14-expertizafiliatiei

8/10/2019 14-expertizafiliatiei

1/29

CURS DE MEDICIN LEGAL UMF Carol Davila

198

EXPERTIZA FILIATIEI

Motive de solicitare a expertizei filiatieiCauze civile: stabilirea filiatiei fata de mama, fata de tata (paternitate).Cauze penale: incest, viol.

Expertiza medico-legala a filiatiei parcurge mai multe etape de investigare succesive:-serologica-dactiloscopica

-antropologica-profil ADN

Filiatia fata de tata: se solicita atunci cind se constata neconcordanta intretatal biologic si cel juridic.

Tagada paternitatii (pentru copilul nascut in interiorul casatoriei): in termende 6 luni de la aflarea stirii: Actiune introdusa de tata impotriva copilului.

Se pleac de la urmtoarele prezumtii legale de paternitate:- copilul nscut n cursul cstoriei are ca tat pe sotul legitim al mamei, si- copilul nscut la cel mult 300 de zile dup desfacerea, anularea sau declararea

nulittii cstoriei, are ca tat pe fostul sot, dac a fost conceput n timpul cstoriei si dacn acest interval de timp mama nu a contractat o nou cstorie.

Stabilirea paternitatii copilului nascut in afara casatoriei: in termen de 1 an dela nasterea copilului. Actiune introdusa de mama in numele copilului impotriva tatalui.

Un barbat poate fi exclus de la paternitate in 2 cazuri:1. identificarea unei proteine la copil care lipseste atit de la mama cit si de la tatal in

cauza (ex. copilul A, parintii O).2. stabilirea faptului ca lipsesc la copil genele ce ar fi trebuit sa fie prezente prin

transmisie de la tatal in cauza. Posibilitati:

2a.cind tatal e homozigot pentru o gena care nu apare la copil (ex. in sistemul Rhtatal CC si copilul cc)

2b.heterozigot pentru gene care nu sint prezente la copil (tata AB, copil O).Excluderile in baza 1 si 2a se numesc de prim ordin (directe) in timp ce acelea pe

baza 2a de ordin secund (indirecte) si aceasta intrucit starea de homozigot nu estedecelabila neechivoc ci este o presupunere.

In mod uzual barbatul se excludede la paternitate si nui seconfirmapaternitatea.

Axiomatic daca o femeie este singura pe o insula cu 10 barbati din care 9 se exclud,cel de-al 10-lea va fi declarat tatal copilului ce se va naste chiar el daca nu este confirmat.

o Filiatia fata de mama: se solicita atunci cind copilul nu are certificat denastere (nerecunoscut/nedeclarat/neinregistrat de catre mama), cind a fost

pierdut/abandonat sau schimbat/furat. Actiunea o introduce copilul in numele sau impotrivamamei.

Legile transmiterii ereditatiiLegile Bernstein:

-un antigen poate apare la copil NUMAI DACA este prezent la unul dintre parinti.-daca un individ este homozigot pentru un antigen (ex. AA) acesta TREBUIE sa apara

la TOTI descendentii lui.Legile Lang:- la progenii din prima generatie se manifest NUMAI CARACTERUL DOMINANT

(uniformitatea hibrizilor din prima generatie);

-n a doua generatie apar si caracterele parentale recesive, care au fost estompatede efectele genelor dominante n prima generatie.

Legile Mendel:

Legea purittii gametilor(legea segregrii caracterelor) se refer la un cuplu degene, adic la dou trsturi contrastante ale aceluiasi caracter (trsturiallelomorfe). Alelele unui cuplu de gene provenite de la parentali nu se amestec

la progeni. La parentali ele se gsesc n relatii de alelism, dar la progeni sesegreg. n acest fel este posibil ca alelele recesive s apar n doz dubl la


2/29


199

progeni si astfel s se manifeste fenotipic. Aceasta permite enuntareaurmtoarelor principii de baz:

MM + MM = MM 100%MM + NN = MN 100%MM + MN = MM 50% + MN 50%

MN + MN = MM 25% + MN 50% + NN 25% Legea asortrii (segregrii independente a caracterelor) se refer la mai multecupluri de gene. Conform acestei legi, transmiterea la progeni a trsturilorallelomorfe apartinnd la dou sau mai multe caractere are loc pentru fiecarecaracter n parte (independent unul de cellalt). Astfel, progenul va primi doualele pentru fiecare caracter, cte una de la fiecare parental.

Mostenirea trsturilor se face n functie de hazard (de exemplu, se pot mosteninumai alele dominante sau numai alele recesive, sau numai o alel dominant si o alelrecesiv).

Clasificarea sistemelor serologice folosite in filiatie-Sisteme antigenice eritrocitare Grupe de singe majore: ABOH, Rh, MNSs Grupe de singe minore: Kidd-Cellano, Lutheran, Duffy, Lewis, etc.

-Sisteme enzimatice eritrocitare: creatinkinaza, fosfogluco-mutaza, esteraza D,fosfataza acida eritrocitara, glucozo 6 fosfat dehidrogenaza, adenilat kinaza, glutamatpriuvat transaminaza, adenozindeaminaza, 6-fosfo gluconat dehidrogenza, pseudocolin-esteraza1, etc.

-Sisteme ale unor proteine serice: haptoglobinele (2 globulina2 cu 3 forme

fenotipice I-I, 2-1, 2-2), grup specific component, hemoglobina, etc.-Sistemul HLA-Alte sisteme: secretor/nesecretor, gustator/negustator

-ADN

Expresia fenotipic a unei gene se numeste marker genetic. Ea se exprim sub

form de calitti biochimice, imunologice si morfologice. Calittile biochimice si imunologicesunt determinate de o singur gen, pe cnd cele morfologice sunt poligenice, determinatede mai multe gene, situate pe loci diferiti.

Orice sistem folosit in stabilirea filiatiei (marker genetic) trebuie sa aiba 3 caractere:

transmitere mendeliana

prezente de la nastere stabilitate pe parcursul vietii

Sansele de excludere in sistemele serologice pot fi sistematizate astfel:SISTEME % sanse excludere

(Boorman K. 1985)% sanse excludere

(KnightB. 1991)

Sisteme ale antigenelor eritrocitare

MNSs 32.1 32.1

Rh 28.0 28.0Kidd 18.7 4.5

Duffy 18.3 4.8

ABO 17.6 17.6

Kell 4.5 3.3

Lutheran 3.7 3.3

Sisteme proteine serice

GSC 30.2 14.5

Hp (haptoglobina) 18.1 17.5

PLG (plasminogen) 16.3 -

TF (transferina) 15.4 -

Pi (1-antitripsina) 25.6 -

C3 - 14.2

Gm - 6.5

1Pseudocolinesteraza este prezenta in ser spre deosebire de colinesteraza adevarata care se afla in eritrocit si

jonctiunile neuromusculare.2Haptoglobina are ca scop eliminarea din organism a pigmentilor de uzura hemoglobinici si a altor reziduuri.


3/29


200

Sisteme enzimatice eritrocitare

PGM (fosfoglucomutaza) 31.1 14.5

EAP (fosfataza acida eritrocitara) 23.4 21.0

GLO (glioxilaza) 18.7 18.4

EsD (esteraza D) 9.7 9.0

ADA (adenozin deaminaza) 4.5 4.5

AK (adenilatkinaza) 3.7 4.5

GPT (glutamat priruvat transaminaza) - 19.0

6-Fosfogluconatdehidrogenaza (6-GPD) - 2.5

Subtotal 1 97.3 93.0

HLA 90 90

Subtotal 2 99.6 99.0

ADN

Total 99,9 99,9

Tabelul de mai sus semnifica faptul ca daca ar fi testati 100 de barbati ce nu sint tati

ai copiilor in discutie la 97 dintre ei se poate face excluderea subtotal 1- (prin includereasistemului HLA un estimat conservativ ofera o sansa de excludere de circa 99% -subtotal2). Prin introducerea tipajului ADN se poate obtine o sansa de excludere de 99.9% -total-.

Transmiterea caracterelor de grup in sistemul ABO.Descoperit de Landsteiner in 1901 (antigenele A, B) la care in

1902 a adaugat descoperirea AB. Antigenele apar pe eritrocit incepind

cu luna 4 de viata intrauterina dar titrul anticorpilor anti-A si anti-Bstabil si elevat apare numai la 3-6 luni de la nastere.

Caracterele ABO sint mostenite prin intermediul a 3 genealelice3numite A,B si O. Gena O se considera tacuta (mut) intrucitnu are antigen pe suprafata eritrocitului si nu exist antiser care s oevidentieze; ea se manifest fenotipic numai dac se afl n doz dublla ambii printi;

Fiecare individ are in total 2 cromozomi ce poartea alele A,B sau O, cite uncromozom de la fiecare parinte. Rezulta fenotipic 4 grupe ABO, adica grupul A (fenotip A:

genotip AA-homozigot-, genotip AO-heterozigot-), grup B (fenotip B-BB, BO-), grup O(fenotip O: genotip OO -homozigot-), si grup AB (fenotip AB: genotip AB-heterozigot-).

Presupunind ca un parinte este grup A (genotip posibil AA, AO)si celalalt este grup B (genotip posibil BB, BO) exista 4 posibile

combinatii genotipale AA x BB, AA xBO, AO x BB, AO x BO. Toateposibilitatile ce rezulta din amesteculgrupelor ABO sint prezentate intabelul de mai jos. Exista 10combinatii fenotipice parentale ce

determina din 21 de combinatii

posibile genotipale; combinatia caregenereaza toate optiunile este AO x

BO.Nu intotdeauna este posibila

determinarea genotipurilor cuprinsein tabelul alaturat.

3Alele, gene alelice= una, doua sau mai multe gene care determina caractere alternative si care sint localizate la

acelasi locus pe cromozomi omologi.

Fenotip Genotip

AAA

AO

BBB

BO

O OO

AB AB

Fenotipurile ABOsi genotipurile lorcorespunzatoare

AA x BB AB (obligatoriu)

AA x BO AB, AO

AO x BB AB, BO

AO x BO AB, A, BO, OOPARINTI COPII

Fenotip Genotipuri Genotipuri Fenotipuri

A x A AA x AA AAA si OAA x AO AA si AO

AO x AO AA, AO si OO

A x B AA x BB AB

A, B, AB, OAA x BO AB si AO

AO x BB AB, BO

AO x BO AB, AO, BO, AB

A x AB AA x AB AA, AB A, B, AB

AO x AB AA, AB, AO, BO

A x O AA x OO AO A, O

AO x OO AO, OO

B x B BB x BB BBB, OBB x BO BB, BO

BO x BO BB, BO, OO

B x AB BB x AB AB, BB A, B, AB

BO x AB AB, BB, AO, BO

B x O BB x OO BO B, O

BO x OO BO, OO

AB x AB AB x AB AA, AB, BB A, B, AB

AB x O AB x OO AO x BO A, B

O x O OO x OO OO O


4/29


201

O privire de ansamblu asupra posibilitatilor/ imposibilitatilor ce rezulta arata:

Ca o consecinta a legii 1 a lui Bernsteinenuntata mai sus, copiii de grup AB nu pot

proveni din doi parinti grup 0 sireciproc.

Mai putem adauga faptul ca mama unuicopil AB nu poate fi niciodat de grup O siinvers, iar grupa tatlui nici nu se mai ia ndiscutie (situatie ntlnit la schimburile de copii

n maternitti).

Daca luam in considerare subgrupele A,

(A1,A2,A3,Ax,Aend,Am,Ael), remarcam ca cele mai puternice sint A1si A2 (A1 detine intre 800.000-900.000 situri de fixare fata deA2160.000-440.000 sau A3 70.000-100.000, , Ael 100-400) lacare A1 dominant fata de A2, ambele codominante fat de B, iar Orecesiv fat de toate trei, se mai adauga urmatoarele posibilitati:

In total rezulta 21 posibilecombinatii fenotipice. De exempludin grupele A1x B poate rezulta:

Antigenul A2poate apare la un copil la care unul din printi este fenotipic A1, daccuplurile parentale sunt genotipicE: fie A1A2 x A1O, fie A1A2 x A1A2, dar nu si dac cuplulparental este A1A1x A1A2.

n cazuri rare, gena H lipseste (genotip Hh) si desi substanta precursor exista nu seformeaz substante antigenice desi genele ABO sunt prezente. n schimb, aglutininele antiA, B, H sunt prezente. Aceast particularitate corespunde fenotipului Bombay (Ch).

Himerismul este o stare genetic rar ntlnit la gemenii la care, datorita unorposibile anastomoze vasculare, celulele deriva nu numai dintr-o singura linie zigoticadistincta. Astfel ei pot primi un implant de maduva osoasa unul de la celalat si astfel saprezinte un grup sanguin majoritar (ex. O in prorportie de 61%) si un alt grup sanguin

minoritar (ex. A in proportie de 39%). Acest lucru este posibil si hemoliza in vivo nu aparedatorita tolerantei imunitare pe care o manifesta organismul fata de antigenele dobinditeinainte de nastere. Pina in 1985 se cunoasteau 32 de cazuri de himere. Problema cea maicomplicata este sa se determine genotipul majoritar. Acest aspect poate fi realizat prin

determinarea grupului in saliva daca este secretor. Astfel intr-un caz prezenta antigen H insaliva si antigen A in singe: genotipul majoritar era de grup O. Un alt aspect interesant estefaptul ca himerele secretoare pot secreta doar antigenele de grup care sint parte aleconstitutiei lor genetice.

Determinarea grupelor de singe in petele vechi nu se poate efectua prin teste deaglutinare intrucit eritrocitele sint lizate, prin metoda inhibitiei rezultatele sint inconstante,incit metoda elutiei ramine cea mai buna. Dupa absorbtia anticorpului pe materialul de

testat se produce elutia permitindu-se ca sa se obtina reactii pozitive la o cantitate de doar0,5-1% eritrocite (1 singur fir de material de 2-5 mm lungime). Selectia speciala aantiserului folosit este insa esentiala.

Activitatea antigenica in eritrocitele vechi scade imediat si se prelungeste citiva ani(maxim 14 ani dupa unele relatari). Petele uscate rapid pastreaza activitatea mai mult timp

decit cele ce ramin mai mult timp umede (bacteriile prolifereaza in mediu umed ceea cepoate induce reactii fal pozitive sau negative). M si N sint mai labili decit A si B. Exista si oreactivitate incrucisata intre anti-N si M.

Rh, Fy, K, S, s sint detectabili citeva luni.

Parinti copii posibili grupuri imposibile

O x O O A, B, AB

O x A O, A B, AB

O x B O, B A, AB

A x A O, A B, ABA x B O, A, B, AB -

B x B O, B A, AB

O x AB A, B O, AB

A x AB A, B, AB O

B x AB A, B, AB O

AB x AB A, B, AB O

Grup (fenotip) genotip

A1

A1A1

A1O

A1A2

A2A2A2

A2O

BBB

BO

O OO

A1B A1B

A2B A2B

Genotipuri

posibile

Fenotipuri

posibile la copil

A1A1x BB A1B

A1A1 x BO A1B,A1

A1O x BB A1B,B

A1O x BO A1,B,A1B,O

A1A2x BB A1B, A2B

A1A2x BO A1,A2,A1B,A2B


5/29


202

Enzimele eritrocitare se denatureaza mai rapid decit antigenele eritrocitare (in citeva

luni). Haptoglobinele, antigenele Gm si Km isi pastreaza activitatea citeva luni.

Sistemul secretorGrupele de singe ABO pot fi detectate nu numai pe suprafata eritrocitului ci si in alte

tesuturi cit si in secretii (ser, saliva, sucuri gastrice, chisturi ovariene, sperma, fluid amioticsi mai putin in sudoare, urina, lacrimi, bila si lapte uman).Circa 76% din populatie este secretor pozitiva: acest contingent secreta in afara

secretiei antigenelor grupelor de singe ABO si unele substante specifice.S-a stabilit ca secretia substantelor specifice este controlata de catre o pereche de

alele Sesi se. Indivizii pot fi homozigoti SeSe, heterozigoti Sesesi homozigoti sese. Cei caredetin alela Sesint secretori.

Aceste persoane secreta 2 substante distincte in secretiile amintite in afaraantigenelor de grup ABO: un glicolipid alcool-solubil (prezent pe suprafata eritrocitului, inaproape toate celelalte tesuturi dar absent din secretii) si o glicoproteina hidrosolubila(aflata in toate secretiile). Astfel secretorii grupelor ABO au in saliva in afara de antigeneleA si B si antigenul H (secretate ca glicoproteine hidrosolubile in glandele mucoase).

Serurile care contin aglutinina anti H aglutineaz mai puternic hematiile de grup O,mai slab pe cele de grup A2, si cel mai slab pe cele ale grupelor A1si A1B;

De fapt substantele specifice pot fi detectate prin tehnici specifice si sensibile la totioamenii: chiar si nesecretorii arata in urma tehnicilor de elutie reactii slab pozitive.

Pentru determinarea grupelor de singe din alte fluide decit singele trebuie folosite inparalel tehnici de elutie si de inhibitie si numai in cazul rezultatului identic , rezultatul se

poate considera corect. Nu trebuie uitat ca bacteriile tind sa se multiplice cu precadere insaliva si fluidul seminal cel putin comparativ cu singele (E.Coli poate fi cauza unui B falspozitiv si mai putin a unui A fals pozitiv).

La nesecretorii la care testele de inhibitie nu pot fi aplicate singurul test util esteelutia dar in acest caz rezultatele trebuie interpretate cu retinere. Trebuie avut in vedere siposibilitatea amestecului se fluide biologice (singe si saliva, fluid seminal si vaginal). Deexemplu tipajul unui grup A secretor pe haine la o femeie violata poate exonera un violator

O secretor (in acest caz A poate veni din transpiratie sau fluid vaginal).Tipajul grupului pe tamponul de secretie dupa un contact sexual poate fi util daca se

cunoaste grupul femeii si mai ales daca acesta este O (daca este AB nu se pot deduce

informatii pertinente).Tipajul grupelor pe fragmente de muschi sau de alt tesut se face prin tehnici de

inhibitie si elutie. Necesita curatirea tesutului in metilalcool si eter pentru a indepartasubstantele grase. Nu trebuie uitata ca E.Coli poate crea reactii fals pozitive mai ales la B si

mai putin la A, ceea ce poate sa apara mai ales la cadavre aflate in submersie.Tipajul grupelor de pe piele, unghii si par se poate realiza prin inhibitie elutie si

aglutinare mixta.Circa 78% din populatia generala sint Lewis negativi (genotip le), 22% Lewis +

(genotip Le). Genele Lele si Sese se segrega separat, incit numarul secretorilor este cam

acelasi cu cel al celor Lewis - (cei care sint Lea

+ nu secreta substante A,B,H).Leb nu este produsa de o gena separata ci rezulta din interactiunea dintre Le a si

genele H. De fapt grupul Lewis nu este eritrocitar ci seric, iar daca in ser cantitatea desubstante antigenice este foarte mare atunci o parte se fixeaza suplimentar si pe eritrocit.Grupul contine glicosfingolipide in plasma si secreta glicoproteine in saliva.

Posibilele fenotipuri sint prezentate mai jos, corelat cu substantele ce se secreta in

fiecare caz in saliva acestora.

Fenotip saliva Continut saliva Gene prezente

Le (a-b+): secretori H,Leb,putin Lea H,Se,Le

Le (a+b-): nesecretori Mult Lea, deloc Lebsau H, putin Lec H,se,Le

Le(a-b-): homozigoti lele, secretori H, deloc Leasau Leb, putin Lec H,Se,le

Le (a-b-): homozigoti lele, nesecretori Deloc H, Lea

si Leb

, putin Lec

H,se,le

Exista si anticorpi Lewis anti-Lea si anti-Leb care de obicei apar impreuna siaglutineaza eritrocitele, dar nu in asa masura incit sa determine hemoliza la nou nascuti.


6/29


203

Sistemul Rh

Descoperit in 1940 de catre Landsteiner si Wiener. Ei au imunizat porci de guinea siiepuri cu singe de la Maccacus Rhesus si au obtinut un antiser care aglutina nu numaieritrocitele de Maccacus ci si pe cele ale circa 80-85% din populatia umana a New York-ului.Astfel au realizat ca au descoperit un nou grup de singe.

Antigenele Rh apar n prima lun de viat intrauterin, independent de celelaltesisteme. Aglutininele naturale anti Rh apar numai prin izoimunizare (transfuzii cu snge Rhpozitiv la persoane Rh negative sau la mame Rh negative imunizate prin sarcini de produsul

de conceptie Rh pozitiv).Sistemul Rh are 3 perechi de gene alelice Cc, Dd, Ee pe cromozomul 1: pe locusul 1

sunt localizate alelele Dd, pe locusul 2 sunt localizate alelele Cc si pe locusul 3 alelele Ee.Astfel, pe cromozomul 1 se afl cte un membru din fiecare pereche, un locus putnd

fi ocupat de una sau alta din cele dou alele pereche. Genotipul este format din cele dougrupuri de cte trei factori antigenici (mosteniti de la mam si de la tat), carese transmit

n bloc.

Caracterele dup care se transmit factorii Rh sunt:- caracterul antitetic prin care se ntelege c lipsa unui factor impune prezenta

celuilalt factor din aceeasi pereche; prezenta unuia din factori nu exclude prezenta celuilalt

din aceeasi pereche (de exemplu Cc);- caracterul alelomorf conform cruia dac un parental are ambii factori ai unei

perechi, la descedent se transmite totdeauna numai unul din ei;- fiecare individ are obligatoriu cel putin un factor din fiecare pereche (deci acesti

factori se transmit egal de la fiecare parental).

Rezulta 8 posibile haplotipuri: Cde, cDE, cDe, CDE, Cde, cdE, CdE, cde, 18 posibile

fenotipuri si 36 de genotipuri (dintre care 10 sint negative: cde/cde/, Cde/cde, Cde/Cde,Cde/cdE, Cde/CdE, cdE/cde, cdE/cdE, cdE/CdE, CdE/cde, CdE/CdE). Toate variantele in careapare alela D sint Rh pozitive Rh (D)+,; restul sint negative Rh (d)-.. Toti acestia cugenotipuri negative pot induce aparitia de anticorpi anti.D daca sint stimulati cu antigen D si

trebuie sa primeasca singe Rh negativ sau din genotipul propriu.Persoanele Rh (D)+ pot fi homozigote (D/D) sau heterozigote (D/d), pe cnd

persoanele Rh (d)- nu pot fi dect homozigote (d/d).Anticorpii anti-Rh pot distruge antigenele Rh (D).

CDe cDE TATA CDe cde MAMA

Sperma CDe cDE Ovul CDe cde

(haplotip)

Celulele CDe CDe CDe cDE CDe cde DE cdecopiilor

Putem sintetiza prin urmatoarele:- antigenul unui copil (ex. D) provine obligatoriu de la unul din printi;- din doi printi Rh negativi rezult obligatoriu un copil Rh negativ;- din doi printi heterozigoti rezult copii heterozigoti;- un copil heterozigot provine dintr-un printe obligatoriu CDE, n caz contrar

nvinuitul se exclude;- dac mama este decedat, iar copilul n viat este cc se exclude nvinuitul CC;- dac mama si copilul sunt Rh +, tatl nu are nici o sans de excludere pe acest

sistem deoarece poate fi DD sau Dd.


7/29


204

Sistemul MnSs

Sistemul MN a fost identificat de Landsteiner si Levine (1927), fiind propriu omuluiprin cele dou gene alelomorfe si codominante MN. Antigenele apar n luna a doua de viatintrauterin, copiii n vrst de 4-6 luni avnd acelasi titru ca si adultii.

Anticorpii anti-M si antiN apar prin imunizare si sunt anticorpi de tip IgG complet.

Grupul M apare in circa 28%, grupul N in 22% iar cel MN in 50%.Transmiterea se face dup legile lui Mendel, adic:MM + MM = MM 100%

MM + NN = MN 100%MM + MN = MM 50% + MN 50%MN + MN = MM 25% + MN 50% + NN 25%

Nu s-au constatat decit extrem de rare si neimportante izoimunizari la antigenele

M,N la nou nascut sau posttransfuzional.Ulterior, Walsh si Montgomery (1947) identific sistemul Ss n care alela S este

dominant, iar alela s este recesiv. Locii MN si Ss ocup pozitii adiacente pe cromozomul 4si de aceea se transmit mpreun.

Anticorpii Ss sunt numai de tip imun, aprnd consecutiv transfuziilor sau n urmasarcinilor. Ei sunt anticorpi de tip incomplet IgG. Exista genotipurile SS, Ss, si ss cu ofrecventa de aparitie fenotipica de 11%, 44% si respectiv 45%. Spre deosebire de anti-M si

anti-N, anti -S si anti-s fiind active la 370C aglutineaza eritrocitele in proportie de 55%(anti-S) si 89% (anti-s) si sint responsabile atit de manifestari hemolitice posttransfuzionalecit si dupa nastere.

Antigenele MN, Ssprezint un poliformismsemnificativ de ras. Astfel,exist gene complexe: MS, Ms,NS, Ns. Sistemul MNSs esteconsiderat ca fiind cel maieficient n expertiza filiatiei.

Putem sintetiza prin:

- dac ambii printi sunt homozigoti de acelasi fel rezult numai copii homozigoti deacelasi fel;

- dac ambii printi sunt heterozigoti, pentru nvinuit nu exist nici o sans deexcludere;

-nvinuitii MN nu au nici o sans de excludere;- antigenele M si N nu pot apare la un copil dac nu exist la cel putin unul din

printi;- dac un copil este NN (MM) iar printii NN, MN se exclude tatl MM (respectiv NN);- mama MM (sau NN) nu poate avea un copil NN (respectiv MM) indiferent de

fenotipul tatlui.

Alte sisteme eritrocitareSistemul Kell-Cellano (Coombs et.al. 1940). Initial, s-a crezut c este format

numai din doi factori: Kell (n functie de care persoanele se diferentiaz n K+ si K-) siCellano (k, n functie de care persoanele se diferentiaz n k+ si k-), cei doi factori fiindalelomorfi si antitetici. Antigenul K se transmite dominant si autosomal. Kell pozitiv cugenotipuri KK circa 0.2% si Kk circa 10% populatie si Kell negativ cu genotip kk in circa90%.

Pe acelasi locus s-au evidentiat ulterior circa 20 alele care dirijeaz si sinteza altorfactori apartinnd aceluiasi sistem. Prin analogie cu sistemul Rh, n sistemul Kell -Cellanoantigenul pare a fi sub controlul unor gene strns linkate, factorul K fiind comparat ca

putere antigenic cu factorul D.n practica filiatiei se foloseste sistemul Kk, dar sistemul n sine nu este consideratsuficient de selectiv.

Anti-M anti-N anti-S anti-s fenotip genotip

+ - + + MSs MSMs

+ - + - MS MSMS

+ - - + Ms MsMs

+ + + + MNSs MSNs, MsNS

+ + + - MNS MSNS

+ + - + MNs MsNs

- + + + NSs NSNs

- + + - NS NSNS

- + - + Ns NsNsGentotipurile si fenotipurile sistemului MNSs


8/29


205

Sistemul Duffy (Cutbush & Chanarin 1950). Initial s-a descoperit antigenul Fya

(Duffy +) determint de alela Fya la circa 65%. Anti-Fy s-au dovedit a putea induce reactiihemolitice letale. Ulterior s-a identificat si antigenul Fyb (alela Fyb) al caror anticorpi nuinduce reactii hemolitice cunoscute.

Ulterior s-a identificat si fenotipul Fy (a-b-), alelaFy foarte frecvent la negri si rar la albi. Astazi se stie caexista 2 tipuri de Fy unul (Fy) comun pentru negrii (negrii

africani 90%, negrii New-York-ezi 80% si sub 3% laeuropeni) iar celalat Fyx la populatia alb. Fenotipul Fy

(a-b-) mai apre si la yemenitii evrei in timp ce la japonezi. Coreeni si eschimosi se intilnesteo mare frecventa a alelei Fya.

Fenotipul Fy (a-b-), caracteristic negrilor, prezint alela Fyo, n locul alelei FyaFyb.Persoanele cu un astfel de fenotip nu formeaz anticorpi anti Duffy dup transfuziile cusnge avnd hematii Fyasau Fyb.

La populatia alb genotipul FyFy este foarte rar. Atunci cnd el este prezent aparanticorpi anti-Fy3 dup transfuziile cu snge continnd hematii Fyasi Fyb. Aceasta constituiediferenta genetic principala ntre cele dou populatii. Se pare c frecventa mare afactorului Fy la negri s-ar datora expunerii in timp a generatiilor la malarie. n acest sens, s-a artat c antigenele Duffy sunt receptori pentru Plasmodium vivax, spre deosebire dehematiile Fy (a-b-).

De asemenea s-au mai evidentiat antigenele Fy3, Fy4, Fy5, al cror rol n paternitatenu a fost stabilit.

Sistemul Kidd (Allen, 1951). Antigenul este Jka iar anticorpul anti-Jka potentialhemolitic. Fenotipurile si genotipurile cunoscute sint:

Din analiza genetica rezulta ca genotipic Jkapoate fi att homozigot ct si heterozigot, pe cnd Jkbeste exclusiv homozigot.

Sistemul Lutheran(Callender&Race, 1946). Gena acestui sistem este localizat pecromozomul 19, prezentnd dou alele: Lua si Lub. Lua se transmite dominant autosomal(Lutheran +).

Fenotipurile si genotipurile n sistemul Lutheran:Din analiza genetica rezulta ca genotipic Lua

poate fi att homozigot ct si heterozigot, pe cnd Lubeste exclusiv homozigot. Ca fenotipuri rare n acest sistem s-au mai descris Lu4, Lu5...Lu20,precum si Lu (a- b-).

Anticorpii anti Lu (a) sunt de tip naturali (evidentiabili n mediul salin) si de tip imun(evidentiabili prin testul antiglobulinic).

Grupele sanguine in determinarea diferentierilor de rasa

1. Exista cel putin 4 forme de hemoglobine:o hemoglobina A (tipul normal al adultului alb)

o F (tipul fetal)o S (10-15% din adultul negru)o C (3% din adultul negru)Forma S este patologica (homozigotul SS preznta anemie falciforma). Caracteristica

S este recesiva fata de forma A incit nu este posibila diferentierea uzuala intre A si AS.Antigenele Kell se regasesc numai la albi, in tip ce antigenele Duffy la 90% din negrii vestafricani. Animalele au propriile lor grupe de singe, diferite de cele ale omului.

2. Sistemul Duffy pentru rasa negroida (vezi mai sus) si alte populatii.

Imunizarea ca raspuns la antigenele grupelor de singe

Cele mai antigenice sint considerate proteinele A,B, si Rh.

Fenotip genotip rata aparitie

Fy (a+b-) FyaFya 17%

Fy (a+b+) Fya Fyb 49%

Fy(a-b+) FybFyb 34%

Fenotipurile si genotipurile Duffy


Jk (a+b-) JkaJka 26%

Jk (a+b+) Jka Jkb 50%

Jk (a-b+) JkbJkb 24%


Lu (a+b+) LuaLub 8%

Lu (a+b-) LuaLua 0.2%

Lu (a-b+) LubLub 92%


9/29


206

Imunizarea Rh

In urma administrarii de singe:O prima administrare a circa 500ml singe Rh pozitiv la o persoana Rh negativ induce

cu probabilitate de 50% izoimunizare in urmatoarele 2-6 luni.Circa 1/3 dintre cei Rh negativi insa sint rezistenti (non-raspunzatori) si nu pot

forma anticorpi anti-D. Altii insa desi nu formeaza anticorpi detectabili au fost totusiimunizati, ceea ce se poate dovedi prin prezenta bolii hemolitice la noul lor nascut.

Prin sarcina:

Este o metoda naturala de izoimunizare care produce anticorpi anti-D evidentiabili ladfirsitul nasterii la circa 2% dintre mame in conditiile in care fatul Rh pozitiv singereaza petimpul graviditatii.

La circa 6 luni de la nastere procentul de detectie a anticorpilor creste la 7% dintre

mame (explicatia consta in trecerea in circulatia materna a unor cantitati de singe fetal uzual circa 10ml- cu ocazia hemoragiilor transplacentare); cu cit singele fetal trece incantitate mai mare cu atit raspunsul imunologic va fi mai intens (initial cu IgM si apoi cuIgG). Amniocentezaa, cezariana extragerea manuala a placentei cresc riscul aparitiei siconcentratia anticorpilor anti-D cu ocazia celi de-a doua nasteri insa chiar mici cantitati desinge fetal pot initia un raspuns imunologic intens cu producerea bolii hemolitice a nouluinascut.

In mod surprinzator atunci cind exista si incompatibilitate de grup sanguin intremama Rh - si fatul Rh+, imunizarea Rh prin sarcina este mai putin apta de a se produce.

Imunizarea ABOIn sistemul ABO in contrast cu sistemul Rh, anticorpii anti-A si anti-B sint in mod

uzual prezenti in ser in raport invers cu prezenta antigenului eritrocitar.Exista chiar o cantitate redusa de anticorpi omologi dezvoltati prin imunizare ca

urmare a patrunderii in circulatie pe timpul vietii a antigenelor de grup sanguin A,B, H cu

diferite ocazii (singele altor persoane, microorganisme, flora intestinala, particule de praf,etc.) incit o prima imunizare pare sa fie produsa cvasiconstant (raspuns cu IgM).

Raspunsul in cazul administratii singelui incompatibil este cu dezvoltare de IgGincomplete incepind cu ziua 2-3 cu un maxim in ziua 10-14 si apoi cu un delin lent spre ziua

20. La aceasta se adauga detectia de hemolizine. Acestea din urma probeaza o imunizare dedata recenta. Problema principala este diferentierea imunizarii naturale de imunizareahemolitica, ceea ce se poate efectua cu eritrocite de porc ce prezinta antigene A-like numite

Ap care se aglutineaza cu anti-A IgG hemolici si nu cu anti-A IgM naturali.

Sistemul limfocitar HLAn cadrul Complexului Major de Histocompatibilitate, sistemul HLA constituie cel mai

cuprinztor sistem de antigene umane, mai ales c acesta este prezent pe toate celulelenucleate, trombocite si chiar pe spermii. Antigenele de histocompatibilitate se definesc caantigene care determin o reactie imunologic la transplantul unui organ sau la transfuzia

ntre dou organisme diferite din punct de vedere genetic. Genele MHC apartin familiei degene imunoglobulinice, cu rol n recunoasterea att a structurilor proprii ct si a celor

strine organismului. Proteinele codificate de ele au mare complexitate de atributebiologice, responsabilitatea lor n individualizarea genetic a fiecrei persoane fiind deimportant capital.

Sistemul HLA este codificat de gene situate pe bratul scurt al cromozomului 6.Fiecare locus poate fi ocupat de mai multe alele. La nivelul acestui cromozom genele HLA-A, B, C si D au localizri bine definite. Astfel: regiunea HLA - D situat ctre centromercodific moleculele de clasa II-a si are trei loci denumiti DP, DQ si DR. Ctre extremitateatelemeric sunt regiunile HLA-A, B si C, care codific pentru moleculele de clasa I. Cele maipolimorfe sunt regiunile HLA-A si HLA-B cu 23 si respectiv 49 de haplotipuri.

Un haplotip reprezint un set de gene localizat pe un cromozom care au exprimaregenotipic unic. ntre HLA-D si HLA-B sunt situate genele care codific pentru moleculelede clasa A III, adic pentru cei doi, C II, C IV si factorul B al complementului.

Transmiterea genetic a antigenelor HLA urmeaz legile de transmitere mendelienepe sistem codominant. Multitudinea de antigene situate pe fiecare locus si imenseleposibilitti de combinare ale acestora n haplotipuri explic polimorfismul extrem al acestuisistem de antigene, neegalat de nici un alt sistem genetic uman.


10/29


207

Pentru tipizarea serologic a HLA se folosesc tehnici variate, cea mai utilizat fiindmetoda limfotoxicittii n prezenta complementului de iepure. Pentru stabilirea fiecruiantigen sunt folosite mai multe seruri test. Studiul antigenelor HLA-A, B si C (clasa I)necesit limfocite din snge periferic, iar pentru evidentierea antigenelor HLA-DR, DP si DQ(clasa II) se folosesc doar limfocite B din snge periferic.

Pentru tiparea antigenelor HLA din clasa II-a se utilizeaz tehnici de biologiemolecular: RFLP, PCR, PCR-RFLP (ultima constnd din asocierea metodelor amintiteanterior, avnd la baz caracterizarea polimorfismului de lungime al fragmentului derestrictie dup amplificarea regiunii variabile).

Antigenele HLA sunt clar diferentiabile serologic unele de altele. Totusi, unele dintreele prezint asemnri datorate probabil unor structuri moleculare similare, fapt care poateduce la aparitia unor reactii ncrucisate. De exemplu: o reactie ncrucisat destul deputernic exist ntre antigenele HLA - A2 si A28, ntre A1, A3 si A11, ntre A9 si A10,precum si ntre subiectele din complexul A19 (A29, A30, A31, A32, A33).

n ceea ce priveste valoarea biologic si clinic a sistemului HLA, aceasta const nspecial n transplantul de organe, de mduv osoas n afectiunile hematologice, nproblematica transfuziilor si n expertiza filiatiei.

Astfel, sistemul HLA este cel mai important marker genetic. Pn n prezent nu s-aidentificat nici un alt sistem de markeri genetici care s aibe un asemenea polimorfism ntr-un model genetic asa de bine definit.

De asemenea, sistemul HLA este foarte util n studiile de genetic uman, studiile deevolutie si selectie a mecanismelor genetice, n caracterizarea populatiilor umane, nalctuirea hrtilor cromozomiale, n studiul bolilor asociate si n studiul eredittii.


11/29


208

TESTELE ADN IN PRACTICA MEDICO-LEGALAMotto:

We used to say that our fate was in our stars. Now we know that, in large measure our fate is in our genesJames Watson genetician, Laureat al Premiului Nobel, co-descoperotor al structurii ADN

Toate conceptele clasice legate de identitatea biologica a indivizilor umani sunt n

prezent revizuite i abordate prin prisma noilor informaii tiinifice aduse de geneticamoleculara. Comunitatea medico-legala i juridica nu prea pregatit n urma cu 10-15 anis receptioneze i, cu att mai putin, sa utilizeze concepte noi de genetic moleculara,testele ADN fiind apanajul unor categorii restranse de specialisti. Problema schimbului de

tehnologie si a principiilor de identificare a fost intens dezbatuta pe plan mondial in tot acestinterval de timp, atat in mediile stiintifice medicale, cat si in cele juridice, nevoite deopotrivasa isi reconsidere o multitudinie din teoriile considerate clasice. Conservatorii stiintelormedico-legale au formulat critici severe referitoare la primele teste ADN, pe cand partizanii

noilor tehnologii le-au aclamat si chiar le-au exagerat infailibilitatea.Prin 1990-1995, perioada in care multe servicii medico-legale din tarile avansate

tehnologic se intrebau daca nu era cumva prematura sau hazardanta o schimbare a

metodelor traditionale de identificare, testele ADN au servit doar la rezolvarea unor cazuri

problema, pentru care metodele conventionale nu ofereau rezultate concludente. Pemasura validarii performantelor si robustetii sistemelor de markeri ADN, testele genetice aufost larg imbratisate de comunitatea stiintifica medico-legala din intreaga lume, tendinta

care s-a accentuat mult in ultimii 5-6 ani, odata cu generalizarea metodologiilor PCR si acelor de detectie si secventiere automata. Ceea ce muli nu credeau cu putiin s-a realizat:testele ADN au devenit ntr-un timp record instrumentul fr rival al investigatiilor medico-legale i criminalistice. La toate acestea, a contribuit desigur intr-un mod decisiv sifinalizarea in 2001 a proiectului Genomul Uman, care a generat o uimitoare cantitate deinformatie stiintifica despre materialul ereditar al speciei noastre.

In acest context, medicina legala moderna si-a definit in cadrul ei o noua disciplina -

genetica medico-legala - axata in principal pe investigarea in scop de identificare agenotipurilor umane.

Tehnologiile de analiza ADN in scop de identificare umana sunt in prezent acceptatefara exceptie in toate sistemele juridice din lume la rezolvarea unor cauze penale si civile.

Aplicatii in domeniul penal si militar Aplicatii in domeniul civil

- identificarea victimelor in omoruri si pruncucideri - cercetarea paternitatii

- identificarea criminalilor dupa urmele lasate la loculfaptei sau asupra victimelor

- cercetarea maternitatii (schimburi accidentale de copii inmaternitati, noi-nascuti abandonati sau pierduti, etc.)

- identificarea agresorilor sexuali - rezolvarea cazurilor de imigratie (reintregirea familiilor )

- identificarea autorilor talhariilor si furturilor - identificarea adoptiilor ilegale

- trierea si excluderea suspectilor in diferite anchetepolitienesti

- identificarea fetilor conceputi prin fertilizare in vitro sau amamelor surogat

- identificarea victimelor in accidente aviatice,catastrofe naturale, acte de terorism, razboaie

- cercetarea unor relatii de inrudire biologica intre:bunici/unchi-nepoti, veri de grd.I-IV (pana la veri de grd.IV), etc.

- elucidarea cauzelor unor accidente rutiere si aviaticepornind de la urmele biologice

- stabilirea unor relatii de descendenta biologica in scopulaflarii adevarului istoric sau din interese politice

- probabrea unor rapiri si sechestrari de persoane, atraficului ilegal de persoane si de organe umane

- stabilirea unor relatii de inrudire la solicitarea societatilorde asigurare

- probarea unor agresiuni fizice - incheierea unor polite de asigurare cu clauze de moarteviolenta

Potentialul testelor ADN de a exclude suspectii intr-o ancheta politieneasca, mai alesin cazurile de viol sau omor, este un castig enorm daca il comparam cu performanteletestelor conventionale serologice sau al amprentelor digitale. Agresiuni sexuale. Ponderea identificarilor pentru agresorii sexuali este de departe cea

mai mare din totalul testelor ADN efectuate pentru diverse alte infractiuni inlaboratoarele medico-legale4. In caz de viol testarea ADN permite identificarea cu

4 Poate cea mai mare contributie a tehnologiei ADN in medicina legala a fost identificarea violatorilor - Prof.

J.J.Cassiman, seful Centrului de Genetica Umana a Universitatii din Leuven


12/29


209

certitudine a agresorului plecand de la celulele spermatice si vaginale existente pe un

tampon vaginal. Profilul ADN al victimei se evidentiaza din celulele vaginale, in timp ceprofilul agresorului se obtine prin analiza celulelor spermatice. Profilele obtinute suntulterior comparate cu profilele de referinta apartinand victimei si persoanelor aflate pelista suspectilor.

Omor.In cazurile de omor testarea ADN se face pornind de la urmele biologice recoltatede la locul faptei sau de pe corpuri delicte: pete de sange, de saliva sau sperma, fire depar, microurme biologice de contact (celule epiteliale descuamate de pe tegumente la

contactul cu diferite suprafete sau obiecte: maner usa, intrerupator lumina, instrumente,bani, etc.). Profilele ADN rezultate sunt comparate cu profilele de referinta obtinute dela suspecti in urma prelevarii unei probe biologice de referinta de de la acestia (sangesau saliva).

Accidente rutiere. In accidentele rutiere testele genetice pot servi la a demonstraimplicarea unui vehicul intr-un accident rutier soldat cu victime umane atunci candvehiculul implicat paraseste locul faptei. In aceste cazuri, profilele ADN evidentiate dinurmele biologice recoltate de pe caroseria masinii sunt comparate cu profilul de referintaal victimei. Daca profilele corespund, atunci se poate stabili cu maxima certitutdine cavehiculul respectiv a fost implicat intr-un accident.

Identificarea cadavrelor necunoscute. Este o problema ce survine frecvent in

practica medico-legala. Pentru analiza genetica se folosesc atat tesuturi moi in diferitestadii de degradare, cat si tesut osos sau dentar. Amprenta genetica se poate efectua petesut osos sau dentar chiar si atunci cand au suferit o carbonizare partiala. Dacaidentitatea cadavrului este prezumata, solutia identificarii rezulta frecvent in urma

cercetarii relatiei de inrudire biologica a persoanei a carei identitate este prezumata cudiferiti membri ai familiei.

Aplicatii in domeniul militar. Realizand performantele si importanta testelor ADN in

identificarile de persoane, armatele SUA si statelor NATO au initiat incepand de lamijlocul anilor 90, programe ample de colectare de probe biologice pentru tipare ADNde la toti angajatii si militarii in termen, dupa modelul programului de colectare aamprentelor digitale initiat cu decenii in urma .

Cercetarea relatiilor de inrudire biologica. Reprezinta un domeniu in expansiunedatorita dezvoltarii de tehnici performante de analiza genetica moleculara. In prezent, inStatele Unite aproximativ 250.000 de mii de cazuri de paternitate sunt rezolvate in

fiecare an cu ajutorul testelor ADN. Raportarile cumulate pentru Europa se situeaza cuaproximatie tot in jurul aceleiasi valori. Insa testele genetice efectuate in scopul stabiliriiunui pedigree vizeaza in prezent si o multitudine de alte aspecte (vezi in tabel - aplicatiiin domeniul civil). Autoritatile din statele vestice rezolva in prezent problemele legate de

imigratie si de reintegrire a familiilor imigrantilor pornind exclusiv de la testele ADN.*

Fiinta umana se dezvolta dintr-o celula ou, ce reuneste zestrea ereditara a celor doiparinti si reprezinta o configuratie genetica noua, unica si irepetabila, constanta in timp.Individualitatea umana este deci o individualitate genetica, desi omul in ansambul sau este

produsul interactiunii permanente dintre ereditate si mediu. Titlul de unicat al fiecaruiunivers genetic uman nu este contrazis pna n prezent dect de gemenii monozigoi.

Ideea realizrii profilului genetic al unei persoane, s-a nascut din conceptelegeneticii clasiceexprimate rezumativ prin:

(1)

unicitatea genetica a fiecarui individ. Fiecare persoana are o infatisarecaracteristica, unica. Intrucat acesta infatisare, fenotip, reprezinta materializarea

genotipului rezulta ca exista o importanta diversitate a materialului genetic uman. Acestlucru se intampla dearece anumite parti ale genomului uman sunt polimorfe, intelegandu-se

prin aceasta ca pentru acele parti din genom exista mai multe variante structurale. Se vavedea ca in special regiunile extragenice poseda un polimorfism accentuat, facand obiectul

predilect al analizei geneticienilor legisti.(2) identitateastructurala a ADN in toate celulele unui organism uman.

Informatia genetica a fiecarui organism viu este continuta in interiorul fiecarei celule, in


13/29


210

molecula de ADN; ADN are in alcatuirea sa genele care codifica fiecare caracteristica a

organismului; toate celulele dintr-un organism viu poseda aceeasi structura a ADN.(3) respectarea legilor mendeliene ale transmiterii caracterelor ereditare in

succesiunea generatiilor. Pogenii mostenesc o serie de trasaturi comune cu alegenitorilor dupa legile bine cunoscutesi definite in genetica clasica.

Drumul cercetarii individualitatii umane a fost deschis la sfarsitul secolului XIX deamprentele papilare, insusiri fenotipice cu determinism multifactorial, poligenic si de mediu,urmate in timp, de antigenele specifice de grup, sangvine si tisulare, pentru a viza in

prezent materialul genetic al speciei umane - molecula de ADN.*

Scurt istoricPornind de la terminologia deja consacrata de amprenta geneticasa neamintim de ruda sa mai varstica, de acum centenara, amprenta digitala. In 1880

antropologul britanic Sir Francis Galton publica primele observatii referitoare la amprenteledigitale ca mijloc fidel de identificare al unei persoane. Incepand cu 1902 amprenteledigitale au fost utilizate sistematic in justitie si armata in tarile anglo-saxone. La vremeaaparitiei lor, amprentele digitale au revolutionat arena justitiei. Dupa 1950, in laboratoarelemedico-legale s-au testat de rutina markerii pentru grupele de sange ABO , polimorfismulproteic fiind astfel un factor de diferentiere genetica. Ulterior, alte grupe de sange, proteineserice, enzime eritrocitare si complexul major de histocompatibilitate HLA au fost serotipate

pentru a servi identificarea probelor biologice sau la cercetarea paternitatii. Primeleobservatii referitoare la polimorfismul moleculei de ADN au fost facute prin 1978 cu ocaziastudiilor genei beta -globinei in siclemii. A fost insa meritul britanicului Alex Jeffreys sadescopere in 1985 ca in genom exista regiuni hipervariabile cu specificitate individuala . El

cerceta gena mioglobinei umane cand a remarcat o serie de secvente repetitive intercalateintre secvente codante ale genei. Atunci cand aceste secvente repetitive erau hibridizate cusecvente complementare si marcate radioactiv se vizualiza un set complex de benzi,

asemanator unui cod de bare. Imaginea descrisa de un astfel de set de benzi (secvente deADN) s-a dovedit a fi unica, specifica fiecarui individ uman.

Definirea termenului de profil ADN. Analiza ADN in scop de identificare estecunoscuta sub numele de tipare ADN, genotipare ADN, profil ADN sau test de

identificare ADN. Desi foarte larg utilizat, termnul de amprenta genetica1nu definestetocmai corect acest tip de analiza.

Profilul ADN se defineste ca fiind totalitatea acelor caracteristicistructurale ale materialului genetic care permit identificarea unuiindivid.

Testele ADN utilizate in medicina legala isi au fundamentarea stiintifica in geneticaclasica, biochimie si biologia moleculara. De aceea pentru a intelege ce reprezinta un test

ADN consideram necesara trecerea in revista a catorva notiuni elementare despre structurasi functiile ADN.

ADNeste macromolecula ce constituie suportul material al ereditatii, reprezentand

cartea noastra de identitate biologica. Informatia genetica este stocata in ADN subforma unui cod, a carui descifrare permite fiecarei celule dintr-un organism sa-siindeplineasca functiile.

Cvasitotalitatea materialului genetic uman se gaseste localizat in nucleul celular sidefineste ADN nuclear (ADNnc). Restul patrimoniului genetic al celulei este reprezentat deADN mitochondrial (ADNmt), o mica molecula de ADN circular, localizata in mitocondrii sicare poseda o organizare si un cod genetic diferit de cel al ADN nuclear.

Structura ADN nuclear. ADN uman se prezinta sub forma unui filament a carui

lungime atinge aproximativ 1m si intra in compozitia cromozomilor din nucleul fiecarei

1 Sintagma amprenta genetic, a fost creata operndu-se o analogie ntre multitudinea de benziobtinute prin analiza de genotipare i multitudinea desenelor liniare ce alctuiesc o amprent digital. Desi

sugestiva, analogia este forat intrucat, cei doi termeni, amprenta digital i amprenta genetic nuau n comundect capacitatea de a reflecta una dintre trsturile fundamentale ale fiinelor vii, i anume unicitatea lorbiologic. Termenul de amprent genetic s-a impus sub aceast form n contiina publicului, insa in prezent, inliteratura medical de specialitate i n limbajulul juridic se foloseste aproape exclusiv termenul de profil ADN.


14/29


211

celule. Molecula de ADN este identica in proportie de 99,9% la toti indivizii din aceesi

specie. Din cele 3,5 bilioane de perechi de nucleotide ce alcatuiesc filementul de ADN, doar3 milioane sunt diferite de la un individ la altul. Aceste mici variatii structurale conferaunicitate biologica fiecarui individ uman. Genomul fiecarei persoane este unic cu exceptiagemenilor monozigoti. Materialul genetic nuclear il mostenim in proportii perfect egale de la

parinti: 50% de la mama si 50% de la tata. De aceea cu ajutorul ADN putem demonstralegaturile de rudenie dintr-o familie.Molecula de ADN are o

structura dublu-elicoidala, fiindalcatuita din doua lanturi rulateunul in jurul celuilalt (spiralavietii). Structura ADN poate fiimaginata destul de plastic ca fiindo scara in spirala marginita dedoua balustrade. Succesiuneatreptelor acestei scari in spiralaeste data de cele 4 tipuri denucleotide: A-adenina, G-guanina, T-timina sau C-citozina.

Schematic structura unei secventedintr-un lant de ADN poate fireprezentata astfel:

A A C T G A TA G G T C T A G

Informatia estedeterminata de secventa de litere

de-a lungul lantului de ADN, cu alte cuvinte este codificata. Este vorba de un cod format din4 litere, extrem de performant, deoarece cu ajurotul sau se inmagazineaza o cantitateuriasa de informatie, o adevarata arhiva genetica, transmisa din generatie in generatie cu oprecizie uimitoare. De exemplu, secventa ACGT reprezinta o informatie diferita fata de

secventa AGTC, in acelasi mod in care cuvantul STOP are un inteles diferit fata decuvantul POST sau SPOT, chiar daca aceste cuvinte contin aceleasi litere.

Conexiunea intre bazele azotate este o conexiune specifica, bazata pe

complementaritate stricta, in sensul ca adenina se leaga numai cu timina, iar guanina numaicu citozina.

A = T C GAstfel, secventa de ADN complementara celei reprezentate mai sus va fi:

A A C T G A T A G G T C T A GT T G A C T A T C C A G A T C

Din acest tip de imperechere specifica al catenelor de ADNrezulta un lucru demare importanta practica pentru tehnicile de analiza moleculara cunoasterea unei

secvente de pe un lant de ADN permite deducerea cu exactitate a secventei complementare,deoarece ori de cate ori se separa cele doua lanturi, ele se vor recombina tot de aceeasimaniera complementara.

Replicarea este cea de-a doua proprietate fundamentala a moleculei de ADN demare importanta practica pentru tehnicile de analiza moleculara in genetica judiciara.Cunoasterea proceselor de replicare a ADN a permis reproducerea lor in vitroprin reactiapolimerizarii in lant (PCR - Polymerase Chain Reaction). Replicarea5este procesul prin care,

in cursul diviziunii celulare, se sintetizeaza o noua molecula de ADN folosind ca matrita omolecula de ADN preexistenta. Molecula nou sintetizata este identica cu molecula de ADN-mama, copia sa fidela sau replica sa.

Procesul de replicare incepe prin separarea celor doua filamente de ADN. Fiecare

filament serveste drept matrita pentru copierea unui nou lant de polinucleotide. Replicarea

este controlata de mai multe enzime, dintre care cea mai importanta esteADN-polimeraza.

5Replicare=sinteza de tip auto-copiativ


15/29


212

Aceasta enzima adauga in procesul de sinteza al noilor catene in jur de 1000 de nucleotide

pe secunda.ADN nuclear are in structura sa:

gene - in numar de aproximativ 250006 secvente inruditecu genele

material extragenic - reprezentat de o cantitate considerabila de secvente deADN repetitiv (junk DNA). Proportia de ADN repetitiv reprezinta peste 90% dingenom.

Structura genomului uman7

G

ENO

M

UL

UMA

N

ADN genic

(gene si secventeinrudite cu genele)

(20-30%)

ADN codant (genic) (< 10%)

ADN necodant (> 90%) - introni, pseudogene etc.

ADN extragenic

(necodant)(7080%)

Secvene unice sau cu un numar mic de repetitii (70-80%)

Secventemoderat

si inalt repetitive(20-30%)

Repetiii intercalte in genom (40% )(Alu repetitiile)

Repetiii grupate in tandemuri(60%) Macosateliti

Minisateliti

Microsateliti

Proprietatile secventelor repetitivegrupate in tandemuri

alterneaza cu secventele codante de tip unicat (genele)

ocupa in genom poziii fixe denumite loci (locusla singular) au o informativitate cu totul excepional, in sensul ca structura lor permite

discriminarea ADN provenit de la diferii indivizi. Diferenele interindividuale dinstructura secventelor repetitive, denumite polimorfisme ADNprin numarul variabil altandemurilor repetitive (Variable Number of Tandem Repeats -VNTR), confera acestorstructuri calitatea de markeri ai regiunilor genomice n care i au sediul

variantele structurale ale unei secvente de tip repetitiv sunt desemnate alele, prinasimilare cu alelele genelor.

Functia indeplinita de ADN repetitiv nu este in prezent elucidata, dar ceeea ceintereseaza este organizarea sa si faptul ca transmiterea acestui material genetic se face

asemeni genelor, cu respectarea legilor ereditatii Mendeliene. Astfel, in cursul diviziuniicelulare mitotice, secventele de tandemuri repetitive:

segrega independent(se combina la intamplare)

se regasesc in succesiunea generatiilorpe cromozomi omologi, la nivelul unui locus

de tip repetitiv, descendentii vor prezenta doua variante (alele) ale secventeirepetitive: una de provenienta materna (alela materna), cealalta de provenienta

paterna (alela paterna).

Tandemurile repetitive au lungimi si structuri variabile: succesiuni de 1-5 nucleotide repetate de cteva zeci-sute de ori definesc microsateliii(STR - short tandem repeats)

succesiuni zeci de nucleotide repetate de sute sau mii de ori definesc minisateliii(VNTR8).

6Date publicate HUGO (Human Genome Organization) in 20047adaptat dup Brown T.A. Genetics A Molecular Approach (1992) Chapman & Hall, London, 280-3108VNTR este un termen care desemneaza intreaga clasa de compusi repetitivi, dar cel mai ades denumeste markeriiincadrati in clasa minisatelitilor


16/29


213

Microsatelitii sunt considerati in prezent standardul de aur in materie deidentificare. Dintre miile de microsateliti din genomul uman, in practica medico-legala suntutilizate doar sistemele STR unilocus (cu localizare unica in genom), formate din tetra- si

pentarepetiisi numar minim de artefacte genetice (microvariante).Analiza unui singur locus STR nu este suficienta pentru afirmarea apartenentei unei

probe la o persoana sau alta. Analiza a 10-16 loci STR permite identificarea cu succes aprovenientei unei probe ADN.

Caracterizarea ADN structurat in tandemuri repetitive9

TIPULREPETITIEI

Numrulde loci

Lungimeaunitatii

repetitive(pb)

Nr. derepetitii

CARACTERISTICI APLICATIITehnica de

analiza

MACROSATELI

TI

1 -2 percromozom cateva mii

Grupari de100-5000kb

lungime

Localizati incentromer si

telomere

Nu auutilizare

medico-legalaSouthern blot

MINISATELITIMii per

genom

9 -1001-30kb

n = 10-30Polimorfism de tipVNTRs

unilocus

multilocus

Valoare incercetarea

filiatiei

Southern blot

PCR

MICROSATELI

TII

Zeci demii pergenom

1 6(CA)n(ATG)n

(GTAG)n

< 1kbn = 10-60 Polimorfism de tip

STRs

Valoare marein identificaresi cercetarea

filiatieiPCR

Avantajele genotiparii markerilor de tip STRconstau in

necesarul redus de material genetic pentru analiza (de ordinul ng pana la pg), incluzandaici si ADN degradat sau izolat prin tehnici de purificare rapida

existenta unui numar limitat de variante alelice - markerii STR au o distributie de tip

discontinua a ordinului de marime, lucru ce permite identificarea lor fidela prin compararecu etaloane de marime

rata inalta de succes a analizei datorat randamentului crescut al reactiei PCR pentru

secvente le scurte de AND (vezi detalii la metodele de analiza)posibilitatea analizarii simultate a mai multor loci STR (combinatii de 3 pana la 20 de loci

STR) prin reactii de amplificare multiplexsi electroforeza multiplexposibilitatea inregistrarii rezultatelor in format digital si alcatuirii de baze de date.

Printre dezavantajele investigatiilor pe STRse numara:riscul crescut al contaminarilor cu ADN uman, bacterian sau viral din mediu, in etapele de

pregatire a probelor de ADN, a reactiei de amplificare sau in etapa de analiza a produsilorde reactie

incidenta inalta a evenimentelor mutationale (single-stepsau double stepmutationprin

mecanism de slippage) estimata in medie la 10-4- 10-3/per locus.

Minisatelitii, desi au deschis era investigatiilor de genetica judiciara, sunt in prezent

considerati markeri de rezerva. Gratie potentialului lor discriminatoriu ridicat sunt incautilizati in testele de paternitate sau la investigarea unor relatii de inrudire biologicacomplexe. Limitarile acestor sisteme de markeri tin cantitatea relativ mare de material

genetic necesara pentru analiza (intre 5-250 ng de ADN/ per proba bilogica) incidenta

mare a secventelordegenerate(constand in variatii interne ale unitatii repetitive) care nupermite o identificare foarte exacta a alelelor.

Exemplul cel mai elocvent, citat in literatura desi nu apartine medicinii legale umane este cel al clonei Dolly, a carei identitate nu a putut fi dovedita prin genotipareamicrosatelitilor, fiind necesara o investigatie suplimentara, de aceasta data efectuata

exclusiv pe minisateliti, pentru a dovedi autenticitatea clonei si a infirma ipoteza coformcareia clona ar fi derivat in urma unei contaminari accidentale cu o celula fetala de la oaiagestanta.

9dupa Krawczak M., Schmidtke J. - Origin and maintenance of DNApolymorphism (1994) DNA Fingerprinting,BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford, 1760 si Trent R.J.-Forensic Medicine (1993) Molecular Medicine

An Introductory Text for Students,Churchill Livingstone, Logman Group, Edinburgh, 179-192


17/29


214

Nomenclatura locilor ADN care fac obiectul testelor genetice medicale sau

judiciare. Locii sunt denumiti conform unei nomenclaturi specifice, standardizate la nivel

international. Alelele locilor de tip STR se denumesc dupa numarul de repetitiipe care le contin.

Pentru orice marker genetic: D semnifica acid dezoxiribonucleic, prima cifra dupa D -localizarea cromozomiala, litera urmatoare descrie complexitatea segmentului de ADN, iarultima cifra indica un numar secvential, dat regiunii.

Exemplificareanomenclaturii

pentru markerulD1S80

D- DNA1 - indica localizarea pe cromozomul 1

S- semnifica segment unic (Single)80- numarul secvential al regiunii de pe cromozomul 1

Unii markeri imbraca si denumiri mai speciale, imprumutand denumirea genei invecinatatea careia sunt localizati: HUMTHO1 (Human tyrosine hydrolase gene), HUMTPOX(Human tyroide peroxydase gene), HUMCSF1 PO (Human c-ims proto-oncogene for CSF1receptor gene), etc.

Inainte de a intra in practica curenta, sistemele de markeri ADN din geneticajudiciara fac obiectul unor ample studii de validare care urmaresc: specificitatea lor despecie, rata artefactelor de analiza, modul de transmitere mendelian, legatura cu maladiilegenetice, frecventa alelelor si rata mutatiilor reflectate in studiile populationale.

Markerii ADN genotipai curent n scop de identificaresi localizrile lor cromozomiale 10

Cromozom Locus STR Cromozom Locus STR

1 F13B,D1S1171 13 D13S308,D13S317

2 TPOX,APOB, D2S1242, D2S1338 14 D14S306

3 D3S1349, D3S1352,D3S1358,D3S1359 15 FES/FPS,Penta E

4 FGA (FIBRA), FABP, GABARB15 16 D16S539,D16S537

5 CSF1PO,D5S373, D5S815,D5S818 17 D17S976

6 F13A1,ACTBP2 (SE33), D6S502 18 D18S51,D18S535, D18S8497 D7S460, D7S809,D7S820,D7S1517 19 D19S253, D19S433

8 LIPOL (LPL),D8S306, D8S320,D8S1179 20 D20S85, D20S470

9 D9S52 21 D21S11,Penta D

10 D10S89 22

11 TH01 (TC11), APOAI1, D11S554 X HPRTB,ARA, STRX1, DXYS156

12 VWA,CD4,PLA2A1,D12S391 Y DYS19,DYS385, DYS389-I, DYS389-IIDYS390,DYS391,DYS392,DYS393

Markeri utilizati in identificare sunt localizati exclusiv la nivelul ADN necodantastfel

incat informaiile genetice vehiculate cu privire la identitatea unei persoane sa nu poata fipuse in legatura cu evetuale maladii cu determinism genetic. Daca testele de identificare s-ar efectua la nivelul ADN codant, ele ar permite, in anumite circumstante, diagnosticarea

neautorizata a indivizilor bolnavi, cu toate consecintele nefaste in plan etic si social cedecurg din aceasta.

Ereditatea extranucleara - ADN mitocondrial (ADNmt). Mitocondria este un

organit celular esential pentru viata celulei, pentru ca aici se desfasoara proceselerespiratorii de baza ce conduc la producerea de energie. Fiecare mitocondrie are pana la 10molecule de ADNmt, iar celula umana contine intre 5000-10000 de mitocondrii. Prin

urmare,ADNmt se regaseste in de sute sau mii de copii intr-o singura celula, comparativ cuADN nuclear care este unic. Daca probele biologice contin ADN nuclear in cantitati extremde mici sau extrem de degradat, sansele de a recupera ADNmt sunt destul de mari, ceea ceprezinta un real avantaj in identificarile medico-legale.

ADNmt uman a fost complet studiat si se cunoaste secventa completa a moleculei.Exista mari diferente intre ADNmt al diferitelor specii de animale, ceea ce face acestmaterial ereditar ideal pentru diferentierea speciilor.

10dupa baza de date a National Institute of Science and technology (www.cstl.nist.gov/div831/strbase)
http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_f13b.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d13s.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_tpox.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d3s.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_fes.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_fga.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d16s.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_csf.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d5s8.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_f13a.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d18s.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d7s8.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_lpl.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d8s1.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d21s.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_th01.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_hprt.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_vwa.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_cd4.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/d12s391.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_dy19.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_y390.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_y391.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_y392.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_y393.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_y393.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_y392.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_y391.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_y390.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_dy19.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/d12s391.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_cd4.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_vwa.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_hprt.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_th01.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d21s.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d8s1.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_lpl.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d7s8.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d18s.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_f13a.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d5s8.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_csf.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d16s.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_fga.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_fes.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d3s.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_tpox.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_d13s.htmhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_9/str_f13b.htm


18/29


215

ADNmt nu contine secvente repetitive, insa are in structura sa o zona polimorfa

numitazona D-loop. In identificarile de persoane sunt analizate prin tehnici de secventieremoleculara regiunile hipervariabile HV1 (Hypervariable 1) si HV2 apartinand zonei D-loop.

Transmiterea materialului genetic mitocondrial nu se face dupa tipul legilorMendeliene, ci preferential

pe linie materna(erediatate de tipmatern). Cercetarile arata

ca in timpul fecundarii,dupa patrunderea in ovul,mitocondriile spermato-zoidului se dezintegreaza,

ramanand in celula ounumai mitocondriileovulului. Datorita faptuluica ADNmt al uneipersoane este mostenitintegral de la genitorulmatern, se poate verifica

descendenta biologica pelinie feminina a membrilorunei familii. Acest lucrueste extrem de util in

identificarile medico-legale, mai ales acolounde una din verigile

dintre generatii lipseste: de exemplu, in cazul in care ambii parintii sunt decedati, studiulsecventelor de ADNmt al nepotilor si bunicii materne permite stabilirea filiatiei lor biologice.

- Modul de transmitere al ADNmt are si dezavantaje legate de imposibilitateadistingerii intre descendentii pe linie materna ale aceleasi familii.

-

Analiza ADNmt nu isi gaseste utilitatea nici pentru testele de paternitate.

ADN nuclear ADN mitocondrial

Localizat in nucleul celulelor Structura dublucatenara helicoidala Unicat in celula Formeaza in timpul diviziunii celulei cele 23 de

perechi de cromozomi Determina fenotipul individului Mostenit de la ambii parinti, in proportii perfect

egale Markeri ADNnc in genetica judiciara secventele

repetitive- utilitate in identificarile de persoane sicercetarea relatiilor de inrudire pe linie paterna saumaterna

Localizat in mitocondrie Structura dublucatenara circulara Multiple molecule de ADNmt in fiecare

mitocondrie, deci cateva sute-mii per celula Nu formeaza cromozomi in cursul diviziunii Codifica enzime si proteine implicate in

metabolismul energetic al celulei Mostenit exclusiv pe linie materna Markeri ADNmt in genetica judiciara regiunile

hipervariabile HV1, HV2 din zona D-loop -utilitate in identificarile de persoane unde analizaADNnc esueaza si pentru cercetarea inrudirilor pelinie materna

Etapele unui test ADN.

O analiza ADN este un proces complex, insa indiferent de tehnica de lucru utilizata in labo-rator, exista cateva etape standardcare se parcurg in mod obligatoriu:

1. Prelevarea si conservarea probelor biologice biulogice

2. Izolarea si purificarea ADN din probele biologice3. Amplificarea fragmentelor de analizat prin PCR4.

Vizualizarea produsilor de reactie

5. Analizarea rezultatelor si inscrierea lor intr-o baza de date

1. Prelevarea si conservarea probelor biologice pentru analiza ADN:


19/29


216

Molecula deADN este omolecula stabila,mai stabila decat

multe alte proteinecare fac de obiceiobiectul analizelor

in laboratoarelemedico-legale.

In tabel sunt prezentate conditiile de prelevare obligatorii in vederea testarii ADN.

Tipul de produsbiologic prelevat

Volumul Suportul pecare se faceprelevarea

Conservarea** Recomandari

sange prelevat dela persoane vii

1-5ml EDTA* refrigerare(4C) saucongelare( -20C)

Congelarea impiedicadegradarile autolitice

sange prelevat laautopsie

1-5ml inutil idem ca mai sus Sangele va fi prelevat dincavitatile cordului sauvase (sinus venoslongitudinal)

saliva 1- 3 esantioane(tampoane sterile)

- mediu uscat Prelevatele trebuieobligatoiu bine uscate

nainte de a fi introduse in

tuburile protectoare dinplastic In caz contrartuburile se congeleaza

prelevate vaginalesau din sferagenitala

3-5 esantioane(tampoane sterile)

- mediu uscat Prelevatele trebuieobligatoiu bine uscatenainte de a fi introduse intuburile protectoare dinplastic In caz contrartuburile se congeleaza

tesuturi:piele,muschi, viscere,os, etc.

2 5 cm2 ! nu se adaugaformol

refrigerare(4C) sau

congelare( -20C)In cazul tesuturilorputrefiate- se preleva din mai multetesuturi (activitatea ADN-azelor difera de la untesut la altul)

Par sau unghii 10-30 fire de parcu radacina cu tot

- mediu uscat -

Pete de sange sausperma

cat mai multeposibil, cu diam.minim de 0,5cm

- mediu uscatfiecare pata sepastreaza separat

-

* Se accepta si utilizarea altor anticoagulanti decat EDTA, cum ar fi heparina sau florura de sodiu (continuta inflacoanele pentru recoltarea alcoolemiei), insa aceastea interfereaza cu activitatea enzimelor din etapa PCRcompromitnd analizar. EDTA are avantajul ca reduce procesele de degradare a ADN prin chelarea unor cationinecesariADN-azelor.** Ideal ar fi ca izolarea materialului genetic sa se faca imediat ce sunt primite probele. Daca intervalul deprelucrare depaseste 72h atunci esantionul se va congela la 20C. Congelarea impiedica degradarile autolitice.Probele pot fi depozitate deci la 4C cateva zile fara ca ADN sa sufere degradari mari; totusi cantitatea si caliatatea

ADN scade cu timpul chiar la 4C, impunandu-se congelarea. Transportul probelor va fi facut in aceleasi conditii in

care a avut loc conservarea acestora.

Degradarea ADN are loc sub actiunea:- ADN-azelor - enzime proprii ale celulei- factorilor din mediu ambiental:umiditate, caldura, lumina UV,contaminarebacteriana.


20/29


217

De aceea este indispensabil de a preleva si conserva corect probele biologice destinate

analizelor genetice, in conditii de:-refrigerare-uscaciune-protejate de lumina solara, radiatii UV, agenti chimici

Eforturile trebuie concentrate in aceasta directie, deoarece reprezinta prima garantiea unor analize de calitate. Neglijenta sau ignoranta in manipularea probelor sau la transportpoate prejudicia intreaga testare, lucru critic uneori in activitatea de identificare medico-

legala.Testele se pot efectua tuturor probelor biologice ce contin celule nucleate:

sange

saliva

tesuturi (proaspete si arhivate)

sperma

os

pulpa dentara

fir de par cu bulb

urina.

lichid amniotic

2. Tehnici de izolare si purificare a ADN din probele biologice.Succesul unei testari depinde in buna masura de etapa de izolare, de aceea este

important sa se obtina ADN:- in cantitate cat mai mare- cu greutate moleculara mare (echivaleaza cu integritatea moleculei de ADN)-

cat mai pur - liber de toate impuritatile de natura proteica, ionica saupolizaharidica.

Tehnicile de izolare variaza in functie de tipul, cantitatea si calitatea probei biologicede analizat. Exista o mare varietate de procedee de izolare a ADN, unele destul de

laborioase prin care se obtine ADN pur si altele denumite metode quick and easy prin carese obtine ADN de puritate medie, dar propriu analizei prin PCR. Mai nou, au aparut omultitudine de echipamente care pot realiza automat extratia ADN si care sunt destinate in

special prelucrarilor esantioanelor biologice in centrele unde se organizeaza baze de dateADN medicale sau judiciare.

Majoritatea laboratoarelor de genetica judiciara folosesc protocoale de izolare a ADNstandard sau cat mai apropiate de cele standard, existand astfel posibilitatea confruntariirezultatelor obtinute intre laboratoare.

3. Amplificarea fragmentelor de analizat prin PCRTestele ADN in scop de identificare a indivizilor umani fac apel in mod curent la tehnica

PCR(Polymerase Chain Reaction). Tehnicile de analiza RFLP11au fost practic abandonate lamijlocul anilor 90 motiv pentru care nu vor fi prezentate. Tendinta generala in domeniueste de a se renunta la tehnicile laborioase, consumatoare de timp si a se opta pentruprocedee lucru automatizate.

Tehnica PCR, una din cele mai performante unelte de lucru ale geneticii moleculareprezente, descoperita si dezvoltata la inceputul anilor 1980 de Kery Mullis si colegii sai de laCetus Corporation, companie americana de biotehnologie. Pentru aceasta descoperireinventatorii au primit premiul Nobel in 1993. Gena umana a beta-globinei a fost printreprimele secventiate prin tehnica PCR. Tehnica are la ora actuala un impact major inmedicina in ce priveste diagnosticul bolilor genetice, infectioase, oncologie si medicina

legala. Datorita tehnicilor PCR a fost posibila derularea si finalizarea cu succes a ProiectuluiGenomul Uman in numai 5 ani de zile. Exista la ora actuala peste 10000 de laboratoare inlume care utilizeaza diagnosticul PCR si numarul lor este in crestere.

11 a fost prima tehnica de laborator utilizata in identificarile de persoane descrisa in 1985 de A.Jeffreyspentru analiza locilor ADN polimorfi de tipul minisatelitilor VNTR multilocus


21/29


218

Reactia de polimerizare in lant (prescurtat PCR) este o metoda de sintetizare in vitroa

unei secvente specifice de ADN, proces ce se repeta ciclic de mai multe ori, avand carezultat final marirea exponentiala a cantitatii de material genetic. Reactia PCR a fostcomparata cu un xerox la nivel molecular.

Tehnica PCR a fost conceputa de asa maniera incat sa mimeze procesul natural de

replicare al moleculei de ADN din timpul diviziunii celulare. In timpul replicarii, fiecaremolecula de ADN se separa in doua lanturi prin desfacerea legaturilor de hidrogen dintreperechile de baze azotate complementare. Apoi, printr-un proces declansat si condus de o

enzima ADN-polimeraza, are loc sintetizarea unui nou lant de ADN, complementar cumatrita ADN originala. Rezultatul il reprezinta o dublare a numarului de molecule de ADN.

Ingredientele reactiei PCR:(1)solutia cu ADNizolat

(2) primeri sau amorse de reactie - fragmente de ADN cu lungimea de pana la 20 denucleotide, sintetizate pe cale chimica si concepute astfel incat sa flancheze secventa ADNde interes(3) Taq-polimeraza- enzima cheie a reactiei, obtinuta din bacteria Thermus aquaticus(4) nucleotide- o mixtura continand cele 4 nucleotide A,G,T,CEchipamentul necesar pentru PCR: un termocycler - aparat prevazut cu un bloc termicprogramabil

Reactia PCRse desfasoara in cicluride 1-3 minute fiecare. Ciclurile se repeta de cca20-30 de ori. Un ciclu complet cuprinde trei etape principale:1. denaturarea termica a ADN dublu-catenar:are ca scop producerea de ADN monocatenar

prin ruperea legaturilor de hidrogen dintre catenele complementare. Denaturarea serealizeaza la peste 90C. Denaturarea termic este un proces reversibil permitandreasocierea ulterioara a catenelor cu formarea unui nou dublu helix. Este important destiut ca dupa mai multe cicluri de denaturare-renaturare ADN-ul isi pastreaza

proprietatile biologice.2. cuplarea primerilor (amorselor) de reactie pe monocatena de ADN:primerii se cupleaza

flancand capetele secventei tinta de ADN monocatenar; cuplarea se face pe baza de

complementaritate;3. extensia (sau polimerizarea):de la nivelul situsurilor de cuplare a primerilor se initiaza

sinteza noilor catene de ADN prin intermediul Taq-polimerazei care va incorpora perand nucleotidele din mixul de reactie

Dupa fiecareciclu de reactie,fiecare segment

tinta de ADNmonocatenar

devine dublu-catenar.

Daca procesuleste 100%eficient, dupa n

cicluri complete seproduc 2n copiidupa ADN

matrita. Deexemplu, dupa 20de cicluri dereactie ar trebui

rezulta in mediulde reactie circa

1.000.000 decopii ale frag-mentului de ADNamplificat.


22/29


219

Prin tehnici PCR multiplex se poate realiza amplificarea simultana a unui numar

mai mare de secvente tinta de ADN folosind o combinatie de 3 pana la 16-20 seturi deprimeri. Tehnicile PCR multiplex sunt larg utilizate in laboratoarele de genetica molecularadeoarece permit cresterea randamentului de lucru si automatizarea proceselor de analiza.

Avantajele metodei PCR:a) senzitivitatea - capacitatea reactiei de a multiplica cantitati de ADN de ordinulnanogramelor si picogramelor (pentru o amplificare de calitate este de regula sufficient

materialul genetic provenit din 10-100 de celule); cum eficienta amplificarii este inversproportionala cu lungimea segmentului de amplificat, majoritatea reactiilor folosescdrept tinta segmente de ADN mai mici de 2kb. Amplificarea genica este usor si sigur de

realizat pentru secvente din genom de mici dimensiuni de tipul markerilor STRs.b) rapiditatea efectuarii analizelei PCR ( in medie 3 ore)

Dezavantajele PCR:

a)

relativa usurinta cu care se poate produce contaminarea probelor de ADN cumaterial genetic provenit din alte surse (ADN apartinand persoanei care facerecoltarea probelor biologice, produsi de amplificare rezultati din reactiile anterioare).

b)

sinteza in vitro a ADN este un proces grefat de erori - rata erorilor asociate cuactivitatea Taq-polimerazei este estimata la 0,25% (o lipsa de incorporare de circa 400de baze in 30 de cicluri).

4. Vizualizarea si identificarea produsilor de reactieVizualizarea produsilor de amplificare (ampliconilor) se poate face in mai multe moduri:

cea mai simpla metoda si la indemana oricarui laborator, este electroforeza in mediu deagaroza urmata de colorare cu ethidium bromide, o substanta care se intercaleaza intrebazele nucleotidice si devine fluorescenta in lumina UV; radiatia UV este absorbita desecventele de ADN si reflectata ca o fluorescenta violet-oranj; fragmentele de ADN devinvizibile sub forma unor benzi intens fluorescente; metoda este utila pentru identificarea

fragmentelor de ADN de mari dimensiuni motiv pentru are in prezent aplicabilitate

redusa in genetica judiciara.

Vizualizarea produsilor de amplificarein gel de agaroza intr-un caz depaternitate pentru markeri de tipVNTR (D1S80, D17S5, APOB):Linia 1- ladder (scara cu etaloane demarime moleculara);liniile 2,5,8 alelele materne;liniile 3,6,9 alelele copilului;

liniile 3,7,10 alelele barbatuluiinvestigat in calitate de prezumptiv

tata biologic.Pentru fiecare marker, se observa ca alelele copilului au cate un corespondent inprofilul matern, respectiv in cel al barbatului testat. Concluzia formulata a fost deconfirmare a paternitatii.

pentru discriminarea fina a secventelor de ADN de mici dimensiuni, specifice markerilorSTRs, in genetica judiciara se utilizeaza tehnici de electroforeza capilara realizate cuajutorul echipamentele de analiza automata - secventiatoare genetice echipate cu

detectie fluoresccenta laser. Produsii de reactie marcati fluorescent sunt identificati cumare precizie.


23/29


220

Vizualizarea produsilor de amplificare cu ajutorul analizorului genetic automat intr-uncaz de paternitate pentru markeri de tip STR (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51,

Penta E). Alele sunt desemnate automat de catre echipamentul de analiza. Linia 1-alelele materne (M); linia 2 - alelele copilului (C); linia 3 - barbatului investigat incalitate de prezumptiv tata biologic (T). Pentru fiecare marker, se observa ca alelelecopilului au cate un corespondent in in profilul matern, respectiv in cel al barbatului

testat. Concluzia formulata a fost de confirmare a paternitatii.

Testul amelogeninei. Testarile ADN utilizate inidentificrile de persoane realizeaz de rutina diagnosticulmolecular al sexului unei persoane prin asa-numitul test alamelogeninei. Testul urmareste punerea in evidenta a unorsecvene localizate n regiuni omologe pe cromozomii X si Y, nimediata vecintate a genei amelogeninei - de unde idenumirea generic de test al amelogeninei. Secventa specificacromozomului X este de dimensiuni mai mici decat cea a

cromozomului Y, motiv pentru diagnosticul de sex este foarteusor de pus (vezi schema de mai jos):- pentru subiectii de sex feminin testul evidentiaza o singura

banda (coresp. secventei de pe cr. X)

-

pentru subiectii de sex masculin testul evidentiaza douabenzi (un semnal corep secventei de pe cr. X si unul corepsecventei de pe cr. Y).

Markerii ADN specifici cromozomului Y. Reprezinta un puternic instrument delucru pentru investigaiile criminale i de filiatie. In ntreaga lume, autorii vastei majoritati aactelor criminale sunt brbai: dupa statisticile oficiale acetia comit peste 99% dinagresiunile sexuale i circa 93% din omucideri. Orice urm, lsat la locul unei fapte decatre un infractor de sex masculin, devine astfel deosebit de informativ, dac n contextulinvestigaiei ADN aa-zise clasice, se are in vedere i analiza markerilor ADN specificicromozomului Y. Analiza comparativ a profilelor ADN specifice cromozomilor Y poate servisi la stabilirea paternitatii descendentilor de sex masculin in cadrul investigatiilor de filiatie.

Metodele clasice de investigare a cromozomului Y.Investigarea cromozomului Y a reprezentat o practic limitat in serviciile medico-

legale i criminalistice in ultimele decenii, servind exclusiv la punerea in evidenta a sexuluiautorului unei infraciuni. Printr-o metod simpl se poate detecta n celule (sangvine, ale

ADN

feminin

ADN

masculinX

XY


24/29


221

mucoasei bucale, spermatozoizi, etc.) expresia citologic a cromozomului Y. Astfel, celulelecare conin cromozom Y, dupa tratare cu quinacrina, prezint n lumina fluorescent uncorpuscul intens luminos - corpusculul fluorescent Y. Numrul punctelor fluorescentedetectate intr-o celul este egal cu numrul cromozomilor Y (XY, XYY, etc.). Dupa ce n1961, Sandberg i colab. au descris sindromul 47,XYY, n numeroase coluri ale lumii s-a

trecut la cutarea febril a cromozomului crimei. Sindromul 47,XYY a fost unul dintrecele mai controversate sindroame cromozomiale, deoarece efectul Y-ului suplimentar a fostlegat la vremea respectiv de comportamentul criminal. Citogenetica parea s aduc n aceaepoc o explicatie obiectiv a comportamentului sociopat. Entuziasmul celor care credeau n

Y-ul criminal s-a stins ns repede atunci cnd studii tiinifice foarte ample au demonstratfr de tgad c nu exist nici o relaie direct ntre constituia YY i comportamentulcriminal. Dosarul Y-ului criminogen odatanchis, s-a diminuat i interesul legitilor icriminalitilor pentru investigarea cromozomului Y.

Caracteristicile cromozomului Y deriv din funcia sa de determinant aldezvoltrii sexuale masculine. Dac Y-ul lipsete sau este nefuncional, genele feminizanteintr spontan in aciune n timpul dezvoltrii embrio-fetale. n timp ce cromozomii autozomii cromozomul sexual X se gasesc perechi n genomul uman si particip perechi -perechi inprocesele de recombinare din timpul diviziunii celulare, cromosomul Y este unic -nepereche (de tip haploid) si nu participa la aceste procese de schimb de material

genetic. Consecina acestui tip de comportament din meioz, este c Y-ul se transmiteintegralde la tat la fiu, n succesiunea generaiilor.

Aceast modalitate de transmitere a cromozomul Y ar corespunde n societatetrasmiterii i motenirii numelui de familie, de la tat la descendenii si de sex masculin.

Polimorfismul cromozomului Y. Ca i restul materialului genetic uman,cromozomul Y acumuleaz gradual o serie de modificri structurale numite mutaii -mrturii ale trecerii timpului i proceselor evolutive specifice tuturor organismelor vii.Polimorfismul ADN al cromozomului Y este produsul mutaiilor care se acumuleaz nsuccesiunea generaiilor.- Polimorfismele de tip STR-Y sunt markeri de elecie pentru investigaiile judiciare i

cercetarea paternitaii. Spre deosebire de markerii STR autozomali, microsateliii STR -Y

se caracterizeaz prin transmiterea lor dup modelul uniparental, strict de latata la fiu.-

Polimorfismele de tip SNP-Y (single nucleotide polimorfism) sunt utile studiilorpopulaionale, de evolutionism genetic i diagnosticului unor infertilitai masculine.

Un profil cromozomial Y definit prin doar 4 microsatelii are rezoluie joas, nschimb, un set de 9-11 markeri STR-Y poate discrimina peste 95% din indivizii de sexmasculin dintr-o populaie. Puterea discriminatorie a markerilor cromozomiali Y este desigurmult mai redusa n izolatele populaionale.

n mod ideal, analiza judiciar a unui profil cromozomial Y ar trebui s includ ctmai muli markeri, astfel nct discriminarea indivizilor s fie posibil in procent de 100%.Discriminarea intre indivizii care au o filiaie comun pe linie masculin (tata -fiu, nepot-bunic patern, frai, veri primari cu bunic patern comun, nepot-unchi patern, etc.) nu sepoate realiza utilizand markerii specifici cromozomului Y.

Aplicaiile ale analizei markerilor ADN specifici cromozomului Y. CromozomulY uman servete n domeniul medicina legala la:1. identificarea agresorilor sexuali brbai - serveste in special ca test de screening al

suspecilor2.

identificarea celulelor epiteliale masculine n ejaculatele indivizilor vasectomizai;3.

investigarea agresiunilor homosexuale

4. cercetarea paternitii pentru cazurile cu descendeni de sex masculin5. studii de genealogie i antropologie.

Investigarea agresiunilor sexuale cu ajutorul markerilor specificicromozomului Y. Markerii ADN specifici cromozomului Y au avantajul c aduc informaiiadiionale n investigaiile medico-legale n afara dovezii c un ADN de origine masculineste prezent ntr-o proba vaginala postcoitala. Analiza PCR a markerilor STR-Y poate genera

intr-un timp record un profil cromozomial Y specific agresorului si aceasta deoarece analiza


25/29


222

nu necesit procedee de extracie prin liz diferenial12 din probele postcoitale. Pentrucazurile de agresiuni sexuale cu agresori multipli, analiza markerilor cromozomiali Y permitedeterminarea cu precizie a numarului minim de agresori sexuali brbai dup numarul deprofile Y identificate.

Investigaiile pe cromozomul Y au o serie de limitri ce in n special de proprietaile

cromozomului Y, de aceea interpretarea rezultatelor testelor trebuie facut cu mult atenie,tinnd cont de mod

14-expertizafiliatiei

Documents

Transcript of 14-expertizafiliatiei