8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
1/34
1
TEHNICI MODERNE N
BIOLOGIA CELULAR
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
2/34
2
STUDIUL PROCESELORCELULARE
2 aspecte:2 aspecte:
Tehnici si metode adecvate de urmTehnici si metode adecvate de urmrire arire afenomenelor celularefenomenelor celulare
Modelarea experimentalModelarea experimental a fenomenelora fenomenelor
celularecelulare
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
3/34
3
MODALITI DE STUDIU
1.1. in vivoin vivo
2.2. in situin situ
3.3. in vitroin vitro
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
4/34
4
MODALITI DE STUDIU
in vivoin vivo -- cand celulele sau organele ale caruicand celulele sau organele ale caruicelule dorim sa le studiem sunt abordate incelule dorim sa le studiem sunt abordate inorganismul intactorganismul intact..
Avantaje: rezultatele obinute sunt edificatoareAvantaje: rezultatele obinute sunt edificatoarepentru procesul studiat la nivel de organismpentru procesul studiat la nivel de organism
Dezavantaje: rDezavantaje: rezultatele experimentelor suntezultatele experimentelor sunt dificildificilde interpretatde interpretat datoritdatorit influeninflueneleloror celorlaltecelorlaltecomponente ale organismuluicomponente ale organismului
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
5/34
5
MODALITI DE STUDIUin situin situ cand organul de interes estecand organul de interes este
mentinut la locul sau in organism dar suntmentinut la locul sau in organism dar suntcontrolate unele influente cum sunt celecontrolate unele influente cum sunt cele
nervoase sau endocrinenervoase sau endocrine
Avantaje: se pot studia variaiile procesuluiAvantaje: se pot studia variaiile procesului
n condiii controlaten condiii controlateDezavantaje: nu se poate identifica rezultatulDezavantaje: nu se poate identifica rezultatul
cu cel n vivocu cel n vivo
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
6/34
6
MODALITI DE STUDIU
in vitroin vitro cand organul ,cand organul , esutul sauesutul saucelulele sunt izolate din organismcelulele sunt izolate din organism
Avantaje:Avantaje: se permite un control rigurosse permite un control rigurosal experimentului.al experimentului.
Dezavantaje: nu se poate garantaDezavantaje: nu se poate garantaobinerea acelorai rezultate in vivo.obinerea acelorai rezultate in vivo.
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
7/34
7
Tehnici in vitro
Baia de organBaia de organ
Cultura de celuleCultura de celule
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
8/34
8
Baia de organ
-- permite menpermite meninerea viabilitinerea viabilitii unor fragmente deii unor fragmente deorgan sauorgan sau esuturi.esuturi.
--variate variate n funcn funcie de organul supus experimentuluiie de organul supus experimentului-- asigurasigur o temperatura constanto temperatura constant , oxigenarea, oxigenareamaterialului biologic , posibilitatea controlmaterialului biologic , posibilitatea controlriiriicompozicompoziiei mediului din baieiei mediului din baie i culegerea dei culegerea dedate funcdate funcionaleionale i ei eantioaneantioane
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
9/34
Culturi de celule - Etape
DigestiaDigestia enzimaticaenzimatica a tesutului cu obtinerea uneia tesutului cu obtinerea uneisuspensii de celulesuspensii de celule
IzolareaIzolarea unei popunei popuulalaii celulare pureii celulare pure IInsnsmmnnareaarea n flacoane de culturn flacoane de cultur sau plsau plcici
Petri obPetri obininndundu--se astfel o culturse astfel o cultur primarprimar PasareaPasarea -- resuspendarea celulelor din culturaresuspendarea celulelor din cultura
primara urmatprimara urmat de de rede de rensnsmmnnareaarea n flacoanen flacoanede culturde cultur sau plsau plci Petri obci Petri obininndundu--se culturise culturisecundarsecundaree
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
10/34
10
Culturi celulare - Evoluie
1.1. Faza de lagFaza de lag sau de inducsau de inducieie -- celulelecelulele iirefac suprafarefac suprafaaa i se acomodeazi se acomodeaz cucumediul de culturmediul de cultur
2.2. FFaza exponenaza exponenialial -- celulele se dividcelulele se dividrapid, exponenrapid, exponenialial
3.3. Faza staFaza staionarionar -- nnumumrrulul de celulede celule
rrmmne constant. In aceastne constant. In aceast fazfaz seseefectueazefectueaz pasareapasarea
4.4. Faza de declinFaza de declin -- scscderea nr. de celulederea nr. de celule
datoritdatorit mbmbtrtrniriinirii i mori morii .ii .
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
11/34
11
Medii de cultur - Componente1.1. AmimoaciziAmimoacizi i vi vitamineitamine2.2. SSruriruri necesare mennecesare meninerii echilibruluiinerii echilibrului
ionicionic i pH mediului de culturi pH mediului de cultur
3.3. Glucoza pentru necesarul energeticGlucoza pentru necesarul energetic4.4. Ser fetalSer fetal
5.5. AntibioticeAntibiotice
6.6. Rosu fenol ca indicator de pHRosu fenol ca indicator de pH
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
12/34
12
1.1. MMorfologia si morfometriaorfologia si morfometria
2.2. Citometria in fluxCitometria in flux3.3. Fractionarea celularaFractionarea celulara
4.4. Citochimia si citoenzimologiaCitochimia si citoenzimologia
5.5. ImunocitochimiaImunocitochimia6.6. Fluorescenta si imunofluorescentaFluorescenta si imunofluorescenta
7.7. Microfiziologia si microinjectiaMicrofiziologia si microinjectia
8.8. RadioautografiaRadioautografia
9.9. Metode biochimiceMetode biochimice
10.10. Tehnici si metode de biologie molecularaTehnici si metode de biologie moleculara
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
13/34
13
MORFOMETRIA
-- utilizeaz unutilizeaz un analizor de imagineanalizor de imagine..
-- se stabiletese stabilete criteriul dupa care se va efectuacriteriul dupa care se va efectuaanalizaanaliza, precum i limitele maxim i minim, precum i limitele maxim i minim
ale acestuiaale acestuia-- Rezultat:Rezultat: diferitdiferitee populapopulaii celulare.ii celulare.
Rezultatul analizei cantitative este afisat sub formaRezultatul analizei cantitative este afisat sub formaunei histograme.unei histograme.
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
14/34
14
Citometria n flux
-- ppeermite analizarmite analiza i separarea celulelor pei separarea celulelor pebaza unor caractere morfologicebaza unor caractere morfologice iibiochimicebiochimice
OferOfer informainformaii asupra :ii asupra :1.1. mmrimii relative a celulelorrimii relative a celulelor
2
.2
. granularitgranularitii interne (neomogenitateaii interne (neomogenitateainternintern citoplasmaticcitoplasmatic) relativ) relativ
3.3. intensitatea relativintensitatea relativ a fluorescena fluoresceneiei..
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
15/34
15
Citometria n flux - utilitate
1.1. mmsurarea caracteristicilor fizice alesurarea caracteristicilor fizice aleceluleicelulei
2.2. identificarea si separarea populaidentificarea si separarea populaiiloriilor
de celule sanguine ( granulocite, monocitede celule sanguine ( granulocite, monocite, limfocite T sau B), limfocite T sau B)3.3. mmsurarea cantitsurarea cantitii de ADii de ADNN din celuldin celul
4.4. mmsurarea cantitsurarea cantitii intracelulare de Caii intracelulare de Ca5.5. masurarea pHmasurarea pH--ului intracelularului intracelular
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
16/34
16
Citometria in flux
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
17/34
17
Fracionarea celular
-- tehnictehnic ce permite izolarea diferitelorce permite izolarea diferitelorelemente ultrastructurale si biochimiceelemente ultrastructurale si biochimiceale celulelorale celulelor
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
18/34
18
Fracionarea celular - Etape
OmogenizareaOmogenizareadistrugerea integritdistrugerea integritiiiitisularetisulare i apoi celulare cu obi apoi celulare cu obinerea uneiinerea unei
suspensii de organitesuspensii de organite i membranei membraneveziculateveziculate n mediul de omogenizaren mediul de omogenizare
SeparareaSeparareaprin centrifugareprin centrifugare i/ saui/ sauultracentrifugareultracentrifugare
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
19/34
19
OMOGENIZAREA
a.a. prinprin soc osmoticsoc osmotic.. DiferenDiferena de osmolaritatea de osmolaritatentre mediul i.c. si cel e.c. duce la umflareantre mediul i.c. si cel e.c. duce la umflareacelulelor pana la ruperea membranelor.celulelor pana la ruperea membranelor.
b.b. prinprin ultrasonicareultrasonicare presupune rupereapresupune rupereamembranelor sub acmembranelor sub aciunea undelor ultrasoniceiunea undelor ultrasonice
c.c. cu omogenizatoarecu omogenizatoare se realizeaza sub acse realizeaza sub aciuneaiunea
forforelor de frecareelor de frecare i torsiune care contribuie lai torsiune care contribuie laruperea membranelor.ruperea membranelor.
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
20/34
20
SEPARAREA
diferendiferenialial cand organitele se depuncand organitele se depunla baza tubului ,la baza tubului , n ordinea densitn ordinea densitii lorii lor
prin centrifugari repetate la forprin centrifugari repetate la fore din cee din ce nnce mai marice mai mari
n gradient de densitaten gradient de densitateprintrprintr--oosingursingur centrifugare la forcentrifugare la fore suficient dee suficient deridicate se obridicate se obin organitele ca fracin organitele ca fraciiiiseparate .separate .
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
21/34
21
NUCLEI
Ultra so n ic a re
Mitocondri i
Lizozom i
M e m b r a n e
celulare
Golg i
m icrosom i
Ribo som i re tic ul e ndo p la sm ic
Purific a re in
grad ient
de de nsitate
Se p a ra re a c onstituentilor
c e lula ri p rin viteze d e c e ntri-
fuga re c resc a nde
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
22/34
22
AUTORADIOGRAFIA
--tehnica de investigare celulartehnica de investigare celular ce permitece permiteidentificarea morfologicidentificarea morfologic i ultrastructurali ultrastructural a unora unorcompucompui radioactivi.i radioactivi.
trasori radioactivitrasori radioactivi ::-- aminoacizi, glucide, nucleotideaminoacizi, glucide, nucleotide
-- fosfat sau sulfat radioactivfosfat sau sulfat radioactiv
-- liganzi radioactivi specificiliganzi radioactivi specifici
Marcarea unorMarcarea unorcomponentecomponente
celularecelulare
receptori saureceptori sauanticorpi radioactivianticorpi radioactivi
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
23/34
23
METODE BIOCHIMICE
ELECTROFOREZAELECTROFOREZA
IMUNOELECTROFOREZAIMUNOELECTROFOREZA
TRANSFERUL ELECTROFORETICTRANSFERUL ELECTROFORETIC
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
24/34
24
ELECTROFOREZA
PRINCIPIU:PRINCIPIU: particuleleparticulele ncncrcate electricrcate electricmigreazmigreaz ntrntr--un mediu vun mediu vscos , subscos , subacaciunea unui ciunea unui cmp electric.mp electric.
Aplicaii practice:Aplicaii practice: studiul proteinelorstudiul proteinelor i ai a
acizilor nucleici.acizilor nucleici.
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
25/34
25
ELECTROFOREZA
PROTEINELORa.a. unidimensionalunidimensional , cand migrarea se, cand migrarea se
realizeazrealizeaz n geln gel ntrntr--o singo singuurr direcdirecieie
b.b. bidimensionalbidimensional , c, cnd migrarea se realizeaznd migrarea se realizeazsuccesivsuccesiv n doun dou direcdireciiii
Aplicaii practiceAplicaii practice electroforeza unidimensionalelectroforeza unidimensional SDSSDS PAGEPAGE FOCALIZAREA IZOELECTRICAFOCALIZAREA IZOELECTRICA
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
26/34
26
ELECTROFOREZA SDS-PAGE
--realizeazrealizeaz separarea proteinelor dintrsepararea proteinelor dintr--ununamestec pe baza gabaritului molecularamestec pe baza gabaritului moleculardirect propordirect proporional cu masa molecularional cu masa molecular..
PrincipiuPrincipiu:: adsorbadsorbiiaa dodecilsulfatdodecilsulfatuluiului dede
sodiu unitar pe proteinesodiu unitar pe proteine,, realizrealiznd ond odensitate de sarcindensitate de sarcin negativnegativ uniformuniform..
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
27/34
27
ELECTROFOREZA SDS-PAGE
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
28/34
28
Focalizarea izoelectrica
-- separarea proteinelor dintrsepararea proteinelor dintr--un amestec seun amestec seface pe baza punctului lor izoelectric.face pe baza punctului lor izoelectric.
Principiu: migrarea pPrincipiu: migrarea protroteeinelineloror n funcn funcie deie depunctul izoelectric,punctul izoelectric, pn npn n zona cu pHzona cu pH--ululidentic cu cel al punctului lor izoelectricidentic cu cel al punctului lor izoelectric,,undeunde devin neutre oprindudevin neutre oprindu--i miscarea.i miscarea.
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
29/34
29
Focalizarea izoelectrica
Benzi r tei e l nct l iz e lectric
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
30/34
30
Electroforeza bidimensionala
--migrarea proteinelormigrarea proteinelor n doun dou direcdirecii :ii :
1.1. in prima direcin prima direcieie n funcn funcie de punctul lorie de punctul lorizoelectricizoelectric -- FOCALIZARE IZOELECTRICAFOCALIZARE IZOELECTRICA
2.2. a doua direca doua direcieie -- SDSSDS PAGE ,PAGE , n funcn funcie deie degreutatea moleculargreutatea molecular a proteinelor.a proteinelor.
Rezultatul se prezinta sub forma uneiRezultatul se prezinta sub forma unei hhrri cui cuproteinele separateproteinele separate n planul gelului.n planul gelului.
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
31/34
31
Electroforeza bidimensionala
Elec tr f r ez l nct iz e lectric
SDS-
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
32/34
32
IMUNOELECTROFOREZA
-- o varianto variant a electroforezei ce combina electroforezei ce combin migrareamigrarea nnccmp electric a proteinelor cu realizarea uneimp electric a proteinelor cu realizarea uneireactii imunereactii imune de tip Agde tip Ag--AcAc
Reactia imunaReactia imuna::
--dupa terminarea migrarii electroforetice,dupa terminarea migrarii electroforetice,
--concomitentconcomitent ((imunoelectroforezaimunoelectroforeza n rachetn rachet)) --apreciere cantitativapreciere cantitativ a Aga Ag ((== suprafsuprafaaaa descrisdescris dedelinia de precipitare cu linia de startlinia de precipitare cu linia de start))..
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
33/34
33
IMUNOELECTROFOREZA
8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5
34/34
34
TRANSFERUL
ELECTROFORETIC
--metodmetod de extragere a proteinelor separatede extragere a proteinelor separateelectroforetic dintrelectroforetic dintr--un gel , cu adsorbireaun gel , cu adsorbirealor pe niste hlor pe niste hrtii cu proprietrtii cu proprieti speciale.i speciale.
ProteineleProteinele sufersufer reacreacii de recunoaii de recunoatereterespecificspecific prin intermediul unorprin intermediul unorinteracinteraciuni de tip receptoriuni de tip receptor ligand sau Agligand sau Ag
AAcc..
Top Related