Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

11
Reactii antigen-anticorp Conf. Univ. Or. Irina Codita Antigene, determinanti antigen ici, epitopi • Antigen = substanta sau corp celular strain de organism, cu proprietati imunogene (determina producerea raspunsului imun) Determinanti antigen ici sau epitopi = portiuni din molecula antigenica care determina specificitatea anticorpilor • Antigen simplu = are un singur determinant antigenic • Antigene complexe = au mai multi determinanti antigenici (epitopi) Caracterele legaturilor necovalente • Forte slabe • Legaturi multiple • Vizeaza lanturile usoare si grele ale Fab - regiunile variabile (mai ales fragmentele hipervariabile) Importanta reactiilor antigen-anticorp Asigura componenta efectoare a raspunsului imun de tip umoral Confera rezistenta specifica a gazdei la boli infectioase In diagnostic - reprezinta mijloace de recunoastere a: - Prezentei antigenelor unui agent infectios in organismul gazda (identificarea antigenului cu ajutorul serurilor imune obtinute prin inocularea Ag la animale) - Relatiei organismului gazda cu un anumit agent infectios (infectie acuta, infectie cronica etc.) si a starii de imunitate a organismului fata de acest antigen (identificarea si/sau masurarea anticorpilor specifici pentru un anumit agent infectios in organismul gazda) Natura reactiei antigen-anticorp • Se produce la suprafata moleculelor de antigen si anticorp • Potrivire de tip "cheie in broasca" • Interactiuni necovalente: - l.eqaturi de hidrogen - Forte electrostatice (ionice) - Legaturi Van der Waals - Legaturi hidrofobe Notiunile de afinitate si aviditate • Afinitate = forta legaturilor intre un singur determinant antigenic si anticorpul produs ca urmare a contactului cu acest determinant • Aviditate = rezultanta fortelor legaturilor dintre determinanti antigen ici multipli ai unui antigen cu mai multi determinanti cu anticorpii multivalenti specifici pentru acesti determinanti - cel mai frecvent in lumea reala 1

Transcript of Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

Page 1: Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

Reactii antigen-anticorp

Conf. Univ. Or. Irina Codita

Antigene,determinanti antigen ici, epitopi

• Antigen = substanta sau corp celular strain deorganism, cu proprietati imunogene (determinaproducerea raspunsului imun)

• Determinanti antigen ici sau epitopi = portiuni dinmolecula antigenica care determinaspecificitatea anticorpilor

• Antigen simplu = are un singur determinantantigenic

• Antigene complexe = au mai multi determinantiantigenici (epitopi)

Caracterele legaturilor necovalente

• Forte slabe

• Legaturi multiple

• Vizeaza lanturile usoare si grele ale Fab -regiunile variabile (mai ales fragmentelehipervariabile)

Importanta reactiilor antigen-anticorp

Asigura componenta efectoare a raspunsului imun de tipumoralConfera rezistenta specifica a gazdei la boli infectioaseIn diagnostic - reprezinta mijloace de recunoastere a:- Prezentei antigenelor unui agent infectios in organismul gazda

(identificarea antigenului cu ajutorul serurilor imune obtinute prininocularea Ag la animale)

- Relatiei organismului gazda cu un anumit agent infectios(infectie acuta, infectie cronica etc.) si a starii de imunitate aorganismului fata de acest antigen (identificarea si/saumasurarea anticorpilor specifici pentru un anumit agent infectiosin organismul gazda)

Natura reactiei antigen-anticorp

• Se produce la suprafata moleculelor deantigen si anticorp

• Potrivire de tip "cheie in broasca"• Interactiuni necovalente:

- l.eqaturi de hidrogen

- Forte electrostatice (ionice)

- Legaturi Van der Waals

- Legaturi hidrofobe

Notiunile de afinitate si aviditate

• Afinitate = forta legaturilor intre un singurdeterminant antigenic si anticorpul produs caurmare a contactului cu acest determinant

• Aviditate = rezultanta fortelor legaturilor dintredeterminanti antigen ici multipli ai unui antigen cumai multi determinanti cu anticorpii multivalentispecifici pentru acesti determinanti - cel maifrecvent in lumea reala

1

Page 2: Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

Afinitatea

• Inalta:- cand potrivirea intre Ag si Ac este perfecta

(Ac specifici pentru determinantul antigenicsau epitopul respectiv)

- Intervin exclusiv forte de atractie• Joasa:

-Intre un Ac si un determinant antigenicasemanator

-Intervin forte de atractie si forte de respingere

Etapele reactiei antigen-anticorp simodalitati de detectare

Interactiuni primare, rapide, cu fonnarea unui complex labilAg-Ac - nu formeaza complexe vizibile - se detecteazautiiizand tehnici de vizualizare a r. Ag-Ac prin marcare (RIA,ELISA, imunofiuorescenta)

II. Interactiuni secundare urmate de realizarea unui complex Ag-Ac insolubil cu aspect diferit in functie de forma de prezentare aantigenului:

1. Reactii de precipitare - precipitat imun2. Reactii de aglutinare si hemaglutinare imuna

Reactii specia le:1. Reactia de neutralizare a activitatii toxice a antigenului2. Reactii in care participa complementul cu imunocitoliza/hemoliza

Formarea precipitatului imun Ag-Ac

Depinde de: Depind de:_ Afinitate } - Calitatea antigenului: GM, nr. si pozitia

. . determinantilor antigenici si- AViditate _Calitate anticorpului: tip, heterogenitate

- Raportul antigen-an ticorp:• Echilibrat (echivalenta)

• Fenomen de zona - cand unul dintre reactanti este in exces

• Fenomenul Danisz - antigenul (toxina) neulralizata laconcentratia de echivalenta adaugata treptat peste cantitateaechivalenta de Ac nu este complet neutralizata - consuminitial excesiv de Ac

- Temperatura, pH, volum de reactie

Specificitate si cross-reactivitateSpecificitate =- Capacitatea unui anticorp de a se combina cu un singur

determinant antigenic sau- Capacitatea unei populatii de molecule de anticorpi (ex. de tip Ig

M, Ig G etc.) sa reactioneze cu un singur antigen

• Cross-reactivitate =- Capacitatea unui anticorp de a recunoaste mai mult de un

determinant antigenic sau- Capacitatea unei populatii de molecule de anticorpi de a

reactiona cu mai mult de un antigen - in urmatoarele situatii:• Epitopul fata de care a fost elaborat Ac este impartit de antigenul A

si antigenul B• Antigenul A si antigenul B au un epitop similar

Reactii de precipitare

• Antigenul si anticorpul sunt in fazasolubila

• Anticorpii sunt de tip Ig G

Proportia optima

• Raportul cantitativ dintre antigen sianticorp in care reactia de precipitare seproduce in timpul cel mai scurt

• Reprezinta un indicator al raportului deechivalenta

2

Page 3: Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

Constanta de echilibru(raport concentratii molare)

• Ag + Ac ~ Ag-Ac

[Ag-AC]• K eq =

Variante si aplicatii - precipitare inmediu lichid

II.

Reactia de precipitare in amestec (ftoculare):

1. ~~~~n~a~~~~~~~i~~~ltf)Uro~~~~J~~e~~~it~~~~~~c~tUnei2. Dean si Webb: stabilirea titrulul unui antiser folosind Ag cu

~fWe~~r~t~~a~~~~~C~~a~~i~~C~r~~e~i;C~a~i~~I:)atoxinaReactia de precipitare in tub t in inel) : procedura specialarn~~~~t:~itareaamestecului intre Ag si Ac - reactie la

Diagnostic retrospectiv antrax (Reactia Asco1i)Originea petelor de sange (Reactia Uhlenhut - medicina legala)

Reactii de precipitare in tub capi/ar - detectare proteinapatologice In ser pacienti, determinare de tip pe bazaproteinei M - streptocociReactii de precipitare pe lama (Metoda Ferreira); detectareprodusi de degradare fibrinogen la pacienti cu SCIVD

1.2.

/II.

IV.

Variante si aplicatii - precipitare inmediu solid

Difuzia simpla radiala - difuzia unui reaelant intr-un gel in care esteincorporat celalalt reactant: precipitarea are loc in zona deechivalenta

- ~Ct~~tio~iot~i~~c~~)U~ii~z:!~~~~~:~~~~}~~e~~el~tivaa unor• Imunoplaci cu gel si Ac anti Ig A, 19 G, 19 M• Serul pacientului - aduce antigenul!H ::; imunoglobulina prin functia ei de

antigen care reactioneaza cu anticorpul anti-imunoglobulinaInel de precipitare la zona de echivalenta (semicantitativa-

diametrul inelului corepunzator unei anumite concentratii)Difuzia dubla - difuzia simultana unul spre celalalt a Ag si Acrepartizati in godeuri diferite ale agarului care nu contine initial niciun reactiv

- Ex. dubla difuzie metoda Ouchter1ony pentru determinarea unor~~~~::~:g:~~~~:~~ane:proteina C reactiva, alfa1 fetoproteina,

- ~ft~~c?:~~i1tidi~t~~~u~:~eree~~~o1:~~â~~:reatoxigenezei bacililor

Arcuri de precipitare la zona de echivalenta

Raportul dintre antigen si anticorp-echivalenta, exces Ac, exces Ag

Precipitare in inel si in amestecRing ~recl~l\otl.n t •• t

B='E;:::;:~'""'-. r-;::::!~l!!:m'~~====-,

c 10UI 20UI 40UI 80UI 160UI

1ml 1ml9 1ml 1ml 1ml

Imunodifuzie simpla

®Acin ser

3

Page 4: Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

runOdifUZie dUl'a

®"7"~~®~-~...~.,~ ~

"I ••. ,,·t••®®-

Imunoelectroforeza

1.

Ac

Ag

2.

Contraimunolectroforeza

+

-AcAg

Metode de imunodifuzie combinatecu migrarea in camp electric

Imunoelectroforeza - etape:1. Electroforeza in gel (separare prin migrare a

antigenelor in functie de incarcaturaelectrica)

2. Adaugare de Ac si dubla imunodifuzie - ex.pentru studiul cantitativ si separareadiferitelor componente ale serului sanguin

Metode de imunodifuzie combinatecu migrarea in camp electric

Contraimunoelectroforeza - dubladifuzie accelerata in camp electric; Ag siAc au incarcatura diferita si sunt asezatiin asa fel incat sa migreze unul sprecelalalt - ex. pentru decelarea acspecifici unui anumit agent infectios (ex.antigen HBs)

Metode de imunodifuzie combinatecu migra rea in camp electric

Electroimunodifuzia - electroforezaantigenului in gel care contine Ac;

- unidimensionala: spoturi;

- bidimensionala: formare de conuri deprecipitare cu h proportionala cuconcentratia antigenului

4

Page 5: Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

Electroimunadifuzie mana sibidimensianala

Realizarea reactiei de aglutinare

Depinde de:- Raportul antigen-anticorp- Caracterele fizice, chimice si structurale ale

reactantilor- Prezenta anticorpilor incompleti - se

evidentiaza utilizand Ac anti-imunoglobulinespecifice (reactia Coombs)

- Factori nespecifici: timp de incubare, agitarein cursul reactiei, temperatura, pH,concentratie de electroliti

Variante si aplicatiiReactii de aglutinare/hemaglutinare• Caz particular al reactiei de precipitare

• Ag este de natura corpusculara (bacterii)sau fixate la suprafata unor particulecorpusculare inerte (latex, hematii - rol depurtator)

• Ag aglutinanti sunt Ig M sau Ig G

Tipuri de reactii de aglutinare

• Aglutinarea directa

• Aglutinare indirecta

• Aglutinare pasiva

• Hemaglutinare

Aglutinarea directa

• Se utilizeaza pentru identificarea si titrarea:- Ag in prezenta Ac specifici cu titru cunoscut

(identificarea serologica)

- Ac in prezenta Ag cunoscute (serodiagnostic)

• Variante folosite:- Calitativa - aglutinare pe lama

- Cantitativa - aglutinare in tuburi sau godeuri

• Exemple:- Bacteriana: salmoneloze - somatica (tip O), de

suprafata (tip Vi), flagelara (tip H)

5

Page 6: Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

Aglutinare indirecta

• Se utilizeaza in evidentierea Ac incompletiprin folosirea Ac antiglobulina adaugati inreactie (test antiglobulinic Coombs)

• Agregate:Ag corpuscular si Ac blocanti pe suprafata+ Ac antiglobulinici care determina aparitiaaglutinarii

Aglutinare pasiva inversata

• Anticorpii sunt fixati pe un suportcorpuscular, celular, hematii sau particuleinerte (latex)

• Purtatorii de Ag sunt agregati sub actiuneaAg care a determinat elaborareaanticorpi lor fixati pe particulele purtatoare

• Se utilizeaza pentru identificarea unuiantigen: ex. antigen de grup streptococic(A, 8, C, G)

Reactii Ag-Ac care utilizeazacomplementul

• Reactia de fixare a complementului

• Citoliza

• Imunoaderenta

• Opsonizarea

Aglutinare pasiva ("de purtator")

• Antigenele solubile sunt fixate pe unsuport corpuscular, celular, hematii sauparticule inerte (latex)

• Purtatorii de Ag sunt agregati sub actiuneaserului specific pentru Ag fixat peparticulele purtatoare

Hemaglutinarea

• Formarea unor agregate:-Ag:

• Proprii membranei hematiilor

• Macromoleculare. adsorbite pe suprafatamembranei hematiilor - se utilizeaza ca mordanttratarea prealabila a hematiilor cu tanin sau formol

- Ac: specifici Ag membranare sau Agadsorbite

Reactia de fixare a complementului(RFC)

• Se bazeaza pe capacitatea C de a se fixala suprafata Ig M si Ig G numai dacaacestia sunt complexati cu Ag specifice

• Elementele in reactie:- Sistemul Ag-Ac

- Complementul in cantitate strict suficienta(titrat anterior)

- Sistemul indicator hemolitic

6

Page 7: Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

Principiul RFC

• Competitie pentru fixarea complementuluiintre sistemul Ag-Ac si sistemul indicatorhemolitic

• Prezenta complexelor Ag-Ac fixeazacomplementul

• Reactie pozitiva = absenta hemolizei• Reactie negativa = prezenta hemolizei

Conditii de efectuare a RFC -interpretare

• Complement (alexina) - strict standardizat, titratin prealabil

• Martori:- Ser sigur pozitiv- Ser sigur negativ- Martor ser pentru complementaritate nespecifica- Martor antigen pentru anticomplementaritate

nespecifica• Ser de cercetat inactivat la 56 o C pentru

inactivarea complementului propriu• Intensitatea hemolizei apreciata pe o scara

RFCComolementFlxlIUon(Dllutlonof Antlsorum)

~"nllbody 1 11:2 1/4 IlS 1/161/321/641/126

~d~~8Bii"ntlbody (mI) 1 1 1 I 1 1 1 1Anllgln (mii I I 1 1 I 1 1 1compllm8nt(ml~ 1 1 1 I 1 1 12CFUaRaCHemolysln(A"tllneep)

Titrare complementComplemantTltntlon

~~:::~:::&..nt (mJj'

Hamol!!sln(AntlohUII)

I I 1 I

I 1 1 I

Aplicatiile RFC

• Reactia Bordet-Wasserman: diagnosticulsifilisului - cu antigen cardiolipinic

• Diagnosticulleptospirozelor

• Diagnosticul tifosului exantematic etc.

7

Page 8: Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

Citoliza - 1

• Sistem de reactie 1:- Cultura celulara infectata

-Imunoser specific

- Complement

• Principiu: prezenta Ac specifici agentuluiinfectios determina liza celulara prinactivarea complementului si fixarea pemembrana a complexului de atac

Imunoaderenta

• Definitie: capacitatea unor microorganisme(bacterii, virusuri, paraziti) de a se fixa peun suport particulat (celule, hematii) inprezenta Ac corespunzatori si aComplementului

Reactii de seroneutralizare (RSN)

• Reactie Ag-Ac care are ca rezultatinhibarea specifica a activitatii biologiceexercitate de Ag asupra unui substratspecific:

• Activitate biologica determinata (virusuri,toxine, enzime)

Citoliza - 2

• Sistem de reactie 2:- Celule

- Imunoser anti complex MHC (Complex Major deHistocompatibilitate)

- Complement

• Principiu: prezenta Ag de histocompatibilitatecorespunzator unui anumit antiser determina lizacelulara prin activarea complementului si fixareape membrana a complexului de atac

Opsonizarea

• Definitie = stimularea fagocitarii unorantigene in prezenta serurilor imune si acomplementului

Complexarea Ag-Ac

Depinde de:

- Raportul antigen-anticorp

- Caracterele fizice, chimice si structurale alereactantilor (stabilitatea legaturilor)

- Factori nespecifici: viteza de combinare,temperatura, pH, concentra tie de electroliti

8

Page 9: Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

Sistemul de reactie

• Antigene biologic active (ex. hemolitice,citotoxice etc.)

• Imunoseruri neutralizante specifice• Substrate celulare indicatoare:

- Animale sensibile

- Culturi celulare sau celule

- Substrat marcat chimic pe suport inert

Tipuri RSN• In functie de mediul in care are loc evidentierea

seroneutralizarii:- Seroneulralizare in vivo: lOR Shick, Oick; administrare seruri

antitoxice, identificarea tipului de toxina botulinica pe soarece- Seroneutralizare in vi/ro: ASLO, serodiagnosticul infectiilor virale

In functie de scopul urmarit:- Identificarea si clasificarea serologica a structurilor antigenice- Terapia cu seruri imune neutralizante antitoxice, antibacteriene

sau antivirale- Evaluarea eficacitatii unor vaccinuri: stabilirea concentratiei Ac

protectori detenninati prin vaccinare; stabilirea potenteivaccinuriJor

- Titrarea concentratiei (puterea toxica a exotoxinelor)

Seroneutralizare in vivo - 2Administrare terapeutica de seruri

antitoxice

• Blocheaza actiunea toxinelor elaborate degermeni patogeni

• Ex.: ser antidifteric, ser antitetanic

Etapele RSN

• Etapa 1: in vitro = complexare Ag-Ac• Etapa 2: in vivo sau in vitro - punerea in

contact cu sistemul decelant, pentruevidentierea eventualei neutralizari aefectelor Ag (ex. Hematie sau celulaasupra careia actioneaza activitateabiologica a antigenului)

Seroneutralizare in vivo - 1: IDR

• Evidentierea unui nivel neutralizant eficacede Ac circulanti protectori fata de anumitetoxine bacteriene:- lOR Schick - in difterie

- lOR Oick - in scarlatina

• Principiu - prezenta Ac serici neutralizantiimpiedica aparitia inflamatiei localeproduse de injectarea toxinei

Seroneutralizare in vivo - 3Testul de seroprotectie (toxinotipaj)

• Se practica pe soarece, care este omoratde toxina botulinica

• Se evidentiaza prezenta celor 3 tipuri detoxina botulinica: A, B, E, cu ajutorulserurilor specifice de tip

Page 10: Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

Seroneutralizare in vitro - 1Reactia ASLO

Sistem de reactie:• Antistreptolizina O• Streptolizina (toxina streptococica cu

activitate hemolitica Oxigen stabila)• Sistem indicator (hematii)• Scopul determinarii:

- Determinarea titrului Ac in serul bolnavilor sauconvalescentilor

- Utilizare in diagnostic, evolutie, prognostic

Alte reactii antigen-anticorp

• Reactia de imunofluorescenta

• Reactia imunoenzimatice

• Metode radioimunometrice

Imunofluorescenta

• Ag se cupleaza cu Ac marcati cu fluorocromi

• Evidentierea complexelor la microscop cufluorescenta

• Aplicatii: detectare antigene microbiene,detectare Ac in boli autoimune

• 2 metode:- Directa: Ag + Ac fluorescent = complex fluorescent

- Indirecta: Ag + Ac specific + Ac antigamaglobulinamarcat cu fluorocrom = complex fluorescent; varianta:sistem biotina-avidina

Seroneutralizare in vitro - 2Serodiagnosticul infectiilor virale

prin titrarea Ac neutralizanti

• Sistem de reactie:- Antigene virale standard

- Anticorpi neutralizanti

~orH'2'lor~fITI: IUI"p. hZllm.

Iii!

Reactii imunoenzimatice

• Sistem de reactie:-Ag- Ac specific cuplat cu o enzima (peroxidaza, fosfataza

alcalina)- Substrat enzima- Sistem de detectie a degradarii substratului

• Principiu: enzima actioneaza numai daca Acmarcat formeaza un complex cu Ag

• Ex. - evidentierea Ag HBs• Avantaj: sensibilitate crescuta

10

Page 11: Microbiologie - Reactia Antigen-Anticorp

Metode radioimunometrice

• Sistem de reactie:• Ag si Ac - unul dintre ei marcat cu izotopi

radioactivi (H3, C14, 1125)• Utilizare: detectare substante in cantitati

foarte miciLa multi ani!

11