Post on 23-Feb-2018
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
1/41
Inginerie citotisularaInginerie citotisulara
si organe artificialesi organe artificiale
CURS 7
Ingineria tisulara a osului siIngineria tisulara a osului si
cartilajuluicartilajului
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
2/41
esutul osos este unul dintre numeroasele tipuri de esutconjunctiv ce se gsete n organism, care implic o matrice
extracelular bogatn colagen. Alte exemple de esut conjunctiv
sunt cartilajul, ligamentele, tendoanele, muchii.
esutului osos i se atribuie trei funcii importante norganismul uman:
(i) ofer sprijin mecanic precum i suport pentru inserarea
muchilor,
(ii) are un rol protector pentru organele internei mduv,
(iii)furnizeaz ionii necesari pentru funcionarea normal a
organismului
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
3/41
Structur i compoziia esutuluiosos
esutulosos n sine este compus din mai multe tipuri de celule diferitefiecare cufuncialorspecific,precumio matriceextracelular, aacum sepoate observa din figura 1. Matriceaextracelulareste compus din 95% decolagen de tip Iiproteoglicani,mpreuncu proteine noncolagenice, 5%.Proteoglicanii sunt molecule de greutate molecular ridicat derivai dinproteineipolizaharide, care, de obicei, segsescnesuturilestructuraleicele conjunctive. Un exemplu de proteoglicani sunt GAG, frecventntlniilanivelulesutuluiosos cticel cartilaginos.
Structura tesutului osos cortical si spongios
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
4/41
Osul este unesut de legtur,format dintr-o matriceextracelularmineralizat icelule specializate: osteoblaste - OB, osteociteiosteoclaste- OC. Principalul component organic al matricei este colagenul de tip I, ceeste n procent de 90%, i restul de 10% este repezentat de o serie deproteine nestructurale de dimensiuni mici, printre care se gseteosteocalcina, osteonectina, unele fosfolipide, siloproteine, factori decretere
iproteine serice.
Faza anorganic este alctuit din cristale minuscule dintr-unmineral cu caracter alcalin, Hap. Aceste cristale se ncrucieazcu fibrelede colagen pentru a forma un material ce ntrunete caracteristicileadecvate de rigiditate, flexibilitatei rezisten.
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
5/41
OB, celulele formatoare de os,lucreazn grupuri pentru a segregaia mineraliza, pachete din matriceaosoas. Microscopic, OB active, suntobservate precum nite celule cuboidale, cu un reticul endoplasmatic
proeminent, caracteristic celulelor secretoare de proteine, situate lasuprafaa osoas (figura 2). Aceste celule sintetizeaz din abundenfosfataz alcalin, o enzim care contribuie la mineralizarea matriceiextracelulare.
Schema de formare siresorbie a esutuluiosos n funcie desarcinile aplicate
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
6/41
Remodelarea osoas cuprinde cinci faze
distincte:
Faza de repaus: cndsuprafaa esutuluiosos esteacoperitcu celule inactive. OB sunt fixate n matriceamineralizat.
Faza de activarea:stimulii hormonali sau fizici trimit semnalectre monocitele mononucleareimacrofage pentru a migra lalocul unde estenecesarremodelareaipentru a sediferenia
n OC.Faza de resorbie: OC ncep s elimine componentele
organice i minerale de la nivelul esutului osos precum iformarea unei caviti caracteristice denumite lacuna luiHowship, la nivelul esutului osos trabecular ct i la nivelulesutuluicortical.
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
7/41
Faza de inversie: OC dispar, iar celulele macrofage mononucleare
se aglomereaz n zona resorbit de ctre osteoclaste, depozitnd osubstan care va favoriza depunerea noului esut osos; dup carepre-osteoblstele ncep s apar datorit unor factori de stimulareprecum IGF-2 i TGF-.
Faza de formare: OB se difereniaz i acoper cavitatea formatde OC ducnd la formarea de noi osteoni prin depunerea de colagen
de tip I.
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
8/41
Remodelarea esutului osos
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
9/41
1.Hormonii:Hormonul paratiroidian(PTH): formareaiactivitatea OC;
proliferareaiactivitateaOB turnoverPTH intermitent: formareaesutuluiosos in
vivoPTH n doze mari: resorbie osoas
pierdereaesutuluiosos.Vitamina D: formareaiactivitatea OC;
proliferarea OB; difereniereaOB
Necesarpentru mineralizarea matricei osoase:deficien rahitism.Calcitonina: formareaiactivitatea OC.Glucocorticoizii:
Necesari pentru dezvoltareai funcionarea normala
osuluin exces pierdere de esutosos/ osteoporoz.Hormoni de cretere:
Necesari pentrucreterea normala scheletului.Hormonii sexuali(estogeniiandrogeni):
formareaiactivitateaOC; activitatea OB (posibil)
Deficitul osteoporozii
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
10/41
2. Factori locali:
Factorii de cretere i citochinele:Efect variabil asupra formrii i activitii OC i OB
Alte molecule:
Prostaglandinele: activitatea OCLeucotrinele: formarea i activitatea OCATP extracelular: formarea i activitatea OC,
activitatea OB
Bradikinina: formarea i activitatea OCCGRP (Calcitonin-Gene Related Peptide): formarea iactivitatea OC
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
11/41
3.Ageni anorganici (locali i sistemici) :H+ extracelular (pH < 7,2): activitatea OC, activitatea OBPO4
3-: formarea i activitatea OCCa2+ : formarea i activitatea OC (efect limitat)F- : formarea osoas
Hipoxia: formrii OC, funciei OBOxidul nitric: formarea i activitatea OC, activitatea OB,intervine n rspunsul la solicitri mecanice
4.Efecte mecanice:
ncrcturi regulare ciclice: activitatea OB, formarea osoas.Absena greutilor: formarea i activitatea OCSchimbri majore ale presiunii hidrostatice: apoptoza OC
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
12/41
Proprietile mecanice ale esutului osos
esut osos cortical Rezisten (MPa s.d.)Modulul de elasticitate
(GPa s.d.)
CompresiuneTractiune
Torsiune
180 36 18,6 28,8
151 28 7,1 28,2
65 9
esut osos spongios Rezisten (MPa s.d.)Modulul de elasticitate
(MPa
s.d.)Compresiune 1,512 40400
Tabelul 2. Proprietaile mecanice ale esutul osos uman
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
13/41
Grefele osoase sunt necesarepentru repararea tesuturilor
lezate ca urmare a:
traume- boli
defecte congenitale
Restabilirea functiei osoase
protejare organe vitale
medierea activitatilor
dependente de musculoschelet
Perspective clinicePerspective clinice Os sanatos
Os - osteoporoza
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
14/41
Semnificatie clinicaSemnificatie clinica
Tesutul osos ocupa locul 2 intre cele maitransplantate tesuturi:
643,000 proceduri anuale (USA)
cost ~ $600 milioane/an (USA)Natura transplantului
45% autologe
45% alogenice
10% sintetice
10% dintre grefe esueaza
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
15/41
Grefe osoase autologeGrefe osoase autologe Transplantul de tesut de la acelasi pacient -
Stimulare Vindecare
Imbunatatiri clinice:
celule, factori de crestere in tesutul grefat
Pot fi remodelate:
nou os format
grefa transplantata resorbita
Limitari:
disponibilitatea de tesut donor (forma si marime)
doua interventii chirurgicale (dureros pentru pacient,
cost ridicat)
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
16/41
Grefe alogenice si sinteticeGrefe alogenice si sintetice
Inlocuirea functiei tesutului
Avantaje
varietate de forma si marime interventie chirurgicala unica
Dezavantaje
integrare slaba
rupturi mecanice in material
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
17/41
StrategiaStrategia inin ingineriaingineria tisularatisulara aa
osuluiosului Producerea de materiale cu caracteristici
similare grefelor osoase autologe
Producerea de materiale cu compozitie similara
grefelor osoase autologe
celule si factori de crestere in matrice colagenice
mineralizata
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
18/41
StrategiaStrategia inin ingineriaingineria tisularatisulara aa
osuluiosului sisi cartilajuluicartilajului
Suport
Aplicatie
clinica
Celule
Substante
active
Cultura de celule
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
19/41
SuportulSuportul
Definit de forma tesutului care trebuie vindecat Macroporos cu suprafata extinsa pentru a favoriza
adeziunea celulara si dezvoltarea de tesut
Goldstein et al. Tissue Eng 5:421, 1999
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
20/41
Pentru ingineria esutului osos, materialele de
substituietrebuiesprezinte:
Biocompatibilitate: lipsarspunsuluiimunogenic. Biodegradabilitate: este un material ceodatimplantatsufera un fenomen de degradare (enzimatic, acid,
bazic), prin interaciune cu sistemele biologice. Acest
degradare se produce ca rezultat al unui proces de alterare
i transformare al implantului datorit aciunilorcelulare,
enzimatice, bacteriane sau virale.
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
21/41
Osteoconductivitate:este o proprietatepasiva unui
material ce permite acceptarea i conducerea creteriiosoase. Aceasta cretere se realizeaz prin invazia
vascular i celular.
Osteoinductivitate: este capacitatea unui material dea induce odifereniere celular pnla sinteza matricei
osoase mineralizate. Osteogenitate: reprezint formarea esutului ososnou format din osteoblaste.
Proprieti mecanice: materialele de substituietrebuie s posede proprieti mecanice asemntoare
cu cele ale esuturilor nvecinate pentru a preveni undezechilibru mecanic, care poate duce la stres i
resorbie osoas.
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
22/41
SuportulSuportulCaracteristici esentiale
stimuleze functiile celulare: factori bioactivi pe
suprafata materialului, medicament/gene in
material
compliante/degradare
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
23/41
Dintre diferitele solutii care s-au propus ca materiale desubstitutie a osului sau care sa ajute regenerarea acestuia se pot cita
ceramicile de hidroxiapatita, amestecate sau nu cu colagen.
Materialele cu colagen - foarte bune biocompatibilitati dei
sunt putin osteoconductoare, cele mai utilizate materiale colagenicefiind atelocolagenul sau fibra de colagen
Un biomaterial implantabil s-a realizat prin formarea treptat decristale de hidroxiapatit ntr-o matrice tip burete de colagen
liofilizat.
SuportulSuportul -- osos
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
24/41
Rezultate
In timp ce buretele de colagen netratat s-a degradat rapid (ntr-o zi),
implantul ncrcat cu minerale a fost capabil s-i menin integritatea
timp de 2 sptmni. In cultura de celule s-a pus n eviden o degradaremedie a implantului printr-o descretere a coninutului de calciu.
Morfologia colagenul liofilizat i forma sa mineralizat (coninnd fosfatde calciu) arata ca structuraporoas a colagenului liofilizat original a fost
meninut cnd s-a realizat depunerea cristalelor de fosfat de calciu deform acicular. Aceasta are o semnificatie deosebita atunci cnd seateapt ca matricea de colagen s fie utilizata pentru creterea iproliferarea celular, difuzia celulelor fiind dependenta de marimeaporilor suportului. Buretele colagenic are, n stadiul uscat,
Pstrarea morfologiei celulare, rotunde originale, asociat cuinteractiunea moderat celul- substrat indic n general faptulca celula si manifest functia sa diferential.
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
25/41
Fosfat de calciu Colagen OS
Fosfat de calciu
sintetic
PolimerCompozit Fosfat de
calciu / Polimer
=
=
1. Proprietati care sa simuleze pe cele ale osului natural
2. Bioactivitate
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
26/41
Componentul Abreviere Formul chimic Raport Ca/P
-Fosfat tricalcic -TCP -Ca3(PO4)2 1,5-Fosfat tricalcic -TCP -Ca3(PO4)2 1,5Fosfat monocalcic monohidrat MCPM Ca(H2PO4)2 * H2O 0,5
Fosfat monocalcic anhidru MCPA Ca(H2PO4)2 0,5
Fosfat dicalcic anhidru, moneit DCPA CaHPO4 1,00
Fosfat dicalcic dihidrat,bruit DCPD CaHPO4 * 2H2O 1,00
Fosfat tetracalcic TTCP Ca4(PO4)2O 2,0
Fosfat octocalcic OCP Ca8H2(PO4)6 * 5H2O 1,33
Hidroxiapatit Hap Ca10(PO4)6(OH)2 1,67Hidroxiapatit deficit n calciu CDHap Ca9(HPO4)(PO4)5OH 1,5
. Diferite forme de fosfai de calciu, abrevierea lor,formula chimic i raportul Ca/P
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
27/41
Procese in sinteza matricilor
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
28/41
Reprezentarea schematica a formarii cristalelor
de hidroxiapatita pe membrana de colagen prin
intermediul acidului citric
Colagen- hidroxiapatita-
acid citric
Pentru cresterea capacitatii de
formare a hidroxiapatitei pemembrane colagenice s-a propus
utilizarea acidului citric ca agent
de complexare, cunoscut fiind
faptul ca mai bine de 70% din
cantitatea de citrat existenta inorganism este localizata la nivelul
sistemului osos.
Acidul citric se leaga de membrana colagenica la functiile -OH, -C=O,
-NH2, prin legaturi de hidrogen, prin intermediul functiilor hidroxilice.Sarcinile negative ale acidului citric pot chelatiniza simultan cu ioni de
Ca2+ din solutie formnd complex Ca-citrat. Se formeaza agregate prin
adsorbtia ulterioara a fosfatilor si ionilor de calciu, rezultnd structuri
tridimensionale care se pot constitui ca nuclee pentru cristalele de
hidroxiapatita.
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
29/41
Alte materiale:
- colagen + hidroxiapatita + acid hialuronic;
- microsfere de colagen cu hidroxiapatita- chitosan + hidroxiapatita
Date de microscopie optica a compozitului colagen-hidroxiapatita
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
30/41
SuportulSuportul -- cartilajcartilaj
Cartilajul prezinta o capacitate redusa de autorefacere datorita naturiisale nevascularizate. Din aceasta cauza, in prezent se practica
reconstructia sa plastica sau chirurgia ortopedica ca tratamente pentru
pacientii cu defecte datorate artritelor, anomaliilor congenitale sau
traumelor diferite.
Terapiile includ:
-transplantul;
-implantul de dispozitive protetice artificiale.
Amndoua tehnici prezinta insadezavantaje:-transplantul presupune gasirea de tesuturi donatoare;
-apar dificultati legate de marimea grefei si fixarea acesteia;
-protezele pot produce toxicitate datorita adeziunii la interfata
cu ruptura.
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
31/41
Sistemul model
Condrocitele izolate se insamanteaza pe suporturi de polimer
biodegradabil si se realizeaza culturi in vitro, in capsule petri,
recipient cu elice sau bioreactor, inainte de implantarea in vivopentru a forma un neocartilaj sau pentru a repara cartilajul
articular.
Se folosesc casuporturi biodegradabile:
-colagen;-acid hialuronic;
-acid poliglicolic
care asigura o structura 3D pentru atasarea celulelor si stabileste
marimea si forma tesutului proiectat. In conditiile specifice ale
culturii in vitro, condrocitele prolifereaza in interiorul suportului
si secreta matricea extracelulara cartilaginoasa formata din
glicozoaminoglicani si colagen. Degradarea suportului in paralel
cu regenerarea tesutului conduce la o biocompatibilitate in timp.
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
32/41
Fig.7 Sistemul model
Suportul poate fi proiectat astfel inct sa corespunda criteriilor specifice ingineriei tisulare.Astfel, ideal ar fi ca materialul:
a) sa fie reproductibil intr-o structura poroasa 3D permitnd o distributie spatiala
uniforma si diminuarea constrngerilor difuzionale din timpul culturii in vitro;
b) stimularea proliferarii celulare si secretia matricii extracelulare fara aparitia
efectelor secundare sau toxice;
c) biodegradarea intr-un ritm controlabil.
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
33/41
Alte potentiale avantaje:
- utilizarea att a condrocitelor autografe ct si alografe;
- imunoprotectia oferita de sechestrarea antigenelor
suprafetelor celulelor de catre matricea extracelulara generata in
timpul culturii in vitro;
- abilitatea de control a culturii in vitro;
- posibilitatea cresterii in vitro a cartilajului in mod
continuuu si astfel complet integrat cu tesutul gazda in care se
implanteaza.
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
34/41
Suport polimeric:Suport polimeric:ex. Material fibrosex. Material fibrossau burete porossau burete poros
Celule precursoare:Celule precursoare: Bioreactor:Bioreactor:Ex. Vas rotativEx. Vas rotativ
Produs al ingineriei tisulareProdus al ingineriei tisulare
Aplicatia:Aplicatia:
Sistem celula polimerSistem celula polimer -- bioreactorbioreactor
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
35/41
Ingineria tisulara a cartilajuluiIngineria tisulara a cartilajului
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
36/41
nativanativanativanativa
Structura cartilajului produsStructura cartilajului produs
Riesle et al., J Cell Biochem
71: 313, 1998
Retea de colagen (Scanning Electron Micrograph)
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
37/41
AsambluAsamblu
Crestere 3 DCrestere 3 D
Formare MatriceFormare Matrice
DiferentiereDiferentiere
VascularizareVascularizare
Formeze un tesut de tip os sau cartilaj
CeluleCelule
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
38/41
Surse de CeluleSurse de Celule
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
39/41
CeluleCelule
Cerinte esentiale:
Stimulare proliferare fara pierde apluripotentei
Diferentiere directa in liniile celularedorite.
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
40/41
Agenti farmaceuticiAgenti farmaceutici
Caracteristici:
Diferiti agenti necesari in diferite stadiide dezvoltare a celulei spre tesut osos
Suporturi proiectate astfel incat saelibereze diferiti factori la anumite
intervale de timp bine precizate
7/24/2019 Medicina Regenerativa6 [Compatibility Mode]
41/41
Agenti farmaceuticiAgenti farmaceutici
Hormoni, factori de crestere:
Stimulaeaza proliferarea celulara
Diferentiere directa a celulelormultipotente in tesut specific
Exemple:
dexamethasone factor de crestere de tip insulina-I (IGF-I)
proteina morfogenetica a osului-2 (BMP-2)