Post on 29-Jul-2015
Reactii antigen-anticorp
Conf. Univ. Or. Irina Codita
Antigene,determinanti antigen ici, epitopi
• Antigen = substanta sau corp celular strain deorganism, cu proprietati imunogene (determinaproducerea raspunsului imun)
• Determinanti antigen ici sau epitopi = portiuni dinmolecula antigenica care determinaspecificitatea anticorpilor
• Antigen simplu = are un singur determinantantigenic
• Antigene complexe = au mai multi determinantiantigenici (epitopi)
Caracterele legaturilor necovalente
• Forte slabe
• Legaturi multiple
• Vizeaza lanturile usoare si grele ale Fab -regiunile variabile (mai ales fragmentelehipervariabile)
Importanta reactiilor antigen-anticorp
Asigura componenta efectoare a raspunsului imun de tipumoralConfera rezistenta specifica a gazdei la boli infectioaseIn diagnostic - reprezinta mijloace de recunoastere a:- Prezentei antigenelor unui agent infectios in organismul gazda
(identificarea antigenului cu ajutorul serurilor imune obtinute prininocularea Ag la animale)
- Relatiei organismului gazda cu un anumit agent infectios(infectie acuta, infectie cronica etc.) si a starii de imunitate aorganismului fata de acest antigen (identificarea si/saumasurarea anticorpilor specifici pentru un anumit agent infectiosin organismul gazda)
Natura reactiei antigen-anticorp
• Se produce la suprafata moleculelor deantigen si anticorp
• Potrivire de tip "cheie in broasca"• Interactiuni necovalente:
- l.eqaturi de hidrogen
- Forte electrostatice (ionice)
- Legaturi Van der Waals
- Legaturi hidrofobe
Notiunile de afinitate si aviditate
• Afinitate = forta legaturilor intre un singurdeterminant antigenic si anticorpul produs caurmare a contactului cu acest determinant
• Aviditate = rezultanta fortelor legaturilor dintredeterminanti antigen ici multipli ai unui antigen cumai multi determinanti cu anticorpii multivalentispecifici pentru acesti determinanti - cel maifrecvent in lumea reala
1
Afinitatea
• Inalta:- cand potrivirea intre Ag si Ac este perfecta
(Ac specifici pentru determinantul antigenicsau epitopul respectiv)
- Intervin exclusiv forte de atractie• Joasa:
-Intre un Ac si un determinant antigenicasemanator
-Intervin forte de atractie si forte de respingere
Etapele reactiei antigen-anticorp simodalitati de detectare
Interactiuni primare, rapide, cu fonnarea unui complex labilAg-Ac - nu formeaza complexe vizibile - se detecteazautiiizand tehnici de vizualizare a r. Ag-Ac prin marcare (RIA,ELISA, imunofiuorescenta)
II. Interactiuni secundare urmate de realizarea unui complex Ag-Ac insolubil cu aspect diferit in functie de forma de prezentare aantigenului:
1. Reactii de precipitare - precipitat imun2. Reactii de aglutinare si hemaglutinare imuna
Reactii specia le:1. Reactia de neutralizare a activitatii toxice a antigenului2. Reactii in care participa complementul cu imunocitoliza/hemoliza
Formarea precipitatului imun Ag-Ac
Depinde de: Depind de:_ Afinitate } - Calitatea antigenului: GM, nr. si pozitia
. . determinantilor antigenici si- AViditate _Calitate anticorpului: tip, heterogenitate
- Raportul antigen-an ticorp:• Echilibrat (echivalenta)
• Fenomen de zona - cand unul dintre reactanti este in exces
• Fenomenul Danisz - antigenul (toxina) neulralizata laconcentratia de echivalenta adaugata treptat peste cantitateaechivalenta de Ac nu este complet neutralizata - consuminitial excesiv de Ac
- Temperatura, pH, volum de reactie
Specificitate si cross-reactivitateSpecificitate =- Capacitatea unui anticorp de a se combina cu un singur
determinant antigenic sau- Capacitatea unei populatii de molecule de anticorpi (ex. de tip Ig
M, Ig G etc.) sa reactioneze cu un singur antigen
• Cross-reactivitate =- Capacitatea unui anticorp de a recunoaste mai mult de un
determinant antigenic sau- Capacitatea unei populatii de molecule de anticorpi de a
reactiona cu mai mult de un antigen - in urmatoarele situatii:• Epitopul fata de care a fost elaborat Ac este impartit de antigenul A
si antigenul B• Antigenul A si antigenul B au un epitop similar
Reactii de precipitare
• Antigenul si anticorpul sunt in fazasolubila
• Anticorpii sunt de tip Ig G
Proportia optima
• Raportul cantitativ dintre antigen sianticorp in care reactia de precipitare seproduce in timpul cel mai scurt
• Reprezinta un indicator al raportului deechivalenta
2
Constanta de echilibru(raport concentratii molare)
• Ag + Ac ~ Ag-Ac
[Ag-AC]• K eq =
Variante si aplicatii - precipitare inmediu lichid
II.
Reactia de precipitare in amestec (ftoculare):
1. ~~~~n~a~~~~~~~i~~~ltf)Uro~~~~J~~e~~~it~~~~~~c~tUnei2. Dean si Webb: stabilirea titrulul unui antiser folosind Ag cu
~fWe~~r~t~~a~~~~~C~~a~~i~~C~r~~e~i;C~a~i~~I:)atoxinaReactia de precipitare in tub t in inel) : procedura specialarn~~~~t:~itareaamestecului intre Ag si Ac - reactie la
Diagnostic retrospectiv antrax (Reactia Asco1i)Originea petelor de sange (Reactia Uhlenhut - medicina legala)
Reactii de precipitare in tub capi/ar - detectare proteinapatologice In ser pacienti, determinare de tip pe bazaproteinei M - streptocociReactii de precipitare pe lama (Metoda Ferreira); detectareprodusi de degradare fibrinogen la pacienti cu SCIVD
1.2.
/II.
IV.
Variante si aplicatii - precipitare inmediu solid
Difuzia simpla radiala - difuzia unui reaelant intr-un gel in care esteincorporat celalalt reactant: precipitarea are loc in zona deechivalenta
- ~Ct~~tio~iot~i~~c~~)U~ii~z:!~~~~~:~~~~}~~e~~el~tivaa unor• Imunoplaci cu gel si Ac anti Ig A, 19 G, 19 M• Serul pacientului - aduce antigenul!H ::; imunoglobulina prin functia ei de
antigen care reactioneaza cu anticorpul anti-imunoglobulinaInel de precipitare la zona de echivalenta (semicantitativa-
diametrul inelului corepunzator unei anumite concentratii)Difuzia dubla - difuzia simultana unul spre celalalt a Ag si Acrepartizati in godeuri diferite ale agarului care nu contine initial niciun reactiv
- Ex. dubla difuzie metoda Ouchter1ony pentru determinarea unor~~~~::~:g:~~~~:~~ane:proteina C reactiva, alfa1 fetoproteina,
- ~ft~~c?:~~i1tidi~t~~~u~:~eree~~~o1:~~â~~:reatoxigenezei bacililor
Arcuri de precipitare la zona de echivalenta
Raportul dintre antigen si anticorp-echivalenta, exces Ac, exces Ag
Precipitare in inel si in amestecRing ~recl~l\otl.n t •• t
B='E;:::;:~'""'-. r-;::::!~l!!:m'~~====-,
c 10UI 20UI 40UI 80UI 160UI
1ml 1ml9 1ml 1ml 1ml
Imunodifuzie simpla
®Acin ser
3
runOdifUZie dUl'a
®"7"~~®~-~...~.,~ ~
"I ••. ,,·t••®®-
Imunoelectroforeza
1.
Ac
Ag
2.
Contraimunolectroforeza
+
-AcAg
Metode de imunodifuzie combinatecu migrarea in camp electric
Imunoelectroforeza - etape:1. Electroforeza in gel (separare prin migrare a
antigenelor in functie de incarcaturaelectrica)
2. Adaugare de Ac si dubla imunodifuzie - ex.pentru studiul cantitativ si separareadiferitelor componente ale serului sanguin
Metode de imunodifuzie combinatecu migrarea in camp electric
Contraimunoelectroforeza - dubladifuzie accelerata in camp electric; Ag siAc au incarcatura diferita si sunt asezatiin asa fel incat sa migreze unul sprecelalalt - ex. pentru decelarea acspecifici unui anumit agent infectios (ex.antigen HBs)
Metode de imunodifuzie combinatecu migra rea in camp electric
Electroimunodifuzia - electroforezaantigenului in gel care contine Ac;
- unidimensionala: spoturi;
- bidimensionala: formare de conuri deprecipitare cu h proportionala cuconcentratia antigenului
4
Electroimunadifuzie mana sibidimensianala
Realizarea reactiei de aglutinare
Depinde de:- Raportul antigen-anticorp- Caracterele fizice, chimice si structurale ale
reactantilor- Prezenta anticorpilor incompleti - se
evidentiaza utilizand Ac anti-imunoglobulinespecifice (reactia Coombs)
- Factori nespecifici: timp de incubare, agitarein cursul reactiei, temperatura, pH,concentratie de electroliti
Variante si aplicatiiReactii de aglutinare/hemaglutinare• Caz particular al reactiei de precipitare
• Ag este de natura corpusculara (bacterii)sau fixate la suprafata unor particulecorpusculare inerte (latex, hematii - rol depurtator)
• Ag aglutinanti sunt Ig M sau Ig G
Tipuri de reactii de aglutinare
• Aglutinarea directa
• Aglutinare indirecta
• Aglutinare pasiva
• Hemaglutinare
Aglutinarea directa
• Se utilizeaza pentru identificarea si titrarea:- Ag in prezenta Ac specifici cu titru cunoscut
(identificarea serologica)
- Ac in prezenta Ag cunoscute (serodiagnostic)
• Variante folosite:- Calitativa - aglutinare pe lama
- Cantitativa - aglutinare in tuburi sau godeuri
• Exemple:- Bacteriana: salmoneloze - somatica (tip O), de
suprafata (tip Vi), flagelara (tip H)
5
Aglutinare indirecta
• Se utilizeaza in evidentierea Ac incompletiprin folosirea Ac antiglobulina adaugati inreactie (test antiglobulinic Coombs)
• Agregate:Ag corpuscular si Ac blocanti pe suprafata+ Ac antiglobulinici care determina aparitiaaglutinarii
Aglutinare pasiva inversata
• Anticorpii sunt fixati pe un suportcorpuscular, celular, hematii sau particuleinerte (latex)
• Purtatorii de Ag sunt agregati sub actiuneaAg care a determinat elaborareaanticorpi lor fixati pe particulele purtatoare
• Se utilizeaza pentru identificarea unuiantigen: ex. antigen de grup streptococic(A, 8, C, G)
Reactii Ag-Ac care utilizeazacomplementul
• Reactia de fixare a complementului
• Citoliza
• Imunoaderenta
• Opsonizarea
Aglutinare pasiva ("de purtator")
• Antigenele solubile sunt fixate pe unsuport corpuscular, celular, hematii sauparticule inerte (latex)
• Purtatorii de Ag sunt agregati sub actiuneaserului specific pentru Ag fixat peparticulele purtatoare
Hemaglutinarea
• Formarea unor agregate:-Ag:
• Proprii membranei hematiilor
• Macromoleculare. adsorbite pe suprafatamembranei hematiilor - se utilizeaza ca mordanttratarea prealabila a hematiilor cu tanin sau formol
- Ac: specifici Ag membranare sau Agadsorbite
Reactia de fixare a complementului(RFC)
• Se bazeaza pe capacitatea C de a se fixala suprafata Ig M si Ig G numai dacaacestia sunt complexati cu Ag specifice
• Elementele in reactie:- Sistemul Ag-Ac
- Complementul in cantitate strict suficienta(titrat anterior)
- Sistemul indicator hemolitic
6
Principiul RFC
• Competitie pentru fixarea complementuluiintre sistemul Ag-Ac si sistemul indicatorhemolitic
• Prezenta complexelor Ag-Ac fixeazacomplementul
• Reactie pozitiva = absenta hemolizei• Reactie negativa = prezenta hemolizei
Conditii de efectuare a RFC -interpretare
• Complement (alexina) - strict standardizat, titratin prealabil
• Martori:- Ser sigur pozitiv- Ser sigur negativ- Martor ser pentru complementaritate nespecifica- Martor antigen pentru anticomplementaritate
nespecifica• Ser de cercetat inactivat la 56 o C pentru
inactivarea complementului propriu• Intensitatea hemolizei apreciata pe o scara
RFCComolementFlxlIUon(Dllutlonof Antlsorum)
~"nllbody 1 11:2 1/4 IlS 1/161/321/641/126
~d~~8Bii"ntlbody (mI) 1 1 1 I 1 1 1 1Anllgln (mii I I 1 1 I 1 1 1compllm8nt(ml~ 1 1 1 I 1 1 12CFUaRaCHemolysln(A"tllneep)
Titrare complementComplemantTltntlon
~~:::~:::&..nt (mJj'
Hamol!!sln(AntlohUII)
I I 1 I
I 1 1 I
Aplicatiile RFC
• Reactia Bordet-Wasserman: diagnosticulsifilisului - cu antigen cardiolipinic
• Diagnosticulleptospirozelor
• Diagnosticul tifosului exantematic etc.
7
Citoliza - 1
• Sistem de reactie 1:- Cultura celulara infectata
-Imunoser specific
- Complement
• Principiu: prezenta Ac specifici agentuluiinfectios determina liza celulara prinactivarea complementului si fixarea pemembrana a complexului de atac
Imunoaderenta
• Definitie: capacitatea unor microorganisme(bacterii, virusuri, paraziti) de a se fixa peun suport particulat (celule, hematii) inprezenta Ac corespunzatori si aComplementului
Reactii de seroneutralizare (RSN)
• Reactie Ag-Ac care are ca rezultatinhibarea specifica a activitatii biologiceexercitate de Ag asupra unui substratspecific:
• Activitate biologica determinata (virusuri,toxine, enzime)
Citoliza - 2
• Sistem de reactie 2:- Celule
- Imunoser anti complex MHC (Complex Major deHistocompatibilitate)
- Complement
• Principiu: prezenta Ag de histocompatibilitatecorespunzator unui anumit antiser determina lizacelulara prin activarea complementului si fixareape membrana a complexului de atac
Opsonizarea
• Definitie = stimularea fagocitarii unorantigene in prezenta serurilor imune si acomplementului
Complexarea Ag-Ac
Depinde de:
- Raportul antigen-anticorp
- Caracterele fizice, chimice si structurale alereactantilor (stabilitatea legaturilor)
- Factori nespecifici: viteza de combinare,temperatura, pH, concentra tie de electroliti
8
Sistemul de reactie
• Antigene biologic active (ex. hemolitice,citotoxice etc.)
• Imunoseruri neutralizante specifice• Substrate celulare indicatoare:
- Animale sensibile
- Culturi celulare sau celule
- Substrat marcat chimic pe suport inert
Tipuri RSN• In functie de mediul in care are loc evidentierea
seroneutralizarii:- Seroneulralizare in vivo: lOR Shick, Oick; administrare seruri
antitoxice, identificarea tipului de toxina botulinica pe soarece- Seroneutralizare in vi/ro: ASLO, serodiagnosticul infectiilor virale
In functie de scopul urmarit:- Identificarea si clasificarea serologica a structurilor antigenice- Terapia cu seruri imune neutralizante antitoxice, antibacteriene
sau antivirale- Evaluarea eficacitatii unor vaccinuri: stabilirea concentratiei Ac
protectori detenninati prin vaccinare; stabilirea potenteivaccinuriJor
- Titrarea concentratiei (puterea toxica a exotoxinelor)
Seroneutralizare in vivo - 2Administrare terapeutica de seruri
antitoxice
• Blocheaza actiunea toxinelor elaborate degermeni patogeni
• Ex.: ser antidifteric, ser antitetanic
Etapele RSN
• Etapa 1: in vitro = complexare Ag-Ac• Etapa 2: in vivo sau in vitro - punerea in
contact cu sistemul decelant, pentruevidentierea eventualei neutralizari aefectelor Ag (ex. Hematie sau celulaasupra careia actioneaza activitateabiologica a antigenului)
Seroneutralizare in vivo - 1: IDR
• Evidentierea unui nivel neutralizant eficacede Ac circulanti protectori fata de anumitetoxine bacteriene:- lOR Schick - in difterie
- lOR Oick - in scarlatina
• Principiu - prezenta Ac serici neutralizantiimpiedica aparitia inflamatiei localeproduse de injectarea toxinei
Seroneutralizare in vivo - 3Testul de seroprotectie (toxinotipaj)
• Se practica pe soarece, care este omoratde toxina botulinica
• Se evidentiaza prezenta celor 3 tipuri detoxina botulinica: A, B, E, cu ajutorulserurilor specifice de tip
Seroneutralizare in vitro - 1Reactia ASLO
Sistem de reactie:• Antistreptolizina O• Streptolizina (toxina streptococica cu
activitate hemolitica Oxigen stabila)• Sistem indicator (hematii)• Scopul determinarii:
- Determinarea titrului Ac in serul bolnavilor sauconvalescentilor
- Utilizare in diagnostic, evolutie, prognostic
Alte reactii antigen-anticorp
• Reactia de imunofluorescenta
• Reactia imunoenzimatice
• Metode radioimunometrice
Imunofluorescenta
• Ag se cupleaza cu Ac marcati cu fluorocromi
• Evidentierea complexelor la microscop cufluorescenta
• Aplicatii: detectare antigene microbiene,detectare Ac in boli autoimune
• 2 metode:- Directa: Ag + Ac fluorescent = complex fluorescent
- Indirecta: Ag + Ac specific + Ac antigamaglobulinamarcat cu fluorocrom = complex fluorescent; varianta:sistem biotina-avidina
Seroneutralizare in vitro - 2Serodiagnosticul infectiilor virale
prin titrarea Ac neutralizanti
• Sistem de reactie:- Antigene virale standard
- Anticorpi neutralizanti
~orH'2'lor~fITI: IUI"p. hZllm.
Iii!
Reactii imunoenzimatice
• Sistem de reactie:-Ag- Ac specific cuplat cu o enzima (peroxidaza, fosfataza
alcalina)- Substrat enzima- Sistem de detectie a degradarii substratului
• Principiu: enzima actioneaza numai daca Acmarcat formeaza un complex cu Ag
• Ex. - evidentierea Ag HBs• Avantaj: sensibilitate crescuta
10
Metode radioimunometrice
• Sistem de reactie:• Ag si Ac - unul dintre ei marcat cu izotopi
radioactivi (H3, C14, 1125)• Utilizare: detectare substante in cantitati
foarte miciLa multi ani!
11