LABORATOR NR. 7

TEHNICI SPECIALE DE COLORARE

Colorarea germenilor acido-alcoolo rezistenti

Majoritatea germenilor acido-alcoolo rezistenti cresc foarte greoi;

- de aceea aceste coloraţii au un rol important în diagnosticul timpuriu al infecţiilor.

- microscopia - cea mai veche, uşoară, rapidă şi necostisitoare procedură pentru detecţia în laborator a acestor bacili. Nu trebuie însă utilizată ca înlocuitor al cultivării.  

Avantaje

1- Oferă un diagnostic prezumtiv al diagnosticului bolilor produse de micobacterii.

2- Cazurile pozitive/infecţioase pot fi rapid identificate.

3- Poate fi utilizată pentru a urmări succesul chemoterapiei la pacienţii tuberculoşi.

4- Are o importanţă vitală pentru pacienţii externaţi din spital sau care se reîntorc la serviciu.

5- Poate confirma că în culturi cresc într-adevăr acido-rezistenţi.

Coloratia Ziehl-Neelsen

- Ehrlich - 1882 descoperă natura acidorezistentă

• Franz Ziehl - 1882

• F. Neelsen în 1883 a modificat-o

• Coloraţia Ziehl-Neelsen

Coloratia Ziehl-Neelsen

• Se foloseste pentru colorarea germenilor din genul Mycobacterium

• Acestia nu se coloreaza prin tehnici uzuale datorita prezentei unor componenti lipidocerosi: acidul micolinic

• Principiul colorarii se bazeaza pe patrunderea fuxinei incalzite la nivelul peretelui celular si legarea de acidul micolinic (legatura stabila la tratare cu acizi si alcooli).

Coloraţia Ziehl - Neelsen (WHO)solutii necesare

• Solutie de fuxina concentrata (fuxina Ziehl – 1%)

• Acid sulfuric diluat ¼

• Solutie de albastru de metilen – 1%

Tehnica de colorare

PASUL I: flambaţi lamele pentru fixarea prin căldură

PASUL 2: Inundaţi lama cu fuxină Ziehl

Asiguraţi-vă că adăugaţi destul colorant pentru a menţine lama acoperită în timpul procesului de colorare

PASUL 3: Utilizând un bec Bunsen încălziţi uşor lama până la apariţia vaporilor. Menţineţi încălzirea pentru 5 minute încălzind intermitent lamele  

Atenţie: o flacără prea puternică poate conduce la spargerea lamelor!

PASUL 4: Spălaţi lama cu apă.

PASUL 5: Inundaţi lama cu acid sulfuric 1/4 şi menţineţi decolorarea pentru 15-20 minute.

- procesul poate fi repetat de 2-3 ori pana cand lama apare curata fara precipitate

Mai jos sunt ex. de lame insuficient şi suficient inundate cu acid.

PASUL 6: Spălaţi lama bine cu apă şi apoi îndepărtaţi excesul.

PASUL 7: Inundaţi lama cu albastru de metilen.  Menţineţi recolorarea pentru 1 minut.

PASUL 8: Spălaţi lama bine cu apă.

Rezultatul colorarii

• Micobacteriile se coloreaza in rosu stralucitor

• Alte bacterii si componentele celulare se coloreaza in albastru

• La unele micobacterii intracitoplasmatic apar granulatii de culoare rosu inchis (granulatii Much)

Dacă toţi paşii au fost realizaţi corect, ar trebui să obţinem o lamă care să prezinte următorul aspect.

Parametri de control ai calităţii

Control NegativRezultat Acceptabil:

Fond de culoare numai albastră

Rezultat Inacceptabil:

Rămâne roşu după decolorare. Fondul nu este suficient decolorat

Parametri de control ai calităţii

Control PozitivRezultat Acceptabil:

Bacili roşii pe un fond albastru

Rezultat Inacceptabil:

Bacili nu sunt coloraţi în roşu iar fondul nu este suficient decolorat

Resurse: http://secure.provlab.ab.ca

Colorarea brucelelor

• Bruceloza – zoonoza grava, cu afinitate pentru aparatul genital, la femele - avort si retentii plcentare iar la masculi orhite, orhiepididimite

• Ca si micobacteriile, brucelele prezinta un oarecare grad de acido-alcoolo-rezistenta, dar se folosesc acizi slabi pentru diferentiere

Coloratia OMS

• Se aplica mai ales pentru colorarea brucelelor din materialele patologice

• Solutii necesare:– Fuxina diluata 1/10– Acid acetic 0,5 %– Albastru de metilen 1%.

Tehnica de colorare

• Frotiul uscat si fixat se acopera cu fuxina diluata 1 minut (colorare)

• Se face diferentierea cu acid acetic 30 secunde

• Se spala frotiul prin acoperirea lamei cu apa distilata 1-3 minute

• Recolorare cu albastru de metilen 30 secunde – 1 minut

• Spalare, uscare si examinare cu imersie

Rezultatul colorarii

• Germenii din genul Brucella se coloreaza in rosu aprins

• Germenii altor genuri se coloreaza in albastru

Leptospira

• ssiimptommptomee– asemănătoare gripeiasemănătoare gripei – boală boală ssiistemicstemică severăă severă

* rinichirinichi* creiercreier * ochiochi

LeptospiroLeptospirozaza

Morfologie

• 0,1-0,2 x 6-20 μm; spire fine, unul sau ambele capete sunt obişnuit sub formă de cârlig; culoare maro închis la colorarea prin impregnare argentică (Tribondeau-Fontana), Gram-negative.

• urină infectată– rozătoare– Animale de fermă

• apă

• Prin pielea lezionată.

Transmiterea

Epidemiologie

zoonoză ubicvitară

gazde animale: şobolani, şoareci, rozătoare sălbatice, câini, porci şi bovine

La om - accidental

Coloratia Tribondeau-Fontana (impregnare argentica)

• Leptospirele – germeni spiralati lungi si f subtiri, necesita ingrosarea structurii pentru vizualizare

• Solutii necesare:– Lichid Ruge– Alcool de 96º– Solutie mordanta (acid tanic si fenol)– Solutie argentica fontana

Tehnica de colorare

• Frotiul uscat si nefixat se acopera cu:– Lichid Ruge 5 min (rol de fixare)– Se inlatura si se adauga iar pentru 5 min– Se spala cu alcool de 96º cateva secunde– Se acopera lama cu solutie mordanta– Se incalzeste la aparitie de vapori– Se spala cu apa distilata– Se acopera cu solutie argentica Fontana – Se incalzeste la emisie de vapori 20-30 sec.

repetand impregnarea de 2-3 ori (pana frotiul capata un aspect metalic)

– spalare finala, uscare si examinare cu imersie.

Rezultatul colorarii

• Leptospirele se coloreaza in brun

• Au aspectul unor filamente cu capetele sub forma de carlig (croseta)

• Fondul preparatului se coloreaza in galben

Rezultatul colorarii