoxP, se utilizează pentru a modula eficienţa recombinării sau specificitatea

7. Vectori utilizaţi pentru rearanjarea genelor ţintăAvantajul celor două sisteme – recombinarea are loc

doar în prezenţa recombinazeiEnzimele:• pot fi adăugate celulelor in vitro sau in vivo, prin

microinjectare în citoplasmă • genele enzimelor pot fi introduse în celule prin vectori

adenovirali• plasmidele care conţin genele enzimelor pot fi introduse

în celule embrionare sau celule somatice• pot fi transmise animalelor prin transgeneză

7. Vectori utilizaţi pentru rearanjarea genelor ţintăa. Deleţia genelor• Pentru inducerea condiţională a knock-out:- gena care trebuie inactivată trebuie mărginită de două LoxP, prin recombinare homoloagă- exprimarea recombinazei Cre induce deleţia secvenţelor floxedknock-out• Este necesară când inactivarea unei gene trebuie să fie făcută în mod controlat (când gena knock-out este letală în embrion)b. Activarea condiționată a genelor• Prin introducerea unei secvenţe inhibitoare între promotor şi secvența cap• Secvenţa poate fi eliminată prin acţiunea recombinazei Cre oricând se doreşte, dacă aceasta a fost floxedc. Inactivarea indusă a genelor• Un element esenţial pentru exprimarea genei studiate poate fi încadrat de LoxP prin recombinare homoloagă • Prezenţa recombinazei Cre poate determina inactivarea genei prin eliminarea controlată a elementului esenţial încadrat de LoxP

7. Vectori utilizaţi pentru rearanjarea genelor ţintă

Activarea condiţionată a unei gene prin eliminarea unei secvenţe inhibitoare. Promotorul este separat de genă printr-o secvenţă inhibitoare mărginită de două secvenţe LoxP. Enzima Creinduce recombinarea LoxP şi eliminarea inhibitorului, ceea ce determină activarea genei

Inactivarea condiţionată a genei prin eliminarea unui element activ. O regiune a genei (sau a promotorului) este iniţial mărginită de două secvenţe LoxP. Recombinaza Cre induce eliminarea acestor două regiuni, ceea ce determină inactivarea genei

7. Vectori utilizaţi pentru rearanjarea genelor ţintă

d. Deleţia fragmentelor genomice• Se realizează prin adăugarea a două secvențe LoxP unui vector• Recombinarea homoloagă elimină regiunea genomică situată între cele două secvenţe LoxP ale vectorului• Pot fi îndepărtate secvenţe ADN relativ lungi (până la 50 kb), dacă se introduc independent două secvențe LoxP în regiuni țintă. Recombinaza Cre induce deleția regiunii localizată între secvențele LoxP

7. Vectori utilizaţi pentru rearanjarea genelor ţintă

Deleţia unui fragment cromozomial prin recombinare homoloagă.Vectorul conţine două regiuni homoloage ale cromozomului. Recombinarea elimină regiunea dintre cele două secvenţe homoloage

Deleţia unui fragment cromozomial prin recombinare homoloagă indusă.Un vector este utilizat pentru a introduce două secvențe LoxP relativ distante. Recombinaza Cre induce deleţia regiunii cromozomiale dintre cele două LoxP

7. Vectori utilizaţi pentru rearanjarea genelor ţintăDeleţia indusă a fragmentelor cromozomiale foarte lungi. Două secvențe LoxP sunt introduse prin integrare ţintită, prin două recombinări homoloage independente. Recombinaza Creelimină regiunile dintre două secvenţe LoxP. Aceste eveniment este foarte rar şi este necesară utilizarea genelor de selecție pentru eliminarea celulelor în care s-a petrecut recombinare nespecifică

7. Vectori utilizaţi pentru rearanjarea genelor ţintăe. Recombinarea intercromozomială• Este un eveniment care se petrece foarte rar• Se poate realiza prin introducerea secvenţelor LoxP în situsuri predeterminate a doi cromozomi, prin recombinare homoloagă. Recombinarea secvențelor LoxP induce translocarea genelor între doi cromozomi• Creşterea frecvenţei – prin metoda TAMERE (targeted meiotic recombination), bazată pe exprimarea recombinazei Cre din celulele precursoare spermatice

7. Vectori utilizaţi pentru rearanjarea genelor ţintăTranslocarea cromozomilor indusă de recombinarea homoloagă. Două secvenţe LoxP se introduc în anumite situsuri de pe doi cromozomi. Recombinaza Cre induce asocierea celor doi cromozomi. Gena HPRT, reconstituită prin recombinarea specifică a LoxP, este utilizată pentru selectarea celulelor în care s-a petrecut translocarea cromozomilor.

7. Vectori utilizaţi pentru rearanjarea genelor ţintăRecombinări posibile, intra- şi intercromozomiale, induse de către sistemul Cre-LoxP.

8. Integrarea ţintită a genelor străine• Cu ajutorul sistemului Cre-LoxP• Se introduce (aleatoriu sau într-un situs precis) un situs LoxP, prin recombinare homoloagă• Gena de interes (transgena) este purtată de un plasmid care conţine o secvență LoxP• Co-introducerea transgenei cu un alt plasmid care conţine gena Cre face posibilă integrarea genei în situsul genomic LoxP• Secvenţa plasmidică a vectorului poate fi eliminată înainte de introducerea în celulă (previne integrarea secvenţei plasmidice în vecinătatea genei de interes)• Favorizarea exprimării transgenei integrate constă în asocierea secvenţei LoxP cu izolatori. Izolatorii atenuează sau suprimă extincţia transgenei• Celulele în care s-a petrecut integrarea sunt selectate înainte de utilizarea lor pentru generarea de animale transgenice

8. Integrarea ţintită a genelor străineIntegrarea ţintită a unei gene străine în genom de către sistemul Cre-LoxP. O secvenţă LoxP se introduce într-un anumit situs prin recombinare homoloagă. Gena străină, mărginită de o secvenţă LoxP, este introdusă în situsul LoxP genomic.

8. Integrarea ţintită a genelor străineIntroducerea unei gene într-un situs aleatoriu de către sistemul Cre-LoxP. O secvenţă LoxP se introduce aleatoriu în genom prin microinjectare sau transfecţie. Un vector care conţine gena străină şi un situs LoxP direcţionează integrarea în situsul LoxP. Situsurile LoxP, care permit o expresie satisfăcătoare a genei străine, pot fi folosite pentru a introduce gene mutante sau gene diferite.

8. Integrarea ţintită a genelor străineIntroducerea unei gene străine într-un situs aleatoriu, în prealabil mărginit de secvenţe care favorizează exprimarea genelor.

8. Integrarea ţintită a genelor străineFrecvenţa recombinării – micăCreşterea frecvenţei recombinăriiTehnica 1• Se utilizează doi mutanţi LoxP a căror secvenţe LoxP se pot recombina• Secvenţele LoxP conţin mutaţii care nu pot fi procesate de către Cre secvenţele LoxP pot fi introduse, dar nu şi eliminateTehnica 2 (RMCE-recombinase-mediated cassette exchange)• Se utilizează doi mutanţi care se pot recombina ei înşişi, dar nu între ei• Regiunea genomică ţintă şi gena străină sunt mărginite cu două LoxP mutante• O recombinare dublă induce integrarea genei străine cu frecvenţă relativ mare

8. Integrarea ţintită a genelor străineUtilizarea secvenţelor LoxP mutante.(A) Un plasmid care adăposteşte o secvenţă LoxP normală are puţine şanse de a rămâne integrat într-un genom într-un situs LoxP similar, deoarece recombinaza Cre va elimina fragmentul de ADN integrat foarte rapid(B) Două secvenţe LoxP mutante fac integrarea posibilă, dar nu eliminarea fragmentului de ADN străin(C) Secvenţa a două LoxP mutante, înainte şi după recombinare.

8. Integrarea ţintită a genelor străineTehnica 3• Utilizează două LoxP sau FRT• Adăugarea în exces a vectorului de recombinare creşte frecvenţa integrării• Selecţia clonelor se face prin gene trappingAvantajul utilizării Cre-LoxP – permite introducerea diferiţilor mutanţi în genom