1
ACADEMIA ROMÂNĂ
INSTITUTUL DE VIRUSOLOGIE ŞTEFAN S. NICOLAU
BUCUREŞTI
TEZĂ DE DOCTORAT
- REZUMAT -
“Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor
tumorale la tratamentul cu agenți chimioterapeutici”
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC:
Dr. Lorelei Irina Braşoveanu, CS I
DOCTORAND:
Maria Monica G. Vasilescu
BUCUREŞTI
- 2019-
2
CUPRINS Pag
Introducere 4
Scopul, obiectivele şi originalitatea tezei 6
Structura tezei 7
Cercetari proprii 8
Materiale şi metode 8
Rezultate şi discuţii 11
Concluzii 31
Bibliografie selectivă 33
3
INTRODUCERE
Cu toate progresele realizate în domeniile chirurgiei, radioterapiei, dar mai ales
chimioterapiei, progrese care au dus la schimbări majore în tratamentul cancerului,
dezvoltarea rezistenței celulelor tumorale la agenții chimioterapeutici constituie încă o
problemă importantă, reducând eficiența terapiilor disponibile.
Numărul mare de pacienți care nu răspund la tratament se poate datora fie capacității
înnăscute mai scăzute de răspuns la chimioterapia citotoxică pe care o au unele tumori precum
carcinomul renal, cancerul de colon, cancerul pancreatic, melanoamele, unele tipuri de
cancere de plămâni, fie dobândirii rezistenței pe parcursul tratamentului, frecvent întâlnită în
cancerul de plămâni cu celule mici, cancerul de sân sau ovarian (Fodale 2011, Holohan 2013).
De regulă, celulele tumorale expuse la un singur compus chimioterapic (antracicline, alcaloizii
de vinca, taxol) dezvoltă rezistență încrucișată la o serie de alți compuși neînrudiți structural și
funcțional, proces numit rezistență la medicamente multiple (MDR) (Ganapathy 2013, Kibria
2014).
Rezistența clinică la citostatice reprezintă un fenomen complex, multifactorial, la nivelul
populațiilor de celule tumorale, putând să fie exprimate în același timp o serie de mecanisme
care să determine un grad crescut de rezistență celulară (Jie Qi 2011, Xing Ke 2017). La baza
rezistenței la chimioterapie pot sta mecanisme legate de modificări de acumulare și distribuție
intracelulară a compușilor chimioterapeutici sau de metabolism celular. O serie de alte
mecanisme responsabile pentru apariția fenotipului rezistent sunt legate de activarea
sistemelor de detoxifiere sau alterarea căilor de semnalizare a apoptozei și creșterea reparării
leziunilor ADN cât și de alterări ale țintelor chimioterapicelor. (Cox 2016, Holohan 2013). În
cadrul acestor mecanisme alterările topoizomerazelor ocupă un loc important.
Capacitatea topoizomerazelor de a tăia ADN-ul dublu catenar și apoi de a relega
catenele clivate, face ca aceste enzime să fie ținte primare pentru o serie de agenți
chimioterapeutici folosiți frecvent pentru tratarea multor forme de neoplazii. (Kellner 2002,
Nitiss 2009, Darzynkiewicz 2009).
Potențialul citotoxic al inhibitorilor topoizomerazelor (camptotecina, irinotecanul,
topotecanul, etoposidulul, teniposidul, doxorubicina) se asociază cu capacitatea pe care o au
de a stabiliza complexele covalente Topo – ADN clivat (complexe de clivare), intermediari
temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent
chimioterapeutic formate, împiedică enzima să relege ADN-ul clivat conducând în final la
lezarea ADN-ului și moartea celulelor (Pommier 2010, Nitiss 2009).
4
Rezistența “atipică” la medicamente multiple (at-MDR) este specifică pentru agenții
chimioterapici care țintesc ADN topoizomerazele și se consideră că este mediată de alterările
cantitative și/sau calitative ale topoizomerazelor (Nielsen 2004, Plo 2002).
Cu toate că alterările topoizomerazelor reprezintă probabil doar unul dintre multiplele
mecanisme de rezistență la terapia antitumorală, se pare că ele pot juca un rol important în
răspunsul chimioterapic. În prezent se fac studii intense pentru a determina care mecanism de
rezistență predomină într-un tip particular de tumoră.
În ultimii ani rolul topoizomerazelor în rezistența la chimioterapie a fost investigat într-o
serie de studii, însă implicarea acestor enzime în chimio-sensibilitate sau chimio-rezistență
rămâne în continuare să fie elucidată întrucât rezultatele au fost neconcludente, uneori
contradictorii și astfel rolul lor predictiv este încă controversat. Aceasta se datorează faptului
că datele furnizate de diferite studii sunt dificil de comparat, deoarece în unele s-a determinat
statusul genic (amplificări, deleții), în altele expresia proteică sau expresia mRNA. In plus,
metodele de determinare folosite au variat destul de mult (FISH/CISH, IHC, WB, qRT-PCR),
întrucăt nu există metode de analiză standardizate pentru topoizomeraze, iar cut-off-urile au
fost alese în mod arbitar.
Pe lângă acestea, cele mai multe studii au urmărit rezistența la citostatice în raport cu o
singură topoizomerază, evaluarea expresiilor celor trei topoizomeraze simultan și implicarea
în rezistență au fost prea puțin abordate. Mai mult, în cazul topoizomerazei II încă nu se
cunoaște sigur care dintre cele două izoforme, alfa sau beta, reprezintă ținte celulare primare
pentru diferite citostatice.
O mai bună cunoaștere a mecanismelor moleculare ale rezistenței la chimioterapie ar
putea permite identificarea unor markeri moleculari predictivi, cu adevarat relevanți pentru
răspunsul la medicamentele antitumorale, precum si la identificarea unor agenți și strategii
terapeutice noi.
5
SCOPUL, OBIECTIVELE SI ORIGINALIZATEA TEZEI
Scopul tezei de doctorat a fost acela de a determina implicarea topoizomerazelor
(topoizomerazei I (Topo I) și izoformelor alfa și beta ale topoizomerazei II (Topo II si )) în
rezistența celulelor tumorale la agenții chimioterapeutici care țintesc aceste enzime, evaluând
modificările care survin în expresiile acestora pe parcursul achiziției fenotipului de rezistență.
De asemenea, s-a urmărit dacă în cazul inhibitorilor de Topoizomeraza I (Topotecanul) și
Topoizomeraza II (Adriablastina) intervine rezistența încrucișată.
Obiectivele urmărite pe parcursul tezei de doctorat au fost:
Obținerea unor modele experimentale reprezentate de sublinii celulare rezistente la
agenți antitumorali reprezentativi pentru clasele de agenti chimioterapeutici care țintesc Topo
I și Topo II, pornind de la linii celulare standardizate.
Determinarea sensibilității/ rezistenței la citostatice, atat directe cât și încrucișate, la
nivelul subliniilor celulare cu rezistență dobândită, prin analiza citotoxicității celulare,
apoptozei și cineticii ciclului celular.
Evaluarea expresiilor proteice și genice ale Topo I și izoformelor α și β ale Topo II
înainte și pe parcursul achiziției fenotipului de rezistență, printr-o abordare complexa si
folosind o serie de tehnici moderne de laborator (citometrie în flux, Western Blot, RT-PCR).
Determinarea eventualelor corelații între nivelurile de expresie a topoizomerazelor și
sensibilitatea/ rezistența la citostatice.
Originalitatea lucrării:
Elaborarea unor modele experimentale in vitro, realizate pe 5 linii tumorale umane
(mamare, ovariene sau de cervix), de inducere a rezistenței tumorale la agenți
chimioterapeutici anti-topoizomeraze, utilizate in studii ulterioare;
Efectuarea unor studii complexe de evaluare concomitentă a modulării expresiei celor
trei topoizomeraze funcție de rezistența indusă la agenti chimioterapeutici anti-topoizomeraze
prin toate tehnicile de laborator prezentate în teza;
Utilizarea în paralel a unor tehnici moderne de imunologie, biologie moleculară,
biochimie, citometrie în flux a permis elucidarea unor aspecte legate de implicarea individuală
a fiecărei topoizomeraze în fenotipul rezistenței directe sau incrucisate la tratament.
6
STRUCTURA TEZEI
Teza de doctorat „Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor tumorale la
tratamentul cu agenți chimioterapeutici” cuprinde doua parti:
I. Partea teoretica, ce consta in fundamentarea stiintifica a subiectului abordat, si
II. Partea experimentala, ce consta in cercetarile proprii, originale.
Partea teoretica este reprezentata de 5 capitole si cuprinde 57 de pagini. Astfel, in
primul capitol, „Cancerul (generalitati)” prezinta sumar informatii despre epidemiologia
cancerelor umane, aspecte generale ale cancerului si strategii terapeutice utilizate.
In capitolul „Rezistența la agenții chimioterapeutici care țintesc topoizomerazele”
sunt descrise aspecte referitoare la mecanismele de rezistență la agenții chimioterapeutici care
țintesc topoizomerazele: alterari în transportul intracelular și metabolismul agenților
chimioterapeutici, sechestrarea agenților chimioterapeutici în diferite compartimente celulare,
activarea sistemelor de detoxifiere, apărarea antioxidantă, statusul proliferativ, mecanisme
care implică alterări în răspunsul celular la lezarea ADN-ului sau alți factori/ mecanisme ale
rezistenței la agenții chimioterapeutici care țintesc topoizomerazele. Capitolul trei „ADN
topoizomerazele” prezinta in detaliu clasificarea ADN topoizomerazelor, caracterizarea și
structura ADN topoizomerazelor de tip I si II alfa și beta, mecanismele de acțiune, functiile
acestora si procesele celulare în care sunt implicate, necesare intelegerii studiilor realizate in
cadrul tezei. In capitolul patru „Agenții chimioterapeutici care țintesc topoizomerazele”,
se fac unele precizari de clasificare a agenților chimioterapeutici anti-topoizomeraze cat si in
ceea ce priveste mecanismele citotoxicitatii mediate de topoizomerazele I și II. Partea
teoretica a tezei se incheie cu capitolul cinci ”Mecanisme de rezistență ce implică alterări
ale topoizomerazelor I și II alfa și beta” in care sunt descrise alterarile topoizomerazelor
(expresia proteica, activitatea enzimatica si mutatiile) implicate in raspunsul la chimioterapie.
Partea experimentala cuprinde Metodologia, care include principiile metodelor,
materialul biologic, consumabilele, reactivii, echipamentele și protocoalele de lucru, si
capitolul de Rezultate, discuții și concluzii partiale ce au reiesit in urma studiilor efectuate.
La finalul acestei parti sunt incluse Concluziile generale, lista de abrevieri, o bibliografie
vasta, ce consta in aproximativ 300 de referinte, lista tabelelor si a figurilor din cadrul tezei de
doctorat.
7
PARTEA EXPERIMENTALA
METODOLOGIE
Studiul implicării topoizomerazelor în rezistența celulelor tumorale la agenți
chimioterapeutici reprezentativi pentru clasele care țintesc cele două tipuri de topoizomeraze
(Topo I și Topo II) s-a realizat pe material biologic reprezentat de linii celulare standardizate,
derivate din adenocarcinoame umane (mamar, ovarian, cervical) și sublinii celulare obținute
din acestea, prin inducerea în laborator a fenotipului rezistent. În acest scop s-au realizat
culturi de celule și pasaje repetate, s-au utilizat o serie de tehnici de determinare a viabilității
celulelor funcție de citotoxicitatea agenților chimioterapeutici, de evaluare a evenimentelor
apoptotice, de analiză a dinamicii ciclului celular și a expresiei proteice, genice a
topoizomerazelor.
- Studiile desfășurate pe parcursul acestei teze de doctorat au fost realizate folosind ca
material biologic un panel de linii celulare umane derivate din tumori maligne mamare
(MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231), ovariene (SK-OV-3) și cervicale (HeLa), care aparțin
conform clasificării moleculare unor subclase reprezentative pentru cele trei tipuri de cancer și
prezintă o serie de caracteristici ce le diferențiază între ele. Toate liniile celulare luate în
studiu au provenit de la European Collection of Cell Culture (ECACC), cu excepția liniei SK-
BR-3 care a fost pusă la dispoziție de dr. Michele Maio (Centro Regionale Oncologico di
Aviano, Advanced Immunotherapy Unit). Drept linie celulara de control pentru studiile
efectuate in cadrul tezei s-a utilizat linia MCF-7/A, rezistenta la Adriamicina, pusa la
dispozitie de dr. Liliana Puiu (Institutul Oncologic „Prof. Dr. Alexandru Trestioreanu”,
Bucuresti).
- Cultivarea liniilor celulare: mentinerea in cultura, manipularea si stocarea liniilor celulare
luate in studiu s-a realizat conform protocoalelor recomandate de ECACC pentru fiecare linie
in parte.
- Elaborarea modelelor experimentale in vitro: subliniile rezistente la adriablastină (ADB),
respectiv topotecan (TPT) au fost obținute în laborator prin expunerea continuă a liniilor
celulare umane parentale de cancer mamar (MCF-7, SKBR3, MDA-MB231), ovarian
(SKOV3) și cervical (HeLa) la concentrații crescatoare de topotecan (TPT) sau adriablastină
(ADB), citostatice reprezentative pentru clasele de chimioterapice care țintesc cele două tipuri
de topoizomeraze Topo I, respectiv Topo II. Inducerea caracterului rezistent s-a facut intr-o
perioada lunga de timp, 10 luni, cu concentratii situate intre 20 nM si 700nM pentru ADB sau
3 nM si 60nM pentru TPT, functie de rezistenta fiecarei linii parentale si IC50 evaluat prin
8
testele de citotoxicitate prin metoda colorimetrică cu MTS sau analiza celulara in timp
real (RTCA). Subliniile cu rezistenta indusa au fost denumite: MCF-7/AR și MCF-7/TR;
SK-BR-3/AR și SK-BR-3/TR; MDA-MB-231/AR și MDA-MB-231/TR; SK-OV-3/AR și SK-
OV-3/TR; HeLa/AR și HeLa/TR.
- Determinarea gradului de rezistență la tratamentele anti-topoizomeraze s-a realizat prin
tehnici colorimetrice (MTS) cu ajutorul kitului CellTiter 96® AQueous One Solution Cell
Proliferation Assay (MTS) (Promega) și calcularea indicelui de citotoxicitate IC50.
Rezultatele obținute în urma testelor de citotoxicitate prin tehnica MTS si determinarilor
spectrofotometrice ( = 490 nm) au fost exprimate ca valori ale densitatii optice (D.O.) si
transformate in valori procentuale ale viabilitătii celulare, ce reprezinta valorile medii ±SD
rezultate din trei experimente, calculate după formula: Viabilitate (%) = DO proba – DO
blank/ DO control – DO blank. Rezultatele au fost confirmate prin analiza celulară în timp
real (RTCA), cu ajutorul sistemului xCELLigence (analizor RTCA+computer cu software
RTCA 1.2.2.).
- Evaluarea evenimentelor apoptotice prin citometrie în flux, in scopul determinarii și
monitorizarii sensibilității/ rezistenței la citostatice, utilizand dubla marcare cu Anexina V-
FITC şi iodură de propidiu (PI), cu ajutorul kitului Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit
(BioVision Inc, USA).
- Prin dubla marcare s-au determinat celulele aflate în diferite faze de moarte celulară:
apoptoza timpurie (anexina V+/ PI
-), apoptoza târzie (anexina V
+ /PI
+) sau necroza (anexina V
-
/PI+). Analiza datelor achizitionate cu citometrul in flux FACS CantoII s-a facut cu
programele software Diva 7.2., WinMDI 2.9 si Kaluza.
- Analiza progresiei prin fazele ciclului celular in liniile celulare tumorale parentale si cu
rezistenta indusa cuprinse in studiu s-a realizat prin tehnica de colorare cu PI, dupa tratarea in
prealabil cu RNAza, urmata de achizitia datelor cu citometrul in flux FACS Calibur si analiza
acestora cu programele ModFIT sau CellFIT. Intensitatea luminii fluorescente este direct
proporțională cu cantitatea de ADN permițând astfel estimarea fazelor ciclului celular (G0/G1,
S si G2/M).
- Evaluarea expresiei antigenelor nucleare Topo I și izoformelor α și β ale TopoII prin
citometrie în flux s-a efectuat înainte și pe parcursul dobândirii caracterului de rezistență la
panelul de linii celulare umane de cancer mamar, ovarian și cervical, cărora li s-a indus
rezistența la ADB sau TPT, după permeabilizarea în prealabil a membranelor celulare.
Achiziția datelor s-a realizat cu citometrul in flux FACS Calibur, iar analiza fluorescenței
celulare s-a facut prin utilizarea programului WinMdi 2.9. Rezultatele au fost exprimate ca
procente de celule pozitive (IIF %) si valori medii ale intensității de fluorescență (MFI),
9
probele fiind clasificate drept pozitive dacă mai mult de 5% dintre celule au legat mAb
specific.
- Determinarea expresiei antigenice funcție de fazele ciclului celular prin citometrie în flux
cu ajutorul citometrului in flux FACS Calibur, in scopul evaluarii expresiei antigenelor în
funcție de fazele ciclului celular prin marcarea celulelor atât cu anticorpi monoclonali
specifici fluorescenți, cât și cu PI. Analiza probelor s-a facut la fel ca si în cazul analizei
ciclului celular. Drept control s-a folosit o probă marcata doar cu anticorpul secundar si PI.
- Determinarea expresiei antigenice prin tehnica SDS-PAGE/ Western blot pentru
detectarea specifică a proteinelor (prezenţa/absenta, nivel de expresie) s-a realizat in lizatele
netratate sau celulelor tratate cu ADB sau TPT. Din lizatele ce contineau amestecuri de
proteine, topoizomerazele au fost separate pe baza greutatii moleculare, prin electroforeză
verticala în gel de poliacrilamidă, iar apoi au fost sunt transferate pe membrane PVDF
(polivinildienă). Detecția proteinelor țintă s-a realizat dupa legarea anticorpilor primari specifici si
anticorpilor secundari marcati cu peroxidaza prin chemiluminiscența ECL (“enhanced
chemiluminescence”), avand ca substrat luminolul, care este oxidat de HRP în prezența H2O2.
- Evaluarea expresiei genice a topoizomerazelor prin tehnica real time PCR (RT-PCR) s-
a realizat in probe de ARNm total, izolate din suspensiile liniilor celulare cu reactivul TRIzol
si purificate (clean-up) pe coloane mini spin cu DNază cu ajutorul kitului RNeasy Mini
(Qiagen Inc, USA). Dupa cuantificarea ARNm-ului, prin citirea densităților optice la 260, 280
și 230 nm si utilizând spectrofotometrul Nanodrop 1000 (Nanodrop Technologies, USA),
probele de ARNm au fost supuse revers-transcripției folosind primeri nespecifici, randomici,
cu ajutorul kitului High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems).
Amplificarea probelor de ADNc a fost realizată prin tehnologia TaqMan, cu ajutorul sondelor
TaqMan gene expression assay, furnizate de Thermo Fisher Scientific. Probele au fost testate în
duplicat si normalizate prin raportarea la gena de referință (gena de housekeeping) GAPDH.
Datele au fost analizate folosind metoda Ct comparativ sau metoda ∆∆Ct.
- Analiza statistica a rezultatelor obtinute si efectuarea studiilor de corelaţie s-au realizat prin
utilizarea programului GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software) sau programul Excel (testul
Student’s t, determinarea coeficientului de corelatie liniara Pearson). Datele analizate cu p <
0.05 au fost considerate semnificative statistic. Analizele de corelatie cu o valoare a indicelui
de corelatie r sau r2 ce au corespus unei valori p < 0.05 au fost considerate semnificative
statistic.
10
REZULTATE ȘI DISCUȚII
I. Profilurile sensibilității/ rezistenței și rezistenței încrucișate la citostatice
1) Evaluarea citotoxicității agenților chimioterapeutici prin analiza celulară în timp
real (tehnica RTCA)
Evaluarea în timp real a efectelor tratamentelor cu Adriablastina (ADB) si Topotecan
(TPT) efectuate pe toate liniile parentale luate in studiu a folosit la stabilirea dozelor şi
perioadelor de timp de tratament specific pentru fiecare agent chimioterapeutic si linie
celulara. În vederea evaluării citotoxicităţii modulatorilor prin metoda RTCA, celulele
tumorale au fost cultivate timp de 24h in placi de cultura de 75 cm2, in mediu de cultura
complet, pana la atingerea unei densităţi de 50%. După indepartarea mediului de cultura,
celulele au fost desprinse, spălate şi incubate în plăci tip E-view cu 16 godeuri cu senzori de
impedanţă (Roche).
Stabilirea concentraţiilor de citostatice folosite ulterior pentru tratarea celulelor s-a făcut
prin utilizarea sistemului de analiză a proliferării celulare RTCA (Real Time Cell Analyzer)
cu ajutorul aparatului xCelligence, varianta RTCA-DP (Acea Biosciences/ prin Roche). In
vederea efectuarii testelor de inhibare a proliferării si alegerea densității optime a celulelor în
godeuri s-a făcut trasarea unor curbe de densitate pentru fiecare linie celulara în parte, prin
adaugarea unor suspensii celulare cu densităţi diferite (5000, 10000, 15000, 20000
celule/godeu). Curbele de creştere celulară s-au înregistrat automat pe sistemul xCELLigence
System în timp real. Datele de creştere brute (exprimate prin indecsi celulari, IC) au fost
normalizate prin soft (“normalized cell index”) la momentul adaugarii compusilor testati.
Figura 1. Profilul curbelor de proliferare induse de ADB sau TPT in liniile celulare parentale
ADB TPT
MCF-7/A
11
MCF-7
Sk-Br-3
MDA-MB-231
Sk-Ov-3
HeLa
NT ---- 10 M ---- 5 M ---- 2 M -----10M ---- 0.5 M ---- 12 h ------ 24 h ------ 36 h ------48 h ------- 60 h ------- 72 h ------
Metoda a permis studiul citotoxicităţii mediate de catre compușii studiati, medicamente
ce tintesc Topo I sau Topo II alpha si beta. Monitorizarea dinamică în timp real a
12
citotoxicităţii a permis calcularea valorilor IC50 dependente de timp, in orice moment al
proliferarii celulare. Astfel, se poate selecta momentul în care o concentrație atinge răspunsul
maxim. Curbele de creştere celulară au fost normalizate faţă de control (reprezentat de curba
celulelor netratate).
- Utilizarea sistemului xCELLigence pentru analiza in timp real a proliferarii vs.
citotoxicitatea celulara sub actiunea unor agenti chimioterapeutici anti-topoizomeraze a oferit
avantaje importante comparativ cu metodele clasice, colorimetrice, tip “end-point”;
- Intregul proces de modulare a proliferării celulare de către stimulii utilizați (agenți
chimioterapeutici anti-topoizomeraza) a putut fi urmarit in timp real, pe parcursul unei
perioade de timp indelungate;
- Normalizarea datelor achizitionate la momentul aplicării tratamentelor a permis o analiză
mai bună a efectului indus de concentrațiile mici comparativ cu cele mai mari;
- Datele obținute au permis selecția concentrațiilor de agenti anti-topoizomeraze și perioadele
de timp pentru aplicarea tratamentelor, utile în testele ulterioare tip „end-point” (citometrie in
flux, RT-PCR, WB);
- Metoda a facut posibila calcularea IC50 in orice moment al curbei de proliferare; valorile
IC50 obținute prin analiza RTCA au fost comparabile cu valorile obținute în urma realizării
testelor de citotoxicitate clasice, colorimetrice (cu MTS). Astfel, în urma analizei curbelor de
inhibare a proliferarii si calcularea IC50 s-a ales un interval pentru concentrațiile de lucru in
functie de rezistenta constitutiva sau indusa a liniilor celulare luate in studiu.
2) Analiza răspunsului celulelor liniilor parentale și subliniilor cu rezistenta la
adriablastină sau topotecan prin colorare cu MTS
Raspunsul citotoxic la diferite concentrații de adriablastină (ADB) sau topotecan (TPT),
agenți antitumorali reprezentativi pentru clasele de chimioterapice care țintesc Topo I și Topo
II, s-a realizat prin evaluarea chimiosensibilitatii liniilor parentale si rezistenței subliniilor
derivate pe baza determinarii indicelui de citotoxicitate IC50 (concentrația de citostatic care
determină o scădere cu 50% a viabilității celulelor), calculat pentru fiecare citostatic din
curbele de supraviețuire obținute după tratarea timp de 72 ore cu ADB sau TPT atât a liniilor
parentale, cât și a subliniilor rezistente.
La nivelul panelului de linii parentale luat în studiu (MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3,
HeLa și SK-OV-3) s-au determinat paternuri de sensibiliate diferite la adriablastină sau
topotecan. Cele mai ridicate valori ale IC50 atât pentru ADB (IC50 = 103.02 μM), cât și TPT
(IC50 = 7.56 μM) au fost determinate pentru linia SK-BR-3; linia MCF-7 a avut un IC50
crescut la ADB (IC50 = 58.44 μM), dar a avut sensibilitate ridicată la TPT (IC50 = 1.33 μM);
13
celulele liniei MDA-MB-231 au fost cele mai sensibile atât la ADB (IC50 = 8.64 μM) cât și
la TPT (IC50 = 1.29 μM); liniile HeLa și SK-OV-3 au avut sensibilități moderate cu indici de
citotoxicitate diferiți la cele două chimioterapice 12.45 μM și 25.92 μM pentru ADB,
respectiv 5.27 μM și 2.31 μM pentru TPT.
Celulele subliniilor rezistente au fost viabile și la concentrații de citostatic la care
celulele liniilor parentale au fost evident mai afectate. Între liniile parentale și subliniile cu
rezistenta care au provenit din acestea, în condiții identice de cultură s-au determinat diferențe
ale valorilor IC50 atât pentru ADB, cât și pentru TPT (Tabel 1).
Tabel 1. Sensibilitatea și cross-rezistența liniilor sensibile și rezistente la
inhibitorii Topo I (TPT) și Topo II (ADB)
a) Factorii de rezistență la adriablastină pentru liniile rezistente la adriablastină
b)Factorii de rezistență la topotecan pentru liniile rezistente la topotecan
Comparând subliniile rezistente între ele, am constatat că în ceea ce privește rezistența
încrucișată la ADB, subliniile cu rezistenta la TPT au păstrat profilul de sensibilitate pe care
l-au avut liniile parentale din care au derivat; si în cazul subliniilor rezistente la ADB s-a
păstrat sensibilitatea la TPT (Tabel 1).
Analiza comparativa a datelelor obținute a arătat că subliniile MCF-7/AR și MCF-7/TR,
MDA-MB-231/AR și MDA-MB-231/TR, SK-BR3/AR și SK-BR3/TR, HeLa/AR și HeLa/TR,
SK-OV-3/AR și SK-OV-3/TR, sunt variante cu diferite grade de rezistență indusa la
adriablastină sau topotecan, prin selecția progresiva a liniilor celulare umane de cancer mamar
Linii celulare
IC50 (μM)
Adriablastina Topotecan
MCF-7
58,44
1,33
MCF-7/TR 68,95 5,66 (4,25)b)
MCF-7/AR 101,15 (1.73)a)
3,08
MDA-MB-231 8,64 1,29
MDA-MB-231/TR 9,99 3,54 (2,74)b)
MDA-MB-231/AR 18,29 (2,12)a)
1,43
SK-BR-3 103,02 7,56
SK-BR-3/TR 108,87 19,02 (2,51)b)
SK-BR-3/AR 204,27 (1,98)a)
7,57
HeLa 12,45 5,27
HeLa/TR 17,95 10,76 (2,04)b)
HeLa/AR 24,68 (1,98)a)
6
SK-OV-3 25,92 2,31
SK-OV-3/TR 26,92 6,34 (2,74)b)
SK-OV-3/AR 58,94 (2,27)a)
2,54
MCF-7/A 129,25 4,84
14
MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231, cancer ovarian SK-OV-3 și cancer cervical HeLa, cultivate
în mediu cu concentrații crescânde de ADB sau TPT.
Rezultatele obtinute au arătat că rezistența la adriablastină nu induce rezistență
încrucișată la topotecan, și viceversa.
3) Determinarea sensibilității sau rezistenței liniilor celulare parentale și subliniilor
cu rezistenta indusa la ADB sau TPT prin evaluarea evenimentelor apoptotice
Indiferent de mecanismul de acțiune, agenții chimioterapeutici determină în final
apoptoza celulelor (moartea celulară programată). De aceea, ca o metodă suplimentară de
analiză a chimiosensibilității liniilor parentale și subliniilor cu rezistenta indusa la ADB sau
TPT, cat si pentru determinarea rezistentei incrucisate, s-a realizat si evaluarea evenimentelor
apoptotice, in paralel cu celelalte teste de laborator.
Agenții chimioterapeutici indiferent de mecanismul de acțiune determină în final
apoptoza celulelor (moartea celulară programată). Alături de inhibiția proliferării celulare, ea
este frecvent evaluată în răspunsul biologic la tratamentul cu diferiți agenți chimioterapeutici.
În studiul de față, evaluarea apoptozei prin dubla marcare cu Anexina V- FITC şi iodura
de propidiu (PI) la flow citometru s-a realizat, alături de MTT ca o metodă suplimentară de
analiză a sensibilității liniilor parentale și subliniilor rezistente la doxorubicină sau topotecan
obținute în laborator. Așadar, determinarea evenimentelor apoptotice a fost utilizată în
monitorizarea și confirmarea fenotipului rezistent, dar și pentru a evalua rezistența încrucișată
la adriablastină sau topotecan.
Pentru aceasta, celulele liniilor parentale (MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3, HeLa, SK-
OV-3) și subliniilor rezistente atât la adriablastină (MCF7/AR, MDA-MB-231/AR, SK-BR-
3/AR, HeLa/AR și SK-OV-3/AR) cât și topotecan (MCF-7/TR , MDA-MB-231/TR, SK-BR-
3/TR, HeLa/TR și SK-OV-3/TR), după ce au fost cultivate și lăsate să adere 24 ore în
la 370C și atmosferă umedă cu 5% CO
2, au fost tratate cu 50 nM topotecan sau 1 μM
adriablastină o perioada de 24 ore. După desprinderea celulelor analiza apoptozei panelurilor
de linii parentale și subliniilor rezistente s-a realizat cu kitul Annexin V-FITC Apoptosis
Detection kit, BioVision, cu dublă marcare a celulelor cu Anexina V-FITC şi iodură de
propidiu (PI). Achiziția și analiza datelor s-a realizat la citometru în flux FACS Canto II. Și au
fost determinate procentele celulelor viabile (celule negative pentru anexina-V și PI) și
celulelor aflate în diferite stadii de moarte celulară: apoptoza timpurie (celule pozitive pentru
anexina V și negative pentru PI), apoptoza târzie/ necroză (celule pozitive pentru anexina-V și
PI).
15
a) Modularea apoptozei de catre ADB in liniile celulare parentale si subliniile cu
rezistenta indusa la ADB
Analiza comparativă a sensibilității celulelor liniilor parentale și rezistente la
adriablastină, la 24 ore de expunere la adriablastină (concentrație 1 μM) a arătat o creștere a
procentului de evenimente apoptotice la toate liniile celulare parentale față de liniile rezistente
(Fig. 2).
Figura 2. Evenimente apoptotice timpurii , târzii și totale induse de ADB
la nivelul liniilor parentale și rezistente la adriablastină (AR)
b) Modularea apoptozei de catre TPTin liniile celulare parentale si subliniile cu
rezistenta indusa la TPT
Analiza comparativă a sensibilității celulelor liniilor parentale și cu rezistenta indusa la
topotecan, la 24 ore de expunere la TPT (concentrație de 50nM), a arătat o creștere a
procentului de evenimente apoptotice in toate liniile celulare parentale față de liniile
rezistente, ceea ce demonstreaza o sensibilitate mai redusă a celulelor cu rezistență indusa la
topotecan față de celulele parentale (Fig. 3).
Figura 3. Evenimente apoptotice timpurii , târzii și totale induse de TPT
la nivelul liniilor parentale și rezistente la topotecan (TR)
0
5
10
15
20
25
30
Ap
op
toza
(%
)
0
5
10
15
20
25
Ap
op
toza
(%
)
16
Rezultatele obținute au evidențiat fenotipul chimiorezistent al subliniilor cu rezistenta
indusa: subliniile rezistente la ADB sau TPT au o apoptoza redusă la expunerea la citostaticul
la care s-a indus rezistența. Datele sunt în concordanță cu cele din literatura de specialitate
(Potter 2002, Giovanetti 2015, Jin Mo Ku 2015). Astfel, studii realizate pe celulele liniei
MCF-7 rezistente la ADB au arătat că o expunere de 24 ore la 1μM ADB nu induce apoptoza
(Jin Mo Ku 2015).
Implicarea topoizomerazelor in procesul apoptotic este susținută de o serie de studii. Se
știe că ADB prezintă mai multe mecanisme de acțiune, însă atât în cazul acesteia, cât și a TPT
s-a demonstrat că citotoxicitatea se datorează în principal interacției cu topoizomerazele Topo
II, respectiv Topo I și formării complexelor ternare Topo-ADN-agent chimioterapic (Lee
2017, Giovanetti 2015); ulterior survine blocarea ciclului celular și moartea celulelor
incapabile să repare eficient ADN-ul (Lee 2017; Cox 2016; Darzynkiewicz 2009; Giovanetti
2015). Studiul lui Potter a arătat că într-adevar, distrugerea ADN-ului se produce
predominant în celulele aflate în Faza G2/M, când Topo II ɑ este supraexprimată (Potter,
2002).
4) Modularea rezistentei incrucisate la ADB si TPT, evaluata prin determinarea
evenimentelor apoptotice in liniile celulare parentale si subliniile cu rezistenta indusa
În cadrul studiului am evaluat și rezistența încrucișată prin cuantificarea evenimentelor
apoptotice după tratarea în paralel a liniilor rezistente cu cel de-al doilea citostatic. Rezultatele
obținute la analiza prin citometrie în flux au arătat că indiferent de tipul tumorii din care liniile
au derivat, la subliniile ADB-rezistente tratate cu TPT, fracțiile de celule apoptotice au avut în
general valori apropiate de cele ale liniilor parentale din care acestea au provenit (tratate și ele
cu aceeași concentrație de TPT). Și în cazul subliniilor TPT-rezistente, tratate cu adriablastină
s-a constatat că fracția de celule apoptotice este apropiată de cea a liniilor parentale.
Rezultatele experimentelor de modulare a apoptozei de catre agentii anti-topoizomeraze
in liniile parentale sau cu rezistenta indusa la ADB sau TPT sunt sistematizate în Tabelul 2.
Evaluarea evenimentelor apoptotice prin citometrie în flux confirmă fenotipul rezistent
achiziționat în timpul procesului de inducere a rezistenței la citostatice. Sensibilitatea la TPT a
celulelor ADB- rezistente și viceversa, sensibilitatea la ADB a celulelor TPT-rezistente,
observata anterior la determinarea citotoxicității prin tehnica MTS, într-o manieră dependentă
de concentrație sunt confirmate și la evaluarea evenimentelor apoptotice prin citometrie în
flux.
17
Tabel 2. Distributia procentuala a evenimentelor apoptotice la nivelul
liniilor parentale și rezistente la TPT (TR) sau ADB (AR)
Linii celulare Agenti chimioterapeutici Apoptoza timpurie (%) Apoptoza tarzie (%) Apoptoza totala (%)
MCF-7
Control 1.18 3.51 4.69
Topotecan 16.81 4.10 20.91
Adriablastina 12.01 6.65 18.66
MCF-7/TR
Control 2.61 3.59 6.20
Topotecan 4.04 9.58 13.62
Adriablastina 9.75 7.24 16.99
MCF-7/AR
Control 4.21 3.72 7.93
Topotecan 4.03 11.35 15.38
Adriablastina 8.49 6.14 14.63
MDA-MB-231
Control 1.48 5.16 6.64
Topotecan 10.34 12.00 22.34
Adriablastina 2.27 23.63 25.9
MDA-MB-231/TR
Control 2.67 10.45 13.12
Topotecan 8.07 9.56 17.63
Adriablastina 4.92 21.89 26.81
MDA-MB-231/AR
Control 3.31 8.36 11.67
Topotecan 5.78 15.44 21.22
Adriablastina 4.34 11.14 15.48
SK-BR-3
Control 2.27 2.06 4.33
Topotecan 7.54 3.59 11.13
Adriablastina 10.60 4.38 14.98
SK-BR-3/TR
Control 3.37 4.35 7.72
Topotecan 5.78 2.67 8.45
Adriablastina 9.90 4.46 14.36
SK-BR-3/AR
Control 2.11 2.29 4.40
Topotecan 7.00 3.98 10.98
Adriablastina 3.81 3.70 7.51
HeLa
Control 2.62 2.62 5.24
Topotecan 1.96 12.52 14.47
Adriablastina 10.26 13.42 23.68
HeLa/TR
Control 4.42 4.65 9.07
Topotecan 1.71 8.65 10.36
Adriablastina 3.25 18.10 21.35
HeLa/AR
Control 3.74 2.44 6.18
Topotecan 2.22 12.10 14.32
Adriablastina 2.78 4.84 7.62
SK-OV-3
Control 0.50 2.64 3.14
Topotecan 2.73 11.94 14.72
Adriablastina 13.22 6.26 19.48
SK-OV-3/TR
Control 6.05 2.02 8.07
Topotecan 4.15 5.45 9.6
Adriablastina 15.02 2.41 17.43
SK-OV-3/AR
Control 1.87 3.09 4.96
Topotecan 5.48 8.21 13.69
Adriablastina 3.31 4.63 7.94
MCF-7/A
Control 1.10 1.76 2.86
Topotecan 2.67 11.18 13.85
Adriablastina 3.34 1.77 5.11
5) Evaluarea statusului de proliferare al liniilor celulare parentale și subliniilor
rezistente la adriablastină și topotecan prin analiza dinamicii ciclului celular
Citometria în flux reprezintă o tehnică superioară metodelor clasice de analiză celulară,
ea fiind cea mai adecvată pentru monitorizarea distribuției cantității de ADN în fazele ciclului
celular. Pentru a determina activitatea proliferativă a liniilor celulare parentale și subliniilor cu
rezistență la adriablastină sau topotecan prin masurarea distribuției nucleilor in fazele ciclului
celular (G0/G1, S și G2/M), s-a realizat colorarea cu iodura de propidiu (PI) a nucleilor liniilor
18
parentale, AR sau TR, urmata de achizitia a 20000 de evenimente si analiza datelor utilizand
soft-urile dedicate.
Figura 4. Distribuția pe fazele ciclului celular a celulelor MCF-7 parentale și rezistente
MCF-7 MCF-7/AR MCF-7/TR
Linia celulara G0/G1 (%) S (%) G2/M (%) IP (%)
MCF-7 72.22 16.86 10.92 27.78 MCF-7/AR 70.17 19.17 10.66 29.83 MCF-7 /TR 71.11 19.01 9.88 28.89
Figura 5. Distribuția pe fazele ciclului celular a celulelor SK-OV-3 parentale și rezistente
SK-OV-3 SK-OV-3/AR SK-OV-3 /TR
Linia celulara G0/G1 (%) S (%) G2/M (%) IP (%)
SK-OV-3 73.08 10.38 15.82 26.2
SK-OV-3/AR 71.70 10.09 18.21 28.3 SK-OV-3/TR 74.85 9.12 16.03 25.15
Figura 6. Distribuția pe fazele ciclului celular a celulelor SK-BR-3 parentale și rezistente
SK-BR-3 SK-BR-3/AR SK-BR-3/TR
Linia celulara G0/G1 (%) S (%) G2/M (%) PI (%)
SK-BR-3 62.36 29.59 8.05 37.64 SK-BR-3/AR 66.15 20.37 13.47 33,84 SK-BR-3/TR 64.20 29.78 6.02 35,8
19
Figura 7. Distribuția pe fazele ciclului celular a celulelor HeLa parentale și rezistente
HeLa HeLa /AR HeLa /TR
Linia celulara G0/G1 (%) S (%) G2/M (%) IP (%)
HeLa 74.57 13.25 12.18 25.43 HeLa/AR 77.62 10.35 11.57 21.92 HeLa/TR 74.03 7.94 13.83 21.77
Figura 8. Distribuția pe fazele ciclului celular a celulelor MCF-7/A parentale și rezistente
MCF-7 MCF-7/AR MCF-7/TR
Linia celulara G0/G1 (%) S (%) G2/M (%) IP (%)
MCF-7 72.22 16.86 10.92 27.78 MCF-7/AR 70.17 19.17 10.66 29.83 MCF-7 /TR 71.11 19.01 9.88 28.89
Rezultatele obținute la analiza dinamicii ciclului celular au arătat că între pattern-urile
de distribuție la nivelul ciclurilor celulare ale celulelor subliniilor rezistente și liniilor
parentale corespunzătoare pentru MCF-7, SK-OV-3 nu apar diferențe notabile în cazul
rezistenței la ADB și nici la TPT. O scădere ușoară a activității proliferative a fost înregistrată
la unele sublinii rezistente (SK-BR-3/Ar, HeLa/AR, HeLa/TR). Suprapunerea histogramelor
ADN (Fig. 9) arată foarte clar distribuția asemănătoare a fazelor ciclului celular in liniile
parentale și subliniile rezistente.
Datele sunt în concordanță cu cele din literatura de specialitate cu privire la scăderea
activității proliferative în rezistența la agenții chimioterapeutici. O explicație pentru scăderea
activității proliferative în celulele cu rezistență ar fi modificarea expresiilor unor proteine
implicate în controlul ciclului celular și diferențierea celulelor rezistente, dezvoltarea
fenotipului rezistent putând fi însoțită de o serie de schimbări în structura morfologică, în rata
de proliferare și în expresia proteinelor implicate în apoptoză și controlul ciclului celular
(Lukyanova, 2009). Se consideră că reducerea expresiei Topo II ar fi implicată în mod direct
20
în reducerea ratei de proliferare întrucât este esențială pentru replicarea ADN-ului (Forushani,
2004), Topo IIα dovedindu-se a fi un marker de proliferare relevant (Romero, 2011).
Figura 9. Profilurile histogramelor ADN ale liniilor parentale și rezistente
MCF-7, MCF-7/AR, MCF-7/TR SK-BR-3, SK-BR/AR, SK-BR-3/TR
SK-OV-3, SK-OV-3/AR, SK-OV-3/TR HeLa-7, HeLa-7/AR, HeLa-7/TR
II. Statusul Topoizomerazei I, Topoizomerazelor II alfa și beta
Cu toate că mecanismele implicate atât în rezistența de novo cât și în cea dobândită au
fost studiate în profunzime, topoizomerazele fiind și ele investigate într-o serie de studii,
implicarea acestora în sensibilitate/rezistență nu este complet elucidată. Astfel, un obiectiv
important al studiului a constat în evaluarea expresiilor Topoizomerazei I și Topoizomerazelor
II α și II β pentru a determina implicarea acestora în rezistența la chimioterapie.
Determinarea s-a făcut la începutul demararii studiilor și pe parcursul dobândirii
caracterului de rezistență la ADB (inhibitor al Topo II) sau TPT (inhibitor al Topo II) pentru
întreg panelul de linii celulare parentale selectate pentru studiu (MCF-7, MDA-MB-231, SK-
BR-3, HeLa, SK-OV-3) și pentru variantele rezistente (MCF7/AR, MCF-7/TR, MDA-MB-
231/AR, MDA-MB-231/TR, SK-BR-3/AR, SK-BR-3/TR, HeLa/AR, HeLa/TR, SK-OV-3/AR
și SK-OV-3/TR).
21
1) Analiza expresiei proteice constitutive a topoizomerazelor prin citometrie în flux și
imunocitochimie
A) Cuantificarea prin citometrie în flux a nivelurilor de expresie proteică constitutiva ale
Topo I, Topo IIα și II β
Determinarea expresiilor antigenelor nucleare Topo I, Topo II (izoformele α și β) prin
citometrie în flux s-a realizat, după permeabilizarea în prealabil a membranelor celulare, prin
marcarea secventiala cu anticorpi monoclonali specifici de iepure anti-om anti-Topo I, anti-
Topo II sau anti-Topo II β, și anticorpi secundari policlonali marcati fluorescent de capra
anti-iepure (IgG – FITC) (Abcam, Cambridge, UK).
Tabelul 3. Valorile procentuale ale nivelurilor de expresie ale Topo I, Topo IIα și IIβ
Antigen/
linie celulara
Celule pozitive (%)
MCF-7 MDA-MB-231 SK-BR-3 HeLa SK-OV-3
Topo I 95,31 94,35 86,79 87,74 91,35
Topo IIα 78,80 90,89 73,18 89,12 86,93
Topo IIβ 83,05 65,03 84,65 77,55 86,74
Analiza prin citometrie in flux, reprezentata prin histogramele distribuției fluorescenței
celulelor, a arătat în liniile parentale de același tip histologic MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-
3 (adenocarcinom mamar), dar și la cele aparținând altor tipuri precum HeLa (adenocarcinom
cervical) sau SK-OV-3 (adenocarcinom ovarian) o expresie proteică crescută a
topoizomerazelor înainte de inducerea rezistenței, exprimata atat ca valori procentuale de
celule pozitive, cât și ca valori MFI.
Tabelul 4. Valorile medii ale intensității fluorescenței ale Topo I, Topo IIα și IIβ
Antigen/
linie celulara
Intensitate medie de fluorescenta (MFI)
MCF-7 MDA-MB-231 SK-BR-3 HeLa SK-OV-3
Topo I 36,87 20,66 32,12 30 24,4
Topo IIα 21,98 25,3 32,14 27,92 25,14
Topo IIβ 21,79 14,66 37,94 25,69 17,83
Nivelurile de expresie antigenica ale Topo I, Topo IIɑ si IIβ determinate pe liniile
celulare parentale (MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3, HeLa și SK-OV-3), exprimate fie ca
procente de celule antigen- pozitive (IIF %), fie ca medii ale intensitatilor de fluorescenta
(MFI), sunt reprezentate prin suprapunerea histogramelor în figura 10.
22
Figura 10. Expresia proteică a Topo I (profil albastu), Topo IIα și (profil roșu), și II β (profil verde),
în celulele liniilor tumorale MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3, HeLa și SK-OV-3
MCF-7 MDA-MB-231 SK-BR-3
MCF-7/A HeLa SK-OV-3
B) Cuantificarea prin citometrie în flux a nivelurilor de expresie proteică ale Topo I, Topo
IIα și IIβ în diversele faze ale ciclului celular
Dubla marcare cu anticorpi monoclonali specifici pentru Topo I, Topo IIα, Topo IIβ/
anticorpi secundari fluorescent și iodura de propidiu a permis cuantificarea nivelului acestor
enzime în diferitele faze ale ciclului celular. Analiza rezultatelor obtinute a evidențiat la toate
liniile celulare parentale luate in studiu expresii antigenice crescute ale celor trei
topoizomeraze in toate fazele ciclului celular, inclusiv în faza G0/G1.
C) Cuantificarea nivelului de expresie proteică al Topo I, Topo IIα și IIβ prin
imunocitochimie
Determinarea expresiei Topo I și izoformelor α și β ale TopoII la nivelul liniilor
celulare prin imunocitochimie s-a realizat pe preparate citospin marcate cu anticorpi primari
specifici după reactivarea epitopului, blocarea peroxidazei endogene și apoi amplificarea
reacției prin incubare cu un anticorp secundar cuplat cu peroxidază. Rezultatele obtinute,
vizualizate prin colorațiile nucleare intens pozitive, au arătat niveluri crescute ale expresiei
antigenice pentru toate cele trei topoizomeraze.
23
Figura 11. Expresia Topo I (A), Topo IIα (B) și IIβ (C) în celulele MCF-7 si HeLa
A
B
C
A
B
C
In concluzie, analiza rezultatelor obtinute atat prin citometrie în flux, cât și prin
imunocitochimie a evidentiat o expresie ridicată constitutiva a topoizomerazelor in toate liniile
celulare luate in studiu si în toate fazele ciclului celular. Din literatura de specialitate (Baker
1995, Heck 1988, Bai 2016, Campos 2016) se cunoaște faptul că TopoI, si TopoII α si β au
pattern-uri de exprimare diferentiate, fiind reglate prin mecanisme diferite în timpul progresiei
prin fazele ciclului celular.
Nivelurile de exprimare ale TopoI și izoformei β a TopoII nu sunt dependente de fazele
ciclului celular, fiind exprimate indiferent de statusul proliferativ, inclusiv în G0/G1. Topo
IIα, cunoscută ca un marker de proliferare celulară și transformare malignă, este înalt
exprimată în celulele aflate în diviziune (Sandri 1996, Jin 2017). În celulele normale aceasta
izomeraza atinge un maxim în timpul fazelor G2/M și apoi scade semnificativ, după mitoză.
Unele studii au arătat că în celulele tumorale expresia este crescută indiferent de fazele
ciclului celular, fiind prezentă și în G0/G1 (Villman 2002).
Rezultatele noastre arată de asemenea o expresie crescută și pentru Topo II α în toate
liniile tumorale luate în studiu, indiferent de tipul histologic al tumorii din care au fost
imortalizate. Prezența topoizomerazelor în faza G0/G1 poate avea implicații clinice
importante, agenții chimioterapeutici care țintesc topoizomerazele I sau II putând acționa
inclusiv în G0 și astfel influența răspunsul la chimioterapie.
S-a observat ca expresiile proteice ale Topo I, Topo IIα și IIβ sunt crescute în liniile
celulare tumorale parentale (MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3, HeLa și SK-OV-3). În cadrul
24
fiecarei linii celulare au fost observate unele diferențe intre nivelurile de expresie ale celor trei
topoizomeraze, fără însă să existe o corelație semnificativa intre ele, rezultata din analiza
statistica realizată pentru determinările prin citometrie în flux, urmărind atât procentul de
celule pozitive, cât si valorile MFI.
2) Analiza prin citometrie în flux a expresiei proteice a topoizomerazelor la nivelul
subliniilor cu rezistenta indusa
Nivelurile de exprimare ale Topo I, Topo IIα și Topo IIβ s-au monitorizat pe întreg
parcursul dobândirii caracterului de rezistență, prin tratarea celulelor cu concentrații crescânde
de TPT (intre 3 la 60 nM in functie de linia celulara) timp de 10 luni si analizând periodic prin
citometrie in flux expresia antigenica a celor trei topoizomeraze in subliniile rezistente la TPT
(MCF-7/TR, MDA-MB-231/TR, SK-BR-3/TR, HeLa/TR și SK-OV-3/TR). După 5 luni de la
inițierea inducerii fenotipului rezistent la TPT s-a observat o scădere tranzitorie, marcantă, a
expresiei Topo I, la nivelul subliniilor SK-BR-3/TR și HeLa/TR, si mai diminuata in
subliniile MCF-7/TR si MDA-MB-231/TR. Topo IIα a prezentat mici variații de expresie
antigenica, în timp ce expresia Topo IIβ a înregistrat fluctuații.
Inducerea rezistenței la ADB in liniile celulare luate in studiu s-a realizat prin
tratamente cu concentrații de la 20 la 700 nM, functie de linie, pe o perioada de 10 luni. La
nivelul subliniilor rezistente la ADB (MCF7/AR, MDA-MB-231/AR, SK-BR-3/AR,
HeLa/AR si SK-OV-3/AR) s-a înregistrat rapid o scădere a expresiei Topo IIα după inițierea
inducerii rezistenței, urmată de o tendință de revenire la un nivel mai ridicat, urmata din nou
de o scădere a expresiei. Cea mai marcantă scădere s-a înregistrat la subliniile MCF-7/AR și
SK-BR-3/AR, iar cel mai ridicat nivel de exprimare a proteinei s-a înregistrat la HeLa/AR.
Expresia Topo I a fost în general nemodificată, în timp ce expresia Topo IIβ a înregistrat
fluctuații.
In concluzie, rezultatele obținute prin analiza expresiei proteice, utilizand citometria in
flux, a Topo I, Topo IIα și Topo IIβ pe parcursul inducerii rezistenței la TPT (citostatic
inhibitor al Topo I) și ADB (citostatic inhibitor al Topo II), au arătat o scădere a nivelului
Topo IIα în cursul dobândirii fenotipului de rezistență la ADB, fără să survină și scăderea
nivelului Topo I; in schimb, în celulele cu rezistență la TPT, s-a constatat o scădere a
nivelului Topo I, fără reducerea expresiei proteice a Topo IIα.
25
3) Evaluarea prin Western Blot a expresiei proteice a topoizomerazelor la nivelul
subliniilor cu rezistenta indusa
Tehnica Western Blot reprezintă tehnica cea mai folosită pentru evaluarea expresiei
proteice a topoizomerazelor. Pentru această determinare, am preparat lizate celulare atat din
liniile celulare parentale, cât și din cele cu rezistență indusa la ADB sau TPT. Separarea
proteinelor s-a facut în gel de poliacrilamidă cu grad de inretelare de 7,5%, pe care apoi le-am
transferat pe membrane de PVDF, ce au fost in continuare tratate cu anticorpi primari specifici
soarece anti-om: clona C-21 anti-TopoI, clone 31 anti-TopoIIα și clone 40 anti-TopoIIβ, iar
apoi cu anticorpul secundar capra anti-soarece cuplat cu peroxidază (BD Biosciences, USA).
Drept control s-a folosit beta actina (MW = 42 kDa). Pentru detecție s-a folosit sistemul de
amplificare prin chemiluminescenta (ECL).
Intensitatea benzilor corespunzătoare maselor moleculare ale celor trei topoizomeraze
(MW = 100 kDa pentru Topo I; MW = 170 kDa pentru Topo IIα, MW = 180 kDa pentru Topo
IIβ) a fost diferită intre liniile parentale, chiar daca proveneau din acelasi tip histologic. Cea
mai înaltă expresie pentru Topo I a fost observată la nivelul liniei MDA-MB-231, iar cea mai
redusă in celulele SK-BR-3 si SK-OV-3. Topo IIα a avut cele mai intense benzi la nivelul
liniilor MDA-MB-231 si HeLa, cel mai redus nivel înregistrandu-se la MCF-7/ SK-BR-3/
SK-OV-3.
Din datele obținute s-a constatat ca intensitatea benzilor corespunzatoare Topo I este
mai redusă in subliniile cu rezistenta indusa la TPT comparativ cu liniile parentale. Analiza
comparativa a nivelurilor Topo I în liniile mentionate a arata că expresia cea mai scăzută este
înregistrată la nivelul subliniei SK-BR-3/TR, iar cea mai crescută in celulele MCF-7/TR. In
ceea ce priveste expresia proteica a Topo IIα si Topo II β, s-au constatat mici variatii.
In subliniile celulare cu rezistenta indusa la ADB, analizand comparativ intensitatea
benzilor corespunzatoare Topo IIα, se observă de asemenea o scadere a intensitații fată de
liniile parentale. Cea mai scăzută intensitate a benzilor s-a înregistrat la SK-BR-3/AR si
MCF-7/AR, intensitatea mai ridicată fiind inregistrată la HeLa/AR si MDA-MB-231/AR.
Topo I a avut in general pattern-uri de expresie asemănătoare liniilor parentale din care au
derivat, in timp ce expresia Topo IIβ a variat.
Rezultatele obținute prin Western Blot sunt în general în concordanță cu datele
obținute din evaluarea expresiei proteice prin citometrie în flux, și sustin ceea ce am constatat
la determinarea expresiei prin această tehnică: prin achiziția fenotipului rezistent la TPT
expresia Topo I scade, fără ca expresia Topo IIα să fie afectată, iar in celulele rezistente la
ADB se inregistrează o scadere a expresiei Topo IIα., fară afectarea expresiei Topo I.
26
4) Analiza expresiei genice a topoizomerazelor la nivelul liniilor parentale și rezistente la
TPT sau ADB
În scopul identificării prezenței sau absenței expresiei genice a topoizomerazelor in
liniile parentale si cu rezistenta indusa, cDNA-urile celulelor au fost supuse analizei expresiei
genice prin RT-PCR, utilizând metoda Taqman și primeri specifici.
Figura 12. Nivelurile de expresie genica ale topoizomerazelor in liniile celulare cu rezistenta indusa,
raportate la liniile parentale (n-fold)
Rezultatele obținute, reprezentate pe scala logaritmica, demonstrează o expresie genică
diferențiată în liniile celulare cu rezistenta indusa, raportata la linia parentala pentru toate cele
trei topoizomeraze, Topo I, Topo IIα sau Topo IIβ, luate in studiu.
27
III. Determinarea corelațiilor existente între nivelurile de expresie a topoizomerazelor și
sensibilitatea/ rezistența la ADB sau TPT
Pentru a determina implicarea topoizomerazelor în rezistența la ADB sau TPT am
analizat eventualele corelatii existente intre nivelurile de expresie proteică a fiecarei
topoizomeraze (Topo I, Topo IIα și β), evaluate prin citometrie in flux și exprimate ca
procente de celule pozitive (IIF%) si răspunsul celulelor la tratamentul cu ADB sau TPT,
exprimat prin valorile IC50.
Analiza corelațiilor dntre nivelurile proteice ale Topo I, Topo IIα sau Topo IIβ, și
valorile IC50 pentru cele două citostatice, a demonstrat corelatii inverse, statistic
semnificative, intre valorile IC50 la TPT si nivelul Topo I in liniile cu rezistenta indusa la
TPT, in timp ce in liniile cu rezistenta indusa la ADB, IC50 la ADB s-a corelat cu nivelul
Topo IIα (Fig. 13). Liniile parentale au demostrat acelasi tip de corelatii, atat pentru IC50/
TPT si nivelul Topo I, cat si pentru IC50/ADB si Topo IIα. Existenta corelatiilor inverse intre
concentratiile de citostatice si expresia topoizomerazelor denota de fapt corelatii directe intre
gradul de sensibilitate la tratament si nivelul de expresie proteica a acestor enzime nucleare.
Figura 13. Analiza corelațiilor între expresia topoizomerazelor (IIF%) și valorile IC50,
pe liniile parentale si rezistente laTPT sau ADB
A. B.
6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0
0
5
1 0
1 5
2 0
T o p o I
IC5
0 T
PT
R2
= 0 .7 4 7 6
p = 0 .0 0 1 2
5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
T o p o II a lp h a
IC
50
AD
B
R2
= 0 .7 6 1 8
p = 0 .0 0 0 5
In urma analizei statistice am găsit de asemenea o corelatie a raspunsului la TPT in
liniie parentale si rezistente la ADB si a raspunsului la ADB in liniile parentale si rezistente la
TPT (Fig. 14).
28
Figura 14. Analiza corelațiilor pentru rezistenta incrucisata, între expresia topoizomerazelor (IIF%) și
valorile IC50, pe liniile parentale si rezistente laTPT sau ADB
A. B.
5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
T o p o II a lp h a
IC5
0 A
DB
R2
= 0 .8 6 1 1
p = 0 .0 0 0 1
Existența corelației între nivelul Topo I și sensibilitatea la TPT sau între nivelul Topo
IIα și sensibilitatea la ADB, plus faptul că în cursul dobândirii fenotipului de rezistență la
ADB scăderea nivelului Topo IIα survine fără să se producă și o diminuare a nivelului Topo I,
iar scăderea nivelului Topo I în celulele cu rezistență la TPT are loc fara diminuarea nivelului
Topo IIα, reprezintă dovezi că aceste enzime sunt implicate în sensibilitatea/ rezistența la
citostaticele care au ținte primare aceste proteine.
Rezultatele obtinute sunt în concordanță cu studii anterioare în care s-a demonstrat că
reducerea nivelului Topo IIα duce la rezistența la ADB (Jarvinen 2000, Houlbrook 1995,
Durbecq 2004) sau reducerea nivelului Topo I determină rezistență la TPT (Zander 2010). Și
în cazul altor inhibitori ai Topo II, de tipul altor antracicline (MacGrogan 2003), sau etoposid,
amsacrină (Matsumoto 2001), dar și inhibitori ai Topo I, cum este irinotecanul (Jandu 2016,
Kumler 2015) s-a arătat că reducerea expresiei topoizomerazelor este asociată cu rezistența.
Explicația cea mai probabilă pentru asocierea dintre nivelul topoizomerazelor și
rezistența la ADB sau TPT ar fi reducerea capacității inhibitorilor de topoizomeraze de a
induce la nivelul ADN-ului rupturi dublu-catenare în urma interacției cu Topo IIα (Cox 2016),
sau rupturi mono-catenare inițial, apoi dublu-catenare, în urma interacției cu Topo I
(Darzynkiewicz 2009), știut fiind faptul că principalul mecanism de acțiune atât al ADB, cât și
al TPT îl reprezintă interacția cu aceste topoizomeraze (Ferreto 2016; Pommier 2009, 2010,
Jain 2017).
Se cunoaște că celulele tumorale care prezintă rezistență la un agent chimioterapeutic
manifestă de regulă rezistență la o serie de alte chimioterapice diferite structural și funcțional
(Ganapathy 2013, Kibria 2014). Multe celule rezistente la ADB prezintă un nivel ridicat de
29
rezistență încrucișată la chimioterapice care țintesc Topo II, precum mitoxantrona și
etoposidul, fără să prezinte însă rezistență încrucișată la cisplatin, carboplatin și 5-FU
(Forushani 2004). De aceea este necesar sa se stabileasca dacă și în cazul inhibitorilor de Topo
I și Topo II intervine rezistența încrucișată. Astfel, în urma analizei de corelație în ceea ce
privește rezistența încrucișată la TPT a liniilor rezistente la ADB și viceversa, s-a constatat că
rezistența la TPT nu conferă rezistență la ADB. Absența cross-rezistenței între ADB și TPT
are implicații clinice deosebite validând folosirea atât împreună a celor două chimioterapice,
cât și a TPT în linia a doua de tratament după utilizarea în prima linie a ADB, în prezent TPT
este în general folosit în cancerul ovarian, în linia a doua la pacienții cu rezistență la
tratamentul cu săruri de platină și taxani (Klejewski 2017), în cancerul cervical împreună cu
săruri de platină (Robati 2008) și cancerul de plămâni (Brahmer 1998).
Este important să se stabilească/cunoască dacă alterarea nivelului topoizomerazelor
determină rezistența la ADB sau TPT independent de alte mecanisme. Analiza trebuie sa fie
mai amplă, întrucât atât în rezistența la ADB, cât și la TPT sunt implicate mecanisme diferite.
30
CONCLUZII GENERALE
- Utilizarea sistemului xCELLigence pentru analiza in timp real a proliferarii vs.
citotoxicitatea celulara sub actiunea unor agenti chimioterapeutici anti-topoizomeraze a oferit
avantaje importante comparativ cu metodele clasice, colorimetrice, tip “end-point”. Datele
obținute au permis selecția concentrațiilor de agenti anti-topoizomeraze și perioadele de timp
pentru aplicarea tratamentelor, utile în testele ulterioare tip „end-point” (citometrie in flux,
RT-PCR, WB);
- Analiza comparativa a datelelor obținute in urma testelor de citotoxicitate prin tehnica MTS
a arătat că subliniile MCF-7/AR și MCF-7/TR, MDA-MB-231/AR și MDA-MB-231/TR,
SK-BR3/AR și SK-BR3/TR, HeLa/AR și HeLa/TR, SK-OV-3/AR și SK-OV-3/TR, variante
ale liniilor umane de cancer mamar MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231, cancer ovarian SK-
OV-3 și cancer cervical HeLa obținute prin selecția treptată a celulelor cultivate în mediu cu
concentrații crescânde de ADB sau TPT, sunt sublinii cu rezistenta indusa, fiecare demostrand
un grad de rezistență specific la ADB sau TPT. Rezultatele obtinute au arătat că rezistența la
ADB nu induce rezistență încrucișată la TPT, și viceversa.
- Valorile IC50 obținute prin analiza RTCA au fost comparabile cu valorile obținute în urma
realizării testelor de citotoxicitate clasice, colorimetrice (cu MTS). Astfel, în urma analizei
curbelor de inhibare a proliferarii si calcularea IC50 s-a ales un interval pentru concentrațiile
de lucru in functie de rezistenta constitutiva sau indusa a liniilor celulare luate in studiu.
- Evaluarea evenimentelor apoptotice prin citometrie în flux confirmă fenotipul
chimiorezistent achiziționat în timpul procesului de inducere a rezistenței la citostatice:
subliniile rezistente la ADB sau TPT au o apoptoza redusă la expunerea la citostaticul la care
s-a indus rezistența. Astfel, sensibilitatea la TPT a celulelor ADB-rezistente și viceversa,
sensibilitatea la ADB a celulelor TPT-rezistente, observata anterior la determinarea
citotoxicității prin tehnica MTS, într-o manieră dependentă de concentrație, sunt confirmate și
la evaluarea evenimentelor apoptotice prin citometrie în flux.
- Analiza dinamicii ciclului celular a aratat că între pattern-urile de distribuție la nivelul
subliniilor cu rezistenta indusa și liniilor parentale corespunzătoare a aratat ca in general nu
apar diferențe notabile în cazul rezistenței la ADB sau TPT. Suprapunerea histogramelor ADN
arată o distribuție asemănătoare a nucleilor in fazele ciclului celular in liniile parentale și
subliniile rezistente. Datele sunt în concordanță cu cele din literatura de specialitate cu privire
la scăderea activității proliferative în rezistența la agenții chimioterapeutici.
31
- Rezultatelor obtinute atat prin citometrie în flux, cât și prin imunocitochimie a evidentiat o
expresie ridicată constitutiva a topoizomerazelor in toate liniile celulare luate in studiu si în
toate fazele ciclului celular.
- Rezultatele obținute prin analiza expresiei proteice, utilizand citometria in flux, a Topo I,
Topo IIα și Topo IIβ pe parcursul inducerii rezistenței la TPT (citostatic inhibitor al Topo I)
sau ADB (citostatic inhibitor al Topo II), au arătat o scădere a nivelului Topo IIα în cursul
dobândirii fenotipului de rezistență la ADB, fără să survină și scăderea nivelului Topo I; in
schimb, în celulele cu rezistență la TPT, s-a constatat o scădere a nivelului Topo I, fără
reducerea expresiei proteice a Topo IIα.
- Rezultatele obținute prin Western Blot sunt în general în concordanță cu datele obținute din
evaluarea expresiei proteice prin citometrie în flux: prin achiziția fenotipului rezistent la TPT
expresia Topo I scade, fără ca expresia Topo IIα să fie afectată, iar in celulele rezistente la
ADB se inregistrează o scadere a expresiei Topo IIα., fară afectarea expresiei Topo I.
- Analiza RT-PCR a demonstrat o expresie genică diferențiată în liniile celulare cu rezistenta
indusa, raportata la linia parentala pentru toate cele trei topoizomeraze, Topo I, Topo IIα sau
Topo IIβ, luate in studiu.
- Analiza corelațiilor dntre nivelurile proteice ale Topo I, Topo IIα sau Topo IIβ, și valorile
IC50 pentru cele două citostatice, a demonstrat corelatii inverse, statistic semnificative, intre
valorile IC50 pentru TPT si nivelul Topo I in liniile cu rezistenta indusa la TPT, in timp ce in
liniile cu rezistenta indusa la ADB, IC50 la ADB s-a corelat cu nivelul Topo IIα.
- Rezultatele prezentate au arătat că scăderea nivelului Topo I sau Topo IIα este suficientă
pentru a determina rezistența la ADB sau TPT în liniile celulare de cancer mamar, cervical sau
ovarian; în cazul inhibitorilor de Topo I (topotecan) și Topo II (adriablastina) nu intervine
rezistența încrucișată.
- O mai bună cunoaștere a mecanismelor moleculare ale rezistenței la chimioterapie ar putea
conduce la identificarea unor markeri moleculari predictivi cu adevarat relevanți pentru
raspunsul la chimioterapie, iar topoizomerazele ar putea juca un rol important in stabilirea
unor strategii inovative, personalizate pentru pacienții cu neoplazii.
32
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA
1. Bai, Y., Li, L.D., Li,J., Lu,X. (2016) Targeting of topoisomerases for prognosis and
drug resistance in ovarian cancer. Journal of Ovarian Research, 9 (1), 35.
2. Baker, S.D., Wadkins, R.M., Stewart, C.F., Beck, W.T., Danks, M.K. (1995) Cell
Cycle Analysis of Amount and Distribution of Nuclear DNA Topoisomerase I as
Determined by Fluorescence Digital Imaging Microscopy. Wilcy-Liss, 19 (2), 134 –
45.
3. Brahmer, J.R., Ettinger, D.S. (1998) The Role of Topotecan in the Treatment of Small
Cell Lung Cancer. The Oncologist, 3 (1), 11 – 14.
4. Campos-Nebel, M., Palmitelli, M., Gonzalez-Cid, M. (2016) A Flow Cytometry-Based
Method for a High-Throughput Analysis of Drug-Stabilized Topoisomerase II
Cleavage Complexes in Human Cells. Cytometry, 89 (9), 852 - 860.
5. Cox, J., Weinman, S. (2016) Mechanisms of doxorubicin resistance in hepatocellular
carcinoma. Hepat Oncol., 3 (1), 57 – 59.
6. Darzynkiewicz, Z., Halicka, D.H., Tanaka T. (2009) Cytometric Assessment of DNA
Damage Induced by DNA Topoisomerase Inhibitors. Methods Mol Biol., 582, 145 -
53.
7. Durbecq, V., Paesmans, M., Cardoso, F., Desmedt, C., Di Leo, A., Chan, S.,
Friedrichs, K., Pinter, T., Van Belle, S., Murray, E., Bodrogi, I., Walpole, E.,
Lesperance, B., Korec, S., Crown, J., Simmonds, P., Perren, T.J., Leroy, J.Y., Rouas,
G., Sotiriou, C., Piccart, M., Larsimont, D. (2004) Topoisomerase-IIA expression as a
predictive marker in a population of advanced breast cancer patients randomly treated
either with single-agent doxorubicin orsingle-agent docetaxel. Mol Cancer Ther, 3
(10), 1207 – 14.
8. Ferreto, N.P., Calaf, G.M. (2016) Influence of doxorubicin on apoptosis and oxidative
stress in breast cancer cell lines. International journal of oncology, 49, 753 - 762
9. Fodale, V., Pierobon, M., Liotta, L., Petricoin, E. (2011) Mechanism of Cell
Adaptation:When and How Do Cancer Cells Develop Chemoresistance? Cancer J., 17
(2), 89 – 95.
10. Forterre, P., Gadelle, D. (2009) Phylogenomics of DNA topoisomerases: their origin
and putative roles in the emergence of modern organisms. Nucleic Acids Research, 37
(3), 679 – 692.
11. Forushani, A.E., Azizi, E., Zeinali, S., Naser, Ostad, S.N. (2004) Cross-resistance to
Vincristin and Etoposide in a sub line of the human breast cancer T47D cells selected
for Adriamycin-resistance. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 2: 103 – 107.
12. Friche, E., Danks, M.K., Schmidt, C.A., Beck, W.T. (1991) Decreased DNA
Topoisomerase II in Daunorubicin-resistant Ehrlich Ascites Tumor Cells. Cancer
Research, 51, 4211 – 4218.
13. Ganapathi, R.N., Ganapathi, M.K. (2013) Mechanisms regulating resistance to
inhibitors of topoisomerase II. Frontier in Pharmacology, 4, 89.
14. Giovannetti, E., Mey, V., Danesi, R., Basolo, F., Barachini, S., Deri, M., Tacca, M.D.
(2005) Interaction between gemcitabine and topotecan in human non-small-cell lung
cancer cells: effects on cell survival, cell cycle and pharmacogenetic profile. British
Journal of Cancer, 92, 681 – 689.
15. Heck, M.M.S., Hittelmant, W.N., Earnshaw, W.C. (1988) Cell Biology differential
expression of DNA topoisomerases I and II during the eukaryotic cell cycle. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 85 (4), 1086 – 1090.
16. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D.B., Johnston, P.G. (2013) Cancer drug
resistance: an evolving Paradigm. Nature Reviews Cancer, 13 (10), 714 - 26.
33
17. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D.B., Johnston, P.G. (2013) Cancer drug
resistance: an evolving Paradigm. Nature Reviews | Cancer, 13 (10), 714 - 26.
18. Houlbrook ,S., Addison, CM., Davies, SL., Carmichaell, J., Stratford, IJ., Harris, AL.,
Hickson, I.D. (1995) Relationship between expression of topoisomerase II isoforms
and intrinsic sensitivity to topoisomerase II inhibitors in breast cancer cell lines.
British Journal of Cancer, 72 (6), 1454 – 1461.
19. Jain, C.K., Majumder, H.K., Roychoudhury, S. ( 2017) Natural Compounds as
Anticancer Agents Targeting DNA Topoisomerases. Current Genomics, 18 (1), 75 –
92.
20. Jandu, H.J., Aluzaite, K., Fogh, L., Thrane, S.W., Noer, J.B., Prosze, J.K., Do, N.,
Hansen, S.N., Damsgaard, B., Nielsen, S.L., Stougaard, M., Knudsen, B.R., Moreira,
J., Hamerlik, P., Gajjar, M., , Smid, M., Martens, J., Foekens, J., Pommier, Y.,
Brünner, N., Schrohl, A.-S. ,Stenvang, J. (2016) Molecular characterization of
irinotecan (SN-38) resistant human breast cancer cell lines. BMC Cancer, 16, 34.
21. Januchowski, R., Wojtowicz, K., Kordowska, P.S., Andrzejewska, M., Zabel, M.
(2013) MDR Gene Expression Analysis of Six Drug-Resistant Ovarian Cancer Cell
Lines. Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International, 241763
22. Jarvinen, T.A.H., Tanner, M., Rantanen, V., Barlund, M., Borg, Å., Grenman, S.,
Isola, J., (2000) Amplification and Deletion of Topoisomerase IIa Associate with
ErbB-2 Amplification and Affect Sensitivity to Topoisomerase II Inhibitor
Doxorubicin in Breast Cancer. American Journal of Pathology, 156 (3), 839 – 847.
23. Jin Mo Ku, Kim, S.R., Hong, S.H., Choi, H.S., Seo, H.S., Shin Y.G., Ko., S.G.
(2015)Cucurbitacin D induces cell cycle arrest and apoptosis by inhibiting STAT3 and
NF-jB signaling in doxorubicin-resistant human breast carcinoma (MCF7/ADR) cells.
Mol Cell Biochem, 409, 33 – 43
24. Jin, J., Zheng, D., Liu, Y. (2017) Correlation between the Expression of Topo Iiα and
Ki67 in Breast Cancer and its clinical Pathological characteristics. Pak J Med Sci, 33
(4), 844 - 848
25. Kar, I., Majumder, H.K., Chattopadhyaya, R. (2017) Extracts of Seven Indian Plants
Inhibit Human Topoisomerase I and Partially Inhibit Human Topoisomerase II.
iMedPub Journalsug 3 (1-1), 1 - 8.
26. Ke, X., Shen, L. (2017) Molecular targeted therapy of cancer: The progress and future
prospect. Frontiers in Laboratory Medicine, 1 (2), 69 – 75.
27. Kellner, U., Sehested, M., Jensen, P.B., Gieseler, F., Rudolph, P. (2002) Culprit and
victim – DNA topoisomerase II. The Lancet Oncology, 3 (4), 235 – 43.
28. Kibria, G., Hatakeyama, H., Akiyama, K., Hida, K., Harashima, H. (2014)
Comparative Study of the Sensitivities of Cancer Cells to Doxorubicin, and
Relationships between the Effect of the Drug-Efflux Pump P-gp. Biol. Pharm. Bull.,
37 (12), 1926 – 1935.
29. Klejewski, A., Świerczewska,M., Zaorska, K., Brązert, M., Nowicki, M., Zabel, M.,
Januchowski, R. (2017) New and Old Genes Associated with Topotecan Resistance
Development in Ovarian Cancer Cell Lines. Anticancer Research, 37, 1625-1636.
30. Kruczynski, A., Barret, J.M., Hille, B., Chansard, N., Astruc, J., Menon, Y., Duchier,
C., Cre´ancier, L., Hill., B.T. (2004) Decreased Nucleotide Excision Repair Activity
and Alterations of Topoisomerase II_ Are Associated with the in Vivo Resistance of a
P388 Leukemia Subline to F11782, a Novel Catalytic Inhibitor of Topoisomerases I
and II. Clinical Cancer Research, 10 (9), 3156 – 3168.
31. Lee, J.H., Wendorff, .J., Berger, J.M. (2017) Resveratrol: a novel type of
topoisomerase II inhibitor. JBC Papers in Press., 292 (51), 21011 – 21022.
32. Lee, K.C., Bramley, R.L., Cowell, I.G., Jackso , G.H., Austin, C.A. (2016)
Proteasomal inhibition potentiates drugs targeting DNA topoisomerase II. Biochemical
Pharmacology, 103, 29 – 39.
34
33. Lukyanova, N.Y., Rusetskya, N.V., Tregubova, N.A., Chekhun, V.F. (2009)
Molecular profile and cell cycle in mcf-7 cells resistant to cisplatin and doxorubicin.
Exp Oncol 2009, 31 (2), 87 – 91
34. MacGrogan, G., Rudolph, P., Mascarel, I., Mauriac, L., Durand, M., Avril, A.,
Dilhuydy, J.M., Robert, J., Mathoulin-Pelissier, S., Picot, V., Floquet, A.,
Sierankowski, G., Coindre, J.M. (2003) DNA topoisomerase IIa expression and the
response to primary chemotherapy in breast cancer. British Journal of Cancer, 89 (4),
666 – 671.
35. Matsumoto, Y., Takano, H., Fojo, T. (1997) Cellular Adaptation to Drug Exposure:
Evolution of the Drug-resistant Phenotype. Cancer Research, 57 (22), 5086 – 5092.
36. Matsumoto, Y., Takano, H., Kunishio, K., Nagao, S., Fojo, T. (2001)
Hypophosphorylation of Topoisomerase II in Etoposide (VP-16)-resistant Human
Carcinoma Cell Lines Associated with Carboxy-terminal Truncation. Jpn. J. Cancer
Res., 92 (7), 799 – 805.
37. Monti, E. (2007) Molecular Determinants of Intrinsic Multidrug Resistance in Cancer
Cells and Tumors. Cancer Drug Resistance, 14, 241 – 260.
38. Nielsen, D.L. (2004) Mechanisms and functional aspects of multidrug resistance in
Ehrlich ascites tumour cells. Danish Medical Bulletin, 51, 393 – 414.
39. Nitiss, J.L. (2009) DNA topoisomerase II and its growing repertoire of biological
Functions. Nat Rev Cancer, 9 (5), 327 – 337.
40. Nitiss, J.L. (2009) Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nat Rev
Cancer, 9 (5), 338 – 350.
41. Nitiss, J.L., Liu, Y.-X., Harbury, P., Jannatipour, M., Wasserman, R., Wang, J.C.
(1992) Amsacrine and Etoposide Hypersensitivity of Yeast Cells Overexpressing DNA
Topoisomerase II. Cancer Research, 52 (16), 4467 – 4472.
42. Patel, A.G., Flatten, K.S., Peterson, K.L., Beito, T.G., Schneider, P.A., Perkins, A.L.,
Harki, D.A., Kaufmann, S.H. (2016) Immunodetection of human topoisomerase I-
DNA covalent complexes. Nucleic Acids Research, 44 (6), 2816 – 2826.
43. Patel, S., Keller, B.A., Fisher, L.M. (2000) Mutations at Arg486 and Glu571 in Human
Topoisomerase IIa Confer Resistance to Amsacrine: Relevance for Antitumor Drug
Resistance in Human Cells. Molecular Pharmacology, 57 (4), 784 – 791.
44. Plo, I., Hernandez, H., Kohlhagen, G., Lautier, D., Pommier, Y., Laurent, G. (2002)
Overexpression of the Atypical Protein Kinase C - Reduces Topoisomerase II
Catalytic Activity, Cleavable Complexes Formation, and Drug-induced Cytotoxicity in
Monocytic U937 Leukemia Cells. The Journal of Biological Chemistry, 277 (35),
31407 – 31415.
45. Plo, I., Hernandez, H., Kohlhagen, G., Lautier, D., Pommier, Y., Laurent, G. (2002)
Overexpression of the Atypical Protein Kinase C - Reduces Topoisomerase II
Catalytic Activity, Cleavable Complexes Formation, and Drug-induced Cytotoxicity in
Monocytic U937 Leukemia Cells. The Journal of Biological Chemistry, 277 (35),
31407 – 31415.
46. Pommier, Y. (2009) DNA Topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, Biology and
Interfacial Inhibition. Chem Rev., 109 (7), 2894 – 2902.
47. Pommier, Y., Leo, E., Zhang, H.L., Marchand, C. (2010) DNA Topoisomerases and
Their Poisoning by Anticancer and Antibacterial Drugs. Chemistry & Biology, 17 (5),
421 – 33.
48. Potter, A.J., Gollahon, K.A., Palanca, B.J.A., Hartbert, M.J., Choi, Y.M., Moskovitz,
A.H., Potter, J.D., Rabinovitch, P.S. (2002) Flow cytometric analysis of the cell cycle
phase specificity of DNA damage induced by radiation, hydrogen peroxide and
doxorubicin. Carcinogenesis, 23 (3), 389 -401.
49. Qi, J., McTigue, M.A., Rogers, A., Lifshits, E., Christensen, J.G., Janne, P.A.,
Engelman, J.A. (2011) Multiple Mutations and Bypass Mechanisms Can Contribute to
35
Development of Acquired Resistance to MET Inhibitors. Cancer Research, 71 (3),
1081 – 91.
50. Robati, M., Holtz, D., Dunton, C.J. (2008) A review of topotecan in combination
chemotherapy for advanced cervical cancer. Therapeutics and Clinical Risk
Management, 4 (1), 213 – 218.
51. Sakasai, R., Iwabuchi, K. (2016) The distinctive cellular responses to DNA strand
breaks caused by a DNA topoisomerase I poison in conjunction with DNA replication
and RNA transcription. Genes Genet. Syst., 90 (4), 187 – 194.
52. Sandri, M., Hochhauser, D., Ayton, P., Camplejohn, R.C., Whitehouse, R., Turley, H.,
Gatter ,K., Hickson, I.D. and Harris, A.L. (1996) Differential expression of the
topoisomerase lla and fi genes in human breast cancers. Itih Joum, d Cmcer, 73 (12),
1518 – 1524.
53. Schaefer-Klein, J.L., Murphy, S.J., Johnson, S.H., Vasmatzis, G., Kovtun, I.V. (2015)
Topoisomerase 2 Alpha Cooperates with Androgen Receptor to Contribute to Prostate
Cancer Progression. PLOS ONE, 10 (11), e0142327.
54. Tanaka, S., Aizawa, K., Katayanagi, N., Tanaka, O. (1994) Flow Cytometric Analysis
of early steps in development of Adriamycin Resistance in a human Gastric cancer
Cell Line. Jpn. J. Cancer Res., 85, 86-92.
55. Vanhoefer, U., Müller, M.R., Hilger, R.A., Lindtner, B., Klaassen, U., Schleucher, N.,
Rustum, Y.M., Seeber, S., Harstrick, A. (1999) Reversal of MDR1-associated
resistance to topotecan by PAK-200S, a new dihydropyridine analogue, in human
cancer cell lines. British Journal of Cancer, 81(8), 1304 – 1310
56. Villman, K., Stahl, E., Liljegren, G., Tidefelt, U., Karlsson, M.G. 2002 Topoisomerase
II- Expression in Different Cell Cycle Phases in Fresh Human Breast Carcinomas.
Mod Pathol 15 (5), 486 – 491.
57. Zander, S.A.L., Kersbergen, A., Van der Burg, E., Water, N., Van Tellingen, O.,
Gunnarsdottir, S., Jaspers, J.E., Pajic, M., Nygren, A.O.H., Jonkers, J., Borst, P.,
Rottenberg, S. (2010) Sensitivity and Acquired Resistance of BRCA1;p53-Deficient
Mouse Mammary Tumors to the Topoisomerase I Inhibitor Topotecan. Cancer
Research, 70 (4), 1700 – 10.
Top Related