Post on 02-Dec-2015
Subiecte rezolvate genetica
1. Structura primară a ADN.
ADN este un polimer de dezoxiribonucleotide. Unitatea structurală a ADN este
dezoxiribonucleotidul, având în componenţă trei elemente distincte: o pentoză, o bază azotată
şi grupul fosfat
a) Pentoza este un glucid cu 5 atomi de carbon, reprezentat de dezoxiriboză, care
prezintă o grupare OH în poziţia 3'.
b) Baza azotată poate fi purinică - adenina (A) şi guanina (G)- sau pirimidinică -
citozina (C) şi timina (T). Baza azotată se leagă printr-o legătură N-glicozi-dică de carbonul 1'
al dezoxiribozei, formînd un nucleozid.
c) Grupul fosfat (P) se ataşează la carbonul 5' al pentozei, formând un nucleotid.
Radicalul de acid fosforic conferă moleculei un caracter acid. În ADN există patru tipuri de
dezoxiribonucleotide: acid dezoxiadenilic (dAMP), dezoxicitidilic (dCMP), dezoxiguanilic
(dGMP) şi dezoxtimidilic (dTMP), deosebite numai prin baza azotată.
Nucleotidele din ADN se leagă între ele prin legături covalente 3'-5' fosfodiester,
stabilite între OH 5' al dezoxi-ribozei unui nucleotid şi OH 3' al dezoxiribozei nucleotidului
următor. Se constituie, astfel, un lanţ polinucleotidic continuu, liniar, lung, care repre-zintă
structura primară a ADN.
În structura polinucleotidului (catenei), complexul fosfat-dezoxiriboză este constant,
iar baza azotată este variabilă.
În catena de ADN, nu există o restricţie cu privire la aşezarea nucleotidelor, acestea
putând ocupa orice poziţie a catenei. Succesiunea nucleotidelor în lungul moleculei de ADN
reprezintă informaţia genetică codificată, pe baza căreia este stabilită ordinea aminoacizilor
în proteine. Această informaţie este citită în sensul 5' - 3', deoarece capetele polinucleotidului
(în poziţia 5' un radical fosfat, iar în poziţia 3' un radical OH) sunt libere.
2. Structura secundară a ADN
Molecula de ADN este constituită din două catene polinucleotidice care formează un
dublu helix. Catenele sunt conectate între ele prin intermediul legăturilor de hidrogen: două
între A şi T şi trei între G şi C. Formarea legăturilor de hidrogen este posibilă numai între o
bază purinică de pe o catenă şi o bază pirimidinică de pe catena opusă, din cauza dimensiunii
moleculare a bazelor. Astfel, cele două catene ale ADN nu sunt identice, ci complementare.
Legea complementarităţii bazelor azotate stă la baza realizării funcţiilor genetice ale ADN:
replicarea, transcrierea, repararea, etc.
În ADN numărul de adenine este egal cu numărul de timine, iar numărul de guanine
egal cu numărul de citozine, respectiv raportul lor este întotdeauna unitar (A/T = 1; G/C = 1);
iar raportul sumelor bazelor purinice şi pirimidinice este întotdeauna unitar (A+G/T+C=1),
indiferent de specie. În schimb, raportul A+T/G+C nu este unitar, fiind o caracteris-tică de
specie (la om, raportul A+T/G+C = 1,7).
Cele două catene din structura dublului helix au o orientare antiparalelă (în sensurile
5' - 3', respectiv 3' - 5'), ca urmare a legăturilor dintre bazele complementare. Catenele,
asemănătoare cu două panglici, sunt răsucite dextrogir una în jurul alteia, şi ambele în jurul
unui ax imaginar, de la stânga la dreapta
Se formează, astfel, o dublă spirală helicoidală, asemănătoare unei scări în spirală, în
care axele glucidofosforice reprezintă marginile, iar perechile de baze treptele scării.
Bazele azotate sunt dispuse în interiorul helixului, perpendicular pe axul glucido-
fosforic; fiecare pereche de baze (pb) este deviată cu aproximativ 36º faţă de pb vecine.
Fiecărui tur complet al spirei îi corespund 10 pb. Distanţa dintre bazele suprapuse este de 0,34
nm, astfel că unui tur de helix (10 pb) (pasul elicei) îi corespunde o lungime de 3,4 nm.
Diametrul dublului helix este de 2 nm. La exteriorul helixului sunt vizibile două
şanţuri: un şanţ mare, important pentru fixarea pe molecula de ADN a proteinelor reglatoare,
şi un şanţ mic, necesar fixării histonelor.
Modelul descris corespunde formei B a ADN care, în condiţii fiziologice, este forma
predominantă. Dintre celelalte variante structurale ale ADN celular, cele mai bine cunoscute
sunt formele A şi Z, care pot fi prezente pe distanţe scurte. Forma A este mai compactă decât
forma B şi este adoptată la concentraţii saline mari. Forma Z este un helix levogir, mai lax ca
forma B, cu pasul de răsucire în zig-zag. Formele C, D, E, dextrogire, par să nu existe in vivo.
Modelul dublu catenar al ADN asigură stabilitatea informaţiei genetice.
3. Tipuri de ADN nuclear
Sunt descrise mai multe clase de ADN, diferite prin repetiţia secvenţelor nucleotidice:
► ADN nerepetitiv reprezintă circa 60% din lungimea totală a genomului uman şi
este alcătuit din secvenţe unice per genom sau în număr foarte mic de exemplare (familii
multigenice). Este dispus printre secvenţele repetitive, în regiunile eucromatice.
Sub 10% (circa 2%) din secvenţele nerepetitive reprezintă regiunile codante ale
genelor care codifică proteine (exonii); aceste gene sunt transcrise de ARN-polimeraza II
(gene de clasă II). Restul ADN-ului nerepetitiv (peste 90%) este necodant, prezent în
interiorul genelor (introni) şi în regiunile dintre gene, iar funcţia sa este încă necunoscută (unii
autori consideră că aceste secvenţe reprezintă gene represate).
► ADN moderat repetitiv (ADN repetitiv dispersat)
ADN moderat repetitiv reprezintă circa 30% din genomul uman şi este alcătuit din
secvenţe scurte, de 300-1000 pb, repetate de zeci şi sute de mii de ori şi dispersate în genom.
Majoritatea acestor secvenţe sunt transcrise în ARN şi cuprind: genele repetate în tandem care
codifică ARNr şi ARNt, secvenţele LINEs şi SINEs.
Genele pentru ARNr sunt secvenţe repetate în tandem (150-200 copii), localizate pe
braţele scurte ale cromozomilor acrocentrici, în regiunile organizatorilor nucleolari (NOR-
nucleolar organizer regions), care formează nucleolii în nucleul interfazic (genele pentru
ARNr 28S, 18S şi 5,8S); genele pentru ARNr 5S sunt situate în vecinătatea telomerului, pe
braţul lung al cromozomului 1. Genele ribozomale sunt transcrise de ARN-polimeraza I (gene
de clasă I).
Genele pentru ARNt (şi alte molecule mici de ARN)
Genele pentru ARNt sunt gene repetate în tandem, localizate mai ales la nivelul
cromozomilor 1 şi 6. Aceste gene sunt transcrise de ARN-polimeraza III (gene de clasă III).
Secvenţele LINEs (long interspersed nuclear elements) au lungimea de 1-6 Kb şi sunt
dispersate în întregul genom, numărul de copii fiind de circa 500.000 (3-5% din genom). Până
acum, sunt cunoscute două familii: L1 şi The 1. Rolul probabil al acestor secvenţe este de a
asigura împerecherea corectă a cromozomilor omologi în meioză, esenţială pentru schimbul
egal de segmente cromozomiale.
Secvenţele SINEs (short interspersed nuclear elements) sunt secvenţe scurte de 150-
300 pb, dispersate în cromozomi în circa 100.000 de copii. Sunt reprezentate de familia Alu;
funcţiile acestei familii sunt necunoscute, dar se presupune că ar avea rol în iniţierea replicării
în diferite puncte ale ADN. Secvemţele Alu pot fi transpozate.
Cele mai multe secvenţe repetitive sunt rezultatul transpoziţiei, majoritatea având
originea într-un ARN viral care, sub acţiunea unei revers-transcriptaze, va forma o copie
ADN ce va fi integrată în alt loc din genom.
► ADN înalt repetitiv
ADN înalt repetitiv reprezintă 10% din genom şi este alcătuit din secvenţe foarte
scurte (2-200 pb), repetate de în tandem de milioane de ori. Secvenţele înalt repetitive, care
nu sunt transcrise, sunt reprezentate de:
- sateliţi (ADN satelit), prezenţi în heterocromatina constitutivă din anumite regiuni
cromozomiale - centromer (banda C), telomere (secvenţa TTAGGG), constricţii secundare,
benzi G, precum şi din cromozomul Y (corpusculul fluorescent); ADN satelit are deci rol
structural.
- minisateliţii sunt secvenţe foarte scurte, de circa 15 pb, repetate în tandem şi
dispersate în toţi cromozomii (cu excepţia cromozomilor X şi Y), unde ocupă situsuri
specifice.
Minisateliţii sunt alcătuiţi dintr-o regiune centrală, cu o secvenţă identică, şi regiuni
periferice variabile. Numărul de copii ale secvenţei unui minisatelit, precum şi variantele
secvenţelor acestuia variază de la o persoană la alta; minisateliţii sunt denumiţi şi regiuni
hipervariabile (VNTR - variable number of tandem repeats) şi reprezintă markeri genetici ai
individului: amprenta ADN (DNA fingerprinting) sau profilul ADN; probabilitatea de a
întâlni doi indivizi neînrudiţi identici este mai mică de 10-20.
- microsateliţii sunt secvenţe de 1-13 pb, cel mai frecvent dinucleotidice (STR - short
tandem repeats sau VNDR - variable number of dinucleotides repeats), distribuite neuniform
la nivelul genomului.
Mini- şi microsateliţii sunt localizaţi în regiunile de eucromatină, şi anume în ADN
extragenic şi introni. Aceste secvenţe repetitive sunt, cel mai probabil, rezultatul unor defecte
ale împerecherii (slippage = alunecare) în timpul procesului de replicare a ADN.
4. ADN mitocontrial(Genomul mitocondrial)
Genomul mitocondrial are o lungime de 16,6 Kb. Conţine un singur tip de ADN
circular, dublu catenar. Cele două catene ale ADN mitocondrial (ADNmt) se deosebesc prin
conţinutul lor în baze azotate: una este bogată în guanină (catena grea - H), iar catena
complementară bogată în citozină (catena uşoară - L). Există o regiune mică, numită bucla D
(displace-ment loop), în care ADN este format din trei catene.
În fiecare celulă umană există câteva mii de copii ale ADN mitocondrial (ADNmt).
Genomul mitocondrial al zigotului provine exclusiv de la ovul, deci este moştenit numai de la
mamă.
ADNmt diferă de cel nuclear şi prin următoarele:
1) nu formează complexe cu proteine;
2) procentul de ADN codant este mare – circa 97%;
3) conţine foarte puţin ADN repetitiv;
4) este lipsit de introni;
5) replicarea este unidirecţională şi începe în puncte de origine diferite pentru cele
două catene;
6) transcrierea este continuă, fără întrerupere, în direcţii diferite pe cele două catene,
rezultând un transcript multigenic de dimensiune mare;
7) lipsesc unele mecanisme de reparare a leziunilor ADN, astfel că mutaţiile se
acumulează rapid;
8) conţine 37 de gene, care codifică ARNr de dimensiuni reduse, ARNt şi
polipeptide;
9) are 4 codoni stop, din care doi sunt codoni sens în ADN nuclear, iar codonul stop
UGA din ADN nuclear este codon sens în ADNmt.
5. Cromatina
Cromatina reprezintă complexul format din ADN nuclear şi proteine. Ea se prezintă microscopic sub două aspecte, diferite ca structură şi funcţie: eucromatina şi heterocromatina.
► Eucromatina este mai puţin condensată şi slab colorată cu coloranţi bazici; reprezintă cromatina activă genetic (transcripţională); se replică precoce în faza S a ciclului celular; conţine mai mult ADN nerepetitiv (în care predomină perechile de baze G-C) şi proteine nehistonice. Eucromatina poate fi evidenţiată în cromozomii metafazici sub forma benzilor R.
► Heterocromatina este puternic condensată sub formă de cromocentri şi colorată mai intens cu coloranţi bazici; este cromatina inactivă genetic; se replică tardiv în faza S; conţine mai mult ADN repetitiv (în care predomină perechile de baze A-T) şi histone. Heterocromatina este de două tipuri: constitutivă şi facultativă.
- Heterocromatina constitutivă rămâne sub formă condensată pe tot parcursul ciclului celular. Nu conţine gene funcţionale şi este formată din ADN înalt repetitiv. La nivel cromozomial, heterocromatina constitutivă se găseşte în la nivelul centromerului, a telomerelor, la nivelul constricţiilor secundare, pe braţul lung al cromozomului Y şi pe braţele scurte ale cromozomilor acrocentrici. Ea ocupă poziţii identice pe cromozomii omologi şi poate fi evidenţiată în cromozomii metafazici sub forma benzilor C. Se presupune că heterocromatina constitutivă are rol în stabilizarea centromerelor şi telomerelor, precum şi în sinapsa dintre cromozomii omologi meiotici.
- Heterocromatina facultativă este o formă de cromatină care a fost sau va fi activă într-un stadiu al dezvoltării ontogenetice şi care intervine probabil în reglarea genelor; conţine secvenţe de ADN nerepetitiv. Exemplul cel mai caracteristic îl constituie cromatina sexuală X, unul dintre cei doi cromozomi X inactivaţi în celulele somatice feminine.
Cromatina sexuală
Cromatina sexuală reprezintă un cromocentru distinct, care permite stabilirea sexului genetic (XX sau XY) şi a anomaliilor numerice ale cromozomilor sexuali.
Cromatina sexuală diferă la sexul feminin şi masculin, deoarece rezultă prin mecanisme diferite.
Cromatina X
La femei (XX), cromatina sexuală rezultă în urma inactivării unuia din cei doi cromozomi X. Cromozomul X condensat (heterocromatinizat) este vizibil sub formă de corpuscul Barr în majoritatea ţesuturilor (figura 1.8) sau sub formă de apendice nuclear (drumstick - băţ de tobă) pe frotiuri de sânge, în polimorfonuclearele neutrofile (figura 1.9). Astfel, atât la femeie cât şi la bărbat, un singur cromozom X rămâne activ, iar cromozomii X suplimentari sunt inactivaţi prin heterocromatinizare. Conform principiului Lyon, inactivarea cromozomului X este totală, se produce precoce în perioada embrionară şi este definitivă; inactivarea cromozomului X se produce la întâmplare, în unele celule fiind inactivat cromozomul X de origine paternă, iar în altele cel de origine maternă.
Numărul de corpusculi Barr este egal cu suma cromozomilor X – 1.
Cromatina Y
La bărbaţi (XY), cromatina sexuală este reprezentată de heterocromatina de la nivelul celor 2/3 distale ale braţului lung al cromozomului Y; poate fi vizualizată, prin coloraţia cu quinacrină şi examinare microscopică în lumină ultravioletă, sub forma unui corpuscul intens fluorescent, denumit şi cromatină Y sau corpuscul F.
Numărul de corpusculi F este egal cu numărul cromozomilor Y.
6. Structura supramoleculara a cromatinei(ADN)
Împachetarea succesivă a ADN, care realizează o scurtare de circa 10.000 de ori a
moleculei de ADN, permite atât adaptarea materialului genetic la volumul mic al nucleului,
cât şi controlul exprimării genelor de pe cromozomi.
1. Primul nivel de organizare supramoleculară a cromatinei este filamentul nucleozomic (figura 1.11b) cu un diametru de 10 nm, denumit şi fibra de 10 nm. Nucleozomul (figura 1.10) este un complex ADN – histone: un segment de ADN se înfăşoară de 1¾ ori în jurul unui octamer histonic, de formă cilindrică, alcătuit din câte două molecule din histonele H2A, H2B, H3, H4. Nucleozomii sunt legaţi între ei printr-un segment de ADN numit ADN de legătură (ADN linker), care este asociat cu histona H1. Se constituie astfel filamentul nucleozomic, asemănător cu un „şirag de mărgele”. Această structură reduce lungimea dublului helix ADN (2 nm) de circa 10 ori.
2. Al doilea nivel de organizare a cromatinei este fibra de cromatină de 30 nm
(figura 1.11c), care rezultă din spiralizarea sub formă de solenoid a fibrei de 10 nm. Această
structură, care reduce lungimea dublului helix de 40 de ori, este stabilizată de histona H1 şi
conţine 6 nucleozomi per tur de helix. Cromatina din nucleul interfazic are ca unitate de
organizare fibra de cromatină de 30 nm.
3. Al treilea nivel de organizare a cromatinei este reprezentat de buclele de
cromatină (fibra pliată în bucle laterale) cu un diametru de 300 nm, care rezultă prin
plierea fibrei de cromatină de 30 nm. Fiecare buclă este ataşată prin anumite regiuni din
structura fibrei de ADN (bogate în AT) la un schelet proteic central. Scheletul proteic central
este format din proteine nehistonice. Fixarea buclelor la scheletul central este neregulată, ele
formând, din loc în loc, mici aglomerări de bucle, denumite cromomere. În cromozomii
condensaţi, cromomerele formează grămezi, vizibile sub forma benzilor G intens colorate.
Buclele de cromatină se spiralizează şi condensează puternic la începutul diviziunii,
alcătuind cromatida unui cromozom (figura 1.11e) care, în metafază, are un diametru de 700
nm şi care atinge cel mai înalt grad de condensare a fibrei elementare de cromatină de 30 nm.
Fiecare cromatidă a unui cromozom conţine deci o singură moleculă de ADN cu grade
succesive de împachetare. La sfârşitul diviziunii, cromozomii se despiralizează.
Histonele sunt proteine mici bazice, bogate în arginină şi lizină, care se fixează de ADN la nivelul şanţului mic. Sunt codificate de gene lipsite de introni, situate pe cromozomii 1, 6 şi 12. Se deosebesc cinci tipuri de histone: H1, H2A, H2B, H3, H4, cu rol important în organizarea supramoleculară a ADN. Histonele H2A, H2B, şi mai ales H3 şi H4, au o structură conservată în evoluţie. În diferite stadii ale ciclului celular, histonele sunt supuse unor transformări chimice care le conferă importante proprietăţi funcţionale: acetilarea lor determină activarea unor gene, metilarea produce represia genelor, iar fosforilarea histonei H1
este urmată de condensarea fibrelor de cromatină în cromozomi şi declanşarea mitozei.
Proteinele nehistonice sunt proteine acide şi neutre, de diferite tipuri, prezente în
număr redus în structura cromatinei. Ele se fixează de ADN la nivelul şanţului major.
Majoritatea proteinelor nehistonice au diferite roluri funcţionale, reglând activitatea genelor.
Unele proteine nehistonice formează scheletul cromozomilor, având deci rol structural.
7.Clasificarea cromozomilor umani
Cromozomii sunt identificaţi pe baza morfologiei lor. Ei sunt clasificaţi conform Sistemului internaţional de nomenclatură citogenetică umană (International System of Human Cytogenetic Nomenclature - ISCN), adoptat în 1995.
Pe baza taliei şi poziţiei centromerului, cromozomii au fost clasificaţi în 7 grupe, notate de la A la G; fiecare cromozom somatic este desemnat printr-un număr de la 1 la 22. Se obţine astfel o aranjare sistematizată a cromozomilor unei celule numită cariotip .
● Cromozomi mari sunt cromozomii grupei A (perechile 1-3), metacentrici (cromozomul 2 este mai submetacentric) şi cromozomii grupei B (perechile 4-5), submetacentrici;
● Cromozomi mijlocii sunt cromozomii grupei C (perechile 6-12 şi cromozomul X), submetacentrici, cromozomii grupei D (perechile 13-15), acrocentrici şi cromozomul 16 (aparţine grupei E ), metacentric;
● Cromozomi mici sunt cromozomii grupei F (perechile 19-20), metacentrici, perechile 17-18 (aparţin grupei E), submetacentrici şi cromozomii grupei G (perechile 21-22 şi cromozomul Y), acrocentrici.
Conform ISCN, pentru a desemna un cariotip normal sau anormal, se menţionează în următoarea ordine şi separaţi prin virgule: numărul de cromozomi, constituţia cromozomilor sexuali şi anomaliile numerice sau structurale ale cromozomilor somatici (atunci când sunt prezente). Prezenţa unui mozaic cromozomial se notează menţionând cariotipurile liniilor celulare componente, separate printr-o diagonală (/) (pentru detalii – vezi Caiet lucrări practice).
8.Heteromorfismul cromozomilor
Termenul de heteromorfism cromozomial defineşte variaţiile în morfologia cromozomilor omologi la un individ sau la persoane diferite, iar cromozomul deosebit morfologic de omologul său este considerat a fi cromozom marker.
Fiecare individ are cel puţin un cromozom marker pe care îl transmite, de obicei, neschimbat la descendenţii săi (poate fi folosit în stabilirea paternităţii).
Regiunile cromozomiale heteromorfice sunt regiuni de heterocromatină alcătuite din ADN repetitiv inactiv genetic, astfel încât nu determină modificări fenotipice şi sunt considerate variante morfologice normale. Cele mai cunoscute tipuri de heteromorfism cromozomial sunt:
• dimensiunea braţului scurt al cromozomului Y
• dimensiunea heterocromatinei centromerice (banda C)
• dimensiunea sateliţilor
• situsurile fragile induse de inhibitori ai acidului folic
9.Principiul tehnicii de clonare in vivo
Clonarea ADN constă în producerea unui număr mare de copii ale unei secvenţe de
ADN pe baza procesului de replicare a ADN. Clonarea se poate efectua in vivo (clonare
celulară), când este utilizat procesul natural de replicare, sau in vitro (clonare acelulară), prin
reacţia de polimerizare în lanţ (PCR).
Clonarea ADN in vivo se realizează în mai multe etape.
1) Obţinerea fragmentelor de ADN
● Fragmentele de ADN care vor fi amplificate şi analizate ulterior pot fi obţinute prin
secţionarea ADN cu ajutorul enzimelor de restricţie.
Enzimele de restricţie (ER) sunt endonucleaze bacteriene care scindează moleculele
ADN (prin hidroliza legăturilor fosfodiester dintre nucleotide) la nivelul unor zone strict
specifice generând fragmente de lungimi variabile, denumite fragmente de restricţie (FR). O
caracteristică esenţială a enzimelor de restricţie o constituie specificitatea acţiunii lor: o ER îşi
exercită activitatea endonucleazică numai asupra unei anumite secvenţe nucleotidice (cu
lungime de câteva perechi de baze), denumită situs de restricţie (SR) sau situs de
recunoaştere şi clivare.
Pentru fiecare ER există în genom numeroase SR, iar distanţa care separă aceste situsuri este foarte diferită. In urma acţiunii unei anumite ER vor rezulta, deci, o multitudine de FR de lungimi variate, ce pot fi separate electroforetic.
Secţiunile pe care le efectuează cele mai multe dintre ER nu sunt situate, de obicei, la
acelaşi nivel pe cele două catene ale moleculei de ADN; ca urmare, pe o porţiune de câteva
nucleotide cape-tele fragmentelor vor fi monocatenare: la unul dintre capete vor fi
desperecheate nucleo-tidele unei catene, iar la celălalt - nucleotidele catenei opuse. Acest mod
de acţiune are o importanţă practică deosebită, deoarece fragmentele ADN generate de o
aceeaşi ER, având capete coezive, pot fi făcute să se sudeze între ele, pe bază de
complementaritate, chiar dacă au origini complet diferite, rezultând o moleculă hibridă de
ADN recombinant.
● O altă metodă de a obţine fragmente de ADN sau gene utilizează ARN mesager,
produsul de transcripţie al genei. Molecula monocatenară de ARNm, extrasă dintr-o celulă
care îl sintetizează în cantităţi mari, serveşte ca matriţă pentru sinteza unei catene de ADN
complementar (ADNc) sub acţiunea enzimei transcriptaza inversă; prin complementaritate,
se sintetizează şi cea de-a doua catenă, obţinându-se astfel o moleculă de ADNc bicatenar
care corespunde exonilor genei.
2) Formarea moleculelor de ADN recombinant
După obţinerea fragmentelor de ADN uman, este necesară multiplicarea fragmentului.
În acest scop, fragmentele sunt inserate în vectori de clonare şi cu ajutorul lor sunt introduse
într-o celulă-gazdă (bacterie etc.), unde se vor multiplica. Unirea a două fragmente de ADN
de origini diferite produce o moleculă de ADN recombinant. Pentru aceasta, moleculele de
ADN din cele două surse sunt secţionate cu aceeaşi ER, producând capete identice, care se
unesc pe bază de complementaritate, iar fragmentele sunt unite cu ajutorul unei ADN-ligaze.
a. Vectorii sunt molecule naturale de ADN utilizate pentru a transporta sevenţele de
ADN de analizat şi care au capacitatea de a se replica independent de genomul gazdei.
Principalele tipuri de vectori utilizaţi sunt plasmidele, bacteriofagii şi cosmidele.
▫ Plasmidele sunt componente ale bacteriilor, făcându-le rezistente la diferite
antibiotice. Sunt alcătuite dintr-o moleculă mică de ADN circular, dublu catenar
extracromozomial, a cărei replicare se produce independent de cromozomul bacterian.
▫ Bacteriofagii sunt virusuri care infectează şi distrug bacteriile, replicându-se de
asemenea, independent şi rapid; sunt alcătuiţi din ADN dublu catenar liniar. În tehnicicle de
clonare cel mai frecvent se utilizează bacteriofagul lambda (λ) care atacă E. coli.
▫ Cosmidele sunt vectori artificiali - hibrizi formaţi dintr-un plasmid şi situs cos al
bacteriofagului λ.
Vectorii în care s-a introdus un fragment de ADN exogen se numesc vectori
recombinanţi.
3) Transformarea şi amplificarea
Moleculele de ADN recombinant sunt transferate în celule-gazdă (cel mai frecvent
bacterii nepatogene modificate) în care vectorii recombinanţi se vor multiplica independent de
cromozomul bacterian, producând mai multe copii identice. Introducerea unui vector într-o
celulă bacteriană se numeşte transformare.
Bacteriile transformate sunt multiplicate. In cazul utilizării vectorilor plasmidici,
celulele bacteriene sunt însămânţate pe o placă de agar, în care se plasează şi o genă de
rezistenţă la antibiotic, precum şi antibioticul faţă de care s-a indus rezistenţa. Bacteriile
transformate devin rezistente şi îşi continuă multiplicarea, fiecare dintre ele formând o colonie
sau clonă (populaţie de celule identice, provenite dintr-o singură celulă). Totalitatea
coloniilor, respectiv a fragmentelor de restricţie clonate, care conţin şi ADN de analizat,
formează o aşa-numită bancă sau bibliotecă de clone ADN (DNA library). In funcţie de
colecţia de FR pe care o conţin, acestea sunt biblioteci de ADNc (care cuprind numai
secvenţele nucleotidice ale genelor active transcripţional) şi biblioteci genomice.
Intrucât clona conţinătoare a FR de interes nu are nici un caracter distinctiv
(bibliotecile sunt „fără catalog”), se procedează la screening-ul sistematic al tuturor coloniilor
sau plăcilor de liză. Secvenţa căutată poate fi identificată direct (prin hibridizare cu sonde
complementare) sau indirect (prin purificarea proteinelor produse de clonele bacteriene şi
recunoaşterea lor cu anticorpi monoclonali).
Amplificarea prin clonare rămâne însă o procedură laborioasă, complicată şi mare
consumatoare de timp.
10. Clonarea ADN in vitro (metoda PCR)
Clonarea ADN constă în producerea unui număr mare de copii ale unei secvenţe de
ADN pe baza procesului de replicare a ADN. Clonarea se poate efectua in vivo (clonare
celulară), când este utilizat procesul natural de replicare, sau in vitro (clonare acelulară), prin
reacţia de polimerizare în lanţ (PCR).
Clonarea ADN prin reacţia polimerizării în lanţ (PCR - polymerase chain reaction)
este o metodă al cărei principiu se bazează pe procesul replicării semiconservative in vitro şi
prin care se realizează amplificarea selectivă şi rapidă a unei secvenţe scurte de ADN sau
ARN (a cărei structură nucleotidică este parţial cunoscută). Procedura este extrem de simplă,
economică şi în întregime automatizată.
Eşantionul ADN, într-o cantitate foarte mică (care poate proveni dintr-o singură
celulă), este introdus într-un tub conţinând următorii reactivi: o ADN - polimerază
termostabilă – Taq (extrasă din bacteria termofilă Thermus aquaticus), cele patru
dezoxiribonucleotide trifosfat şi două oligonucleotide sintetice denumite amorse sau
primeri. Amorsele, a căror secvenţă nucleotidică trebuie să fie complementară cu secvenţele
ADN care flanchează capetele segmentului ce urmează să fie amplificat, constituie punctele la
nivelul cărora se iniţiază activitatea ADN polimerazei. Într-o primă etapă, segmentul de ADN
de amplificat este denaturat termic (la 95°C), rezultând un amestec de fragmente
monocatenare. În al doilea timp, prin răcire uşoară, amorsele se poziţionează şi hibridizează
cu secvenţele complementare (situate la capătul 3’) de pe fiecare catenă. În a treia etapă,
pornind de la amorse, ADN-polimeraza începe să adauge dezoxiribonucleotide în sensul 5’-3’
pe matriţele reprezentate de monocatenele segmentului ţintă. Reîncălzirea mediului determină
iniţierea unei noi reacţii de polimerizare. Procesul se desfăşoară ciclic: la sfârşitul a n cicluri,
în mediul de reacţie vor exista 2n molecule de ADN dublu catenar, copii ale secţiunii ADN
aflată între amorse.
Cantitatea optimă este obţinută după mai puţin de 30 cicluri de reacţie, când în tub vor
exista câte 109 copii ale secvenţei iniţiale. Durata unui ciclu fiind de 5 minute, rezultă că
această cantitate va fi obţinută în aproximativ 3 ore.
Metoda acceptă ADN provenit din cele mai variate surse (celule din frotiuri, pete de
sânge, spermă sau foliculi piloşi etc.). Dezavantajele majore ale metodei sunt necesitatea
cunoaşterii secvenţelor capetelor ADN-ţintă (pentru fabricarea amorselor), cantitatea foarte
mică de produs şi frecvenţa destul de mare a erorilor de împerechere.
Metoda PCR este aplicată şi pentru molecule de ADN complementar: RT-PCR
(reverse transcriptase PCR).
11. Analiza ADN genomic uman prin tehnica Southern blot
Cele câteva sute de mii de fragmente de restricţie care rezultă din digestia genomului
uman cu enzime de restricţie (ER) pot fi separate prin metoda electroforezei în gel.
Moleculele ADN au o încărcătură electrică negativă, migrând astfel către anod, cu o viteză
invers proporţională cu greutatea lor moleculară. Fragmentele de restricţie separate
electroforetic se dispun într-un ansamblu reproductibil de benzi ADN care sunt invizibile în
gelul de agaroză; evidenţierea lor se realizează prin impregnarea gelului cu un colorant
specific pentru ADN (bromura de etidiu) care în lumina ultravioletă devine fluorescent.
Analiza structurii fragmentelor rezultate prin digestie cu ER se realizează prin metoda
marcării radioactive a ADN, cunoscută sub numele de Southern blot. Ea se desfăşoară în
mai multe etape (figura 2.4):
1) fragmentarea ADN genomic extras din celule, prin clivarea cu o enzimă de restricţie
corespunzătoare;
2) separarea fragmentelor de restricţie prin electroforeză, pe baza dimensiunii lor;
3) denaturarea chimică a fragmentelor ADN bicatenare incluse în gel;
4) transferarea prin capilaritate (blotting) a monocatenelor de pe gelul de agaroză pe o
membrană de nailon sau de nitroceluloză; se obţine, astfel, o replică a modelului de benzi din
gelul de agaroză;
5) hibridizarea moleculelor ADN de pe membrană cu o sondă ADN sau ARN marcată
radioactiv, complementară cu secvenţa urmărită; se vor forma complexe dublu catenare
stabile în zonele membranei în care se află secvenţele complementare;
6) detectarea autoradiografică a complexelor dublu catenare (după contactul
membranei cu un film foto).
Prin această tehnică se poate evidenţia prezenţa sau absenţa unui fragment de ADN-
ţintă, obţinut din ADN genomic. Importanţa majoră pentru medicină a analizei Southern
blotting constă în capacitatea ei de a detecta polimorfismele lungimii fragmentelor de
restricţie (restriction fragment length polymorphisms - RFLPs) şi, prin aceasta, de a funcţiona
ca instrument de diagnostic ADN indirect.
Aceeaşi procedură poate fi aplicată şi pentru ARN, purtând denumirea de Northern Blot, iar pentru proteine - Western Blot.
12. Analiza cu sonde oligonucleotidice specifice alelelor (allele specific
oligonucleotides - ASO).
ASO reprezintă o metodă importantă de diagnostic a bolilor monogenice produse de
mutaţii a căror bază moleculară este cunoscută. Metoda utilizează ca sonde două sau mai
multe oligonucleotide sintetice (15-20 pb), dintre care unul corespunde (în sensul
complementarităţii bazelor) secvenţei genice normale, iar celelalte secvenţelor modificate prin
mutaţie.
Metoda ASO este larg utilizată în diagnosticul prenatal al unor afecţiuni produse de
mutaţii punctiforme. Un exemplu de boală genetică al cărei diagnostic poate fi stabilit în
primul trimestru al sarcinii prin analiza ASO este cel al anemiei drepanocitare. Boala are drept
cauză o mutaţie punctiformă interesând codonul 6 – GAG – al genei care codifică lanţurile
β -globinice ale hemoglobinei. In urma mutaţiei, codonul GAG se transformă în GTG,
consecinţa fiind substituirea acidului glutamic cu valina în poziţia 6 a lanţului aminoacidic al
β -globinei. Diagnosticul presupune utilizarea unei sonde complementare cu secvenţa
specifică genei normale (sonda conţine în porţiunea centrală tripleta CTC) şi a unei sonde în a
cărei secvenţă se află tripleta CAC (aceasta va interacţiona specific cu codonul alterat al genei
patologice). Dacă ADN extras din celulele lichidului amniotic hibridizează numai cu sonda
specifică mutaţiei, afectarea fătului este certă; hibridizarea cu ambele sonde relevă starea de
heterozigot, iar reacţia negativă cu sonda pentru gena patologică exclude prezenţa bolii.
13.Hibridizarea in situ
Hibridizarea in situ reprezintă o tehnică în care, după hibridizare cu secvenţele
specifice din moleculele ADN sau ARN, sondele marcate izotopic sau chimic sunt vizualizate
direct pe preparatele celulare sau cromozomiale. Datorită rezoluţiei insuficiente şi perioadei
lungi de timp necesară obţinerii rezultatelor, tehnicile care folosesc probe marcate radioactiv
tind să fie complet abandonate, în locul lor fiind utilizată tehnica denumită FISH
(fluorescence in situ hibridization) sau hibridizare in situ prin marcare fluorescentă, relativ
simplă şi nu foarte costisitoare. Fluorocromii utilizaţi sunt acidul 7-amino-4-metilcumarin-3
acetic (AMCA) (fluorescenţă albastră), fluoresceina (fluorescenţă verde) sau Texas red
(fluorescenţă roşie).
Tehnica FISH este aplicată în citogenetica moleculară pentru:
- analiza cromozomilor metafazici sau a nucleilor interfazici cu sonde ADN;
- „pictarea” cromozomilor (chromosome painting), care detectează cromozomi
singulari sau numai părţi componente (centromer, telomere);
- detectarea întregului genom – de exemplu M-FISH (Multicolor-FISH: 24 culori)
14. Fenomenul de înlănţuire genică (linkage) şi încrucişare cromozomială
(crossing-over)
Fiecare cromozom este alcătuit din mai multe gene nealele, care ocupă fiecare un
locus distinct. Ele au o dispoziţie liniară în cromozom, una după alta. Înlănţuirea fizică a
locilor aflaţi pe acelaşi cromozom se numeşte sintenie.
Genele situate pe acelaşi cromozom au tendinţa de a se transmite grupat (odată cu
cromozomul respectiv) de la părinţi la descendenţi, prin gameţi. Fenomenul în care genele
nealele situate aproape una de alta pe acelaşi cromozom nu segregă în meioză şi au tendinţa
de a se transmite împreună în succesiunea generaţiilor se numeşte înlănţuire genică (linkage)
(fenomenul se referă la loci, nu şi la alele). Genele dintr-o regiune cromozomială transmise
împreună formează un grup de înlănţuire (linkage group) sau haplotip.
Numai genele situate foarte aproape una de alta se transmit totdeauna împreună,
înlănţuite. De exemplu, genele C, D şi E care determină grupul sanguin Rhesus (Rh),
localizate pe cromozomul 1, se transmit înlănţuite.
Genele situate mai la distanţă una de alta pe acelaşi cromozom pot fi separate prin
crossing-over.
În profaza primei diviziuni meiotice, cromozomii omologi se împerechează (sinapsă)
pe întreaga lor lungime, formând unităţi alcătuite din patru cromatide denumite tetrade
(excepţie fac cromozomii sexuali X şi Y, care se alătură prin capetele braţelor scurte). La
locul de contact (chiasmă) dintre cromatidele dispuse central ale unei tetrade (una aparţinând
cromozomului patern, iar cealaltă cromozomului matern) se produc apoi fenomene de
crossing-over, constând în schimburi reciproce (încrucişate) şi egale de gene. Pentru că o genă
trece astfel de pe un cromozom pe omologul său, producând o schimbare a poziţiei genelor
parentale, fenomenul este numit recombinare genetică.
Recombinarea genică intracromozomială produsă prin crossing-over este
întâmplătoare şi nu poate fi prevăzută. Probabilitatea de producere a crossing-over-ului între
două gene este direct proporţională cu distanţa fizică dintre ele: cu cât genele sunt mai
apropiate, şansa de recombinare este mai mică şi invers.
Distanţa dintre două gene de pe acelaşi cromozom se exprimă în centiMorgan (1cM =
1Mb = 106 pb) sau procent de recombinare.
15. Cadrul de citire
Cadrul de citire, aflat în regiunea centrală a genei, reprezintă regiunea transcrisă, sub
acţiunea ARN-polimerazei II, în ARN mesager precursor (ARN premesager). El este alcătuit
din secvenţe codante numite exoni şi secvenţe necodante numite introni.
Exonii sunt secvenţele codante ale genei, care codifică anumite regiuni ale proteinei
numite domenii. Regiunea centrală a genelor începe şi se termină cu exoni, ceea ce înseamnă
că orice genă are n exoni şi n-1 introni. Numărul exonilor variază de la o genă la alta, fiind
cuprins între 2 şi câteva zeci. Există gene mici cu un singur exon - genele ADN mitocondrial,
genele histonelor, genele interferonilor, gena SRY, gena receptorului angiotensinei II, etc..
Lungimea exonilor variază în limte largi (lungimea medie este de 150 pb) (de exemplu genele
insulinei – 150 pb, gena distrofinei – 180 pb).
Intronii sunt secvenţele care, în general, nu codifică nici un produs specific şi care
sunt transcrise iniţial în ARNm precursor, dar nu se regăsesc în ARNm matur. Numărul
intronilor variază de la 2 la genele insulinei, la 79 la genele distrofinei. Lungimea intronilor
este variabilă (între câteva sute şi câteva mii de pb), de obicei mult mai mare ca a exonilor.
Majoritatea intronilor încep cu dinucleotidul 5'GT (situs donor) şi se termină cu
dinucleotidul 3'AG (situs acceptor). Aceste secvenţe dinucleotidice au rolul de semnale
pentru decuparea corectă a intronilor în timpul procesului de matisare (splicing).
Rolul intronilor nu este încă bine cunoscut. Iniţial se considera că funcţia intronilor ar
consta în separarea exonilor, dar mai recent se acceptă că ei au rol în autoclivarea ARN,
respectiv în reglarea expresiei genelor, iar în unele cazuri au chiar funcţii codificatoare.
Cadrul de citire al genei începe cu situsul de iniţiere (start) al transcrierii. Situsul de
iniţiere este urmat de o regiune netradusă numită 5'UTR (untranslated region), care conţine o
secvenţă consens (prezentă la toate genele) şi codonul start ATG (locul de iniţiere a translaţiei,
corespunzător primului aminoacid din lanţul polipeptidic). Urmează primul exon.
După ultimul exon din cadrul de citire există o secvenţă netradusă 3'UTR, care începe
cu unul dintre codonii stop (TGA, TAG, TAA); codonii stop reprezintă semnalul de oprire a
translaţiei. Regiunea 3'UTR se continuă cu secvenţa AATAAA care reprezintă situsul de
terminare al transcripţiei. La circa 20 de nucleotide în aval de situsul terminator se află
situsul de poliadenilare, denumit astfel, deoarece la acest nivel la ARNm se adaugă circa
200 de nucleotide cu adenozină; tot la acest nivel se produce şi desprinderea ARN-polimerazi
şi eliberarea moleculei ARN sintetizate.
16. Secvenţele de reglare a genei
Secvenţele de reglare a genelor sunt secvenţe netranscrise, dispuse de o parte şi de alta
a cadrului de citire. Majoritatea se află la capătul 5’ al genei.
a) Promotorul reprezintă o succesiune de secvenţe situată în amonte de cadrul de
citire, întinse pe o distanţă de circa 150 pb faţă de situsului de iniţiere a transcrierii.
Promotorul conţine mai multe secvenţe nucleotidice scurte, pe care se fixează nişte
proteine reglatoare numite factori de transcripţie (TF II – transcription factors). Factorii de
transcripţie au rolul a lega ARN-polimeraza II astfel ca transcripţia să înceapă exact la situsul
de iniţiere (cu primul nucleotid) şi de a activa enzima, deoarece ARN-polimeraza nu poate
recunoaşte direct promotorul şi nu poate iniţia singură transcripţia.
Promotorul cuprinde mai multe secvenţe:
(1) Boxa (cutia) TATA (Hogness) este secvenţa TATAAA, situată la 25-35 pb în
amonte faţă de situsul de iniţiere a transcrieii.
Boxa TATA reprezintă locul la care se fixează ARN-polimeraza II prin intermediul
factorului de transcripţie TFIID. Această secvenţă este necesară pentru iniţierea corectă a
procesului de transcriere (în punctul de start) şi asigură expresia genei la un nivel bazal.
Mutaţia secvenţei permite iniţierea transcripţiei, dar deplasează punctul de start faţă de
normal.
Boxa TATA este prezentă la majoritatea genelor specifice unui anumit tip de ţesut
(specific tisulare). La genele comune („housekeeping genes”) este prezentă, în locul boxei
TATA, secvenţa GC (insulele CG).
(2) Boxa CAAT (secvenţa GGCCAATCT) şi boxa GC (secvenţa GGGCGG) sunt
secvenţe situate în amonte de boxa TATA, la circa 70-80 pb, respectiv 90 pb faţă de situsul de
iniţiere, de care se fixează alţi factori de transcripţie şi având rolul de a creşte eficienţa
transcrierii.
În regiunea proximală a promotorului se mai află o serie de secvenţe ADN care, după
fixarea anumitor FT, stimulează intens sau, dimpotrivă, blochează transcripţia. Ele determină
astfel specificitatea expresiei unei gene în funcţie de ţesut şi de stadiul dezvoltării:
(3) Secvenţele octamerice (ATTTGCAT) sunt secvenţe care determină expresia
specifică a anumitor gene în funcţie de tipul de celulă sau de stadiul dezvoltării ontogenetice.
(4) Secvenţele (elementele) de răspuns (response elements) sunt secvenţe care
determină transcripţia temporară a anumitor gene în funcţie de anumite semnale extracelulare
(temperatură, concentraţia unor ioni, substanţe nutritive, hormoni, morfogeni); aceste semnale
activează anumiţi FT care se fixează pe secvenţele de răspuns.
b) Intensificatorii (activatorii) (enhancers) sunt secvenţe ADN care cresc nivelul
bazal al transcripţiei, amplificând activitatea promotorului (de zeci-mii ce ori). Activatorii
sunt situaţi în amonte faţă de promotor, adesea la sute sau mii de pb faţă de situsul de iniţiere.
O serie de intensificatori funcţionează predominant sau exclusiv în anumite ţesuturi, ceea ce
sugerează rolul lor în diferenţierea celulară.
c) Atenuatorii (silencers) sunt secvenţe ADN situate, de asemenea, în amonte de
promotor şi care reduc sau uneori chiar reprimă (blochează) transcripţia unor gene.
17. ELEMENTE GENETICE MOBILE
În general, genele au o poziţie fixă în genom. Unele secvenţe de ADN se pot deplasa
uneori dintr-o poziţie cromozomială în alta, fenomen numit transpoziţie; secvenţele
respective se numesc elemente transpozabile sau transpozoni.
În funcţie de mecanismele realizare a transpoziţiei, elementele transpozabile se împart
în transpozoni şi retrotranspozoni.
(1) Transpozonii sunt elemente care se deplasează ca atare, adică sub forma de
secvenţe ADN. Transpozonii conţin în structura lor şi genele care codifică enzimele
(transpozaze) necesare exciziei şi inserţiei lor. Elementul transpozabil de origine îşi păstrează
de cele mai multe ori poziţia neschimbată şi doar copiile acestuia, realizate prin replicare, se
deplasează şi se integrează în altă poziţie din genom. La om, fenomenul de transpoziţie este
încă discutabil.
(2) Retrotranspozonii sunt elemente transpozabile a căror migrare se realizează prin
intermediul transcriptelor ARN. Denumirea provine de la faptul că mecanismele transpoziţiei
sunt asemănătoare celor prin care se realizează deplasarea retrovirusurilor. ARN este copiat,
sub acţiunea reverstranscriptazei, într-o moleculă de ADN care va fi integrată, la întâmplare,
într-o altă regiune a genomului.
Retrotranspozonii au originea în elemente retrovirale, care se integrează în genomul
celulelor germinale şi se transmit în stare latentă în succesiunea generaţiilor.
Retrotranspozonii reprezintă marea majoritate a elementelor transpozabile la om,
ocupă circa 10% din genom şi sunt reprezentate de două familii - LINEs şi SINEs, diferite
prin lungimea şi originea lor: LINEs sunt produşii transcripţiei efectuată de ARN-polimeraza
II, în timp ce SINEs derivă din transcriptele primare ale ARN-polimerazei III.
Existenţa elementelor genetice mobile demonstrează plasticitatea genomului.
18.TRANSCRIPŢIA
Transcripţia este procesul prin care informaţia genetică a unei gene este copiată într-o
moleculă de ARN complementară şi antiparalelă, numită ARN mesager (ARNm). Acest
proces are loc în nucleu.
Acidul ribonucleic (ARN) prezintă o serie de particularităţi structurale.
ARN este alcătuit din ribonucleotide. Fiecare ribonucleotid este format din riboză (o pentoză care prezintă câte o grupare OH în poziţiile 2’ şi 3’), o bază azotată (adenină – A, guanină – G, citozină – C sau uracil – U) şi un grup fosfat. Prin polimerizarea în sensul 5’→3’ a ribonucleotidelor rezultă o monocatenă, de obicei scurtă, de ARN.
Se deosebesc mai multe tipuri de ARN, cu funcţii diferite:
- ARNm sau mesager este codant, deoarece prin translaţie determină sinteza unui
polipeptid;
ARNr sau ribozomal participă la formarea ribozomilor;
- ARNt sau de transfer are rolul de a transporta aminoacizii la ribozomi;
- ARNsn (mic nuclear) şi ARNsno (mic nucleolar) intervin în procesarea intronilor,
respectiv a ARNr.
În cele ce urmează, este prezentată sinteza ARNm catalizată de ARN-polimeraza II.
Elemente implicate în transcripţie. Pentru a se realiza sinteza unui ARN mesager sunt necesare:
(1) Ribonucleotide activate. Prin ruperea legăturilor fosfat macroergice dintre fosfaţii
α şi β ai ribonucleozid-trifosfaţilor (adenozintrifosfat - ATP, guanozintrifosfat - GTP,
citidintrifosfat - CTP şi uridintrifosfat - UTP) se eliberează ribonucleotidele (ribonucleozid-
monofosfaţii) şi energia necesară polimerizării acestora.
(2) Matriţa este reprezentată de o singură catenă de ADN. Numai una dintre cele două
catene ale ADN (3’→5’) este transcrisă şi serveşte ca matriţă pentru sinteza moleculei
complementare şi antiparalele de ARNm (5’→3’); catena transcrisă este denumită şi catenă
antisens. Catena ADN netranscrisă, ale cărei secvenţe nucleotidice sunt identice cu cele ale
ARNm, este numită şi catenă sens . Cele două catene ale ADN se vor separa astfel temporar
şi pe lungimi scurte, pentru ca una din ele să servească drept matriţă pentru ribonucleotidele
complementare. Alegerea catenei transcrise depinde în mare parte de localizarea şi orientarea
promotorului.
(3) Enzima care catalizează tanscrierea ADN genic în ARNm este ARN-polimeraza II (transcriptază, ARN-polimeraza ADN-dependentă).
Etapele procesului de transcripţie
Pentru realizarea transcrierii, este necesară relaxarea (decondensarea) cromatinei, acetilarea histonelor şi intervenţia elementelor reglatoare din regiunea 5’ a genei (asupra cărora acţionează factorii de transripţie).
Procesul transcripţiei se desfăşoară în două mari etape:
- formarea ARN mesager precursor (pre-ARNm sau transcript primar);
- procesarea (maturarea) ARN mesager precursor.
19. Formarea ARNm precursor
Formarea ARN mesager precursor (ARN premesager, transcript primar, ARN heterogen nuclear) începe prin decondensarea zonei din ADN care conţine gena sau genele ce vor fi transcrise. Acest proces intervin factori de transcripţie de clasa I (TF I), acetilarea histonelor şi deplasarea histonei H1.
ARNm precursor se formează în trei etape:
iniţiere
elongare
terminare.
(1) Iniţierea transcripţiei. Deoarece ARN-polimeraza nu poate recunoaşte direct
promotorul şi nu poate iniţia singură transcripţia, sunt necesari o serie de factori de
transcripţie de clasă II (TFII), care se fixează pe secvenţele promotorului, dirijând şi
activând astfel enzima. Primul factor de transcripţie care se leagă de promotor - TFIID - are o
subunitate numită proteina de legare a TATA (TATA binding protein–TBP) care recunoaşte şi
se fixează de boxa TATA. TFIID atrage după sine şi alţi FT (în ordinea TFIIA, TFIIB, TFIIF,
TFIIE şi TFIIH), care permit fixarea ARN-polimerazei în regiunea promotor şi activarea
enzimei (fig. 4.2). Transcripţia începe (este iniţiată) la nivelul situsului de iniţiere a
transcripţiei; primul nucleotid transcris este numerotat convenţional „+1”.
(2) Transcripţia propriu-zisă (elongarea). După fixarea ARN-polimerazei pe
regiunea promotor, cele două catene ale ADN sunt separate prin acţiunea TFIIF, care are
acţiune de helicază, eliberându-se catena antisens, 3’→5’; catena antisens serveşte ca matriţă
pentru ataşarea complementară, în sensul 5’- 3’, a ribonucleotidelor activate (fig. 4.3); prin
polimerizarea ribonucleotidelor sub acţiunea ARN-polimerazei se formează ARNpre-m.
ARNm se desprinde treptat de pe catena transcrisă, iar cele două catene refac treptat dublul
helix.
(3) Terminarea transcripţiei se produce atunci când ARN-polimeraza întâlneşte
situsul de terminare a transcripţiei, unde pe catena antisens se află secvenţa AATAAA. La
15-30 pb în aval de această secvenţă, în dreptul situsului de poliadenilare, se va produce
secţionarea (sub acţiunea unei nucleaze) a ARNm. ARN-polimeraza şi factorii de transcripţie
se detaşează de matriţa ADN şi se eliberează molecula de ARNm precursor sau transcriptul
primar care conţine atât exonii, cât şi intronii genei copiate.
O genă poate fi transcrisă simultan de mai multe molecule de ARN-polimerază,
formându-se astfel mai multe copii de ARNm ce conţin aceeaşi informaţie genetică.
20 Procesarea (maturarea) ARNm precursor
Maturarea ARNm precursor are loc la nivel nuclear şi se realizează prin două procese:
(1) inserţia de secvenţe nucleotidice la extremităţile moleculei şi (2) matisarea ARN precursor
(fig. 4.4).
(1) Inserţia de secvenţe nucleotidice la cele două capete ale moleculei de ARNm
precursor facilitează creşterea stabilităţii moleculei, transportul spre citoplasmă, recunoaşterea
şi fixarea sa la subunitatea mică (40S) a ribozomilor.
La primul nucleotid al capătului 5’ al transcriptului primar se adaugă o moleculă de 7-
metil-guanozină, formând o structură denumită bonetă (cap).
La capătul 3’ se adaugă între 50-200 nucleotide cu adenină, formând o coadă
poliadenilică.
(2) Matisarea ARN precursor.
ARNm precursor conţine secvenţele compementare întregului cadru de citire, deci atât
exonii cât şi intronii. Matisarea (splicing) constă în decuparea şi eliminarea intronilor,
urmată de reunirea (legarea „cap la cap”) a exonilor, cu formarea ARNm matur.
Atât decuparea, cât şi reunirea sunt procese care trebuie să fie foarte precise şi care
depind de existenţa secvenţelor nucleotidice-semnal situate la limita dintre introni şi exoni
(situsuri de clivare) - 5’GU (situs donor) şi 3’AG (situs acceptor).
Matisarea (splicing) implică următoarele procese: (1) clivarea joncţiunii 5’GU; (2)
ataşarea nucleotidului G la nucleotidul A al situsului de legătură şi formarea unei bucle; (3)
secţionarea intronului la joncţiunea 3’AG; (4) îndepărtarea intronului şi sudarea secvenţelor
exonice .
Procesul de matisare este mediat de un complex format din ARN nuclear mic
(ARNsn) şi proteine numit spliceosome sau particule mici ribonucleoproteice (small
ribonucleotide particles - snurps). În cadrul procesului de matisare exonii sunt sudaţi, de cele
mai multe ori, în ordinea în care aceştia sunt dispuşi în interiorul genelor - matisare
constitutivă (constitutive splicing) (vezi Reglarea expresiei genelor).
21. TRANSLAŢIA
Translaţia (traducerea) reprezintă a doua etapă a expresiei genice şi constă în
decodificarea informaţiei genetice din ARNm care permite aranjarea specifică a
aminoacizilor şi polimerizarea lor într-un lanţ polipeptidic.
Procesul de translaţie necesită un „dicţionar” reprezentat de codul genetic şi un aparat
de translaţie, care cuprinde un „traducător”, reprezentat de moleculele de ARN de transfer
(ARNt), ribozomi, enzime şi cofactori proteici.
Codul genetic
Conform dogmei centrale a geneticii moleculare informaţia din structura unei gene,
stocată sub forma unei anumite secvenţe a celor patru tipuri de nucleotide (A, T, G, C) este
copiată (transcrisă) complementar (U, A, C, G) în ARNm şi apoi tradusă într-o anumită
secvenţă de aminoacizi, care vor forma un lanţ polipeptidic. Translaţia este efectuată cu
ajutorul codului genetic.
Codul genetic reprezintă relaţia de corespondenţă între o anumită secvenţă de trei
nucleotide numită codon şi un anumit aminoacid. Cele patru litere (nucleotide) pot forma
cuvinte alcătuie din trei litere, iar gena este un „mesaj coerent” format dintr-o înşiruire de
codoni (tabel 4.1).
Caracteristicile codului genetic.
(1) “Cuvintele” codului sunt reprezentate de grupuri de câte trei nucleotide, numite
codoni. Codul genetic este triplet.
Combinaţiile celor patru baze luate câte trei (43) realizează 64 de triplete de baze sau
codoni, dintre care 61 codifică un aminoacid (codoni sens).
(2) Codul genetic are un codon iniţiator (start) (AUG) şi trei codoni stop (UAA,
UAG, UGA) (codoni nonsens).
(3) Deoarece există 61 de codoni sens şi numai 20 de aminoacizi, înseamnă că unii
aminoacizi pot fi specificaţi de mai mulţi codoni; codonii diferiţi ce codifică acelaşi
aminoacid se numesc codoni sinonimi (diferiţi, de obicei, prin a treia bază), iar codul genetic
este degenerat (redundant). Cu excepţia metioninei şi a triptofanului, codificaţi fiecare de un
singur codon, ceilalţi 18 aminoacizi sunt codificaţi de doi sau mai mulţi codoni.
Caracterul degenerat al codului genetic constituie un avantaj pentru celulă, oferind
protecţie împotriva efectelor mutaţiilor (mutaţiile genice care produc codoni sinonimi nu
afectează structura proteinei codificate).
(4) Codul genetic este nesuperpozabil: codonii vecini nu au nici un nucleotid comun.
(5) Codul genetic prezintă continuitate (fără pauze): între codonii adiacenţi nu există
nucleotide cu rol de „virgulă”.
(6) Codul genetic este lipsit de ambiguitate: un codon specifică întotdeauna un
aminoacid, totdeauna acelaşi.
(7) Codul genetic este universal, acelaşi la toate organismele (bacterii, plante, animale
şi om). Cu toate acestea, codul genetic mitocondrial are câteva mici diferenţe faţă de cel
nuclear.
22. Aparatul de translaţie
Aparatul de translaţie este alcătuit din ARNm, ARNt, ribozomi, aminoacizi, factori de
iniţiere, factori de elongare, enzime, surse de energie (GTP, etc)
a) ARN de transfer (ARNt) transportă aminoacizii din citoplasmă la ribozomi, sediul
sintezei proteice, unde îi poziţionează în ordinea dictată de codonii din ARNm; ARNt are deci
rolul de „translator”.
ARNt este un poliribonucleo-tid monocatenar de dimensiuni mici (75-100 nucleotide), cu structură secundară „în trifoi”: prezintă trei regiuni scurte, dublu catenare numite tulpini, care se termină cu bucle monocatenare (fig. 4.6), structură care este identică la toate tipurile de ARN. ARNt conţine două secvenţe importante: (1) secvenţa CCA de la capătul 3’OH de care se leagă aminoacidul cu ajutorul enzimei aminoacil-ARNt-sintetaza; (2) anti-codonul, o secvenţă de trei nucleotide situată în bucla opusă capătului 3’; anticodonul recunoaşte, prin complementaritate, codonul din ARNm corespunzător aminoacidului.
(b) Ribozomii sunt organite citoplasmatice în care are loc asamblarea aminoacizilor în
proteine pe baza informaţiei din ARNm. Sunt alcătuiţi din două subunităţi deosebite prin
constanta de sedimentare (S). În perioada în care nu sunt implicate în sinteză proteică, cele
două subunităţi sunt disociate şi libere în citoplasmă; ele se asociază la începutul translaţiei
formând ribozomul activ. Fiecare subunitate este alcătuită din ARN ribozomal (ARNr) şi
proteine. Subunitatea mică (40S) prezintă un situs de legare a capătului 5’ a ARNm.
Subunitatea mare (60S) prezintă două situsuri învecinate: situsul A (aminoacil) şi situsul P
(peptidil) unde se fixează moleculele de ARNt cuplate cu aminoacizi (fig. 4.7).
(c) Enzimele implicate în procesul translaţiei sunt aminoacil-ARNt-sintetaza şi
peptidil-transferaza. Aminoacil-ARNt-sintetazele sunt 20 de enzime care recunosc şi leagă
fiecare atât un aminoacid, cât şi ARNt corespunzător. Peptidil-transferaza cata-lizează
formarea de legături peptidice între aminoacizi.
(d) Cofactorii proteici, reprezentaţi de factorii de iniţiere (IF), factorii de elongaţie
(EF) şi factorul de terminare, intervin în diferite etape ale translaţiei.
23. Procesul de translaţie
Translaţia se desfăşoară în trei faze succesive: iniţierea, elongarea şi terminarea
translaţiei.
(1) Iniţierea translaţiei este etapa în care primul aminoacid al proteinei (de la capătul
NH2-terminal) este poziţionat în dreptul codonului start AUG din ARNm (ce corespunde
metioninei) şi sunt asamblate cele două subunităţi.
Iniţial, ARNm se fixează cu „boneta” (cap) şi secvenţa 5’-AUG-3’ pe subunitatea
mică (40S) a ribozomului; apoi ARNm şi primul ARNt „încărcat” cu primul aminoacid
metionina (ARNt iniţiator) formează complexul de iniţiere; anticodonul ARNt-1 este în
contact cu codonul AUG al ARNm. Urmează fixarea subunităţii mari (60S), iar ribozomul
devine activ. ARNt-iniţiator ocupă situsul P al subunităţii mari, situsul A fiind liber (fig. 4.8).
(2) Elongarea este etapa în cursul căreia se formează legături peptidice între
aminoacizii aranjaţi pe baza ordinii codonilor din ARNm.
După pozionarea ARNt iniţiator în situsul P al ribozomului, pe situsul A liber se
plasează al doilea ARNt încărcat cu aminoacidul codificat de al doilea codon din ARNm. Sub
acţiunea peptidil-transferazei, se formează o legătură peptidică între primii doi aminoacizi;
rezultă astfel un dipeptid care este legat la cel de-al doilea ARNt. Apoi, sub acţiunea unui
factor de elongare, GTP şi a unei translocaze, ribozomul se deplasează cu trei nucleotide în
lungul ARNm, în direcţia 5’→3’. Astfel, ARNt iniţiator părăseşte situsul P, care va fi ocupat
de cel de-al doilea ARNt ce conţine dipeptidul. În situsul A eliberat se fixează a treilea ARNt
cu aminoacidul corespunzător, iar acest al treilea aminoacid se leagă de dipeptid (fig. 4.9).
Cele trei faze – ataşarea aminoacid-ARNt la ribozom, formarea legăturii peptidice şi
translocarea ribozomului – se repetă ciclic, determinând creşterea lanţului polipeptidic.
Pe măsură ce un ribozom avansează în lungul moleculei de ARNm, şi alţi ribozomi
pot începe citirea moleculei, formându-se astfel sute sau mii de polipeptide identice
(amplificare).
(3) Terminarea traducerii are loc în momentul când în situsul A ajunge un codon stop
(UAA, UAG sau UGA) (fig. 4.10). Deoarece nu există un ARNt corespunzător codonilor
stop, pe situsul A se ataşează factorii de terminare care leagă o moleculă de apă la nivelul
peptidului. Polipeptidul eliberat astfel din ribozom va suferi o serie de modificări şi va
dobândi forma tridimensională specifică.
24. PROCESAREA POSTTRANSLAŢIONALĂ A PROTEINELOR
(1) Fiecare proteină sintetizată va funcţiona într-un anumit compartiment al celulei sau
în spaţiul extracelular. Astfel proteinele sunt dirijate (targeting) spre o anumită destinaţie cu
ajutorul unor secvenţe semnal, prezente în structura acestora .
Într-o primă etapă sunt separate proteinele destinate celulei de cele care vor fi
eliminate la exteriorul acesteia. Astfel, proteinele care urmează a fi excretate prezintă la
capătul N-terminal o secvenţă de 10-30 de aminoacizi denumită peptid-semnal (signal
peptide), absent la proteinele destinate celulei.
În momentul în care secvenţa semnal devine vizibilă la suprafaţa ribozomului, de ea se
leagă o particulă de recunoaştere a semnalului (SRP-signal recognition particle), care
opreşte procesul de translaţie (SRP este o particulă ribonucleoproteică, alcătuită din şase
proteine diferite şi ARN 7S). Complexul ribozom-peptid semnal-SRP recunoaşte şi se fixează
de un receptor al particulei de recunoaştere a semnalului (docking protein sau signal
recognition particle receptor) aflat pe faţa citosolică a membranei reticulului endoplasmic
(RE). Odată fixat la RE, translaţia se reia, iar polipeptidul traversează membrana RE printr-un
canal de translocare (translocon); ajuns în lumenul RE, peptidul-semnal se desprinde de
proteină sub acţiune enzimatică (signal peptidase).
Mecanismul dirijării este asemănător pentru proteinele destinate nucleului,
complexului Golgi sau mitocondriilor.
Proteinele destinate lizozomilor – proteaze – conţin o secvenţă aminoacidică ce
determină ataşarea posttrans-laţională de manoză-6-fosfat.
(2) Pe măsura sintezei unui polipeptid, acesta se pliază în anumite regiuni realizând
structuri secundare (α-helix sau β-pliere) prin interacţiuni între diferiţi aminoacizi. Această
pliere este posibilă numai în prezenţa unor proteine numite chaperones. Astfel, la sfârşitul
sintezei, polipeptidul are o configuraţie tridimensională specifică funcţiei sale.
Polipeptidele suferă, de asemenea, diferite modificări permanente sau reversibile, care
fac proteina să devină activă.
Fosforilarea serinei (kinaze), acetilarea lizinei (histone) sunt exemple de modificări
chimice reversibile.
Modificările permanente sunt reprezentate de:
a) Clivarea proteolitică a lanţului polipeptidic
După sinteză are loc frecvent clivarea şi îndepărtarea metioninei iniţiale sau, la unele
proteine, a peptidului semnal de la extremitatea NH2.
Numeroase proteine sunt sintetizate sub formă de precursori inactivi (pro-hormoni,
pro-enzime); aceşti precursori sunt clivaţi proteolitic, rezultând proteina matură activă. De
exemplu, în cazul insulinei, din produsul genic rezultă mai multe lanţuri polipeptidice.
b) Glicozilarea are loc în RE sau în complexul Golgi în cazul glicoproteinelor
secretate.
c) Hidroxilarea unor aminoacizi, de exemplu a prolinei şi lizinei, este întâlnită în
cazul proteinelor ţesutului conjunctiv - colagen şi elastină (asigură integritatea structurală);
hidroxi-prolina este prezentă în structura acetilcolinesterazei şi a complementului.
e) Adăugarea de lipide caracterizează proteinele membranei celulare. Cele mai
frecvente sunt acilările (ataşarea de acizi graşi) şi prenilările. Dintre acizii graşi, cel mai
frecvent se adaugă acidul N-miristic la nivelul glicinei amino-terminale.
Proteinele pot fi alcătuite din unul sau mai multe polipeptide, de exemplu
hemoglobina, fibra de colagen, fiecare dintre ele fiind supusă modificărilor postranslaţionale.
25. Reglarea epigenetică (pretranscripţională) a expresiei genelor
Acest tip de reglare are ca scop expresia genelor în anumite organe, ţesuturi, tipuri de
celule sau celule individuale (deci organizarea lor spaţială). Pentru aceasta în celulele
embrionare diferenţiate sunt selectate anumite gene, care se vor exprima şi la descendenţii lor.
Aceste fenomene presupun modificarea structurii cromatinei, realizată în principal prin
mecanisme epigenetice.
În nucleu, ADN formează cu histonele structuri cu diferite grade de compactare –
cromatina. Pentru ca o genă să poată fi transcrisă, factorii reglatori trebuie să aibă acces la
promotorul genei. Aceasta necesită o modificare a structurii cromatinei, mai ales a
eucromatinei, şi anume modificări ale histonelor şi metilarea ADN. Acestea sunt reversibile şi
sunt transmisibile ereditar.
a) Modificările histonelor au drept consecinţă modificarea cromatinei. De exemplu,
metilarea lizinei 4 din structura histonei H3 este asociată cu activarea expresiei genelor, în
timp ce metilarea lizinei 9 a aceleiaşi histone diminuă expresia lor. Acetilarea histonelor este
asociată cu relaxarea cromatinei, deci cu activarea transcripţiei genelor.
Cromatina inactivă (heterocromatina) este puternic condensată ca urmare a fixării
strânse a histonei H1. Cromatina activă (eucromatina) este mai relaxată datorită acetilării
histonelor din structura nucleozomului.
b) Metilarea ADN este datorată enzimei ADN-metiltransferaza, care introduce o
grupare metil în poziţia 5’ a citozinei secvenţelor CG şi GC, localizate în promotorul
majorităţii genelor. Metilarea ADN reprezintă cel mai important mecanism de represie a
transcripţiei.
Imediat după fecundare sunt activate numeroase gene prin demetilarea ambelor
genomuri parentale, cromatina se relaxează şi sunt activate astfel genele necesare dezvoltării
embrionare precoce. Pe măsură ce are loc diferenţierea celulară, unele dintre aceste gene vor
fi inactivate selectiv.
Metilarea ADN este responsabilă şi pentru fenomenul de amprentare genomică, care
constă în exprimarea diferenţiată a unei gene în funcţie de originea, maternă sau paternă, a
acesteia.
c) Se consideră că trecerea temporară de la configuraţia B la forma Z a ADN unor
gene face ca acestea să fie mai accesibile la factorii de transcripţie.
26. Reglarea transcripţională
Etapa principală a reglării expresiei genice are loc în toate celulele la nivelul iniţierii
transcripţiei, mai precis la reglarea activităţii ARN-polimerazei II, enzima care transcrie
genele care codifică proteine. Această reglare necesită interacţiunea proteinelor trans-
reglatoare (factorii de transcripţie) cu secvenţe specifice, cis-reglatoare, de ADN. Ca rezultat
al acestei interacţiuni, gene specifice sunt transcrise într-un anumit moment.
Secvenţele cis-reglatoare sunt secvenţe scurte de ADN la care se fixează factori
specifici de transcripţie; în acest fel este gena este recunoscută de către ARN-polimerază şi
este reglată specificitatea şi intensitatea transcripţiei în funcţie de necesităţile celulare.
Unele dintre aceste secvenţe au localizare precisă, la nivelul promotorului genei
(TATA, CAAT, GC). Alte secvenţe, situate în amonte, conferă genelor specificitate tisulară.
Secvenţele care reglează intensitatea transcripţiei (intensificatori, atenuatori) au localizare
variabilă.
În urma fixării factorilor de transcripţie pe aceste secvenţe, cromatina se
decondensează, ceea ce permite ataşarea ARN-polimerazei lângă situsul de iniţiere şi
declanşarea transcrierii.
Factorii de transcripţie
Factorii de transcripţie (transcription factors) (FT) sunt proteine trans-reglatoare care
recunosc şi se leagă de secvenţele de reglare (cis) ale ADN. Pentru transcrierea unei gene
umane este necesară interacţiunea mai multor FT (se cunosc sute de FT).
Toţi factorii de transcripţie conţin două domenii: un domeniu de activare (care
activează transcrierea) şi un domeniu de fixare la ADN; domeniul de fixare are o structură
particulară de aminoacizi ce formează un motiv structural; în funcţie de aceasta, se descriu
mai multe tipuri de FT:
• Proteine helix-buclă-helix (helix-loop-helix) la care domeniul de fixare este format
din două α-helixuri separate printr-o buclă scurtă ; acest model structural este prezent la FT
care stimulează sinteza de imunoglobuline.
• Proteine cu degete de zinc (zinc finger), în care aminoacizii se dispun în spaţiu sub
forma unor degete de mănuşă, la baza cărora se fixează un ion de zinc (Zn2+) (cel mai frecvent
de cisteină sau histidină) (fig. 4.11); acestea se întâlnesc în structura FT ai promotorului
genelor menajere
• Proteine cu fermoar de leucine (leucine zipper) sunt proteine dimerice; fiecare
monomer, α-helicoidal, conţine câte o leucină la fiecare şapte aminoacizi (fig. 4.13). Cele
două helixuri interacţionează strâns (ca un fermoar), mai ales prin legături între leucine. Acest
tip de FT se găsesc la unele protooncogene.
Deoarece aceste secvenţe sunt situate adesea la distanţe foarte mari, în amonte sau în
aval de situsul de iniţiere, se presupune că activatorul fixat pe secvenţa intensificatoare
interacţionează cu o componentă a complexului bazal de transcripţie, formând o buclă de
ADN care apropie cele două secvenţe.
Factorii de transcripţie sunt codificaţi de aşa-numitele gene reglatoare (master genes
sau selector genes), situate aproape sau la distanţă mare (40.000 pb) de genele pe care le
controlează.
Promotori alternativi
Unele gene umane au doi sau mai mulţi promotori. Prin folosirea lor alternativă
rezultă diferite izoforme ale unei proteine, cu proprietăţi diferite. Alegerea promotorilor nu se
face la întâmplare, ci prin acţiunea unor factori trans-reglatori, dintre care unii specific
tisulari. Selectarea promotorilor are loc, de exemplu, în cazul genei distrofinei, care are cel
puţin opt promotori. Patru promotori sunt situaţi în regiunea 5’ şi sunt specifici pentru
cortexul cerebral, cerebel, muşchi, limfocite; datorită folosirii unui prim exon diferit, produc
patru izoforme de distrofină, diferite prin capătul N-terminal. Ceilalţi patru promotori sunt
intragenici, în structura cadrului de citire; atunci când transcripţia începe la nivelul acestor
promotori sunt folosiţi numai o parte din exoni, rezultând izoforme mici de distrofină prezente
în retină, celulele Schwann, rinichi.
27. Reglarea postranscripţională
După transcripţie, reglarea expresiei genelor poate consta într-o modificarea calitativă
sau cantitativă a ARNm.
(1) În procesul de matisare exonii sunt reuniţi, de cele mai multe ori, în ordinea în care
sunt dispuşi în gene - matisare constitutivă (constitutive splicing)
La numeroase gene umane, din ARNm precursor sunt eliminaţi atât intronii, cât şi o
parte din exoni; moleculele de ARN matur conţin doar anumiţi exoni care păstrează ordinea în
care sunt dispuşi în genă. Prin acest proces de matisare alternativă (alternative splicing),
dintr-un transcript primar se formează molecule diferite de ARNm matur. În felul acesta o
genă poate determina sinteza mai multor proteine diferite.
Uneori, aceste proteine sunt izoforme, având funcţii similare. Alteori se produc
proteine complet diferite ca structură şi funcţie; de exemplu, gena calcitoninei produce în
celulele C din glanda tiroidă calcitonina (hormon cu rol în reglarea metabolismului fosfo-
calcic), iar în hipotalamus un peptid înrudit cu calcitonina (calcitonin-related peptide) (cu
funcţii neuromodulatoare şi trofice).
(2) Amestecarea exonilor (exon shuffling) reprezintă un alt proces prin care, din
aceeaşi genă, se obţin proteine cu structuri şi funcţii diferite: ARNm matur conţine toţi exonii,
dar într-o ordine diferită faţă de genă;
(3) Editarea ARN (RNA editing) este o formă rară de procesare a ARNm în care se
produce deleţia, inserţia sau substituţia unui nucleotid. În felul acesta, în ţesuturi diferite
acelaşi ARNm îşi modifică structura, producând proteine diferite ca lungime. La om,
fenomenul de editare a fost descris în gena pentru apolipoproteina B (apoB este un transportor
de grăsimi); în intestinul subţire, în codonul 2152 al ARNm pentru apo B, C este înlocuită cu
U, transformând un codon sens într-un codon stop, oprind astfel translaţia (varianta scurtată a
apo B leagă şi transportă grăsimile de origine alimentară); în ficat, acelaşi ARNm nu este
modificat, producând o proteină apo B mai lungă (transportă grăsimile sintetizate de către
ficat).
(4) Poliadenilarea alternativă
Genele care conţin la nivelul regiunii 3’UTR două sau mai multe situsuri de
poliadenilare pot suferi procese de adenilare alternativă, specifice pentru anumite ţesuturi.
(5) Modificarea stabilităţii (duratei de viaţă) a ARNm
Durata de viaţă a ARNm depinde de cantitatea acestuia. De exemplu, ARNm al
histonelor are o stabilitate crescută în timpul replicării ADN, când sinteza acestor proteine
este intensă, şi foarte scăzută în alte faze ale ciclului celular. ARNm al unor protooncogene
are o stabilitate anormal de crescută şi determină o sinteză excesivă a proteinelor
corepunzătoare.
(6) Modificarea stocajului ARNm
După transcripţie moleculele de ARNm pot fi stocate în nucleu sau citoplasmă printr-
un mecanism încă necunoscut. Unii hormoni pot produce o creştere rapidă a sintezei de
proteine prin eliberarea ARN stocat şi nu prin stimularea transcripţiei.
29. Elemente implicate în replicarea ADN
(1) Dezoxiribonucleotide activate (dezoxiribonucleozide trifosfat - dNTP):
dezoxiadenozintrifosfat (dATP), dezoxiguanozintrifosfat (dGTP), dezoxicitidintrifosfat
(dCTP) şi dezoxitimidintrifosfat (dTTP). Ruperea legăturilor fosfat macroergice dintre fosfaţii
α şi β eliberează două grupuri fosfat şi formează dezoxiribonucleotide activate.
(2) Matriţa (tipar) este reprezentată de fiecare catenă parentală de ADN.
(3) Enzimele care catalizează sinteza de ADN sunt numite ADN-polimeraze. La om
au fost identificate cinci ADN-polimeraze, notate α, β, γ, δ şi ε; replicarea ADN nuclear este
realizată de ADN-polimeraza δ, enzima majoră a replicării şi ADN-polimeraza α; ADN-
polimeraza γ realizează replicarea ADN mitocondrial, iar ADN-polimerazele β şi ε sunt
implicate în repararea ADN.
(4) ADN-helicazele catalizează desfacerea dublului helix de ADN (folosind energie
rezultată din ruperea legăturilor fosfat macroergice) şi eliberează monocatenele matriţă.
Helicazele acţionează în puncte specifice numite origini de replicare, asigurând apoi
înaintarea furcii de replicare prin ruperea legăturilor de hidrogen, despiralizarea şi deschiderea
moleculei, pentru a deveni accesibilă diferitelor proteine ale replicării.
(5) Proteinele de replicare A (RPA), numite şi proteine de legare a monocatenelor
ADN sau proteine SSBP (single-strand binding protein) menţin separate cele două catene
desfăcute de helicaze; SSBP se fixează la monocatenele ADN şi împiedică reîmperecherea
bazelor, deci respiralizarea.
(6) ADN-topoizomerazele I şi II. Despiralizarea dublului helix fără rotaţia acestuia
crează în aval de furca de replicare nişte superhelixuri (asemănător separării bruşte a firelor
răsucite dintr-o frânghie); topoizomerazele rup legăturile fosfodiester la nivelul uneia
(topizomeraza I) sau a ambelor catene (topizomeraza II), produc rotaţia liberă a capetelor
helixului şi apoi resudarea lor; în acest fel topoizomerazele detensionează (relaxează)
molecula de ADN.
(7) Primaza este o ARN-polimerază specifică implicată în sinteza primerului şi
replicarea catenei „întârziate”. ADN-polimerazele nu pot iniţia replicarea, o pot doar
continua. Astfel, sub acţiunea primazei se sintetizează primerul, un fragment scurt de ARN
(10-12 nucleotide), complementar cu catena matriţă; ADN-polimeraza α adaugă, la capătul
OH 3’ al primerului, circa 30 de dexoxiribonucleotide. Primaza şi ADN-polimeraza α sunt
apoi îndepărtate, sinteza lanţului continuând sub acţiunea ADN-polimerazei δ.
(8) Proteinele de replicare C (RPC) se leagă la joncţiunea dintre primer şi matriţă,
stabilizând interacţiunea ADN-polimerazei cu matriţa ADN.
(9) Antigenul nuclear de proliferare celulară (PCNA – Proliferating Cell Nuclear
Antigen) se leagă în imediata vecinătate a proteinelor C; ambele controlează pornirea sau
oprirea replicării.
(10) Ribonucleaza H1 (RNaza H1) îndepărtează primerul ARN, folosit pentru
iniţiera replicării; lacuna rămasă este completată de ADN-polimeraza δ, iar sudarea capetelor
este realizată de către o ADN-ligază, refăcând continuitatea catenei.
30.Mecanismul molecular al replicării ADN
Procesul de replicare începe în puncte specifice numite origini de replicare (ori) şi,
de aici, progresează în ambele direcţii, până ce ADN este complet duplicat . La nivelul
originilor de replicare, pe ADN se fixează enzimele replicării: topoizomerazele, helicazele,
primazele, ADN-polimerazele.
Dublul helix este despiralat sub acţiunea topoizomerazelor, iar catenele sunt separate
temporar de către helicaze, formând furca de replicare, o structură în formă de Y. Pe fiecare
catenă separată se fixează proteinele SSB (RPA), care împiedică reîmperecherea bazelor
complementare şi refacerea spontană a dublului helix.
Pe cele două catene matriţă, ADN-polimeraza δ ataşează secvenţial şi complementar
dezoxiribonucleotidele activate.
Polimerizarea nucleotidelor se face diferit pe cele două catene, care sunt antiparalele.
ADN-polimeraza nu poate începe sinteza prin legarea a două nucleotide; ea poate doar să
adauge nucleotide la capătul 3’OH al unui lanţ preexistent (ADN-polimeraza poate numai să
alungească catena în curs de sinteză); de aceea necesită utilizarea unui primer ARN, sintetizat
sub acţiunea primazei. Sinteza se poate efectua numai în sensul 5’-3’. Astfel numai una din
cele două catene, denumită catenă conducătoare sau directoare (leading strand) (catena
care are ca matriţă catena 5’-3’) poate fi sintetizată în mod continuu şi în sensul deplasării
furcii de replicare.
Cealaltă catenă - catena întârziată (lagging strand) (catena care are ca matriţă catena
3’-5’) - este sintetizată discontinuu şi mai lent, sub formă de secvenţe scurte (100-1000
nucleotide) denumite fragmente Okazaki; sinteza fiecărui fragment are loc în sens opus celui
în care se deplasează furca de replicare.
Primerul este eliminat prin hidroliză şi înlocuit cu secvenţe ADN, sub acţiunea ADN-
polimerazei δ, iar fragmentele sunt unite de către o ADN-ligază. Primerul este necesar numai
la începutul replicării pentru catena conducătoare, iar pentru catena întârziată la sinteza
fiecărui fragment Okazaki
31. Particularităţile replicării ADN la eucariote
(1) Datorită dimensiunii mari a genomului şi asocierii cu proteine, viteza de replicare
este mai redusă – circa 50 nucleotide/secundă (faţă de 500 nucleotide/secundă la procariote).
Replicarea începe în mai multe puncte de origine (secvenţe specifice de ADN) care
corespund unităţilor de replicare numite repliconi. Replicarea progresează bidirecţional
pentru fiecare replicon şi, după ce se termină, repliconii fuzionează treptat până ce întregul
cromozom este duplicat.
(2) Comportamentul proteinelor nucleozomale în timpul replicării încă nu este
cunoscut cu precizie; se ştie însă că, odată cu siteza ADN, în nucleu are loc şi o intensă
sinteză de histone, necesare formării de noi nucleozomi.
(3) Replicarea are loc în faza S a ciclului celular şi durează, în celulele umane, circa 8
ore (la un ciclu celular de 24 de ore). Deoarece acest timp este scurt pentru replicarea celor
peste 6 miliarde de pb din genomul uman, uneori pot apare erori.
Relicarea este reglată de o serie de proteine:
• diferite cicline asigură trecerea din faza G1 în faza S, precum şi progresia prin faza S;
• CDK4 este o protein-kinază activatoare
• anumiţi factori de transcripţie activează punctele de origine, iar alţii stimulează
expresia genelor necesare intrării în faza S;
• Inhibitorii kinazelor dependente de cicline - CKI - blochează intrarea şi progresia
prin faza S (prin inhibarea complexelor CDK-cicline şi PCNA) atunci când apar leziuni ale
ADN sau când un ţesut a încheiat diferenţierea.
Replicarea celor 20-80 de repliconi nu este sincronă şi se realizează într-o anumită
ordine, în funcţie de structura cromatinei: la începutul fazei S este replicată eucromatina, iar
la sfârşitul fazei S este replicată heterocromatina.
În mod normal, întregul genom este replicat în faza S o singură dată.
(4) Replicarea telomerelor
Telomerele sunt alcătuite din secvenţe hexamerice repetitive TTAGGG dispuse în
tandem pe o lungime de 5-20 kb. Un fenomen caracteristic telomerelor este pierderea de
secvenţe ADN la fiecare replicare, deoarece, la capătul 5’ al catenelor nou sintetizate
replicarea este incompletă, pierzându-se la fiecare ciclu celular între 25 şi 200 pb. Aceasta
duce la scurtarea progresivă a telomerelor şi, după un număr de replicări (maximum 80 la
celulele somatice, când este atinsă limita critică de circa 1,5 kb), la oprirea replicării şi a
diviziunii.
La nivelul celulelor germinale, în succesiunea generaţiilor, lungimea telomerelor rămâne nemodificată datorită acţiunii enzimei telomeraza. Telomeraza este o reverstranscriptază specială care conţine o secvenţă scurtă de ARN, complemetară secvenţelor repetitive telomerice; telomeraza adaugă secvenţe TTAGGG la capătul 3’, fără a necesita o matriţă (fig. 5.4.).
În majoritatea celulelor somatice, expresia genei telomerazei este inhibată încă din stadiul embrio-fetal. Dispariţia activităţii telomerazei după naştere determină scurtarea progresivă a telomerelor după fiecare diviziune, pe măsura înaintării în vârstă. Când este atinsă o lungime critică, diviziunea se opreşte şi începe senescenţa. Pierderea telomerelor produce, de asemenea, instabilitate genomică, urmată adesea de rearanjamente cromozomiale.
Telomeraza este reactivată în celulele canceroase (vezi Cap. Boala canceroasă).
(5) Procesul de replicare este realizat de către ADN-polimeraze cu mare fidelitate: rata erorilor de împerechere (mismatch) este de circa 1/109.
ADN-polimeraza are, în primul rând, capacitatea de a poziţiona corect bazele
complementare (probabil pe baza conformaţiei tridimensionale). În al doilea rând, ADN-
polimerazele δ şi ε au activitate de corectare (proofreading), înlăturând nucleotidele greşit
încorporate printr-o acţiune 3’-5’- exonucleazică.
Puţinele erori de împerechere care apar în prezenţa mecanismelor menţionate sunt
reparate.
32. Recombinarea genetică
Fenomenul recombinării genetice conduce la apariţia unor combinaţii genetice noi
(recombinanţi) prin rearanjarea (reasortarea şi redistribuirea) materialului genetic de la doi
genitori diferiţi. Procesul este foarte larg răspândit, asigurând, în limite naturale, variabilitatea
informaţiei ereditare.
Recombinarea genetică are loc în perioadele preconcepţională şi concepţională şi este
de două tipuri: cromozomială şi genomică.
1. Recombinarea cromozomială are loc în gametogeneză şi poate fi intra- şi
intercromozomială.
• Recombinarea intracromozomială (omoloagă) este reprezentată prin procesul de
crossing-over cromozomial, care se realizează în profaza primei diviziuni meiotice (vezi
Gametogeneza), în urma căruia are loc un amestec de gene între cromozomii omologi paterni
şi materni. Această recombinarea intragenică produce o genă hibridă (fuziune genică) ce
conţine fragmentul terminal dintr-o alelă şi restul de secvenţă din cealaltă alelă (fig. 6.1.).
• Recombinarea intercromozomială se realizează ca urmare a segregării bivalenţilor
din tetradă în anafaza meiozei primare, repartizarea unei perechi de omologi în celulele-fiice
fiind întâmplătoare şi independentă de celelalte perechi. Consecinţa segregării întâmplătoare
şi independente o reprezintă faptul că fiecare gamet dobândeşte o combinaţie diferită de
cromozomi paterni şi materni.
2. Recombinarea genomică are loc în fecundare prin reasortarea (amestecarea)
cromozomilor (genomilor) din cei doi gameţi (de la doi indivizi diferiţi), determinând apariţia
unor descendenţi care diferă genetic atât de cei doi genitori, cât şi între ei: pentru fiecare
gamet există 223= 8.388.608 variante de combinaţii cromozomiale, iar pentru fiecare zigot
există 246 posibilităţi (246 = 70.368.744.177.664).
Cele trei tipuri de recombinare au loc secvenţial, permiţând amplificarea diversificării
genetice a indivizilor dintr-o specie.
Recombinarea genetică duce, în timp, la diversificarea fondului genetic al speciei prin:
creşterea spectrului de genotipuri individuale, creşterea gradului de heterozigoţie şi apariţia
indivizilor mai viabili şi mai fertili.
Fiecare individ este un unicat genetic (la nivel molecular, celular, fiziologic,
morfologic şi psiho-comportamental). Individualitatea genică explică, printre altele,
capacitatea diferenţiată de adaptare, predispoziţia diferită la diversele boli, răspunsul diferit al
indivizilor la administrarea unui medicament, compatibilitatea sau incompatibilitatea grefelor
etc.
33. Mutaţiile: definitie, clasificare
Mutaţiile sunt modificări accidentale (nenaturale), permanente şi ereditare
(transmisibile în succesiunea generaţiilor) ale secvenţei de nucleotide din ADN. Aceste
modificări produc variante alelice ale secvenţei de ADN (genic sau extragenic).
Clasificarea mutaţiilor
a) În funcţie de mărimea materialului genetic interesat, se deosebesc trei categorii
de mutaţii: genice, cromozomiale şi genomice.
Mutaţiile genice interesează secvenţa de nucleotide a unei gene. Mutaţiile
cromozomiale produc modificări ale structurii cromozomilor şi, implicit ale ordinii genelor în
cromozomi (rearanjări sau remanieri cromozomiale). Mutaţiile genomice sunt modificări ale
numărului diploid al cromozomilor: aneuploidie – când sunt afectate 1-2 perechi, sau
poliploidie – când sunt afectaţi toţi cromozomii.
b) După tipul celular afectat: mutaţii somatice şi germinale. Mutaţiile somatice sunt
mai frecvente; nu se transmit la urmaşi, ci numai de la o celulă la alta, formând o clonă
celulară (populaţie celulară) anormală – mozaicism somatic; sunt răspunzătoare de apariţia
cancerului şi de accelerarea procesului de îmbătrânire. Mutaţiile germinale sunt mai rare şi
nu afectează individul, dar se transmit la urmaşi (sunt ereditare);.
c) În funcţie de cauză, mutaţiile se clasifică în spontane şi induse. Mutaţiile spontane
sunt mutaţii ale căror factori cauzali (de cele mai multe ori naturali) nu pot fi identificaţi (se
consideră adesea a fi rezultatul unor erori de copiere în cursul procesului de replicare).
Mutaţiile induse sunt mai frecvente şi sunt produse sub acţiunea unor factori fizici (radiaţii
ionizante), chimici sau biologici.
Modificarea informaţiei genetice nu este, obligatoriu, însoţită de modificarea
fenotipului. Majoritatea mutaţiilor germinale ale ADN extragenic nu se exprimă fenotipic, ele
fiind neutre; sunt responsabile de producerea unor variante alelice care formează
polimorfismul ADN. Mai rar, mutaţiile pot avea efecte benefice (avantajoase), determinând o
adaptare mai bună la mediu, la diferite agresiuni din mediul extern sau creşterea fitness-ului.
Alterori ele sunt dezavantajoase (detrimentale, patogene), implicate în producerea unor boli;
mutaţiile reprezintă, de altfel, cea mai importantă cauză de boală la om.
34. Substituţia - înlocuirea unei singure baze azotate - reprezintă cel mai frecvent tip
de mutaţie la om şi poate fi de două tipuri:
tranziţia, constând în înlocuirea unei baze purinice (A sau G) sau pirimidinice
(C sau T) cu o bază de acelaşi tip;
transversia, mai rar întâlnită, în care o bază purinică (A sau G) este înlocuită
cu o bază pirimidinică (C sau T) şi invers.
Consecinţele substituţiei asupra informaţiei genetice
Substituţia unui nucleotid poate avea consecinţe diferite în funcţie de localizarea
mutaţiei: secvenţe codante, necodante sau secvenţe reglatoare ale genei.
(1) În regiunile codante (exoni), substituţia poate interesa un codon sens sau non-
sens.
► Substituţia într-un codon sens poate produce:
a) un codon sens sinonim, care codifică acelaşi aminoacid; poplipeptidul codificat
rămâne neschimbat, deci mutaţia este neutră din punct de vedere fenotipic şi evolutiv şi se
numeşte mutaţie silenţioasă (mută) (silent mutation) sau sinonimă; circa 25% din mutaţiile
punctiforme sunt silenţioase.
GUU AAG GCU GCU → Val – Lys – Ala – Ala
GUU AAA GCU GCU → Val – Lys – Ala – Ala
b) un alt codon sens care va codifica un aminoacid diferit; aceste mutaţii sunt
nesinonime, deoarece modifică sensul unui codon şi sunt denumite mutaţii cu sens greşit
(missense mutations).
Substituţiile cu sens greşit pot fi clasificate în:
- conservative - când aminoacidul este înlocuit cu altul similar din punct de vedere
chimic şi funcţional (de exemplu, arginina şi lizina), astfel că efectul asupra funcţiei proteinei
este minim;
- neconservative - înlocuirea unui aminoacid cu un altul diferit din punct de vedere
chimic şi funcţional şi care modifică funcţia proteinei; aceste mutaţii sunt cele mai frecvente
în patologia umană (50%).
GUU AAG GCU GCU → Val – Lys – Ala – Ala
GUU AAG GAU GCU → Val – Lys – Asp – Ala
ex. HbS din anemia drepanocitară (mutaţia GAG→GTG duce la înlocuirea acidului
glutamic cu valina).
c) un codon non-sens sau stop, care nu codifică nici un aminoacid; urmarea o
constituie terminarea prematură a procesului traducerii, cu formarea unui ARNm mai scurt,
iar dacă acesta este stabil, va rezulta o proteină de dimensiuni mai reduse, nefuncţională (de
obicei instabilă, mai alesa dacă mutaţia se produce la începutul genei); aceste mutaţii, numite
mutaţii fără sens (nonsens mutation), reprezintă circa 12% din mutaţiile produse la om; de
exemplu în talasemii (anemii hemolitice datorate producerii insuficente fie de lanţuri α, fie de
lanţuri β ale globinei).
► Substituţia într-un codon nonsens poate produce:
a) un codon sens, care codifică un aminoacid; astfel transcripţia va continua până la
următorul codon stop, formându-se un ARNm şi un poplipeptid anormal de lungi.
b) un alt codon stop (foarte rar), mutaţia fiind fără efect asupra proteinei.
(2) În regiunile necodante intragenice mutaţia interesează cel mai frecvent intronii
(10-15% din mutaţii). Substituţia se produce la nivelul situsurilor de clivare (splicing) a
intronilor (splice site mutation), adică situsul donor 5-GT sau acceptor AG-3’; mutaţia acestor
situsuri poate avea următoarele efecte:
- abolirea (pierderea) situsurilor de clivare a unui intron; clivarea se produce la
următorul exon şi astfel în ARNm matur se va găsi o secvenţă intronică sau va lipsi un exon
(exon skipping), în funcţie de situsul afectat;
- activarea unor situsuri criptice de clivare (secvenţe similare unui situs autentic); în
ARNm matur va fi prezent un fragment de intron sau va lipsi o parte din exon.
În ambele situaţii produsul matisării este nefuncţional.
(3) Mutaţiile secvenţelor reglatoare conduc la o funcţionare anormală a
mecanismelor de control ale expresiei unei gene normale. Astfel, gena se poate exprima într-
un ţesut neadecvat (unde în mod normal gena ar trebui să fie represată – exprimare ectopică)
sau la un moment nepotrivit. Aceste mutaţii afectează cantitatea de proteină sintetizată.
Mutaţiile promotorului modifică rata transcripţiei, iar cele ale situsului de poliadenilare
influenţează stabilitatea moleculei de ARNm.
GUU AAG GCU GCU → Val – Lys – Ala – Ala
GUU UAG GAU GCU → Val – stop
35. Deleţii şi inserţii mici (microdeleţii, microinserţii)
Deleţia (pierderea) sau inserţia (introducerea) unuia sau a mai multor nucleotide
reprezintă circa 25% din totalul mutaţiilor la om.
• Dacă deleţiile sau inserţiile sunt un multiplu de trei nucleotide, se produce pierderea
sau adăugarea unor aminoacizi în proteină.
GUU AAG GCU GCU → Val – Lys – Ala – Ala
GUU ---- GCU GCU → Val – Ala – Ala
De exemplu, la europeni, circa 70% din cazurile de fibroză chistică sunt produse de
mutaţia F508del (prin deleţia a trei nucleotide din gena CF se pierde fenilalanina din poziţia
508 a proteinei CFTR)
• Dacă deleţiile sau inserţiile nu sunt un multiplu de trei nucleotide, se produce o
decalare a cadrului de citire al genei de la locul în care s-a produs deleţia sau inserţia. Aceste
mutaţii, numite mutaţii cu modificarea cadrului de citire (frameshift mutations), alterează
întreaga secvenţă de aminoacizi în aval de locul mutaţiei.
GUU AAG GCU GCU → Val – Lys – Ala – Ala
GUU – AGG CUG CU → Val – Arg – Leu
36. Leziuni extinse (remanieri genice aberante)- crossing-over inegal
Leziunile extinse se produc prin schimburi între două secvenţe alelice sau nealelice de
ADN şi sunt mai rare în patologia umană. Cel mai important mecanism este recombinarea
omoloagă nealelică (RON) produsă între secvenţe similare situate în regiuni diferite ale
cromozomilor. Ea se produce cel mai frecvent în profaza meiozei primare (când are loc
împerecherea omologilor) şi constă într-un schimb reciproc inegal - crossing-over inegal ,
prin care se modifică ambele cromatide (unul dintre cromozomi va avea o duplicaţie a unei
secvenţe, iar celălalt o deleţie a aceleiaşi secvenţe).
37. Mutaţii dinamice (instabile)
Conform conceptului clasic, mutaţiile sunt modificări permanente, stabile, care se
transmit nemodificate la descendenţi. Recent (după 1991) a fost descoperită o nouă clasă de
mutaţii, complet diferită de mutaţia clasică, denumită mutaţie dinamică (instabilă, extensia
sau amplificarea repetărilor trinucleotidice)
Mutaţiile dinamice sunt reprezentate de creşteri ale numărului unor secvenţe repetitive
trinucleotidice (CAG, CTG, CGG sau GAA) dispuse în tandem în exoni, introni sau la
capetele genei. Caracteristica fundamentală a acestor mutaţii o constituie instabilitatea lor,
exprimată prin creşterea, cu ocazia diviziunilor celulelor purtătoare, a numărului de copii ale
respectivelor secvenţe repetitive. Până a deveni manifeste, se numesc premutaţii,
caracterizate doar prin instabilitate; odată depăşit numărul critic de repetări, mutaţia este
completă, se manifestă fenotipic şi se accentuează pe măsura creşterii repetărilor.
Ca urmare a extensiei (creşterii) progresive a repetărilor pe măsura diviziunii celulelor
liniei sexuale, bolile produse de mutaţii dinamice, transmise de obicei dominant, se
caracterizează prin fenomenul de anticipaţie: debutează mai precoce şi prezintă
simptomatologie mai severă în succesiunea generaţiilor. Formele cele mai severe se transmit
mai des prin unul din părinţi – efect parental.
În majoritatea lor, variaţiile numerice ale repetărilor trinucleotidice sunt lipsite de
efecte fenotipice. Sunt cunoscute, până în prezent, mai multe excepţii, reprezentative fiind:
- expansiunea CGG la nivelul promotorului genei FMR1 (Frax Mental Retardation)
de pe cromozomul X (Xq27.3) (6-50 repetări în gena normală, 50-200 în premutaţie) de la
230 la peste 1000. Mutaţia produce o metilare anormală a repetiţiilor CGG şi apariţia situsului
fragil pe Xq, asociat cu inhibarea expresiei genei FMR1 şi instalarea sindromului X fragil,
transmis XD.
- expansiunea CAG la nivelul exonului 1 al genei umane HD (codifică huntingtina) de
pe cromozomul 4p16.3; gena normală conţine un număr de repetări mai mic de 26; o creştere
a repetărilor peste 37 la nivelul genei produce boala Huntington, transmisă AD; expansiunea
modifică funcţia proteinei, generând o secvenţă poliglutamică anormală
- repetarea între 50 şi câteva mii de ori a secvenţei CTG din regiunea 3’ netradusă a
genei DMPK (codifică o protein-kinază) (alela normală conţine între 5 şi 30 de repetări)
determină apariţia distrofiei miotonice Steinert, transmisă AD.
Mecanismul de producere a expansiunii nu este cunoscut exact; se presupune că este
rezultatul alinieri greşite şi împerecheri decalate a repetărilor trinucleotidice - glisare
replicativă.
C. Cauzele mutaţiilor genice
Mutaţiile genice se pot produce spontan, natural (cel mai frecvent prin erori ale
procesului de replicare) sau pot fi induse de agenţi din mediul extern sau intern numiţi
mutageni. Aceste cauze, spontane sau induse, determină leziuni ADN, definite ca fiind orice
modificare a structurii normale a ADN. Leziunile ADN reprezintă semnalul pentru intrarea în
activitate a mecanismelor reparatorii; în lipsa refacerii structurii normale (reparării),
respectivele modificări se fixează sub formă de mutaţii. Principalele tipuri de leziuni ADN
sunt:
- modificări ale bazelor purinice sau pirimidinice: dezaminări spontane, metilări,
adiţii, substituţii sau pierderi de baze şi crearea de situsuri abazice (apurinice sau
apirimidinice);
- formarea de punţi intracatenare sau intercatenare;
- rupturi monocatenare şi bicatenare.
38.Cauzele mutatiilor spontane
Cauzele mutaţiilor genice
Mutaţiile genice se pot produce spontan, natural (cel mai frecvent prin erori ale
procesului de replicare) sau pot fi induse de agenţi din mediul extern sau intern numiţi
mutageni. Aceste cauze, spontane sau induse, determină leziuni ADN, definite ca fiind orice
modificare a structurii normale a ADN. Leziunile ADN reprezintă semnalul pentru intrarea în
activitate a mecanismelor reparatorii; în lipsa refacerii structurii normale (reparării),
respectivele modificări se fixează sub formă de mutaţii. Principalele tipuri de leziuni ADN
sunt:
- modificări ale bazelor purinice sau pirimidinice: dezaminări spontane, metilări,
adiţii, substituţii sau pierderi de baze şi crearea de situsuri abazice (apurinice sau
apirimidinice);
- formarea de punţi intracatenare sau intercatenare;
- rupturi monocatenare şi bicatenare.
Mutaţii spontane. Cele mai importante mecanisme de producere a mutaţiilor
spontane sunt:
(1) Erori ale procesului de replicare
• Modificări spontane de tipul formelor tautomere ale bazelor. Formele cetonică
(C=O) şi aminică (C-NH2) sunt mai stabile, adică mai „normale” din punct de vedere genetic,
dar pentru perioade scurte de timp bazele pot exista şi în formele enolică (C-OH), respectiv
iminică (C=NH), mult mai instabile; de exemplu, forma imino a adeninei nu formează
legături de hidrogen cu timina, ci cu citozina.
(2) Leziuni spontane pot apare prin dezaminare sau depurinare a bazelor.
• Citozina suferă adesea o dezaminare spontană, transformându-se în uracil (bază
anormală pentru ADN) şi astfel perechea de baze CG este transformată într-o pereche AT (U
se aseamănă structural cu T), deci s-a produs tranziţia C→T (fig. 6.3.). Această tranziţie este
frecventă la nivelul dinucleotidul CG din regiunea promotoare a genelor. Dezaminare
spontană poate suferi şi adenina, guanina sau 5-metilcitozina, transformându-se în
hipoxantină, xantină, respectiv timină.
• La temperaturi crescute sau scăderea pH-ului celular, legătura N-glicozidică dintre o
bază purinică şi dezoxiriboză poate fi scindată prin hidroliză - depurinare spontană,
rezultând un situs apurinic.
39.Cauzele mutatiilor induse(radiatiile)
Cauzele mutaţiilor genice
Mutaţiile genice se pot produce spontan, natural (cel mai frecvent prin erori ale
procesului de replicare) sau pot fi induse de agenţi din mediul extern sau intern numiţi
mutageni. Aceste cauze, spontane sau induse, determină leziuni ADN, definite ca fiind orice
modificare a structurii normale a ADN. Leziunile ADN reprezintă semnalul pentru intrarea în
activitate a mecanismelor reparatorii; în lipsa refacerii structurii normale (reparării),
respectivele modificări se fixează sub formă de mutaţii. Principalele tipuri de leziuni ADN
sunt:
- modificări ale bazelor purinice sau pirimidinice: dezaminări spontane, metilări,
adiţii, substituţii sau pierderi de baze şi crearea de situsuri abazice (apurinice sau
apirimidinice);
- formarea de punţi intracatenare sau intercatenare;
- rupturi monocatenare şi bicatenare.
Mutaţii induse
Mutaţiile induse sunt produse de agenţi mutageni din mediul extern sau intern.
(1) Factorii mutageni din mediul extern (radiaţii ultraviolete, radiaţii ionozante,
agenţi chimici) produc diferite alterări ale structurii ADN.
• Cele mai frecvente sunt radiaţiile ultraviolete (componente ale radiaţiei solare) care
produc dimerizarea pirimidinelor adiacente (în special a timinelor adiacente) (fig. 6.4.).
• Agenţii carcinogeni - fum de ţigară, poluanţi atmosferici (agenţi alchilanţi sau
metilanţi, hidrocarburi policiclice în produşii de combustie), gudroane, medicamente
antitumorale, difeite metale – produc adiţii ale unor radicali chimici.
• Radiaţiile ionizante cuprind undele elecromagnetice cu lungime de undă foarte mică
(raze X şi raze gama) şi particule cu energie înaltă (particule alfa şi beta, neutroni). Sursele de
radiaţii la care sunt expuse populaţiile umane sunt naturale (radiaţii cosmice, materiale
radioactive) şi artificiale (radiologie diagnostică sau terapeutică, expunere profesională,
expunere accidentală). Cantitatea de radiaţii pătrunsă în ţesut se numeşte doză de
radiaţii şi se măsoară în doză absorbită de radiaţii – rad (radiation absorbed dose). Deoarece
oamenii sunt expuşi la mai multe surse, se foloseşte unitatea rem (roentgen equivalent for
man). Un rem de radiaţie este doza absorbită ce produce acelaşi efect biologic ca 1 rad de raze
X. 100 rem echivalează cu 1 Sievert (Sv). Doza medie de radiaţii primită de gonade este de
2,4 Sv pe an şi 72 Sv pe perioadă reproductivă (30 de ani) sau 6-7 rem pe an şi 30-80 rem
pe 30 de ani.
Radiaţiile ionizante (X, gama) produc mai ales rupturi mono- sau bicatenare ale
ADN-ului, dar dozele sunt foarte scăzute, permiţând sistemelor de reparare să remedieze
leziunile. Uneori, acestea sunt lipsite de eficienţă, putând apărea mutaţii, care sunt, de obicei,
sub formă recesivă.
Radiaţiile ionizante au efect cumulativ în timp, care depinde de doza totală încasată.
Riscul este mic la nivelul populaţiei generale, dar mai crescut la persoanele expuse
profesional.
• O serie de substanţe chimice au efect mutagen prin:
- interferare cu sinteza ADN: analogii bazelor azotate (au structură similară bazelor
normale, putând fi încorporate accidental în ADN): de exemplu 5-bromouracil, cofeina
(analogi ai timinei), 2-aminopurina (analog al adeninei)
- alterarea structurii ADN: azot iperita, acridinele, epoxizii
• Dintre factorii biologici, cei mai importanţi sunt virusurile:
- virusurile oncogene produc modificări structurale la nivelul cromozomilor (sesizat
pentru viruşii rubeolei, parotiditei epidemice, herpetici).
- la unii viruşi, efectul mutagen constă în inserţia lor în genomul celulei gazdă şi
decalarea cadrului de citire.
(2) Factorii mutageni din mediul intern. Cei mai importanţi sunt speciile reactive de
oxigen (peroxizi de hidrogen, radicali hidroxil) şi produşii de peroxidare a lipidelor
(acroleina, malodialdehida). Dacă sistemele antioxidante de reparare nu sunt eficiente, aceşti
agenţi produc substituţii de baze şi rupturi monocatenare.
40. Repararea erorilor de împerechere
Obişnuit, în cursul procesului de replicare ADN-polimerazele poziţionează
nucleotide activate pe baza complementarităţii. Uneori, însă, se produce o împerechere
greşită, necomplementară (mai ales G-T) (cu o probabilitate de 1:10.000), care crează
distorsiuni ale dublului helix, acestea acţionând ca semnal pentru îndepărtarea bazei inserate
greşit.
ADN-polimerazele pot interveni şi printr-un alt mecanism important – de
autocorectare (proofreading). Enzimele verifică dacă la capătul 3’OH nu s-a produs o
împerechere greşită; dacă a apărut o eroare, îndepărtează nucleotidul necomplementar prin
capacitatea 3’-5’ exonucleazică (ruperea legăturii fosfodiester de la capătul 3’) pe care o
posedă ADN-polimerazele δ şi ε.
Puţinele erori care apar în ciuda acestor mecanisme sunt supuse după replicare unor
mecanisme de reparare a erorilor de împerechere MMR (mismatch repair). Cele mai
importante enzime din sistemul MMR sunt codificate de genele Mut H, Mut L şi Mut S (la om
MLH1, MSH2, MSH6, PMS1 şi PMS2). Produşii acesor gene recunosc împerecherile greşite
(care produc o distorsiune a catenei nou sintetizate); procesul de reparare constă în clivarea şi
degradarea exonucleazică a fragmentului (de peste 1-2 Kb) ce conţine eroarea şi refacerea
secvenţei normale (în care sunt implicate ADN-polimerazele δ şi ε). Mutaţiile genelor din
sistemul MMR sunt implicate în producerea cancerului non-polipozic colorectal ereditar.
41. Repararea bazelor modificate după replicare
Bazele azotate pot fi modificate postreplicativ sub acţiunea unor agenţi exogeni sau
endogeni.
(1) Mecanismul de reparare prin excizia bazei (base excision repair – BER)
intervine în cazul leziunilor produse de agenţi endogeni. O bază modificată chimic (cel mai
frecvent prin dezaminare spontană) este îndepărtată sub acţiunea unei ADN-glicozilaze, care
clivează legătura N-glicozil dintre baza azotată şi dezoxiriboză. Se produce astfel un situs
abazic (apurinic/apirimidinic) care este recunoscut de către endonucleaza APE1
(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1), enzima esenţială pentru acest tip de reparare la om.
Enzima clivează catena ADN la capătul 5’ al situsului abazic, după care intervine ADN-
polimeraza β care îndepărtează reziduul 5’-dezoxiribozo-fosfat, introduce nucleotidul
corespunzător, iar continuitatea catenei este refăcută de către o ligază.
(2) Reparare fără excizia bazei sau repararea directă monoenzimatică (base
excision repair – BER) intervine în cazul leziunilor produse de agenţi alchilanţi (endogeni sau
exogeni). Agenţii alchilanţi transferă gruparea metil în situsurile reactive ale bazelor azotate,
de exemplu în cel al guaninei rezultând o guanină metilată (care se poate împerechea cu
timina). Modificările produse de agenţii alchilanţi sunt reparate direct, fără a îndepărta bazele
azotate, de o enzimă specifică numită metilguanin metil-transferaza (MGMT); aceasta
transferă gruparea metil de la nivelul metilguaninei pe un reziduu propriu de cisteină formând
metilcisteina (care inactivează enzima). Astfel la fiecare reparare este distrusă o întreagă
enzimă, iar mecanismul de reparare nu poate face faţă atunci când leziunile sunt produse de
agenţi alchilanţi exogeni.
(3) Reparare prin excizia nucleotidelor (nucleotide excision repair – NER). Această
cale este utilizată pentru corectarea leziunilor care produc distorsiunea dublului helix, ca de
pildă dimerii de pirimidină produşi de radiaţiile ultraviolete sau modificările chimice produse
de aflatoxină sau benzpiren. Sistemul de reparare este complex şi cuprinde mai multe gene
(ale căror mutaţii au fost identificate în două afecţiuni rare: Xeroderma pigmentosum şi
sindromul Cockayne).
Modul de localizare a leziunii nu este pe deplin cunoscut. După recunoaştere, este
blocată activitatea helicazelor şi se formează un complex mare proteic care va produce incizia
dublă a catenei ce conţine leziunea; după îndepărtarea fragmentului cu leziune, este
resintetizat ADN-ul (cu ajutorul ADN-polimerazei δ sau ε) şi sunt legate capetele de către
ligază.
Mecanismele MMR, BER, NER reprezintă variante ale unui mecanism general de
reparare prin excizie-resinteză, care diferă prin tipul leziunii, modul de recunoaştere şi prin
moleculele reparatoare, şi care se realizează în mai multe etape:
- recunoaşterea leziunii de către enzime specifice;
- desfacerea dublului helix de către o helicază;
- excizia fragmentului lezat şi a unui segment învecinat sub acţiunea unei
endonucleaze;
- îndepărtarea şi degradarea fregmentului de către exonucleaze;
- resinteza componentelor lacunei, folosind ca matriţă catena complementară de
ADN, de către ADN-polimeraze;
- formarea legăturii fosfodiester între fragmentul nou sintetizat şi capetele libere ale
catenei de ADN de către o ADN-ligază.
42.ANOMALIILE CROMOZOMIALE
Când modificările cantitative sau calitative ale materialului genetic implică regiuni
cromozomiale suficient de mari pentru a fi vizibile la microscopul optic de rutină folosind
tehnici de analiză citogenetică (cariotiparea, bandarea, autoradiografia etc.), ele sunt denumite
mutaţii sau anomalii cromozomiale.
Anomaliile cromosomiale sunt modificări ale structurii sau numărului cromozomilor.
1. Clasificarea anomaliilor cromozomiale
a) După momentul producerii lor, se împart în constituţionale şi dobândite.
Anomaliile constituţionale se produc în cursul gametogenezei unuia din părinţi sau în primele
etape ale embriogenezi, fiind prezente la naştere. Anomaliile dobândite apar în cursul vieţii,
sub formă de clone celulare anormale.
b) După modul de afectare a cromozomilor, se împart în structurale şi numerice.
Anomaliile cromozomiale structurale se caracterizează prin modificarea structurii
normale a cromozomilor. În funcţie de efectul lor fenotipic, sunt împărţite în anomalii
structurale echilibrate şi neechilibrate. Anomaliile echilibrate (translocaţii şi inversii) sunt
caracterizate prin modificarea poziţiei unuia sau a mai multor segmente cromozomiale, deci
fără afectarea cantităţii de material genetic şi fără efecte fenotipice (în majoritatea cazurilor).
Anomaliile neechilibrate (deleţii, duplicaţii, cromozomii inelari, cromozomii dicentrici şi
izocromozomii) sunt caracterizate prin prezenţa suplimentară (trisomie parţială) sau absenţa
(monosomie parţială) a unei părţi din cromozom.
Anomaliile cromozomiale numerice sunt modificări ale numărului de cromozomi faţă
de numărul normal diploid (2n = 46). Ele se clasifică în poliploidii – prezenţa în plus a unuia
sau mai multor seturi haploide de cromozomi – şi aneuploidii – prezenţa în plus sau absenţa
unuia sau a ami multor cromozomi.
c) În funcţie de numărul de celule afectate, se împart în omogene şi în mozaic.
Anomaliile omogene se caracterizează prin prezenţa anomaliei în toate celulele individului,
iar cele în mozaic prin prezenţa a două sau mai multe linii celulare diferite prin numărul de
cromozomi (provenite din acelaşi zigot).
d) În funcţie de tipul de cromozom afectat, se clasifică în autozomale (interesează
cromozomii somatici), gonozomale (interesează cromozomii sexuali X sau Y) şi mixte (sunt
implicaţi şi autozomi şi cromozomi sexuali).
e) În funcţie de tipul de celulă afectată, se împart în somatice (care modifică
fenotipul individului afectat) şi germinale (care nu modifică fenotipul individului afectat, dar
se pot transmite prin gameţi la descendenţi)
43.Anomalii structurale intracromozomiale
Anomaliile cromozomiale structurale (mutaţii cromozomiale)
Modificările structurale sunt consecinţa ruperii cromozomilor şi reunirii anormale a
capetelor cromozomiale.
(1) Deleţiiile (del) sunt anomalii cromozomiale neechilibrate, care constau în
pierderea unui fragment cromozomial.
• Prezenţa unei singure rupturi determină apariţia unei deleţii terminale (fig. 6.5a);
fragmentul acentric se pierde, iar la capătul rupt se formează un nou telomer; deleţia terminală
poate fi observată doar prin tehnici de bandare (deleţie microscopică) sau de citogenetică
moleculară (FISH) (deleţie submicroscopică sau microdeleţie)
• Deleţia interstiţială (fig. 6.5b) se produce în prezenţa a două rupturi pe acelaşi braţ
cromozomial, cu eliminarea segmentului intermediar şi reunirea extremităţilor; deleţiile
interstiţiale sunt mai frecvente decât deleţiile terminale, deoarece nu implică formarea de noi
telomere (necesare pentru stabilizarea cromozomului).
Toate deleţiile produc o monosomie parţială (haploinsuficienţă) pentru genele situate
în regiunea cromozomială absentă. În funcţie de dimensiunea fragmentului absent, deleţia
permite sau nu supravieţuirea. Atunci când fragmentul absent depăşeşte 2% din mărimea
setului haploid, monosomia este incompatibilă cu viaţa postnatală. Deleţiile submicroscopice
(microdeleţiile) determină sindroame ale genelor contigue, în care manifestările fenotipice
sunt datorate pierderii mai multor gene învecinate.
Cele mai frecvente deleţii întâlnite în practică sunt sindromul Wolf-Hirschhorn
(del4p), sindromul cri du chat (del5p), sindromul velo-cardio-facial DiGeorge (del22q11),
sindroamele Prader-Willi şi Angelman (del 15q11-12) ş.a.
(2) Cromozomii inelari (r) sunt consecinţa a două rupturi produse pe braţe diferite ale
cromozomului; prin reunirea extremităţilor fragmentului cu centromer (centric) se formează
un cromozom inelar (fig. 6.6.), iar fragmentele acentrice (terminale) se vor pierde. Această
anomalie realizează o deleţie şi monosomie parţială a segmentelor terminale cromozomiale;
cromozomii inelari, de exemplu r(21), r(X), sunt mai rari în practică, deoarece sunt instabili.
(3) Inversiile (inv) sunt determinate de prezenţa a două rupturi; înainte ca procesul de
reunire să aibă loc, segmentul dintre cele două puncte de ruptură suferă o rotaţie de 180o.
Atunci când ambele rupturi sunt localizate pe acelaşi braţ al cromozomului, iar fragmentul
rotit nu conţine centromerul, inversia este denumită paracentrică (fig. 6.7a). Inversiile
pericentrice includ şi centromerul, fiind produse prin rupturi pe ambele braţe (fig. 6.7b).
Inversiile paracentrice nu pot fi recunoscute cu ajutorul tehnicilor clasice de coloraţie,
deoarece nu modifică forma cromozomului; ele pot fi însă identificate prin metodele de
bandare, deoarece succesiunea benzilor este evident alterată. Inversiile pericentrice pot fi
detectate şi cu ajutorul tehnicilor uzuale, atunci când rupturile sunt localizate la distanţe
diferite faţă de centromer, deoarece se modifică poziţia centromerului
Inversiile sunt anomalii cromozomiale echilibrate, care nu determină modificări ale
cantităţii de material genetic, ci doar în ordinea genelor de pe segmentele cromozomiale
inversate. Ele produc, în schimb, tulburări ale procesului de crossing-over, gameţii formaţi
fiind neechilibraţi.
(4) Duplicaţia (dup) reprezintă dublarea unui segment cromozomial, care se poate
ataşa în tandem (păstrând succesiunea genelor) sau se roteşte cu 180° inversând ordinea
genelor (duplicaţie în tandem invers). Consecinţa o reprezintă apariţia unei trisomii parţiale
pentru segmentul duplicat. Duplicaţia poate avea ca origine un crossing-over inegal (cel mai
frecvent), o translocaţie echilibrată sau un izocromozom.
La om, duplicaţia este mai frecvent întâlnită comparativ cu deleţia, iar consecinţele
sale fenotipice sunt mai puţin severe; duplicaţiile produse la nivel molecular pot avea un
important rol în evoluţie, prin diversificarea genică. Cele mai frecvente duplicaţii sunt:
dup12q şi dup17q, care produc sindromul Pallister, respectiv sindromul Charcot-Marie-
Tooth.
(5) Izocromozomul (i) se formează prin clivarea anormală, transversală a
centromerului. In acest caz, rezultă un cromozom telocentric instabil, care poate fi transformat
într-un cromozom metacentric, ale cărui braţe au un conţinut genetic identic, denumit
izocromozom (alcătuit numai din braţe scurte sau numai din braţe lungi) (fig. 6.8).
Prezenţa unui izocromozom presupune existenţa unei monosomii pentru braţul pierdut
şi a unei trisomii pentru braţul implicat în formarea izocromozomului. Cel mai frecvent,
izocromozomul a fost identificat la circa 20% din cazurile de sindrom Turner i(Xq):
pacientele prezintă, alături de un cromozom X normal, un izocromosom pentru braţul lung al
celuilalt cromosom X (fig. 6.9).
44. Anomalii structurale intercromozomiale
Anomaliile cromozomiale structurale (mutaţii cromozomiale)
Modificările structurale sunt consecinţa ruperii cromozomilor şi reunirii anormale a
capetelor cromozomiale.
(1) Translocaţiiile constau în transferul unui fragment cromozomial între doi
cromozomi. Translocaţiile pot fi reciproce, robertsoniene şi nereciproce (inserţii).
● Translocaţia reciprocă (t) se caracterizează printr-un schimb reciproc de segmente
cromozomiale între doi cromozomi neomologi, care au suferit rupturi (fig. 6.10a). In funcţie
de lungimea segmentelor cromosomiale schimbate, translocaţiile reciproce pot fi egale sau
inegale. Translocaţiile reciproce au o importanţă deosebită pentru patologia umană, deoarece
purtătorii unei translocaţii echilibrate, normali fenotipic, pot da naştere unor descendenţi cu o
constituţie cromozomială anormală (translocaţie, trisomie sau monosomie parţială).
● Translocaţia robertsoniană (rob) sau fuziunea centrică este o translocaţie
reciprocă între doi cromozomi acrocentrici (excepţie cromozomul Y), omologi sau
neomologi, care suferă rupturi la nivelul braţelor scurte. In majoritatea cazurilor, rupturile se
produc la nivelul centromerelor sau pe braţele scurte, foarte aproape de centromer, rezultând
un cromozom monocentric sau dicentric şi două fragmente acentrice (ce conţin ambele braţe
scurte, care se pierd) (fig. 6.10b); pierderea braţelor scurte (conţin genele pentru ARN
ribozomal) este lipsită de efecte fenotipice, deoarece sunt suficiente genele rămase pe
cromozomii acrocentrici normali. Numărul de cromozomi din celulă se reduce de la 46 la 45.
Fuziunea centrică a cromozomilor 13 şi 14 – rob(13q14q) este cea mai frecventă de
translocaţie la om, fiind urmată, ca frecvenţă, de fuziunea centrică a cromozomilor 14 şi 21 -
rob(21q14q). Purtătorii unei translocaţii robertsoniene sunt normali fenotipic dar pot da
naştere unor descendenţi anormali; de exemplu, în cazul translocaţiei rob(21q14q), prin
fecundare cu gameţi normali pot rezulta şase tipuri de zigoţi: normal, cu translocaţie
robertsoniană, cu trisomie 14, cu monosomie 14, cu trisomie 21 şi monosomie 21.
● Inserţia (ins) este o translocaţie nereciprocă ce constă în inserţia unui segment
cromozomial în regiunea interstiţială a unui cromozom neomolog; este condiţionată de
prezenţa a trei rupturi (două pe un cromozom şi una pe celălalt cromozom) (fig. 6.11.), fiind
astfel o anomalie rară. Din nou, purtătorul inserţiei este sănătos, dar descendenţii săi pot fi
neechilibraţi genetic (cu monosomie sau trisomie parţială).
(2) Cromozomii dicentrici (dic) rezultă din deleţia regiunilor telomerice de la doi
cromozomi, urmată de fuzionarea lor telomerică (fig. 6.12.). Numărul de cromozomi din
celulă se reduce la 45. Dacă cei doi centromeri sunt suficient de îndepărtaţi unul de cealalt,
unul dintre ei se inactivează rezultând un cromozom pseudocentric, care se poate menţine pe
parcursul a mai multe generaţii celulare. Cromozomul dicentric cu ambele centromere active
este instabil şi va fi eliminat în timpul diviziunii.
45. Anomalii cromozomiale numerice
La om, celulele somatice normale sunt diploide (2n = 46 de cromozomi), iar celulele
sexuale normale sunt haploide (n = 23 de cromozomi). Anomaliile numărului de cromozomi
sunt de două tipuri: poliploidii şi aneuploidii, care pot fi omogene sau în mozaic.
a) Poliploidia reprezintă multiplicarea setului haploid (n) de cromozomi, de exemplu
3n, 4n, 5n etc. Singurele poliploidii identificate la om sunt triplodia şi tetraploidia.
(1) Un set haploid de cromozomi suplimentari determină apariţia unei celule triploide
(3n = 69 cromozomi); formula genetică pentru o astfel de celulă este 69,XXX, 69,XXY (cea
mai frecventă) sau 69,XYY.
Triploidia este incompatibilă cu viaţa postnatală, fiind observată frecvent la embrionii
avortaţi în primele săptămâni de sarcină. Majoritatea produşilor de concepţie triploizi care au
supravieţuit o anumită perioadă de timp au avut o constituţie cromozomială în mozaic 3n/2n,
cu prezenţa unui număr mare de celule diploide.
Triploidia poate fi consecinţa unor defecte din timpul:
● meiozei: lipsa diviziunii unuia din precursorii celulelor sexuale, ducând la apariţia
unui gamet diploid; este frecventă lipsa eliminării globulului polar din ovocitul II, urmată de
fecundarea cu un spermatozoid normal (diginie).
● mitozei: în cazul mozaicurilor (3n/2n)
● fecundării: fertilizarea ovulului de către doi spermatozoizi (dispermie);
Cercetările efectuate cu ajutorul tehnicilor de bandare sugerează că factorii paterni, şi
îndeosebi dispermia, sunt sursa predominantă a triploidiei la specia umană.
(2) Tetraploidia (4n = 92 cromozomi), multiplicarea de 4 ori a numărului haploid de
cromozomi (92,XXXX, 92,XXYY etc.), este extrem de rară şi întotdeauna letală. Poate fi
consecinţa fuzionării a doi gameţi anormali, nereduşi (2n), dar acest mecanism este
improbabil (sunt menţionate doar câteva cazuri în literatură). Este mai plauzibilă ipoteza
suprimării primei diviziuni de clivare a unui zigot diploid, după diviziunea cromozomilor, dar
înainte de diviziunea citoplasmei (absenţa citokinezei).
Poliploidia poate apare şi în decursul vieţii adulte, datorită unui accident mitotic -
absenţa citokinezei (endomitoza): cromozomii se comportă normal până în stadiul de telofază,
dar citokineza nu se produce, rezultând o celulă tetraploidă cu 4n cromozomi
monocromatidieni.
Celule poliploide se întâlnesc în unele ţesuturi şi în condiţii normale; astfel,
megacariocitele din măduva osoasă au de 8-16 ori numărul haploid de cromozomi. Celule
tetraploide sunt prezente, de asemenea, şi la nivelul ficatului în regenerare, ca urmare absenţei
citokinezei.
46.Cauzele aneuploidiilor omogene
Aneuploidia este modificarea numărului de cromozomi din una sau mai multe perechi;
pot exista unul sau mai mulţi cromozomi în plus sau în minus faţă de numărul normal.
Aneuploidia este înregistrată în populaţia umană mai frecvent comparativ cu
poliploidia, iar consecinţele sale sunt importante pentru patologia umană. Aneuploidia implică
modificări numerice atât la nivelul autozomilor, cât şi a cromozomilor sexuali (X sau Y).
Cauzele principale ale aneuploidiei omogene sunt erori produse în cursul meiozei: non-
disjuncţia (nedisjuncţia) şi pierderea de cromozomi datorită procesului de retardare
anafazică.
a) Non-disjuncţia meiotică
Non-disjuncţia reprezintă lipsa separării cromozomilor unei perechi de omologi în
anafaza meiozei I (non-disjuncţia cromozomială) sau a cromatidelor surori ale unui
cromozom meioza II (non-disjuncţia cromatidiană); datorită acestei erori, ambele elemente
(cromozomul sau cromatida) trec în una din celulele-fiice şi vor lipsi în cealaltă celulă-fiică.
Non-disjuncţia poate interesa cromozomii somatici sau cromozomii sexuali.
Non-disjuncţia din gametogeneză determină apariţia unor gameţi anormali, având
consecinţe diferite la bărbaţi şi la femei, din cauza particularităţilor gametogenezei la cele
două sexe. Astfel, la bărbat, dintr-un spermatocit primar rezultă patru spermatozoizi
funcţionali; fiecare diviziune meiotică fiind însoţită de eliminarea unui globul polar
Din acest motiv, la bărbat, nondisjuncţia în decursul primei meioze va determina apriţia unor
spermatozoizi disomici (n+1) şi nulisomici (n-1), în timp ce nondisjuncţia care survine în
decursul meiozei II va produce şi gameţi normali, alături de gameţi disomici şi nulisomici
(fig. 6.15.).
La femeie însă, non-disjuncţia survenită fie în decursul primei, fie a celei de a doua meioze,
nu poate produce decât ovule anormale, disomice sau nulisomice (fig. 6.16.).
După fecundarea cu un gamet normal, gameţii disomici şi nulisomici vor forma un zigot
trisomic sau monosomic. Posibilitatea ca un zigot anormal să fie consecinţa unei anomalii
survenite în timpul ovogenezei este astfel mai mare decât cea a unei anomalii similare apărute
în decursul spermatogenezei.
b) Retardarea (întârzierea) anafazică (fig. 6.13.) constă în deplasarea cu întârziere a unui cromozom (cromatidă) în cursul anafazei meiozei I sau II şi care, în momentul refacerii membranelor nucleare, va rămâne în afara celulelor-fiice. În consecinţă, apar gameţi nulisomici care, prin fecundare, vor forma zigoţi monosomici.
47.Cauzele aneuploidiilor in mozaic
Aneuploidia este modificarea numărului de cromozomi din una sau mai multe perechi;
pot exista unul sau mai mulţi cromozomi în plus sau în minus faţă de numărul normal.
Aneuploidia este înregistrată în populaţia umană mai frecvent comparativ cu
poliploidia, iar consecinţele sale sunt importante pentru patologia umană. Aneuploidia implică
modificări numerice atât la nivelul autozomilor, cât şi a cromozomilor sexuali (X sau Y).
Aneuploidiile în mozaic sunt de obicei consecinţa unei erori produse în cursul
mitozei zigotului.
a) Non-disjuncţia zigotică. Rezultatul non-disjunţiei zigotice este apariţia unui
mozaic (mixoploid), a cărui constituţie cromozomială depinde de momentul în care a avut loc
accidentul mitotic. Astfel, dacă non-disjuncţia interesează prima diviziune de clivare a unui
zigot normal, va rezulta un produs de concepţie care prezintă două linii celulare anormale: una
monosomică şi una trisomică pentru cromozomul în cauză . Dacă non-disjuncţia interesează a
doua diviziune de clivare a zigotului va rezulta un blastocist mixoploid alcătuit din trei linii
celulare: una normală (disomică), una trisomică şi una monosomică
b) Retardarea anafazică are drept rezultat apariţia unor clone celulare cu 2n-1/2n
cromozomi.
48. Consecinţele fenotipice ale anomaliilor cromozomiale
În funcţie de consecinţele fenotipice, anomaliile cromozomiale se împart în:
- anomalii echilibrate, în care cantitatea de material genetic rămâne nemodificată şi
fenotipul este normal;
- anomalii neechilibrate, în care cantitatea de material genetic se modifică (în plus
sau minus) şi fenotipul este anormal;
1) Consecinţele anomaliilor cromozomiale echilibrate
Anomaliile echilibrate (translocaţii reciproce, inversii) determină, în general, un
fenotip normal, dar au consecinţe asupra reproducerii:
- datorită prezenţei anomaliei structurale, sinapsa între cromozomii omologi este
anormală şi produce blocarea gametogenezei;
- producerea de gameţi anormali care, după fecundare, formează embrioni cu
monosomii sau trisomii parţiale (uneori complete), care de multe ori sunt eliminaţi prin avort
spontan (circa 1 din 250 de persoane aparent sănătoase are o anomalie cromozomială
echilibrată care poate da tulburări majore de reproducere).
2) Consecinţele anomaliilor cromozomiale neechilibrate
Anomaliile neechilibrate (poliploidii, aneuploidii, deleţii, duplicaţii, cromozomi
inelari, izocromozomi) sunt modificări cantitative ale materialului genetic (anomalii de dozaj
genic); întrucât informaţia genetică din cromozomii anormali nu este modificată calitativ,
fenotipul anormal este consecinţa excesului sau lipsei unei gene normale.
Anomaliile de dozaj genic se caracterizează printr-o serie de modificări comune:
tulburări de creştere pre- şi postnatală, dismorfie facială, anomalii congenitale majore
multiple, alterări ale structurii şi funcţiei sistemului nervos central (manifestate prin întârzieri
în dezvoltarea psiho-motorie), modificări ale dermatoglifelor, anomalii ale funcţiei gonadelor.
Factorii care influenţează gravitatea afectării fenotipice sunt:
(a) Mărimea dezechilibrului genetic. Poliploidiile, trisomiile cromozomilor mari şi
monosomiile autozomale sunt incompatibile cu viaţa; cu cât dimensiunea cromozomului este
mai mare, cu atât gravitatea trisomiilor autozomale este mai mare (tri 13 > tri 18 > tri 21).
(b) Tipul de anomalie. Monosomiile sunt mai grave decât trisomiile şi sunt letale
pentru toţi autozomii, dar şi a majorităţii cromozomilor X. Aneuploidiile cromozomilor
sexuali sunt mai puţin grave decât cele ale autozomilor, datorită inactivării parţiale a
cromozomilor X suplimentari.
(c) Conţinutul genic şi cantitatea de eucromatină/heterocromatină a cromozomului
implicat. Anomaliile care interesează regiunile eucromatice sunt mai grave decât cele care
interesează regiunile bogate în heterocromatină.
(d) Numărul celulelor afectate. Aneuploidiile omogene sunt mai grave decât cele în
mozaic.