2014 13 14 c Tehnici Cromatografice w

METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA

Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 1

C13+C14 9 Tehnici cromatografice ................................................................................................................................ 2 9.1 Metode cromatografice instrumentale. Fundamentul separărilor cromatografice....................................... 4 9.2 Constanta de distribuţie, profilul izotermelor de distribuţie în cromatografie............................................... 5 9.3 Distribuţia benzilor cromatografice. Lărgirea benzilor cromatografice ........................................................ 6 9.4 Informaţii ce se pot obţine dintr-o cromatogramă........................................................................................ 7 9.5 Overview pentru parametrii specifici separărilor cromatografici.................................................................. 9 9.6 Teorii în separările cromatografice ............................................................................................................ 13

9.6.1 Teoria talerelor ................................................................................................................................. 13 9.6.2 Teoria cinetică şi variabile cinetice care afectează lărgirea benzilor............................................... 14

10 Cromatografia în strat subţire (thin layer chromatography, TLC)....................................................... 16 10.1 Adorbenţi folosiţi în TLC.................................................................................................................... 16 10.2 Mecanismul separării ........................................................................................................................ 18 10.3 Cromatoplăci pentru tehnica TLC şi aplicarea probelor.................................................................... 20 10.4 Dezvoltarea cromatogramei şi detecţia (localizarea) analiţilor pe cromatoplacă.............................. 21 10.5 Caracteristici ale cromatoplăcilor din TLC ........................................................................................ 22

10.5.1 Factorul de ratardare (retenţie, Rf) .......................................................................................... 22 10.5.2 Factorul de capacitate ............................................................................................................. 22 10.5.3 Înălţimea unui taler cromatografic ........................................................................................... 23

10.6 Aplicaţii ale cromatografiei în strat subţire ........................................................................................ 23 11 Tehnici cromatografice instrumentale ................................................................................................... 25 11.1 Cromatografia de lichide pe coloană instrumentală.......................................................................... 25

11.1.1 Clasificare ...................................................................................................................................... 25 11.1.2 Aparatura utilizată în cromatografia de lichide............................................................................... 26 11.1.3 Faze mobile şi staţionare, polaritate .............................................................................................. 27

11.2 Cromatografia ionică (IC)...................................................................................................................... 28 11.2.1 Schimbătorii de ioni........................................................................................................................ 28 11.2.2 Precursori polimerici ai răşinilor schimbătoare de ioni................................................................... 29 11.2.3 Mecanisme de separare................................................................................................................. 30 11.2.4 Conductometria - mijloc modern de detecţie în cromatografia ionică............................................ 31

11.2.4.1 Principiul detectorilor conductometrici de supresie .............................................................. 32 11.2.4.2 Supresorul electrochimic ...................................................................................................... 33

11.3 Cromatografia de gaze.......................................................................................................................... 35 11.3.1 Aspecte teoretice ........................................................................................................................... 35 11.3.2 Sistemul gaz cromatografic............................................................................................................ 36 11.3.3 Faza mobilă folosită în cromatografia de gaz ................................................................................ 37 11.3.4 Faze staţionare folosită în cromatografia de gaz........................................................................... 37 11.3.5 Detectori folosiţi în cromatografia de gaz....................................................................................... 39 11.3.6 Aplicaţii ale cromatografiei de gaz ................................................................................................. 40



9 Tehnici cromatografice Chimia reprezintă instrumentul major folosit în investigarea sistemelor chimice. Prin mijloacele sale

va permite obţinerea informaţiilor referitoare la materie, incluzând compoziţia, structura,

proprietăţile fizice şi reactivitatea acesteia. Separarea amestecurilor (complexe) în componente

este aplicată în toate domeniile chimiei, precum şi în ştiinţele înrudite cu aceasta. În prezent

tehnicile moderne de separare, cum ar fi cromatografia şi electroforeza, sunt folosite în domenii în

care principalii compuşi studiaţi sunt de natură (bio)organică, cromatografia fiind folosită mai ales

în chimia organică, iar electroforeza în biochimie şi biotehnologie. Separarea eficientă a

compuşilor chimici similari este posibilă doar prin folosirea unor paşi repetaţi de separare şi care,

în acord cu distribuţia lui Craig, sunt potriviţi în termeni practici numai pentru etapele preparative.

Botanistul rus Mikhail Semanovich Tswett este considerat „părintele” cromatografiei, prin

studiul fenomenului de absorbţie în coloane cu umplutură, dezvoltat în jurul anilor 1900. La acea

perioadă, folosind o coloană împachetată, cercetătorul a reuşit să separe extracte din pigmenţii

frunzelor, precum clorofila şi xantofil spiriloxantina. Într-o lucrare scrisă în limba rusă, cercetătorul

descrie paşii experimentali parcurşi la separarea „carotenului” (zonă galben roşie), a xantofilului

(zonă galbenă) (carotinoida oxigenată la C40) şi a clorofilului (zonă verde) pe o coloană umplută cu

inulină (C6H10O5-H2O, o polizaharidă solubilă, alcătuită din grupări fructoză, ce apare în diferite

plante ca rezervă de hrană), folosind ligroin ca solvent (un amestec de hidrocarburi cu p.f. 70-120

°C). Observarea unor zone colorate pe coloană l-a condus pe cercetătorul rus la ideea de a

denumi tehnica dezvoltată prin cuvântul cromatografie (grecescul „chroma” pentru culoare şi

„graphein” pentru scriere). În 1906, Tswett a prezentat o descriere amănunţită a metodei

cromatografice dar ceea ce a uimit ulterior cercetătorii din domeniul cromatografie a fost, ìn

special, contrastul între simplitatea aparaturii folosite şi rezultatele obţinute.

Un pas important ce a introdus cromatografia într-o perioadă de dezvoltare extraordinară a fost

înregistrat în 1931 când Kuhn (laureat al premiului Nobel în 1938) şi Lederer au separat în scop

preparativ carotenul din morcovi (morcovi roşii) în două hidrocarburi alfa şi beta caroten (C40H56),

prin adsorbţie pe o coloană umplută cu oxid de aluminiu. Aproape în aceeaşi perioadă, Winterstein

a separat pe o coloană cu umplutură de CaCO3 (cu diametru de 7 cm) două xantofile, violaxantina

(pigment xantofilic de culoare portocalie care protejează plantele de eventualele distrugeri foto-

oxidative) şi luteina (carotenoid natural cu acţiune antioxidantă).

În orice caz, istoric vorbind, evoluţiile înregistrate în domeniul cromatografiei pot fi enumerate

după cum urmează:

1903 Tswett: Fenomenul de adsorbţie în coloană cu umplutură

1931 Kuhn, Lederer Winterstein: Primele separări semnificative din punct de vedere preparativ

1937 Tiselius: Electroforeza soluţiilor libere într-un tub

1938 Izmailov, Shraibee: Cromatografia în strat subţire (thin layer chromatography, TLC)

1941 Martin, Synge: Cromatografia de repartiţie (liquid chromatography, LC)

1944 Cnodsen, Gordon, Martin: Cromatografia pe hârtie (planar chromatography, PC)



1948 Tiselius: Electroforeza

1949 Spedding, Tompkins: Cromatografie de schimb ionic (ionic exchange chromatography, IEC)

1952 James, Martin: Cromatografia de gaze (gas chromatography, GC)

1957 Galay: Cromatografia de gaze cu coloane capilare (capilar gaz chromatography, CGC)

1959 Parath, Fladin: Gel cromatografia - gel filtrarea

1966 Piel: Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (high performance (pressure) liquid

chromatography, HPLC)

1969 Klesper: Cromatografia de fluide supercritice (supercritical fluid chromatography, SFC)

1981 Nakagawa: Cromatografia electrocinetică

Bazele teoretice riguroase şi progresul înregistrat în domeniul electronicii au permis elaborarea

unor procedee de înaltă performanţă în instalaţii automate de reglare, măsurare, înregistrare a

semnalelor şi prelucrare a datelor iar în tehnica cromatografică, aceste evoluţii au permis

îndeplinirea unei mai veche dorinţe a chimiştilor analişti, aceea de a realiza un aparat care să

permită o programare în urma căreia după introducerea probei de analizat, aparatul să furnizeze

într-un timp foarte scurt rezultatul exact al întregii analize.

Cromatografia include o variată şi importantă grupă de metode ce permit separarea unor

compuşi asemănători din amestecuri complexe. Cromatografia a evoluat progresiv de la o metoda

de separare şi purificare de laborator la o tehnica de separare şi analiza chimică cu o arie de

aplicare universală. Analiza chimică cromatografică este un domeniu recent al analizei

instrumentale care include metode de separare şi analiză a componenţilor unui amestec complex

dintr-o probă. În toate variantele, separarea precede analiza şi se realizează prin repetarea, de un

număr mare de ori, a echilibrului de distribuţie între o faza staţionară (aflată de obicei într-un tub

numit coloană) şi o faza mobilă care se deplasează prin golurile primei faze.

Principiul cromatografiei se bazează pe trecerea constituienţilor de separat prin cele două faze

nemiscibile, faza staţionară şi faza mobilă. Pentru aceasta proba este dizolvată în faza mobilă,

care poate fi un lichid, gaz sau fază supercritică, şi ulterior transportată de-a lungul fazei staţionare

care poate fi într-o coloană sau pe o suprafaţă solidă.

Funcţie de felul în care se dezvoltă cromatograma se face distincţie între cromatogramele

interne şi cromatogramele externe. În cromatogramele interne diferiţi constituenţi ai probei se

deplasează pe distanţe diferite în acelaşi interval de timp iar la sfârşitul separării aceştia încă se

află în stratul de separare ceea ce înseamnă că, de fapt, aceştia sunt detectaţi direct în stratul de

separare. Acest tip de cromatografie este folosit în tehnicile planare precum cromatografia pe

hârtie şi cromatografia în strat subţire. În aceste situaţii faza staţionară este situată pe un suport

planar şi faza mobilă se deplasează de-a lungul fazei staţionare prin forţe capilare sau prin

influenţa gravitaţiei. Cromatogramele externe se obţin în cromatografia pe coloană. În acest caz

toţi constituenţii traversează aceeaşi rută prin stratul de separare şi, datorită interacţiilor specifice

cu faza staţionară, apar la sfârşitul coloanei la timpi diferiţi.



Faza mobilă, denumită şi eluent, poate provoca migrarea cu viteze diferite a unui număr mare

de componenţi ai unui amestec de separat de-a lungul coloanei. Amestecul supus separării poate

fi introdus sub formă de soluţie la începutul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a

probei (de exemplu o micro-seringă), şi se află iniţial fixat într-o zonă îngustă de la începutul

coloanei.

Spălaţi de eluent, o parte din componenţii probei migrează apoi prin coloană cu viteze diferite.

Acest lucru se datorează interacţiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei şi faza staţionară

(nu orice moleculă poate migra pe orice fază staţionară). Efectul, este numit retenţie şi aceasta

provoacă o aşa-numită migrare diferenţiată când moleculele migrează în grupuri, în fiecare grup

existând doar molecule de acelaşi fel. Aceasta face posibilă sesizarea componenţilor, pe rând, la

părăsirea coloanei, de către un instrument, în grupurile respective - denumite uneori zone.

Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai mulţi (în mod ideal la oricare)

dintre componenţii ce ies din coloană şi care este plasat în eluent, imediat după ieşirea din

coloană. Acest analizor, denumit detector este capabil să dea un semnal proporţional cu masa sau

cu concentraţia soluţiei de component în faza mobilă. Dispozitivul sesizează trecerea fiecăreia din

substanţele ce formează iniţial proba iar prin reprezentarea grafică a semnalului detectorului în

funcţie de timp se va obţine cromatograma.

9.1 Metode cromatografice instrumentale. Fundamentul separărilor cromatografice

În funcţie de natura fazelor şi a echilibrelor implicate la transferul solutului (analitului) între faze se

disting tipurile de cromatografie prezentate în Tabelul 9.1.

Tabelul 9.1: Clasificare funcţie de natura fazelor implicate în procesele cromatografice.

Clasificare generală Metoda specifică Faza staţionară Tipul de echilibru Lichid-lichid sau partiţie Lichid adsorbit pe un

solid Partiţie/repartiţie/distribuţie între lichide nemiscibile

Fază cu lichid legat Specii organice legate la o suprafaţă solidă

Partiţie/repartiţie/distribuţie între lichid şi suprafaţa legată

Lichid solid sau adsorbţie

Solid Adsorbţie

Schimb ionic Răşini schimbătoare de ioni

Schimb ionic

Cromatografia de lichide (faza mobilă lichid)

Excluziunea mărimii Lichid în interstiţiile unui polimer solid

Partiţie/repartiţie/distribuţie

Gaz lichid Lichid adsorbit pe un solid

Partiţie/repartiţie/distribuţie între gaz şi lichid

Fază cu gaz legat Specii organice legate la o suprafaţă solidă

Partiţie/repartiţie/distribuţie între lichid şi suprafaţa legată

Cromatografie de gaz (faza mobilă gaz)

Gaz solid Solid Adsorbţie Cromatografia cu fluide supercritice

Specii organice legate la o suprafaţă solidă

Partiţie/repartiţie/distribuţie între fluidul supercritic şi suprafaţa legată



9.2 Constanta de distribuţie, profilul izotermelor de distribuţie în cromatografie

În separările cromatografice sunt implicate faza staţionară (fS), faza mobilă (fM) sau eluent şi solutul

(soluţii) sau analiţii dizolvaţi. Procesul de separare cromatografică în orice tehnică cromatografică

se realizează prin echilibre interfazice sucesive. Orice proces de separare cromatografică este

caracterizat de de o constantă sau un coeficient de distribuţie (partiţie/repartiţie) notat KD,

MSD CCK =

unde CS si CM denotă concentraţiile solutului în faza staţionară, respectiv, mobilă. Valoarea

coeficientului de partiţie nu poate fi dedus direct din cromatogramă.

Adeseori constanta de distribuţie este referită ca şi izotermă de distribuţie care caracterizează

echilibrele interfazice şi arată modul în care variază coeficientul global de distribuţie (raportul

concentraţiei solutului în cele două faze) la echilibru. Idealitatea într-o separare cromatografică se

atribuie din izotermele de distribuţie valabile. Izotermele de distribuţie caracterizează procesul de

separare şi descriu modul în care coeficientul de distribuţie KD (CS/CM) variază la echilibru. În

contextul prezentat, o izotermă este o funcţie care raportează concentraţiile unui sistem

multicomponent între două faze la temperatură constantă. Izotermele de distribuţie pot fi liniare şi

neliniare care la rândul lor pot fi concave şi convexe.

Izotermele liniare

Dacă distribuţia solutului este determinată pe criterii statistice, atunci KD va avea intotdeauna

valoare unitară. Valoare unitară înseamnă că fracţia totală a solutului în fiecare din faze va fi egală

cu fracţia de volum a sistemului ocupată de acea fază. O astfel de izotermă poartă numele de

izotermă liniară. Constanta de distribuţie arată că există proporţionalitate între concentraţiile

solutului în cele două faze care are drept consecinţă faptul că va avea loc străbaterea coloanei cu

o viteză dependentă de concentraţie. Valoarea acestei constante va depinde doar de proprietăţile

substanţei dizolvate şi de cuplul de faze folosit. Izoterme liniare se întâlnesc în cromatografia de

repartiţie şi în unele situaţii în cromatografia de adsorbţie.

Izotermele neliniare

Există situaţii când coeficientul KD este diferit de valoarea 1. În cazul izotermelor neliniare

coeficientul de distribuţie este influenţat de concentraţia solutului în faza mobilă. Pentru sistemele

în care solutul are afinitate mare pentru faza staţionară, KD poate avea valori mari, în timp ce

pentru sistemele în care solutul preferă faza mobilă, KD ia valori foarte mici (către 0). Izotermele

neliniare se întâlnesc în primul rând în cromatografia de adsorbţie în fază lichidă sau gazoasă şi în

cromatografia ionică. Izotermele liniare sau neliniare se reprezintă grafic ca în Figura 9.1.

Concentratia in faza mobila

A

B

C

Figura 9.1: Tipuri de izoterme pentru distribuţia unei

specii între două faze.



Atunci când un analit este eluat din coloana cromatografică profilul concentraţiei sale ca o

funcţie de distanţa străbătută prin coloană se prezintă ca în Figura 9.2. Picurile, de obicei, sunt

simetrice şi urmează forma unei funcţii de distribuţie tip Gaussian. Izoterma de tip B e cunoscută

ca şi izotermă “codată” iar cea de tip C ca izotermă “frontală”. Chiar şi pentru un analit cu o

izotermă neliniară, profilul picului nu va fi deformat cu severitate, dacă analitul a pătruns numai pe

o distanţă mică în coloană.

A B

Distanta Distanta

C

Distanta

Figura 9.2: Picuri distorsionate. Profilul concentraţiei unui analit de-a lungul coloanei funcţie de distanţa parcursă de la intarea în coloană. A, profil pentru KD constant. B, profil pentru izoterma de tip B. C, profil pentru izoterma de tip C.

Poziţia şi forma izotermelor oferă indicaţii asupra eficienţei procesului de separare. Poziţia

poate indica ordinea în care componenţii se distribuie de-a lungul coloanei cromatografice sau o

părăsesc. Izotermele îndepărtate dau indicaţii asupra unei separări eficiente în timp ce izotermele

apropiate reflectă o eventuală suprapunere.

9.3 Distribuţia benzilor cromatografice. Lărgirea benzilor cromatografice Fenomenul de lăţire a picurilor este un proces inevitabil în cromatografie. Un astfel de fenomen

este de nedorit atunci când se are în vedere separarea unor picuri multiple. Picurile oblice sunt

nedorite de asemeni mai ales datorită faptului că picurile asimetrice suferă procesul de lărgire într-

un timp mai redus decât cele simetrice. Cu cât izoterma este mai convexă (concavă), cu atât

efectul va fi mai pronunţat şi mai dăunător. Examinarea picurilor dintr-o cromatogramă reliefează

similarităţi cu o curbă de distribuţie Gaussiană care se obţine atunci când valorile replicate ale unei

măsurători sunt reprezentate ca o funcţie de frecvenţa apariţiei lor.

În separările cromatografice o parte din moleculele analitului traversează rapid coloana datorită

includerii lor accidentale, pentru o perioadă mai mare de timp, în faza mobilă. Alte molecule pot

întârzâia deoarece sunt incorporate în faza staţionară pentru o perioadă de timp mai mare decât

valoarea medie. Consecinţa acestor procese individuale întâmplătoare o constituie apariţia unei

distribuţii simetrice a vitezelor în jurul valorilor medii, care reprezintă comportamentul majorităţii

moleculelor analitului. Lărgimea unei benzi creşte la deplasarea prin coloană deoarece, pentru ca

dispersia să aibă loc, este nevoie de mai mult timp. În aceste condiţii, lăţimea benzii este legată

direct de timpul de rezidenţă în coloană şi este invers raportată la viteza de deplasare a fazei

mobile.

Distribuţia benzilor cromatografice se aseamănă cu distribuţia descrisă de o funcţie din teoria

probabilităţilor. De fapt, după cum variază n (creşte), distribuţia binomială tinde spre o distribuţie

Gaussiană ca cea prezentată în Figura 9.3.



Cmax

w1/2

2σ0,607Cmax

0,5Cmax

w

Figura 9.3: Diverse metode de a determina deviaţia standard din curba Gaussiana: w1/2=2,354σ; w=4σ.

În termeni care sunt apropriaţi operaţiilor cromatografice, expresia Gaussiană care corelează

concentraţia şi volumul picului este de forma:

( )( )

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ −−

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡=

2

σVV0,5

exp2πσ

1C E21

unde VE este volumul de eluţie al analitului şi σ este dispersia picului. Determinarea dispersiei

picului reprezintă o metodă de determinare a numărului talerelor teoretice (N) dintr-o coloană sau

înălţimea (H) echivalentă unui taler teoretic (heigh equivalent to a theoretical plate - HETP).

Relaţia de calcul a numărului talerelor este 2

E

σV

N ⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛=

HETP se calculează împărţind lungimea coloanei la numărul de talere. O expresie alternativă

pentru H este dată de relaţia

LσH

2

=

unde L este distanţa parcursă de un pic iar σ este deviaţia standard a dispersiei picului în unităţi de

lungime. Figura 9.3 prezintă metode comune de a determina σ din distribuţia Gaussiană. În

termeni practici, în mod convenabil şi probabil cel mai exact, σ este evaluat din W1/2 care

reprezintă lăţimea la jumătatea înălţimii picului (aplicarea tangentelor duse prin punctele de

inflexiune poate fi subiectivă uneori).

9.4 Informaţii ce se pot obţine dintr-o cromatogramă Detectorul transformă diferenţa unei proprietăţi fizice dintre component şi eluent în semnal electric

care este proporţional cu concentraţia componenţilor din probe.



00 Timp

tR

tM

W

Figura 9.4: Profilul unei cromatograme obţinută prin reprezentarea grafică a dependenţei semnalului înregistrat funcţie de timpul de înregistrare a cromatogramei.

Numărul de picuri dă informaţii asupra numărului componenţilor din amestec. Identificarea

componenţilor se poate face în funcţie de parametri de reţinere (timp de reţinere, tR, viteză de

eluţie a anlitului, v).

Profilul picului cromatografic este caracterizat de parametri cantitativi şi parametri calitativi.

Parametrii cantitativi includ înălţimea picului (h) şi aria picului cromatografic (A) iar parametrii

calitativi fac referire la timpii de retenţie, volumele de retenţie.

Timpul de retenţie poate fi teoretic (tR = L/v unde L este lungimea coloanei şi v este viteza de

eluţie a unui component) şi practic.

Timpul de retenţie practic se estimează prin cronometrare (timpul scurs din momentul

introducerii probei în aparat până în momentul apariţiei picului corespunzător componenţilor.

Timpul mort, tM, este timpul necesar eluentului sau unui component nereţinut de faza staţionară

să ajungă la detector.

Timpul de reţinere aparent tR reprezintă timpul necesar componenţilor să ajungă la detector; se

măsoară din momentul introducerii probei în aparat până în momentul apariţiei picului

cromatogramei. Depinde de condiţiile de lucru.

Timpul de reţinere corectat tR0 reprezintă timpul de permanenţă al molecule de solut în coloana

cromatografică → un parametru calitativ; în funcţie de el se pot face identificări ale componenţilor

din amestec prin compararea cu timpii de reţinere ai unor standarde.

tR0 =tR - tM

Alţi parametri specifici separărilor cromatografice includ eficienţa şi selectivitatea coloanelor

cromatografice care se determină în funcţie de:

N – numărul talerelor teoretice

H - înălţimea unui taler teoretic

α – factorul de selectivitate

Parametrii precum N şi H se pot calcula din caracteristicile unui singur pic cromatografic.

Conceptele aferente parametrilor N şi H sunt bine explicate şi justificate dacă în mod imaginar

coloana cromatografică se împarte într-un număr egal de segmente (talere teoretice conform

Figurii 9.5), în fiecare taler stabilindu-se un echilibru de distribuţie interfazic.



L

H

Figura 9.5: Tratarea ipotetică a unei coloane.

Parametrii N şi H sunt direct legaţi de eficienţa coloanei şi α de selectivitatea umpluturii

acesteia.

Numărul de talere

Cu cât avem mai multe talere cu atât vor avea loc mai multe echilibre de distribuţie interfazică şi

coloana va fi mai eficientă

N = L/H

Numărul de talere se poate obţine din profilul unui pic cromatografic. Picul se aseamănă cu o

curbă Gauss (a se vedea şi Figura 9.3).

2RtN⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜

⎝

⎛

σ= sau

2

w

t16N R

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

Înălţimea talerului teoretic

H are semnificaţia unei lungimi din coloană, pe care se realizează echilibrul complet al

componenţilor în cele două faze. Este analog cu un taler de distilare fracţionată.

N, H sunt mărimi caracteristice dispersiei zonelor cromatografice. O dispersie redusă conduce

la picuri înguste (coloana este eficientă), în timp ce o dispersie mare duce la picuri late (coloana

este ineficientă).

Estimarea lui H se poate face din:

- teoria talerelor teoretice: H = L/N

- din teoria cinetică: uCu

BAH ⋅++=

unde:

A, B, C – constante

u – viteza liniară de deplasare a fazei mobile sau eluentului

A – contribuţia difuziei turbulente

B – contribuţia difuziei moleculare longitudinale

C – contribuţia transferului de masă între faze

9.5 Overview pentru parametrii specifici separărilor cromatografici Coeficientul de partiţie

stationara fazamobila faza AA ↔



M

SD

CCK =

unde: CS – concentraţia molară a analitului în faza staţionară şi CM – concentraţia analitului în faza

mobilă. Ideal, coeficientul de partiţie este constant peste un domeniu larg de concentraţii (CS este

direct proporţional cu CM). Cromatografia în care se aplică ecuaţia anterioară poartă numele de

cromatografie liniară.

Timpul de retenţie

Timpul de retenţie este parametrul calitativ care redă timpul necesar după efectuarea injecţiei

pentru ca picul analitului să ajungă la detector (tR). Adeseori proba sau faza mobilă conţin specii

care nu sunt reţinute de coloană. Timpul mort (aferent noţiunii de void volume) reprezintă timpul

necesar speciilor nereţinute de coloană să ajungă la detector (tM). Analiţii migrează cu viteza liniară

medie v

RtLv =

iar moleculele fazei mobile (analiţii nereţinuţi de coloană) se deplasează cu viteza liniară medie u

MtLu =

În ambele expresii L denotă lungimea coloanei.

Relaţia de legătură între timpul de retenţie şi coeficienţii de partiţie

Pentru a raporta timpul de retenţie al unei specii la coeficientul său de partiţie se poate exprima

viteza de migrare ca o fracţie din viteza fazei mobile

mobila faza in analit de petrecuta timp de fractiauv ×=

Această fracţie, în orice caz, este egală cu numărul mediu de moli de analit în fază mobilă, în orice

moment, raportat la numărul total de moli de analit din coloană

analit de totali molimobila faza in analit de moliuv ×=

Numărul total de moli de analit în faza mobilă este egal cu concentraţia molară CM a analitului în

faza mobilă înmulţită cu volumul său, VM. Similar, numărul total de moli de analit în faza staţionară

este egal cu concentraţia molară CS a analitului în faza staţionară înmulţită cu volumul său, VS.

MSMMSSSSMM

MM

V/KV11u

VC/VC11u

VCVCVCuv

+×=

+×=

+×=

Factorul de capacitate. Viteza de migrare a solutului/analitului

Factorul de capacitate kA’ este un parametru important folosit pentru descrierea vitezelor de

migrare a analiţilor prin coloană. Funcţie de tipul cromatografiei implicate, de adsorbţie, de schimb

ionic, de excluziune sterică, factorul a fost denumit coeficient de adsorbţie, de distribuţie ionică,



respectiv de difuziune. Pentru o specie oarecare A, factorul de capacitate kA’ se defineşte prin

relaţia:

M

SA'A

VVKk =

unde KA reprezintă coeficientul de partiţie al speciei A. Substituind ecuaţia anterioară în ecuaţia

pentru v se obţine

'Ak1

1uv+

×=

'AMR k1

1tL

tL

+×=

M

MR'A

tttk −=

Factorul de capacitate se poate estima din parametrii tR şi tM care se deduc uşor dintr-o

cromatogramă. Un factor de capacitate mare indică o reţinere mai puternică în coloană a unui

component. Factorii de capacitate ar trebui să fie cuprinşi între 1 şi 5. Dacă este <1 compuşii se

eluează mult prea repede şi determinarea timpului de retenţie cu acurateţe este dificilă. Dacă este

cuprins între 20 şi 30 timpii de retenţie sunt mult prea mari.

Factorul de selectivitate. Viteze de migrare diferenţiate

Factorul de separare (selectivitate) α pentru o anumită coloană de separare descrie diferenţele ce

apar între vitezele de migrare specifice componenţilor, fiind raportul dintre factorii de capacitate kB’ şi kA’, ai componenţilor B (eluţie îndelungată, mai puternic reţinut) şi A (eluţie rapidă, foarte puţin

reţinut) aflaţi în amestec. Acest factor trebuie să fie întotdeauna mai mare decât 1.

Factorul este definit prin raportul dintre coeficientul de partiţie dintre componenta mai puternic

reţinută (B) şi coeficientul de partiţie pentru specia mai puţin reţinută sau mai rapid eluată (A).

A

BKK

α =

Se poate obţine o relaţie de legătură între factorii de selectivitate ai analiţilor şi factorii lor de

capacitate:

'A

'B

kkα =

Se poate obţine expresia care permite determinarea factorului de selectivitate dintr-o

cromatogramă experimentală

MR(A)

MR(B)

tttt

α−

−=

Rezoluţia coloanelor



Obiectivul major al cromatografiei este acela de a separa analiţii în benzi distincte (diferite).

Calitatea separării depinde de extinderea cu care are lor deplasarea centrului benzii unui analit şi

de gradul de dispesie al benzii. Rezoluţia este termenul cel mai adesea utilizat pentru a descrie

calitatea separării cromatografice. Rezoluţia unei coloane furnizează o măsură cantitativă a

capacităţii sale de a separa doi analiţi. Prin măsurarea volumelor picurilor de eluţie (timpilor) şi a

lăţimii benzilor se pot calcula valori ce exprima în mod cantitativ gradul de rezoluţie. Expresia

comună utilizată este:

( ) ( )21

RR

21

12

ww

tt2

wwVV2

R 12

+

−=

+−

= sau ( ) ( )[ ]BA

ARBR

BABAS

WWtt2

WW∆Z2

/2W/2W∆ZR

+−

=+⋅=

+=

unde R este rezolutia, V1 si V2 sunt volumele de eluent folosite pentru eluţia a doi analiţi adiacenţi,

iar W1 si W2 sunt lăţimile picurilor la bază, determinate prin trasarea tangentelor la punctele de

inflexiune ale picurilor (Figura 9.6) (∆Z = tR2 – tR1).

Rezoluţia în separarea cromatografică este rezultatul a 2 efecte opuse: echilibru, sau efecte

termodinamice care cauzează deplasarea benzilor, şi efecte cinetice care cauzează suprapunerea

benzilor. Optimizarea acestor efecte competitive este o artă în cromatografie.

W2W1

V2

V1

Figura 9.6: Rezoluţia la separarea a doi analiţi printr-o coloană cromatografică.

Semnificaţia termenului R este ilustrată în Figura 9.7 care conţine cromatograme pentru

speciile A şi B pe coloane cu rezoluţii diferite.

Figura 9.7: Separări la patru rezoluţii diferite.



Din Figura 9.7 este evident că o rezoluţie de 1,5 dă o separare completă pentru doi

componenţi (eventual doar 3% suprapunere pentru analiţii separaţi), în timp ce o rezoluţie de 0,75

dă o rezolvare parţială iar una de 0,5 conduce la fenomenul de anvelopare (o singură bandă

observabilă). La o rezoluţie de 1, zona A conţine 4% din B şi zona B conţine o cantitate egală din

A. Rezoluţia unei faze staţionare date poate fi îmbunătăţită prin lungirea unei coloane şi implicit

prin creşterea numărului de talere. O consecinţă a creşterii numărului de talere o poate constitui în

schimb creşterea timpului necesar separării.

Cum ar trebui să funcţioneze un cromatograf pentru a optimiza aceste efecte? Un bun punct de

plecare ar fi dacă se porneşte de la aspectele de echilibru ale fazei mobile, fazei stationare şi

analitului. De exemplu, printr-o simplă schimbare în compoziţia fazei mobile, se poate obţine o

creştere semnificativă a rezoluţiei.

Extinderea până la care un analist poate interveni în controlul cinetic al rezoluţiei depinde în

mare măsura de cât de mult este implicat acesta în prepararea umpluturii coloanei cromatografice.

Producătorul de coloane va avea grijă în mod evident de mărimea particulelor din cadrul fazei

staţionare şi de modul în care acestea umplu coloana, permeabilitatea umpluturii cu afinitate la

eluenţi, şi oricare alte probleme care ar influenţa eficienţa coloanei. Chimistul analist va trebui de

obicei să accepte tipul de coloane care sunt disponibile.

9.6 Teorii în separările cromatografice Teoria cinetică a cromatografiei explică în termeni cantitativi forma picurilor cromatografice şi

efectele unor variabile asupra formei acestora. Parametrii cantitativi care descriu eficienţa coloanei

sunt înălţimea talerului H şi numărul talerelor teoretice, N. Cei 2 parametri sunt legaţi prin relaţia:

HLN =

unde L este lungimea (în cm de obicei) umpluturii coloanei.

Eficienţa coloanelor cromatografice creşte odată cu creşterea numărului talerelor şi odată cu

scăderea înălţimii talerului. Eficienţa, în termeni de număr de talere, poate varia de la câteva sute

la câteva sute de mii, în timp ce, înălţimea unui taler poate varia de la câteva zeci la o mie µm, sau

chiar dimensiuni mai mici.

9.6.1 Teoria talerelor Teoria talerelor nu reprezintă o teorie cromatografică propriu-zisă, ea este mai mult o adaptare

analogică pentru procesul cromatografic. Iniţial, teoria a fost dezvoltată de către Martin si Synge

care au observat legăturile dintre comportamentul la eluţia printr-o coloană obişnuită în condiţii de

neechilibru şi o coloană ipotetică subdivizată într-un număr de nivele care operează în condiţii de

echilibru. Se consideră un sistem ca cel prezentat în Figura 9.8 care este format dintr-un număr de

celule unitare (talere) care conţin faza mobilă şi faza staţionară.



0 1 2 3 n

faza mobila

faza stationara

Figura 9.8: Unitate cromatografică teoretică. Fiecare compartiment cuprinde fazele mobilă şi staţionară. În unitate este permisă atingerea echilibrului în fiecare compartiment, deplasarea către dreapta a fazei mobile dintr-un compartiment în altul, reechilibrare, o alta deplasare dintr-un compartiment în altul şi aşa mai departe. Procesul de echilibrare urmat de o deplasare către dreapta poartă numele de transfer.

Sistemul anterior prezentat include o serie de talere pe parcursul cărora conţinutul fazei mobile

din talerul 0 este transferat în talerul 1, ulterior 2, în timp ce conţinutul corespunzător fazei

staţionare rămâne stabil. Se poate considera o moleculă care se află în talerul 0. După echilibrare,

faza mobilă din talerul 0 este transferată în talerul 1 cu o probabilitate p. În alte cuvinte, se poate

spune că un transfer va permite deplasarea moleculei printr-un număr de p talere astfel încât,

numărul etapei (M) în care molecula se află cu cea mai mare probabilitate după un număr de r

transferuri va fi dat de relaţia M = r×p. Pentru un număr mare de molecule, talerul M este talerul în

care concentraţia moleculelor va fi maximă.

Deşi la nivel experimental modelul teoretic al talerelor conduce la rezultate în deplin acord cu

cele experimentale, există de multe ori foarte multe limitări. Cea mai importantă problemă o

constituie faptul că această teorie are capacitate redusă de a prezice valori reale. Teoria talerelor

poate oferi o relaţie de legătură credibilă între lărgimea benzii şi lungimea acesteia, dar nu poate

furniza o modalitate de prezicere a mărimii dispersiei (în alte cuvinte înălţimea talerului). De

asemeni nu pot fi prezise efectele modificării unor variabile cum ar fi debitul sau dimensiunea

particulei, întrucât nu se ţine cont de aceşti factori. Probabil cel mai mare avantaj derivă din

simplitatea abordării.

9.6.2 Teoria cinetică şi variabile cinetice care afectează lărgirea benzilor Efectul de lărgire în cromatografie apare datorită unor cauze precum:

1) echilibrul de distribuţie al solutului între faze nu se stabileşte instantaneu în toate punctele

coloanei

2) apar modificări în structura solidelor din faza staţionară datorită diferenţelor dintre faza

mobilă şi faza staţionară

3) curgerea fazei mobilă are loc în mod întâmplător prin canale de lungimi diferite şi direcţii

diferite antrenând moleculele de solut cu viteze diferite (proprii cromatogramelor ideale)

4) faza staţionară solidă reţine o parte din faza mobilă care rămâne fixată în micropori,

participând în final la procesul de separare

5) distribuţia fazei staţionare lichide sub formă de filme neuniforme în jurul granulelor de

suport (solid inert).

Lărgirea benzilor este o consencinţă a vitezei finite la care intervin câteva procese cu transfer

de masă în timpul migrării unei specii de-a lungul unei coloane. Unele din aceste viteze sunt

controlabile prin ajustarea variabilelor experimentale, permiţând astfel îmbunătăţiri în separare.



Eficienţa unei coloane cromatografice poate fi aproximată de expresia

H = B/u + Csu +CMu

unde H este înălţimea talerului în cm şi u reprezintă viteza liniară a fazei mobile în cm s-1. B, CS şi

CM sunt coeficienţi care sunt legaţi de proprietăţile analitului. Ecuaţia anterioară este cunoscută

sub numele de ecuaţia lui Van Deemter. Figura 9.9 arată variaţia termenilor din ecuaţia lui Van

Deemter funcţie de viteza fazei mobile. Curba care dă numărul de talere este însumare efectelor

din Figură. Viteza optimă există acolo unde înălţimea talerului este minimă şi eficienţa la separare

este maximă.

Două variabile importante care afectează eficienţa coloanei şi care pot fi controlate includ

diametrul particulelor umpluturii şi diametrul coloanei. La fazele mobile gazoase viteza difuziei

longitudinale poate fi redusă considerabil prin scăderea temperaturii şi a coeficientului de difuzie

DM. Consecinţa este o scădere a înălţimii talerului la scăderea temperaturii. În cromatografia de

lichide efectul nu este considerabil deoarce difuzia este suficient de lentă pentru ca termenul

difuziei longitudinale să aibă efect scăzut asupra relaţiei.

Viteza liniara a fazei mobile, u, cm s-1

H

CSu

CMu

B/u

Figura 9.9: Contribuţiile coeficienţilor transferului de masă la înălţimea talerelor, H.



10 Cromatografia în strat subţire (thin layer chromatography, TLC) Acest tip de cromatografie are drept scop separarea şi concentrarea cantităţilor mici de substanţă

din amestecuri complexe. Bazele tehniciii TLC au fost puse de Izmailov şi Schreider (1939) care

au folosit extracte de plante medicinale, iar ca suport Al2O3. Zece ani mai târziu Mainhard şi Hall

au folosit această tehnică pentru separarea unor ioni anorganici folosind ca adsorbant alumina, ca

liant amidonul iar ca suport solid lamele de microscop. Mai târziu Kelles (1951) foloseşte ca suport

silicagelul, iar ca liant ipsosul. Cromatografia în strat subţire este mai rapidă, are o rezoluţie mai

bună şi este mai sensibilă decât cromatografia pe hârtie.

În termeni teoretici, tipurile de faze staţionare şi mobile, aplicaţiile cromatografiei pe hârtie şi

cromatografiei în strat subţire sunt aproape identice. Tehnica TLC adeseori este folosită ca mijloc

de determinare a condiţiilor optime pentru efectuarea separărilor prin tehnica cromatografiei de

lichide pe coloană. Avantajele utilizării acestei tehnici sunt constituite din viteza mare şi costurile

scăzute pentru efectuarea unor experimente exploratorii. Unii cercetători susţin ideea că tehnica

TLC ar trebui să preceadă analiza pe coloană.

Tehnica TLC a devenit o metodă de rutină în industriua farmaceutică mai ales în scopul

monitorizării purităţii produşilor. Şi-a găsit aplicaţii şi în laboratoarele clinice dar şi în laboratoarele

biologice şi biochimice. Deoarece particulele fazei staţionare sunt similare celor folosite în

cromatografia de adsorbţie, de partiţie cu faze normale sau inversate, de schimb ionic şi de

excluziune pe baza mărimii, tehnica TLC se consideră că se aseamănă foarte mult cu tehnica

cromatografiei de lichide de înaltă performanţă. Chiar şi fazele mobile se aseamănă cu cele

folosite în cromatografia de lichide.

10.1 Adorbenţi folosiţi în TLC Adsorbenţii folosiţi în tehnica TLC trebuie să îndeplinească o serie de condiţii cum ar fi:

Să nu reacţioneze cu substanţa de separat, cu solvenţii sau cu reactivii folosiţi pentru

vizualizarea spoturilor.

Să fie rezistenţi la temperaturi înalte.

Să aibă o suprafţă activă şi specifică.

Să aibă o granulaţie cât mai fină şi un număr mare de pori cu diametru mic şi controlat (de

aceeaşi dimensiune). Cu cât dimensiunea porilor este mai mică cu atât viteza de deplasare

este mai mică.

Ca adsorbenţi se folosesc geluri de silice cum ar fi silicagel G care este un silicagel cu liant

(ipsos), silicagel cu indicator de fluorescenţă, adsorbenţi anorganici de tipul aluminei (Al2O3).

Alumina, funcţie de modul de preparare şi activare se poate găsi în formele:

a) γ care este o formă activă utilizată în TLC

b) α care este o formă compactă, reactivă care se obţine din γ alumină încălzită la 1000 oC.



S-a studiat structura poroasă a Al2O3 şi s-a constatat că posedă un sistem regulat de micropori

cilindrici cu diametru de 2,7 µÅ la care se adaugă micropori neregulaţi cu diametru normal mai

mare. Al2O3 conţine cantităţi diferite de apă fie sub formă grupelor OH superficiale sau ca apă

adsorbită. S-a presupus că interacţiile la suprafaţa aluminei sunt în general de natura

electrostatică. Centrele active de pe suprafaţa aluminei sunt centre acide, bazice sau cu transfer

de sarcină. După natura grupărlor funcţionale superficiale pe care le prezintă alumina există trei

tipuri de fază staţionară:

Al

OH

Al

OH

O

a) Alumină acidă

Al AlO

O

b) Alumină neutră obţinută prin dehidroxilare

Al

O-Na+

Al

O-Na+

O

c) Alumină bazică

Activitatea de adsorbţie a aluminei poate fi controlată prin modificarea conţinutului de apă. Prin

încălzire la 360 oC timp de 5 h alumina este total lipsită de apă (gradul I de acţionare exprimat în

procente de 0%). Hitratând aceasta la diverse temperaturi şi cu un anumit conţinut de apă se

poate obţine alumină grad II (3% grade de activiytate), alumină grad III (6%), grad IV (10%) şi grad

V (15%).

Silicagelul e adsorbentul cu cea mai largă utilizare. Este produsul de policondensare a cidului

orto-silicic. Pe suprafaţa silicagelului în afara grupelor silanolice tip OH se pot forma şi alte grupări,

prin dehidroxilare.

Si

OH

OSi

OH

SiO

Si

O

a) legături siloxanice obţinute prin

dehidroxilarea unei anumite cantităţi din

aceste grupări.

Si

O

OSi

O

H HO

H H

b) grupe silanolice hidratate ce pot apare într-

o anumită proporţie chiar după uscare. Se

preferă această formă pentru compuşii

polari deoarece are suprafaţă de contact

mare.

Si OH Si O- + H+

Si

OH

O Si

OH

SiH3C

CH3

CH3

HN Si

CH3

CH3

CH3

+ Si

O

O Si

O

Si SiH3C

CH3

CH3

CH3

CH3

H3C

Si

O

O Si

OSi

H3C CH3



Grupările silanolice se pot manifesta şi ca schimbători de ioni. Constanta de disociere, K~1010, comparativă

cu a fenolilor. Pentru remedierea acestor deficienţe s-au propus mai multe metode dintre care blocarea

centrilor de adsorbţie cu Pd sau Ag, adsorbţia continuă a unor compuşi puernic adsorbabili care să reducă

dispersia fără a afecta selectivitatea, silanizarea suprafeţelor (tratarea cu hexametilen disiloxan sau dimetil

diclor silan).

Si OH

Si OH

SiOH

SiOH

Si Si

Si Si

O

O

c) la temperaturi mai mari de 400 oC se poate

produce o sintetizare a particulelor

adiacente conducând la micşorarea

suprafeţei specifice.

Pe lângă modificarea polarităţii se poate modifica şi suprafaţa specifică. Viteza de distribuţie va

fi lentă. Unii autori au arătat că există 3 tipuri fundamentale de grupări OH superficiale:

a) grupe OH legate

b) grupe OH reactive

c) grupe OH libere

Tăria relativă ca centre de adsorbţie a acestor grupe OH este în ordinea a<b<c. Silicagelul are

o structură poroasă. Mărind pH-ul soluţiei de gel între 4 -10 se obţin diferite soluţii având suprafeţe

specifice cuprinse între 200-800 m2/g. Moleculele adsorbite joacă rol de donori de e- stabilind

legătura de H.

Cărbunii pot avea suprafaţă nepolară (grafitul coloidal). Suprafaţa polară etse obţinută prin

supunerea cărbunelui la un proces redox. În acest caz se va comporta ca un oxid metalic.

Suporturile de natură organică includ: celuloza, celuloza modificată, derivaţi de celuloză.

Adsorbenţii cel mai des folosiţi sunt cei modificaţi chimic sau cei specifici (se prepară în

prezenţa compusului respectiv şi apoi se extrage din suport cu soluţii saline). Cei de înaltă

eficienţă pot fi:

a) Total poroşi cu diametrul particulei de 5 µm. Au o sensibilitate şi selectivitate ridicate.

b) Cu miez compact cu suprafaţă cu porozitate controlată. Conferă o suprafaţă de contact mai

mare, o sensibilitate şi selectivitate mai mari.

10.2 Mecanismul separării Mecanismul separării prin TLC se bazează în principiu pe distribuirea componenţilor unui amestec

complex între două faze dintre care o fază staţionară (fs) solidă sau lichidă şi alta o fază mobilă (fm)

care străbate faza staţionară. Funcţie de natura fazei staţionare se întâlnesc:

TLC de adsorbţie (faza staţionară S şi faza mobilă L)

TLC de repartiţie (faza staţionară L şi faza mobilă L)

TLC de schimb ionic.



Componenţii amestecului sunt antrenaţi de faza mobilă şi trecuţi peste faza staţionară. Viteza

de migrare va fi diferită şi va depinde de modul în care componenţii se distribuie în cele două faze

(viteza de migrare a componentului sau eluentului). Dacă unul din componenţii amestecului este

mai puternic adsorbit de faza staţionară el va rămâne mai mult timp mobilizat în această fază, deci

va rămâne mult în urma frontului de solvent. Dacă componentul migrează mai repede acest

comportament este un indiciu că moleculele lui sunt mai strâns legate de faza mobilă şi la echilibru

aceasta conţine un număr mai mare din moleculele solutului decât faza staţionară. Un rol important

în separare îl joacă mărimea suprafeţei adsorbentului, separarea fiind cu atât mai bună cu cât

suprafaţa specifică e mai mare. În cromatografia în strat subţire granulaţia adsorbentului e fină,

mai mică de 60 µm, adsorbentul este întins sub forma unei pelicule subţiri şi omogene (grosime de

240 – 250 µm), care are ca efect micşorarea accentuată a spaţiilor interstiţiale neeficace şi deci

conduce la creşterea eficienţei metodei.

Procedeul de adsorbţie în faza staţionară din faza mobilă poate fi descris de izotermele de

adsorbţie. În cazul separării a 2 compuşi A şi B, din care A este mai puternic reţinut de faza

staţionară şi B mai puternic reţinut de faza mobilă, sunt posibile în urma separării situaţiile

prezentate în Figura 10.1.

Concentratia in faza mobila (CM)

AB

CM CSAB

A

B

Figura 10.1.a: Izoterme de distribuţie liniare ideale.


A

B

CM CSAB

A

B

Figura 10.1.b: Izoterme de distribuţie neliniare neideale (fenomene însoţite di difuzia zonelor).


A

B

CM CSAB

A

B

Figura 10.1.c: Izoterme de distribuţie neliniare neideale (fenomene însoţite di difuzia zonelor).



Tratarea riguros matematică a acestor procese nu e posibilă dacă pe lângă procesul de

repartiţie-adsorbţie are loc procesul secundar de transport de masă, difuziune, adsorbţie-desorbţie,

fenomene care se influenţează şi se condiţionează reciproc.

a) izoterma liniară ideală: este o linie dreaptă mai mult sau mai puţin înclinată, după cum

componentul mai mult sau mai puţin reţinut de faza staţionară. Echilibrul se stabileşte

instantaneu, fenomenul de difuzie lipseşte iar forma zonelor de separare a celor doi

componenţi e perfect determinată şi simetrică. Concentraţia componenţilor substanţelor în

interiorul fiecărei zone e repartizată uniform.

b) izoterma adsorbţiei neideale este aproximativ liniară. Echilibru de adsorbţie se stabileşte relativ

încet. Substanţele difuzează şi ca atare petele cromatografice au margini difuze. Repartizarea

substanţelor în interiorul petei e neuniformă.

c) izoterme curbe concave sau convexe: substanţele diferă mult, petele apar cu cozi şi există

condiţii necorespunzătoare pentru separare. Pot apare aceste situaţii din cauza faptului că

adsorbanţii sau solvenţii de migrare nu au fost bine aleşi sau datorită faptului ca nivelul

concentraţiilor celor două substanţe e mult prea mare şi depăşeşte capacitatea de adsorbţie a

fazei staţionare. Repartizarea componenţilor de-a lungul cromatogramei se face funcţie de

solubilitatea solutului în cele două faze lichide şi va depinde de o serie de factori structurali şi

polaritate. Faza mobilă dă legături intermoleculare (legături de hidrogen) dacă în cealaltă fază

există substanţe care conţine grupări capabile să formeze astfel de legături (grupări OH).

Exemple de adsorbenţi ce posedă aceste legături includ silicagelul şi alumina (valorile Rf cresc

odată cu creşterea tăriei legăturii de hidrogen între substanţă şi solvent şi valorile Rf scad

odată cu creşterea energiei legăturii de hidrogen între substanţe şi adsorbent ). Mai pot apare

legături polare, multipolare, legături donor-acceptor.

10.3 Cromatoplăci pentru tehnica TLC şi aplicarea probelor Tehnica TLC constă în obţinerea unui strat subţire de adsorbent pe o placă de sticlă sau alt suport.

Dimensiunile sunt diferite. Plăcile pot fi şi achiziţionate. Mărimile acestor plăci variază de la 5×20,

10×20 şi 20×20. Plăcile comerciale pot fi convenţionale şi de înaltă performanţă. La plăcile

convenţionale grosimea stratului este de 200 – 250 µm cu dimensiuni ale particulelor de 20 µm. La

plăcile de înaltă performanţă grosimea stratului este de 100 µm cu dimensiuni ale particulelor de 5

µm sau chiar mai mici. Cromatoplăcile de înaltă performanţă dau separări mai bune în timp mai

scurt. O placă convenţională poate da până la 2000 talere pe o distanţă de 12 cm într-un timp de

25 minute. Pentru cromatoplăcile de înaltă performanţă se pot obţine până la 4000 talere pe o

distanţă de 3 cm într-un timp de până la 10 minute. Dezavantajul cromatoplăcilor de înaltă

performanţă suferă de dezavantajul de a avea capacităţi reduse ale probelor.

Aplicarea probelor în tehnica TLC este cel mai critic aspect. Pe cromatoplăci se trasează o linie

de start imaginară la circa 2 cm de unul din capete. Soluţia de analizat (de concentraţie 0,01 –

0,1%) se aplică cu o micropipetă (1 – 10 µl sau 1 - 10 µg). Diametrul petei aplicate nu trebuie să



depăşească 3 mm în diametru (pentru a obţine eficienţa cea mai bună la separare). Pentru

depunerea succesivă a unei soluţii diluate este necesară uscarea petei de fiecare dată, pentru a

obţine zone înguste concentrate. Aplicarea manuală se realizează prin folosirea unei capilare sau

a unei seringi hipodermice. Există şi sisteme automate care cresc precizia şi acurateţea la

aplicarea probei (Skoog). Folosirea capilarelor din platină-iridiu permite aplicarea unor spoturi cu

volume de 100 – 200 nL (Kellner).

10.4 Dezvoltarea cromatogramei şi detecţia (localizarea) analiţilor pe cromatoplacă Pentru separări se folosesc cromatoplaci activate. Activarea cromatoplăcilor se face înainte de

utilizare prin introducerea în etuvă la o temperatură în jur de 1000 C, timp de 45 minute – 1 oră.

După pregătirea probelor placa se usucă şi se supune migrării în camere cromatografice speciale,

închise etanş. Linia de start de pe placă trebuie să fie cu cel puţin 0,75 – 1 cm deasupra nivelului

lichidului din camera cromatografică închisă etanş şi saturată în vapori în mediul de deasupra

solventului. Se lasă să se irige placa (frontul solventului să ajungă la 2 cm de partea superioară),

se îndepărtează cromatoplaca din camera cromatografică, se usucă şi se identifică substanţele

separate.

Pentru localizarea spoturilor (vizualizare) după realizarea separării se pot folosi atât reactivi

anorganici cât şi organici. Metodele cel mai des aplicate implică spray-ere cu o soluţie de iod sau

acid sulfuric, ambele reacţionând cu o serie de compuşi organici. Se poate folosi şi ninhidrina. O

altă metodă de detecţie constă în încorporarea unui material fluorescent în faza staţionară. După

dezvoltarea cromatogramei, cromatoplaca se examinează sub lumină UV. Componenţii probei

atenuează fluorescenţa astfel că toată cromatoplaca are fluorescenţă cu excepţia spoturilor unde

există analiţii separaţi.

Metodele de localizare a spoturilor pot fi sistematizate în orice caz după cum urmează:

a) folosirea caracteristicilor de luminiscenţă a analitului (fenomenul de fluorescenţă pentru

compuşi organici şi fenomenul de fosforescenţă pentru compuşi anorganici)

b) impregnarea stratului fazei staţionare cu o substanţă indicatoare fluorescentă (ca substanţe

indicatori se pot folosi derivaţii de piren, fluoresceina, morina sau rodamina B)

c) spray-ere cu un oxidant pouternic nespecific (HNO3, KMnO4, H2SO4). Apar spoturi negre la

oxidarea compyşilor organici

d) spray-ere cu soluţii de reactivi specifici (ninhidrina pentru a vizualiza gruparea NH2 (Figura 10.2), clorura de Fe(III) pentru fenoli, ftalatul de anilină pentru zaharurile reducătoare, sau

reactivi de formare a complecşilor pentru vizualizarea ionilor metalici.

C

C

O

O

C

OH

OH

ninhidrina

R-NH2

C

C

C

O

O

N

O

O

produs albastru colorat

Figura 10.2: Formarea produsului colorat în albastru din reacţia dintre ninhidrină şi grupările NH2.



10.5 Caracteristici ale cromatoplăcilor din TLC 10.5.1 Factorul de ratardare (retenţie, Rf) Factorul de retardare, Rf se determină prin raportul dintre distanţa parcursă de analit de la linia de

bază şi distanţa parcursă de solvent de la linia de bază.

M

Rf

d

dR =

Deoarece spoturile nu sunt simetrice, distanţa se măsoară până la poziţia de intensitate maximă

(Figura 10.3).

Linia de start Frontul solventului

Proba 2

Proba 1

W

WA WB

dR

dM

Rf = dR/dM

Figura 10.3: Cromatogramă obţinută prin tehnica TLC.

10.5.2 Factorul de capacitate Factorii dR (distanţa parcursă de analit de la linia de start) şi dM (distanţa parcursă de solvent de la

linia de start) pot fi raportaţi la tR (timpul necesar solventului să parcurgă o anumită distanţă) şi tM

(timpul necesar solutului/analitului să parcurgă o anumită distanţă).

Timpul petrecut de analit/solut în faza mobilă este egal cu distanţa parcursă împărţită la viteza

liniară a solventului, u.

u

dt RM =

Solutul nu ajunge la acest punct până când faza mobilă nu parcurge distanţa dM.

u

dt MR =

Factorul de capacitate se notează cu k’ şi este dat de relaţia:

R

RM

d

ddk

−=′

Factorul de capacitate poate fi exprimat şi prin intermediul factorilor Rf.

f

f

MR

MR

R

R1

dd

dd1

k−

=−

=′



Factorii de capacitate astfel obţinuţi pot fi folosiţi pentru dezvolatrea cromatografiei pe coloană.

10.5.3 Înălţimea unui taler cromatografic Înălţimi ale talerelor pot fi obţinute pentru anumite tipuri de cromatoplăci din tehnica TLC. Numărul

de talere teoretice se poate calcula cu relaţia 2

R

W

d16N ⎟

⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

Înălţimea unui taler se calculează cu relaţia:

N

dH R=

unde dR şi W sunt cele definite în Figura 10.3.

10.6 Aplicaţii ale cromatografiei în strat subţire Tehnica TLC se foloseşte atât la determinări calitative (Rf – metoda comparării valorilor Rf) cât şi

determinări cantitative (prin metode gravimetrice, volumetrice sau spectrofotometrice în VIZ şi UV).

Datele de la o singură cromatogramă, în mod uzual, nu furnizează informaţii suficiente pentru a

permite identificarea unor specii prezente într-un amestec din cauza variabilităţii factorului Rf cu

mărimea probei, numărul de talere şi condiţiile de la migrare.

Cei mai importanţi factori care determină mărimea factorului Rf includ grosimea fazei

staţionare, umiditatea fazelor mobilă şi staţionară, temperatura, gradul de saturare a camerei

cromatografice în vaporii fazei mobile, mărimea probei. Aceste variabile nu pot fi controlate dar pot

fi parţial ameliorate prin folosirea unui factor de retenţie relativ (Rrel) determinat pentru analitul i în

raport cu o substanţă standard, st:

f(st)

f(i)rel

R

R

standard substanta o de parcursa distanta

analit de parcursa distantaR ==

Pentru identificarea spoturilor evidenţiate la dezvoltarea cromatogramei se poate folosi metoda

comparării factorului Rf cu acela al unor substanţe pure (standarde).

Identificarea se poate realiza şi prin tehnica prelevării exacte a spotului evidenţiat pentru un

analit. Prelevarea se poate realiza cu o spatulă, aducerea componentei prelevate într-o eprubetă,

dizolvarea analitului cu un solvent potrivit, separarea de faza staţionară insolubilă prin centrifugare

şi analiză prin spectrometrie de masă, rezonanţă magnetică nucleară sau spectroscopie în

infraroşu.

Comparativ cu tehnica cromatografiei de lichide de înaltă performanţă, tehnica TLC are câteva

puncte slabe cum ar fi:



a) Viteza solventului nu este constantă, poate fi modificată prin mărimea particulelor fazei

staţionare şi tipul solventului folosit. Scăderea vitezei de migrare poate duce la lărgirea

spoturilor.

b) Compoziţia solventului se poate modifica în timpul separării datorită unor echilibre induse de

faza staţionară. Acest fapt conduce la factori de capacitate care sunt greu de reprodus şi

implicit la separări nereproductibile.



11 Tehnici cromatografice instrumentale

11.1 Cromatografia de lichide pe coloană instrumentală Reprezintă tehnică ce se caracterizează prin:

a) folosirea coloanelor lungi şi înguste umplute cu particule mici;

b) separări de înaltă eficienţă realizate într-un timp scurt;

c) operarea la presiune ridicată;

d) detecţia continuă a componen�ilor separati cu posibilitate de automatizare a procesului de

separare;

e) precizia determinărilor cantitative;

f) capacitatea de a separa specii nevolatile sau instabile termic.

Cromatografia de lichide pe coloană de înaltă performanţă (HPLC): necesită crearea unor condiţii

optime de transport a fazei lichide sub presiune; necesită asigurarea atingerii rapide a echilibrelor

de distribuţie şi a detecţiei optime pentru componenţii separaţi.

11.1.1 Clasificare Metodele cromatografiei de lichide sunt complementare şi principalele metode utilizate în

cromatografia de lichide precum şi întrepătrunderea acestora în vederea utilizării lor în practică

sunt prezentate în Figura 11.1.

AdsorbtiePartitie

Schimb ionic

Partitienormala

Partitie cu fazeinversate

Permeatie prin gel Filtrare prin gel

Excluziune

102

103

104

105

106

Polari neionici

Nepolari Ionici

Insolubili in apa Solubili in apa

Cresterea polaritatii

Figura 11.1: Aplicaţiile cromatografiei de lichide.

Tehnica cromatografiei de lichide poate cuprinde prin urmare tehnici precum:

- cromatografia de adsorbţie (cromatografia L-S bazată pe mecanisme de adsorbţie);



- cromatografia prin schimb ionic (CSI sau IC bazată pe mecanisme de schimb);

- cromatografia de excludere difuzie (cromatografia prin penetraţie prin gel şi filtrare pe gel);

- cromatografia de repartiţie (cromatografia L-L bazată pe mecanisme de repartiţie);

- alte metode: cromatografia de afinitate sau schimb de liganzi şi cromatografia perechilor ionice.

Metodele cromatografiei de lichide pot fi utilizate funcţie de scopul urmărit:

- Pentru moleculele cu greutate moleculară mare se foloseşte cromatografia de excludere –

difuzie;

- Pentru compuşii ionici cu greutatemoleculară mică se foloseşe în mod curent CSI.

- Pentru speciile neionice, dar puţin polare se foloseşte cromatografia de repartiţie.

11.1.2 Aparatura utilizată în cromatografia de lichide După cum se observă în Figura 11.2 sistemul cromatografului de lichide este compus din 4

componente de bază.

Rezervoare fază mobilă

Valvă partiţionare

solvent Pompă

Detector

Col

oană

Pre-coloană

Amortizare pulsuri

Injector, tip “6 căi”

Figura 11.2: Prezentarea schematica a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern.

1. coloana cromatografică în care se desfăşoară procesul de separare al componenţilor.

2. dispozitive de introducere a probei care poate fi dependent de tipul de analiză efectuat: calitativ

sau cantitativ.

3. sistem de alimentare cu fază mobilă care con�ine circuitul de solvent care transportă faza

mobilă prin coloana cromatografică. Acest sistem de alimentare include:

a. rezervoare cu fază mobilă de aceeaşi polaritate sau polarităţi diferite;

b. dispozitive de reglare a vitezei de curgere;

c. dispozitive de monitorizare a presiunii debitului;

d. dispozitiv de purificare;

e. precoloane de amestecare aşezate în faţa coloanei cromatografice.

4. detectori cu sau fără sistem de înregistrare (reprezintă sistemul de identificare şi dozare a

componenţilor din amestec).

Sistemul este astfel construit încât să permită transmiterea fazei mobile corespunzătoare

pentru o eluţie continuă sau o eluţie în gradient. Faza mobilă curge printr-o cameră de

preamestecare plasată între pompă şi rezervoare pentru a compensa schimbările făcute în fază.



Pompa pulsează faza mobilă din camera de amestecare în coloana cromatografică şi apoi o

împinge spre detector. Viteza de curgere a fazei mobile trebuie să se menţină constantă şi

reproductibilă. Componenţii situaţi în coloană ajung direct la detector care transformă diferenţa

unor proprietăţi dintre componenţi şi faza mobilă în semnal electric, semnal care este amplificat şi

înregistrat sub forma unor cromatograme care se analizează calitativ şi cantitativ.

În cromatografia de lichide se folosesc coloane confecţionate din metale (Al, Cu), oţel

inoxidabil, materiale plastice de o anumită duritate. Diametrul poate varia între 2 – 10 cm.

Lungimea coloanei este de la 20 până la 100 cm. Uneori este nevoie să se lege în serie mai multe

coloane pentru a asigura eficienţa presiunii de separare. În HPLC coloanele trebuie să reziste la

presiuni ridicate, ceea ce impune entaşiezări la capete prin racorduri corespunzătoare.

Dimensiunile coloanei variază în funcţie de granulaţia umpluturii. Diametrul în HPLC poate fi de la

1 la 4 cm şi lungimea între 10 – 25 cm.

Detectorii folosiţi în cromatografia de lichide asigură detecţia componenţilor analizaţi dar ridică

probleme mai grele. Condiţiile care se impun pentru detectori includ:

- să prezinte sensibilitate ridicată (10-11 – 10-13 g component mL-1);

- să dea răspuns liniar în funcţie de concentraţie;

- să prezinte viteză mare de răspuns şi să semnaleze prezenţa tuturor componenţilor;

- să fie nedestructiv;

- să nu fie influenţat de modificarea compoziţiei fazei mobile; deoarece nici un detector nu

îndeplineşte aceste condiţii, se recomandă utilizarea simultană a mai multor detectori.

Se pot folosi detectori refractometri (bazaţi pe unghiuri de refracţie), indicatori fotometrici,

indicatori bazaţi pe măsurarea căldurii de absorbţie şi bazaţi pe măsurarea conductibilităţii termice.

11.1.3 Faze mobile şi staţionare, polaritate Faza mobilă poate fi un singur solvent de compoziţie constantă în coloana cromatografică

(cromatografia izocratică) sau un amestec de solvenţi de polaritate diferită în cromatografia cu

gradienţi.

Condiţiile pe care faza mobilă trebuie să le îndeplinească includ:

- să prezinte puritate înaltă;

- vâscozitate scăzută;

- punct de fierbere între 20 – 500 C;

- reactivitate chimică scăzută;

- compatibilitate cu detectorii utilizaţi;

- inflamabilitatea şi toxicitatea ridicată să fie strict monitorizate.

În cromatografia de lichide trebuie să se ţină seama de polaritatea celor 3 componenţi care

participă în procesul de separare: solut→ fază mobilă → fază staţionară. Polaritatea solutului şi a

fazei mobile se aleg apropiate şi net diferite de a fazei staţionare.



a) polarităţi asemănătoare pentru (solut, fază staţionară) şi diferite de ale fazei mobile: viteze mici

de deplasare, timp mare de separare.

b) polarităţi asemănătoare pentru (solut, fază mobilă) şi diferite de ale fazei staţionare: timp foarte

scurt de separare.

În cazul cromatografiei cu faze normale

Faza staţionară este polară (silicaţi sau particule de silicagel sau lichide polare precum etilen

glicol) iar faza mobilă este relativ nepolară (hexanul, izopropil eterul).

Dacă se consideră un amestec de analiţi A, B, C, polaritatea compuşilor A > B > C, cu creşterea

polarităţii fazei mobile, timpul de reţinere se micşorează şi ordinea de eluţie este: C > B > A. De

fapt componentul cel mai puţin polar iese primul din coloană.

În cazul cromatografiei cu faze inverse

Faza staţionară este nepolară (hidrocarburi, coloane C8 şi C18) şi faza mobilă este polară. Dacă

se consideră amestecul de analiţi A, B, C, polaritatea compuşilor A > B > C, ordinea de eluţie este:

A > B > C.

11.2 Cromatografia ionică (IC) Analiza amestecurile de anioni, cationi sau compuşi polari a impus necesitatea utilizării

cromatografiei ionice, lucru dificil sau imposibil de realizat eficient prin celelalte variante ale

cromatografiei de lichide. Aceasta variantă a cromatografiei de lichide de înaltă presiune se

bazează pe utilizarea coloanelor cu schimbători de ioni respectiv a materialelor rezistente la

agresivitatea acizilor, bazelor sau sărurilor – substanţe a caror soluţii apoase servesc drept eluenţi.

Dintre toate elementele unui sistem cromatografic faza staţionară reprezintă elementul cheie

deoarece determină mecanismul de separare care este operativ. Mecanismul de separare, în

schimb, dictează alegerea fazei mobile şi adeseori care metode de detecţie ar putea fi aplicate în

mod corespunzător. Pentru a înţelege importanţa fazei staţionare în procesul cromatografic este

necesar să se cunoască unele aspecte privind compoziţia sa şi, în acelaşi timp, este util să se

cunoască cum se prepară o fază staţionară.

11.2.1 Schimbătorii de ioni Schimbătorii de ioni reprezintă cea mai utilizată fază staţionară în cromatografia de ioni. Un

schimbator de ioni cuprinde în compoziţia sa următoarele trei elemente importante: o matrice

insolubilă care poate fi de natură organică sau anorganică, locaţii ionice fixe care sunt fie ataşate,

fie parte integrantă din matricea insolubilă şi, în asociere cu aceste locaţii fixe, o cantitate

echivalentă de ioni de sarcină opusă, faţă de cei din locaţiile fixe.

Grupările ataşate mai sunt cunoscute şi sub denumirea de grupări funcţionale iar ionii asociaţi

mai sunt numiţi şi contraioni. Contraionii sunt mobili în interiorul schimbătorului de ioni şi deţin

proprietatea importantă că au capacitatea de a fi înlocuiţi cu alţi ioni de aceeaşi sarcină atunci



când sunt plasaţi într-o soluţie care conţine asemenea ioni. Această ultimă proprietate este cea

care furnizează acestor materiale numele lor.

Pe lângă această proprietate fundamentală, schimbătorii de ioni, pentru a putea fi utilizaţi în

cromatografia ionică, ar trebui să prezinte şi următoarele proprietăţi:

1. Proprietatea de a schimba ionii rapid.

2. Stabilitate chimică ridicată într-un domeniu larg de pH.

3. Rezistenţă mecanică ridicată şi rezistenţă la şocuri osmotice.

4. Rezistenţă la deformare atunci când sunt împachetate în coloana şi supuse la curgerea fazei

mobile.

Drept matrice pe care se ancorează locaţiile ionice ale schimbătorilor de ioni se utilizează o

gamă largă de materiale. În cromatografia ionică modernă cele mai utilizate materiale includ silicea

şi o serie de polimeri organici care au la bază stirenul. Excelenta stabilitate chimică a răşinilor

schimbătoare de ioni de tip organic le furnizează un avantaj clar în faţa celor pe bază de silice cu

sensibilitate ridicată la variaţii de pH.

11.2.2 Precursori polimerici ai răşinilor schimbătoare de ioni În cromatografia ionică faza staţionară este o răşină polimerică interlegată (Figura 11.3), de obicei

de forma divinil benzen interlegat cu polistiren, cu grupări funcţionale ionice ataşate covalent.

Răşinile schimbătoare de ioni pot fi împărţite în patru categorii: schimbători cationici puternic acizi,

schimbători cationici slab acizi, schimbători anionici puternic bazici, schimbători anionici slab

bazici.

stiren divinil benzen

Figura 11.3: Structuri ale stirenului, divinil-benzenului şi un copolimer modificat de stiren-divinil-benzen pentru a fi folosit ca răşină schimbătoare de ioni. Site-ul pentru schimb este de obicei în poziţia para şi nu este neapărat necesar să fie legat la toate unităţile de stiren. R- poate fi –SO3

-H+, COO-H+, -NH3+OH- sau –

N(CH3)3+OH-.

Locaţie pentru schimb ionic Interlegătură



Cel mai uzual mod de preparare a unei răşini schimbătoare de ioni este acela în care mai întâi

se prepară un polimer neutru pe bază de stiren, pentru ca mai apoi acesta să fie modificat chimic

pentru a introduce grupările cu funcţiuni ionice. În mod alternativ, monomerii care conţin funcţiunea

ionică necesară pot fi polimerizaţi printr-o interlegătură potrivită pentru a obţine un schimbător de

ioni, dar materialele obţinute pe această cale nu sunt utilizate în mod obişnuit în cromatografia

ionică. Există două căi principale pentru obţinerea precursorilor polistirenici folosiţi în cadrul

majorităţii răşinilor schimbătoare de ioni. Din prima se obţin produşi ce sunt cunoscuţi drept

polimeri de tip gel, iar din cea de-a doua cale se obţin materiale macroporoase. Diferenţa

structurală dintre cele două tipuri de polimeri are implicaţii importante în privinţa schimbătorului de

ioni, în special în ceea ce periveşte viteza de schimb ionic, mai ales atunci când aceştia au

dimensiuni mari.

11.2.3 Mecanisme de separare Schimbătorii de ioni sunt materiale solide - derivaţi ai unor polimeri reticulaţi (poroşi), obţinuţi prin

legarea de catenele hidrocarbonate, ramificate, ale unor grupe funcţionale aşa cum sunt

reprezentate schematizat în Tabelul 11.1. Granulele de răşină se solvatează cu apa tinzând spre

un volum- limită maxim. Prin spaţiile dintre catenele unui cationit pot pătrunde prin difuziune în faza

lichidă doar molecule neutre sau cationi, anionii fiind excluşi.

Pătrunderea în granule a ionilor de semn contrar este îngreunată şi de “efectul Donnan” de

membrană, care apare pe suprafaţa granulei şi provoacă o selectivitate a acesteia la pătrunderea

ionului, în funcţie de dimensiunile acestuia. Un alt mecanism util în cazul substanţelor neionice sau

a celor ionice dar cu gruparea ionică identică dar cu geometria moleculei diferită – este difuzia prin

granule. Analog stau lucrurile într-un anionit, cu deosebirea că de astă dată sunt excluşi cationii.

Tabel 11.1: Tipuri de schimbători de ioni.

Tip Grupare funcţională Exemple Schimbători cationici puternic acizi Acid sulfonic -SO3

- -CH2CH2SO3

- Schimbători cationici slab acizi Acid carboxilic -COO-

-CH2COO- Schimbători anionici puternic bazici Amine cuaternare -CH2N(CH3)3

+ -CH2CH2N(CH2CH3)3

+ Schimbători anionici slab bazici Amine -NH3

+ -CH2CH2NH(CH2CH3)2

+

De exemplu, prin introducerea unui amestec de Na+ şi K+ pe o coloana umplută cu un cationit

aceştia vor fi fixaţi pe răşină, eliberând o cantitate echivalentă de ioni hidroniu.

R-H + Na+ → R-Na + H+

R-H + K+ → R-K + H+

Pompând un eluent prin coloana, (HCl diluat), ionii H+ din acid, fiind în concentraţie mai mare,

vor deplasa ionii fixaţi, prin echilibre ionice similare spre o porţiune inferioară iar aceştia se vor

putea fixa din nou, puţin mai jos, pe alte centre de schimb din coloană.



R-Na + H+ → R-H + Na+

R-K + H+ → R-H + K+

Repetarea procesului duce la migrarea ionilor prin coloană, însă, datorită afinităţii sporite a

grupărilor funcţionale tip -SO3- pentru K+ faţă de Na+, primul grup de ioni (sau prima zona) care va

ieşi din coloană va fi cel format din ionii de sodiu şi abia după un timp va iesi grupul conţinând ionii

de potasiu, asigurând separarea celor doi ioni. Similar sunt separate şi amestecuri mai complicate,

uneori fiind necesare coloane mai lungi.

Deoarece creşterea diametrului granulelor conduce la apariţia unor zone mai largi şi separări

mai de durată, iar granulele se deformeaza mecanic în timp, răşina se aplică sub formă de peliculă

subţire pe un miez de sticlă sferică, eficacitatea separării şi fiabilitatea coloanelor crescând foarte

mult. Fazele mobile în IC sunt simple – de obicei soluţii apoase diluate de acizi sau baze. Uneori

poate fi necesară adăugarea de metanol pentru a facilita dizolvarea moleculelor puţin ionizate în

apă. Pentru separarea cationilor se utilizează ca faze staţionare cationiţi (schimbători de cationi) şi

drept eluenţi, soluţii de acizi, iar pentru separarea bazelor se folosesc anioniţi (schimbători de

anioni) şi ca eluenţi soluţii de baze, de exemplu, o soluţie de bicarbonat de sodiu.

11.2.4 Conductometria - mijloc modern de detecţie în cromatografia ionică Monitorizarea conductivităţii prezintă o serie de caracteristici care oferă acestei proprietăţi

posibilitatea să fie folosită ca mijloc de detecţie. Conductivitatea este o proprietate universală a

soluţiilor ionice, reprezentând de fapt proprietate proporţională cu concentraţia componenţilor.

Deoarece fazele mobile folosite în cromatografia cu schimbători de ioni sunt ionice (de aceea

de multe ori aceste faze prezintă o conductivitate ridicată) detectorul de conductivitate folosit în

această metodă este un detector al unei proprietăţi comune. În acest tip de detecţie,

conductivitatea de fond a eluentului folosit în cromatografia cu schimb ionic este intensificată, dar

celula de conductivitate este transformată dintr-un detector al unei proprietăţi comune într-un

detector de proprietate al unui solut.

Acest fundament teoretic a fost exploatat şi desăvârşit prin adăugarea unei a doua coloane de

schimb ionic între separator şi celula de conductivitate care transportă ionii eluentului, sau care

modifică conductivitatea acestora la valori mai mici, în timp ce conductivitatea eluaţilor este

intensificată. Procedura a devenit cunoscută sub numele de supresia eluentului şi a fost raportată

pentru prima dată în anul 1975 de către Small şi colaboratorii săi. Mai târziu, a apărut posibilitatea

cuplării directe a coloanei schimbătoare de ioni cu detectorul de conductivitate şi metoda a fost

cunoscută sub numele de cromatografia ionică cu o singură coloană. Ţinând cont de această

procedură de lucru, detectorii conductometrici pot fi incluşi în două mari categorii tip detectori

conductometrici cu supresie şi detectori conductometrici fără supresie.



11.2.4.1 Principiul detectorilor conductometrici de supresie Detectorii conductometrici se utilizează cu precădere în cromatografia pe schimbători de ioni şi

sunt sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici. Sunt detectori specifici şi sunt

suficient de sensibili (500 pg – 1 ng). Detectorii conductometrici sunt sisteme caracterizate de

sensibilitate ridicată, stabilitate, flexibilitate, acurateţe şi reproductibilitate, şi de capacitate mare de

a furniza date de încredere. Detectorii conductometrici oferă posibilitatea unei cuantificări a

anionilor, cationilor, metalelor şi acizilor organici aflaţi în diferite probe, în concentraţii mai mici de

ordinul părţilor per bilion (ppb). Noile micro-procesoare, bazate pe circuite electrice, îmbunătăţesc

sensibilitatea detecţiei analitului prin reducerea zgomotului de fond.

De obicei, la ieşirea din coloana cromatografică ionii nu pot fi detectaţi suficient de sensibil pe

cale conductometrică în mod direct, deoarece au concentraţii coborâte şi sunt conţinuţi în eluentul

format dintr-un electrolit cu o concentraţie comparabilă sau chiar mai mare. Pentru îmbunătăţirea

performanţelor s-a recurs la supresorul ionic care a fost realizat pentru prima dată în 1975 de un

grup de cercetători americani (H. Small şi colab.). Iniţial sistemul a constat dintr-o coloană-

supresor, plasată în continuarea celei de separare, cu rolul de a transforma eluentul (un acid sau o

bază tare) în apă.

De exemplu, pentru eluent acid (acidul clorhidric) coloana supresor este umplută cu o răşină

schimbătoare de anioni cu formula generală R-OH, caracterizată de capacitate de schimb mare.

Coloana de separare poate fi redată ca RH şi coloana de supresie ca ROH. Eluentul care conţine

acid clorhidric diluat de exemplu, la ieşirea din coloana de separare va pătrunde în coloana

supresor unde se va petrece reacţia:

R-OH + (H+ + Cl-) → R-Cl + H2O

Reacţie prin care acidul utilizat drept eluent este trecut în apă care este un neelectrolit.

Între timp, sărurile se transformă în hidroxizii corespunzători:

R-OH + (Na+ + Cl-) → R-Cl + (Na+ + OH-)

R-OH + (K+ + Cl-) → R-Cl + (K+ + OH-)

Apa fiind practic neionizată va permite detecţia sensibilă a hidroxizilor total ionizaţi ce au apărut

din zonele formate iniţial din cele două săruri. Deoarece şi eluentul este format din ioni care

conduc curentul, înainte de supresor semnalul va fi mai slab.

Dacă se urmăreşte separarea a doi anioni, de exemplu Cl- şi Br-, eluentul ar putea fi, nu un

acid ci o bază diluată, de exemplu NaOH, sau NaHCO3. În acest caz separarea se va realiza pe

coloane de anioniţi şi eluentul ar fi de exemplu NaOH. La ieşirea din coloana de separare avem în

eluentul folosit zonele separate ale sărurilor anionilor supuşi analizei, adică NaCl şi NaBr.

Supresorul utilizat în acest caz va fi format dintr-o răşină de forma R-H în exces pe care se va

petrece reacţia:

R-H + (Na+ + OH-) → R-Na + H2O



11.2.4.2 Supresorul electrochimic În prezent, supresorul electrochimic (sau autosupresorul) din cromatografele ionice recente a

înlocuit coloana cu schimbători de ioni cu membrane schimbătoare de ioni. În plus, procesul de

schimb ionic în cromatografele moderne este accelerat prin electrodializă. În acest fel s-a mărit

viteza procesului şi s-a micşorat volumul mort. Mai mult, a crescut durata de funcţionare a

detectorului.

În aceste tipuri de detectori, în general, celula detectorului este localizată într-o incintă specială

de reglare a temperaturii, care are rolul de a izola celula detectorului de fluctuaţiile externe de

temperatură. Un schimbător de căldură unic, încălzeşte faza mobilă şi proba înainte ca acestea să

ajungă în celula detectorului. Aceste două trăsături furnizează stabilitatea liniei de bază (se elimină

influenţa curentului indus de temperatură care este întîlnită la alte tipuri de detectoare).

În Figura 11.4 se prezintă schematic, procesul de îmbunătăţire a raportului semnal-zgomot

pentru un sistem de analiză formal. În acest exemplu, sistemul de supresie cu autoregenerare,

înlocuieşte ionii de sodiu (şi alţi cationi) din eluent şi îi transportă odată cu ionii hidroniu din apa

folosită ca regenerant. Ionii hidroniu se combină cu ionii hidroxid rezultaţi din eluent şi formează

apa, care are o conductivitatea mult mai mică decât a hidroxidului de sodiu folosit ca eluent.

Conductivitatea analitului este intensificată deoarece anionii analitului se asociază cu ionii hidroniu

care sunt mult mai conductivi.

Reziduuri

H2O

HF, HCl, H2SO4, în H2O

NaF, NaCl, Na2SO4, în H2O

Coloana analitică

Sistem de supresie cu regenerare

Eluent (NaOH) Probă (F-, Cl-, SO42-

F-

Cl- SO4

2- µS

Separare prin supresie

F- Cl-SO4

2-

Separare fără supresie

Tim

µS

T

Ionii interferenţi

Figura 11.4: Reprezentarea schematică a procesului de îmbunătăţirea a raportului semnal-zgomot

Aceste procese convertesc în mod efectiv un detector de conductivitate dintr-un detector al

unei proprietăţi comune, într-un detector de proprietate specific capabil să detecteze concentraţii

extrem de joase (ppb) ale ionilor cu specificitate deosebită. Pentru sistemele de supresie cu auto

regenerare se cunosc două tipuri de sisteme: sisteme anionice de supresie cu auto-regenerare

(analiza anionilor) şi sisteme cationice de supresie cu auto-regenerare (analiza cationilor). În

funcţie de sistemul de operare, supresorii pot fi incluşi în trei categorii: supresori care operează în

modul ciclic, supresori care operează în modul extern şi supresori în modul chimic.



Chimismul din sistemul de supresie cu auto-regenerare anionică este ilustrat în Figura 11.5.

Exemplul este dat pentru situaţia în care ca eluent se foloseşte hidroxidul de sodiu, dar în calitate

de eluent pot fi folosite şi amestecurile carbonat/bicarbonat de sodiu sau acid boric/tetraborat. În

acest sistem, apa este folosită ca agent de regenerare care suferă procesul de electroliză cu

formare de oxigen în stare gazoasă şi ioni de hidroniu în camera anodică, şi cu formare de

hidrogen gazos şi ioni hidroxil în camera catodică. Ionii hidroxil formaţi la catod sunt înlăturaţi din

camera eluentului printr-un proces de excluziune. Membranele schimbătoare de cationi permit

transportul ionilor hidroniu de la camera anodică în camera eluentului unde se produce

neutralizarea hidroxidului din eluent, în timp ce ionii de sodiu din eluent sunt transportaţi de-a

lungul membranei în camera catodului, menţinînd bilanţul de sarcini. Rezultatul acestui proces este

îmbunătăţirea semnificativă a raportului semnal-zgomot datorită a trei factori:

1) conductivitatea de fond a eluentului descreşte după cum eluentul este supus procesului de

supresie la o conductivitate medie, mai mică în valoare, corespunzătoare apei;

2) conductivitatea analitului creşte prin asocierea cu ionii hidroniu din camera eluentului, şi

3) contorizarea picurilor corespunzătoare interferenţilor este înlăturată. Analit

Na+OH- eluent Anod

-+

Membrană schimbătoare de cationi

Membrană schimbătoare de cationi

H2O H2O

Analit şi H2O

H2O H2O

H+ + OH-=H2O

H2O şi O2

H+ + O2

H+ Na+

OH-

Spre detector

H2 + OH-

Na+OH- şi H2

Reziduuri Reziduuri Catod

Figura 11.5: Autosupresia într-un sistem de supresie cu auto-regenerare anionică.

Chimismul sistemului de supresie cu auto-regenerare cationică este prezentat în Figura 11.6.

Şi în aceste sisteme, ca agent de regenerare se foloseşte apa care suferă procesul de electroliză

cu formare de hidrogen în stare gazoasă şi ioni hidroxil în camera catodică şi oxigen gazos şi ioni

hidroniu în camera anodică. Ionii hidroniu generaţi la anod sunt înlăturaţi din camera eluentului prin

acelaşi proces de excluziune întîlnit şi în cazul celuilalt tip de sistem. Membranele schimbătoare de

anioni permit ionilor hidroxil să fie transportaţi din camera catodului în camera eluentului cu

neutralizarea ionilor hidroniu în eluent, în timp ce alţi ioni ai eluentului (MSA-) sunt transportaţi de-a

lungul membranei în camera anodică cu menţinerea bilanţului de sarcină. Răspunsul va fi puternic



îmbunătăţit prin asocierea cationilor analitului cu ionii hidroxil caracterizaţi de conductivităţi ridicate

ca valoare.

Analit Na+OH- eluent Anod Catod

-+

Membrană schimbătoare de anioni

Membrană schimbătoare de anioni

H2O H2O

Analit şi H2O

H2O H2O

MSA-

H+MSA-şi O2

H+ + O2

H+

OH-

Spre detector

H2 + OH-

H2O şi H2

Reziduuri Reziduuri

H+ + OH-=H2O

MSA-H+

Figura 11.6: Autosupresia într-un sistem de supresie cu auto-regenerare cationică.

11.3 Cromatografia de gaze 11.3.1 Aspecte teoretice Baza separărilor cromatografice în fază gazoasă o constituie distribuţie componenţilor între două

faze. Funcţie de natura fazei staţionare (fS) se întâlnesc:

- cromatografia GS (CGS, cromatografia gaz-solid) când fază staţionară este un solid

(separarea este bazată pe mecanismul de adsorbţie);

- cromatografia GL (CGL, cromatografia gaz-lichid) când faza staţionară este un lichid depus

pe un suport inert (separarea este bazată pe un mecanism de repartiţie).

Principiile cromatografiei în fază gazoasă includ:

- reţinerea specifică a componenţilor pe coloană are loc datorită presiunilor diferite de vapori

ale componenţilor de analizat;

- desorbţia componenţilor din faza staţionară în faza mobilă are loc cu atât mai rapid cu cât

volatilitatea lor este mai mare.

Avantajele cromatografiei de gaze faţă de a altor metode de separare includ:

- vâscozitatea redusă a fazei mobile permite folosirea coloanelor lungi, ridicând astfel

eficienţa procesului de separare,

- vâscozitatea redusă a fazei mobile conduce la stabilirea rapidă a echilibrelor de distribuţie,

- atingerea rapidă a echilibrelor are ca efect o rezistenţă mică la transferul de masă ceea ce

face posibilă o viteză mare de flux,



- timpul de analiză este foarte scurt, aparatura relativ simplă se pretează la analize calitative,

cantitative, pe lângă separarea componenţilor,

- se aplică în domenii variate şi la o gamă largă de produse exceptând produşii labili din

punct de vedere termic şi cei nevolatili.

11.3.2 Sistemul gaz cromatografic Schema de principiu a unui cromatograf de gaze este prezentată în Figura 11.7.

Coloană

SeptumBloc injector Blocul detector

Faza mobilă

Debit-metruControl debit

Regulator presiune

Cuptor

Figura 11.7: Schema de principiu a unui cromatograf de gaze.

Componentele majore ale instrumentului cuprind:

- butelia ce conţine gazul purtător (faza mobilă) sub presiune (150 atm)

- reductor de presiune şi sistem pentru reglarea şi măsurarea debitului

- bloc injector (sistemul de injecţie)

- coloana cromatografică-reprezintă sediul proceselor de separare; poate fi confecţionată din

metal, sticlă, poate fi dreaptă, sau forma literei U sau sub formă de spirală

- cuptor (sistemul de termostatare a coloanei sau programare a rampelor de temperatură)

- blocul detector cu amplificator amplifică semnalul dat de detector

Gazul purtător (eluentul) este eliberat dintr-o butelie ce ţine gazul sub presiune. Ulterior este

trecut printr-o serie de dispozitive de purificare, de reglare de presiune şi de măsurare a ei.

Eluentul ajunge apoi în dispozitivul de introducere a probei, pe care o preia şi o transportă în

evaporator (probele sunt vaporizate) şi apoi în coloana cromatografică. Dispozitivele pentru

introducerea probei constau în microseringi şi valve de injecţie. Valvele de injecţie au avantajul că

asigură trecerea continuă a gazului purtător (fazei mobile) prin coloană. Cantitatea de probă

injectată variază de la câteva µg la câteva mg.

Coloana este partea cea mai importantă a unui cromatograf şi reprezintă sediul procesului de

separare, componenţii sunt introduşi simultan, parcurg coloana cu viteze diferite (timpi diferiţi) şi o

părăsesc separat. Coloana de separare este confecţionată din tuburi metalice (Cu, Al, oţel

inoxidabil), tuburi de sticlă sau, mai nou, coloane capilare. După alte criterii de clasificare coloanele

din gaz cromatografie se împart în coloane umplute şi coloane tubulare deschise sau coloane

capilare. Lungimea coloanelor umplute poate fi de până la câţiva cm în timp ce lungimea

coloanelor capilare poate ajunge până la 50 m.



Componenţii separaţi de coloană ajung la detector, acesta transformând diferenţa unei

proprietăţi dintre eluent şi component în semnal electric. Acest semnal este amplificat şi înregistrat

sub formă unei cromatograme, care se interpretează din punct de vedere calitativ (identificarea

componenţilor) şi cantitativ (determinarea lor).

11.3.3 Faza mobilă folosită în cromatografia de gaz Eluentul sau gazul purtător are rolul de a antrena şi de a transporta componentele amestecului de-

a lungul coloanei cromatografice. Acesta trebuie să îndeplinească o serie de caracteristici precum:

- să fie inert (să nu reacţioneze cu componenţii probei sau cu faza staţionară

- să efectueze separarea fără să afecteze viteza de desfăşurare a analizei

- alegerea gazului purtător se face în funcţie de sensibilitatea detectorului, în funcţie de

eficienţa separării şi de posibilităţile de interacţiune cu solutul sau faza staţionară; de

exemplu la detectorul de conductivitate termică se aleg ca eluenţi gaze care au o

conductivitate termică mult diferită de a componenţilor ce se separă

- deoarece impurităţile din faza mobilă pot induce modificări asupra fazei staţionare, între

sistemul de alimentare cu gaz şi instrument, se folosesc de obicei filtre sub forma sitelor

moleculare

- pentru a se obţine rezultate reproductibile debitul fazei mobile în timpul analizei trebuie

menţinut constant.

11.3.4 Faze staţionare folosită în cromatografia de gaz Fazele staţionare folosite în cromatografia de gaz pot fi: polare (polietilenglicoli), nepolare

(cauciucuri siliconice), intermediare, cu punţi de hidrogen sau specifice (separarea amestecurilor

racemice). Fazele staţionare sunt lichide sau solide.

Fazele staţionare solide au rolul de a furniza un suport pentru faza mobilă. Faza staţionară solidă

trebuie: să fie poroasă, să fie inertă şi să nu recţioneze cu componenţii probei, să prezinte (la

suport) suprafeţe mari, să aibă rezistenţă mecanică şi termică ridicată.

Suportul solid este format din particule mici, sferice şi uniforme. Prima umplutură utilizată

pentru o coloană cromatografică a fost constituită din pământuri diatomice provenite din scheletele

unor plante monocelulare. Chromosorb P, W, G reprezintă faze staţionare prelucrate în flux de

Na2CO3 după calcinare.

O problemă des întâlnită în GC a constituit-o adsorbţia fizică a speciilor de analiţi polari sau

polarizabili, precum alcooli sau hidrocarburi aromatice, la suprafaţa silicaţilor umpluturii coloanei

sau a pereţilor coloanei. Adsorbţia rezultă în picuri deformate. S-a arătat că adsorbţia este o

consecinţă a grupărilor silanolice care se formează pe suprafaţa silicaţilor prin reacţie cu

umiditatea. O suprafaţă de silice hidrolizată apare în forma



Si

OHOSi

OH OSi

OOH

Gruparea SiOH de la suprafaţa suportului are afinitate foarte ridicată pentru molecule organice

polare şi tind să le reţină prin adsorbţie. Materialele suport pot fi dezactivate prin silanizare cu

dimetilclororsilan (DMCS).

Si OH + SiCl

CH3

CH3

Cl Si O Si

CH3

CH3

Cl + HCl

După spălare cu alcool, al doilea Cl este înlocuit de o grupare metoxi.

Si O SiCH3

CH3

Cl Si O SiCH3

CH3

OCH3+ CH3OH + HCl

Suprafeţele silanizate încă mai pot prezenta adsorbţie reziduală care derivă din impurităţile

oxizilor metalici din elementele diatomice. Impurităţile pot fi înlăturate prin spălare cu acid.

Fazele staţionare lichide se realizează folosind un lichid ales în funcţie de natura amestecului

care trebuie separat. Se pot folosi faze: solide, lichide, nepolare, polare. Proprietăţile fazelor lichide

imobilizate într-o coloană gaz-lichid cromatografică includ: 1) volatilitate scăzută (ideal, punctul de

fierbere al lichidului ar trebui să fie cu cel puţin 100 oC mai mare decât temperatura maximă de

operare a coloanei), 2) stabilitate termică, 3) nereactivitate chimică.

Fazele staţionare lichide sunt formate din lichide nevolatile având o compoziţie chimică foarte

variată (peste 100 de tipuri). Pentru a se putea lega chimic numărul acestora a fost restrâns la cele

care pot, prin sinteza, să formeze un film grefat pe partea internă a coloanei, preferaţi fiind

polisiloxanii şi polietilenglicolii fiecare într-o varietate care sa permită modificarea polarităţii

acestora.

Pentru a avea un timp rezonabil de rezidenţă în coloană, o specie trebuie să prezinte un

anumit grad de compatibilitate (solubilitate) cu faza staţionară. Polaritatea este efectul câmpului

electric în imediata vecinătate a unei molecule şi este măsurat de momentul de dipol al speciei.

Fazele staţionare polare conţin grupări funcţionale precum –CN, -CO, şi –OH. Fazele staţionare tip

hidrocarburi şi dialchil siloxanii sunt nepolare în timp ce fazele poliesterice sunt foarte polare.

Analiţii polari includ alcooli, acizi, amine, speciile de polaritate medie includ eterii, cetonele şi

aldehidele. Hidrocarburile saturate sunt nepolare. În general polaritatea fazei staţionare trebuie să

se potrivească cu cea a componenţilor probei. Când potrivirea este bună, ordinea eluţiei este

determinată de punctele de fierbere ale eluenţilor.

Materialul de plecare în obţinerea fazelor staţionare este polidimetilsiloxanului a cărui structură

este:

SiR

R

R

O Si

R

R

O Si

R

Rn



Parte din polidimetilsiloxani au gruparea R de tip –CH3 şi conduc la un lichid relativ nepolar. În

alte cazuri, o parte din grupările metil sunt înlocuite de grupări funcţionale precum fenil (-C6H5),

cianopropil (-C3H6CN) şi trifluoropropil (-C3H6CF3), ceea ce duce la creşterea polarităţii lichidelor.

Carbowax este un polietilen glicol cu structura HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-OH cu utilizări ìn

separarea speciilor polare.

11.3.5 Detectori folosiţi în cromatografia de gaz Se clasifică în:

- universali: dau răspuns pentru un număr foarte mare de componenţi

- specifici: sunt aplicabili doar la anumiţi componenţi cu anumite grupări funcţionale.

Cei mai importanţi detectori sunt:

- detectori de conductibilitate termică - catarometru

- detectori de ionizare în flacără

- detectori de ionizare cu radiaţii (detector cu captură de e- utilizaţi în analiza pesticidelor).

Catarometrul este un detector universal, sensibilitate 10-5 g component/s (ceilalţi detectori pot

atinge sensibilitate de până la 10-15 g component/s). Este nespecific, nedestructiv şi se poate cupla

cu alte instrumente cum ar fi spectrometrele de masă sau spectrofotometrele utilizate în infraroşu.

Principiul de funcţionare se bazează pe măsurarea diferenţei de conductibilitate termică dintre

component şi eluent. Un fir metalic încălzit pierde căldura cu o viteză dependentă de natura lui şi a

gazului ce îl înconjoară. Catarometru se compune din 2 celule de conductibilitate (una de măsură

şi una una de referinţă) şi 2 rezistenţe (una fixă şi una variabilă) legate în punte Winstone. În celule

sunt montate fire de Pt sau W. Prin cele 2 celule circulă iniţial doar gazul purtător (eluentul). Se

aplică un curent continuu de câţiva volţi ce alimentează puntea. Cele 2 fire sunt încălzite la o

temperatură mai ridicată cu circa 80 oC faţă de pereţii detectorului. Pentru aceasta este necesar un

curent de câteva sute de miliamperi. Cele două rezistenţe fiind egale, instrumentul de măsură va

indica linia de zero. În momentul în care din coloană iese un component (analit) el va prelua de la

fir o altă cantitate de căldură. Puntea se dezechilibrează. Circuitul electronic este astfel conceput

încât să marcheze reechilibrarea punţii, apoi printr-un semnal electric este amplificat şi apoi

înregistrat sub forma unei cromatograme. Cele mai utilizate faze mobile în cazul catarometrului

sunt gazele cu mase mici cum ar fi hidrogenul şi heliul.

Detectorii de ionizare au la bază un principiu de funcţionare care se bazează pe creşterea

curentului produs când substanţele eluate care îi traversează sunt ionizate. Aceşti detectori sunt

ideali pentru coloanele capilare şi satisfăcătoare pentru coloanele cu umplutură. Sunt detectori

foarte sensibili, volumul mort este foarte mic, răspunsul fiind aproape instantaneu. Sunt suficient

de stabili la fluctuaţiile de viteză ale fluxului de gaz şi la fluctuaţiile de temperatură. Dau un răspuns

liniar în funcţie de concentraţie.



11.3.6 Aplicaţii ale cromatografiei de gaz Utilizată în separarea şi analiza hidrocarburilor, acizilor şi a esterilor, în aplicaţii biomedicale.

Cuplată cu spectrometria de masă gaz cromatografia este utilizată în diagnosticarea şi evoluţia

tratamentelor unor boli. Se pot separa metaboliţi biologici volatili din urină, ser, plasmă, fluid

cerebro spinal. Metoda poate fi utilizată şi în studiul unor medicamente în plasmă, urină, salivă, în

omogenat de ficat, în ţesuturi. Este utilizată şi în studiul unor esenţe: de exemplu: cromatograma

poate fi asimilată cu amprenta buchetului unor vinuri, a componenţilor unor parfumuri, esenţa de

ceai, cafea. Cromatografia gaz solid şi-a găsit o mare aplicabilitate în separarea gazelor

permanente, a hidrocarburilor cu masă moleculară mică, a izotopilor precum şi a unor compuşi

foarte polari.

2014 13 14 c Tehnici Cromatografice w

Documents

Transcript of 2014 13 14 c Tehnici Cromatografice w