1
CompuCompuşşi organici i organici neazotaneazotaţţii: : glucidele glucidele şşi lipidei lipide
•
Dozarea enzimatică a glucozei
•
Determinarea lipidelor totale, a colesterolului liber şi esterificat, a trigliceridelor
•
Corpi cetonici
Curs 5
2
1. 1. CarbohidraCarbohidraţţii
Definiţie, clasificare, analizăGlucozaHemoglobina glicatăCorpi cetonici
3
CarboCarbohidrahidraţţii- polihidroxialdehide
sau cetone sau substanţe ce produc astfel de compuşi prin hidroliză
- sursă importantă de energie pentru organism şi modalitate
de stocare
a energiei;
Clasificare:
Monozaharide – zaharuri simple C4-C8, care conţin o funcţie aldehidică sau cetonică, sau sunt derivaţi ai acestor molecule.
Ex. Glucoza: 4 atomi C asimetrici, structurile liniare D şi L se referă la poziţia grupării –OH care poate fi situată la dreapta (izomer D) sau la stânga (izomer L) faţă de C-5.
Structura ciclică introduce un carbon asimetric suplimentar la C-1, cu izomerii α şi β pentru gruparea –OH la dreapta şi respectiv la stânga.
Monozaharidele au proprietăţi reducătoare conferite de gruparea aldehidică sau cetonică.
Oligozaharide – zaharuri care în urma hidrolizei furnizează 2 – 6 molecule de zaharidă.
maltoza (2 molecule de glucoză)lactoza (glucoză + galactoză)sucroza (glucoză + fructoză)
Polizaharide – Cei mai mulţi carbohidraţi din natură sunt polizaharide. În urma hidrolizei furnizează un număr mare de monozaharide (Ex. glicogen, amidon).
4
Structuri ale glucozei
5
GlucozaGlucoza
•
Cea mai investigată dintre glucidele serice•
Valoare
de referinţă: 70 –
110 mg/100 ml
•
Proba
analizată: ser, plasmă
Enzimele glicolitice din celulele sângelui pot determina scăderea nivelului de glucoză (cu 7 %/h)
Procedee de încetinire a glicolizei:
Adaos de inhibitori (NaF)Răcirea probeiSepararea serului de fracţiunea celulară imediat după recoltarea probei
6
Metode de analiză a glucozeiMetode de analiză a glucozei
•
Metoda nespecifică bazată pe proprietăţile reducătoare ale glucozei
(reacţie de culoare).
Eroarea
metodei:
5 -
15 mg/dl.
•
Metode
enzimatice specifice pentru glucoză
–
Glucozoxidaza–
Hexokinaza
–
Glucozdehidrogenaza
7
xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx x
Dozarea glucozei prin metoda colorimetrica cu o-toluidină
Principiu: Conjugarea
aldo-
şi cetohexozele
cu amine aromatice conduce la compuşi coloraţi, fotometrabili.
Pentru dozarea glucozei, amina cea mai potrivită este o-toluidina care formează cu aldohexozele
un compus intens colorat în verde, conform
reacţiei:
8
Determinarea Glucozei Determinarea Glucozei Metoda GODMetoda GOD--PODPOD
Principiu:Glucoza este oxidată în prezenţa glucozoxidazei (GOD) la acid gluconic cu formare de H2O2. În reacţia cromogenă auxiliară cu fenol şi 4-amino-antipirina, în prezenţă de peroxidază, se formează chinonimina, un compus roşu, fotometrabil.
Fotometrare: A 505 nm
; 37o C
22GOD
22 OHgluconicacidOHOGlucoza +⎯⎯ →⎯++
OHrosieChinonairinAminoantip-4FenolO2H 2POD
22 +⎯⎯ →⎯++
9
Determinarea Glucozei Metoda cu Hexokinaza
Principiu:Glucoza în prezenţă de ATP şi hexokinază este fosforilată la glucozo-6-fosfat. În reacţia cromogenă auxiliară glucozo-6-fosfatul în prezenţă de NADP+ şi sub acţiunea enzimatică a glucozo-6-fosfat dehidrogenazei (G-6-PDH) se transformă în 6-fosfogluconat (6-PG)Cantitatea de NADPH rezultată este echivalentă cu cantitatea de glucoză intrată în reacţieAbsorbaţa se măsoară la 340 nm.
ADPPGATPGlucoza Hexokinaza +−−⎯⎯⎯ →⎯+ 6
+−−+ ++−⎯⎯⎯ →⎯+−− HNADPHPGNADPPG PDHG 66 6
10
Nicotinamid
adenin
dinucleotid
fosfat NADP+
AbsorbantaX10-3
Lungime de undă, nm
NADP+
NADPH
11
ATPATP
Adenozin-5'-trifosfat (ATP) este o nucleotidă multifuncţională, importantă în transferul de energie intracelular.
Transportă energia chimică necesară metabolismului în cadrul celulelor
Este generat ca sursă de energie în timpul proceselor de fotosinteză şi respiraţie celulară
Este consumat de către multe enzime şi o multitudine de procese celulare.
12
ADPADP
Adenozin
fosfat
(ADP)
(esterul acidului pirofosforic
cu nucleozida
adenozinei
-
alcătuit din gruparea pirofosfat, pentoza riboză şi adenină
-
ADP este produsul de defosforilare
al ATP sub acţiunea
ATPazei
-
ADP este transformat înapoi la ATP sub acţiunea ATPsintetazei.
13
Determinarea glucozei pe filme multistrat
•
Secţiune transversală prin filmul multistrat Schema unui fotometru de pentru determinarea glucozei reflectanţă
Stratul de dispersie (acetat de celuloză +TiO2 ca reflectant) are trei roluri:reflectă radiaţia de la sursa luminoasă din spatele reactivului şi a suportului spre detectorul unui fotometru;forţează proba să difuzeze într-un strat uniform; reţine celule, cristale şi particule precum molecule mari, cum sunt proteinele.
Proba (10 μl) este aplicată pe film, incubată la 37.00±0.05o
C timp de 7 min.
Reflectanţa este măsurată la 495 nm.
Strat de difuzie şi reflexie
Strat
cu reactiviGODPOD
Tampon pH=5Indicator redox
Gelatină
Suport
transparent
Probă
10 μm
100μm
Film multistrat
Filtru
Sursă Detector
14
HemoglobinaHemoglobina
glicatglicată ă ((GHbGHb))
Glicoproteine
-
proteine care au ataşate covalent oligozaharide, formând glicoproteine
Cea mai importantă - GHb
NH2 H-C=O H-C=N-βA H2C-NH-βA + βA H-C-OH H-C-OH C=O HbA + Glucoză pre Hb A1c Hb A1c
•
Formarea sa este practic ireversibilă •
Conc.în sânge depinde de tviaţă
al hematiilor (~
120 zile) şi de conc. de glucoză •
Vformare
a GHb
este d.p.
cu nivelul glucozei din sânge ⇒ conc.
GHb reprezintă o valoare integrată a glucozei pe o perioadă anterioară de 6-8 săptămâni.
•
Valori
de referinta
-
4.8-6% (din hemoglobina
totală)
Grupare aminică N terminală Bază Schiff Cetonamină
RAPID LENT
15
Avantajele
pe
care le prezintă
determinarea HbA1c faţă
de glicemie:
Nu sunt necesare condiţiile “a jeun”;Stabilitate preanalitică mai mare;Variaţie biologică intraindividuală ↓ în comparaţie cu glicemia;Variaţii ↓ în condiţii de stres şi afecţiuni intercurente
Dezavantaje
ale HbA1c:
Cost mai ridicat;Lipsa de disponibilitate a testului în unele tari/regiuni;Lipsa de corelaţie a HbA1c cu glicemia medie la unele persoane;HbA1c nu este relevantă la pacienţii cu unele boli de sînge
16
2. 2. LipideLipide
Definiţie
Clasificare
Analiza
lipidelor
17
LIPIDE
LipideLipidede constituţiede depozitcirculante
Compuşi cu structură
eterogenă, cu unele
caracteristici comune
greu solubile în apăsolubile în solvenţi nepolarirăspândiţi în lumea vie, principala formă de depozitare a resurselor de natură
energetică
Principalele
lipide
circulante
:TriglicerideColesterolFosfolipide
(intră în alcătuirea membranei celulare)
18
Lipidele circulă în organism sub formă de:
LIPOPROTEINE
particule sferice
miez hidrofob ce conţine trigliceride (T) şi colesterol liber (C) sau esterificat (CE)
înveliş format din molecule amfotere, situate cu capătulhidrofob către interiorul lipoproteinei şi cu cel hidrofil cătreexterior, în contact cu mediul apos (plasma); conţine fosfolipide(PL) şi unele proteine numite apolipoproteine (P).
19
Clasificarea lipoproteinelor
în funcţie
de densitate:
chilomicroni – transportă trigliceride
lipoproteine cu densitate foarte joasă (very low density lipoproteins –VLDL) - transportă trigliceride nou sintetizate
lipoproteine cu densitate joasă (low density lipoproteins – LDL) - transportă “colesterol rău”
lipoproteine cu densitate înaltă (high density lipoproteins – HDL) - transportă “colesterol bun”
Fracţiunile se pot separa cromatografic.
20
Lipoproteine Lipoproteine ––predictoripredictori
aiai
afeafeccţţiuniloriunilor coronarienecoronariene
Investigarea metabolismului lipidelor se bazează pe realizarea tabloului lipidic în sânge.
Concentraţiile de colesterol în HDL, LDL şi VLDL sunt predictori
importanţi pentru afecţiuni coronariene.
•HDL funcţional (colesterolul bun) oferă protecţie prin îndepărtarea colesterolului din celule şi ateroame.
•Concentraţii mai mari de LDL şi mai mici de HDL funcţional sunt strâns corelate cu boli cardiovasculare şi risc de ateroscleroză.
Valori optime Valori de risc Colesterol total <200 >240 LDL colesterol <100 160-189 HDL colesterol ~60 <40 Trigliceride <150
Lipide analizate pentru tabloul lipidic şi valorile optime (mg/dL)
21
ClasificareaClasificarea
lipidelorlipidelor
D.p.d.v.
chimic: lipidele conţin legături C-H nepolare produşii de hidroliză:
acizi graşi şi alcooli complecşi
Unele lipide conţin grupări polare
(
–OH, –
NH2
, –SH, fosforil, sialic), ceea ce le conferă afinitate atât pentru apă cât şi faţă de solvenţi organici.
Clasificare după structura chimică (şase categorii):
•
Colesterol•
Acizi graşi•
Trigliceride•
Sfingolipide•
Prostaglandine•
Terpene
22
Colesterol
C27
H46
O(3 β
OH colestan)
Denumirea
provine
din grecescul
chole (bilă) şi
stereos (solid) plus sufixul ol, fiind
identificat
în
calculii
colesterolici
în
anul
1784
• substanţă albă, caracter hidrofob pronunţat
• steroid, compus specific animalelor superioare
• se află în toate ţesuturile, în cantităţi mari în bilă
•
în organism se află atât liber cât şi esterificat cu acizii graşi
ca LDL şi HDL
23
AciziAcizi
gragraşşii•
Formula generală RCOOH; R -
rest alchilic. (acizi graşi saturaţi, acizi graşi mono-
sau polinesaturaţi) •
Acizii graşi circulanţi sunt în formă liberă sau esterificaţi la trigliceride, fosfolipide, colesterolesteri.
•
prin ruperea acizilor graşi liberi rezultă corpii
cetonici
(acetilacetatul, β-OH-
butiratul
şi acetona). Analiza corpilor cetonici se face în legătură cu boala diabetică
Denumire comună Denumrea sistematică
Lauric Dodecanoic
Miristic Tetradecanoic
Palmitic Hexadecanoic
Palmitoleic 9-Hexadecenoic
Stearic Octadecanoic
Oleic 9-Octadecanoic
Linoleic
(esenţial) 9,12-Octadecanoic
Linolenic
(esenţial) 9,12,15-Octadecanoic
Arahidic Eicosanoic
Arahidonic 5,8,11,14-Eicosatetraenoic
Principalii
acizi graşi prezenţi în ţesutul uman
24
Trigliceride
(grăsimi neutre)-esteri ai glicerolului cu 3 acizi graşi (oleic, palmitic, linoleic, stearic, etc.)-simple (cu un singur acid) sau mixte (cu mai mulţi acizi)-rol în stocarea energiei şi în eliberarea acizilor graşi pentru procesele de oxidare din ţesuturi
Fosfolipide–
conţin în structură acid fosforic alături de acizi graşi şi un alcool, tipic
glicerol. Partea hidrofilă şi cea hidrofobă conferă fosfolipidelor posibilitatea de transport.
25
Analiza lipidelor
•
Lipide totale-
se extrag în CH3
OH+CHCl3
; se evaporă solventul şi se cântăreşte reziduul
•
Colesterol totalEtape:
–
hidroliza esterului şi transformarea în colesterol liber şi acid gras
–
oxidarea colesterolului
–
Reacţia cromogenă auxiliară
grasacidColesterolesterColesterol CHE +⎯⎯ →⎯−
222 OHColestenOColesterol CHO +⎯⎯ →⎯+
OHrosieChinonatipirin4AminonoanFenolO2H 2POD
22 +⎯⎯ →⎯++
26
Determinarea colesterolului HDL
Principiu: Lipoproteinele din plasmă, cu excepţia HDL, sunt separate sau mascate
•
Separarea celorlalte lipoproteine: la punctul izoelectric cu polianioni, de ex. heparină, acid fosfowolframic, reacţie catalizată de prezenţa cationilor divalenţi; centrifugare; HDL rămâne în supernatant, unde se determină.
•
Determinarea directă a HDL
(în fază omogenă): mascarea colesterolului din celelalte lipoproteine
Determinarea colesterolului LDL
Metode indirecte
•
Ecuaţia Friedewald
Colesterol LDL = [colesterol total]-[colesterol HDL]-[trigliceride]/5 (mg/dL).
•
LDL sunt precipitate cu heparină la punctul izolectric al acestora (pH 5.12). După centrifugare, HDL şi VLDL rămân în supernatant
şi pot fi determinate prin metode enzimatice. Colesterolul LDL se estimează prin diferenţă:LDL colesterol = Colesterol
total –
Colesterol în supernatant
Metode directe
•
Precipitarea LDL urmată de determinarea colesterolui. •
Ca şi în cazul HDL, a câştigat teren metoda directă cu reactivi omogeni, în care măsurarea colesterolului LDL se face după mascarea colesterolului existent
în celelalte lipoproteine ori prin solubilizarea selectivă a LDL după pecipitare.
27
•
Trigliceride
Etape: –
hidroliza şi transformarea în glicerol şi acizi graşi
–
transformarea în glicerol fosfat
–
Oxidarea
la dihidroxiacetona
–
Reactia
cromogena
cu fenol
si
4-aminoantipirin
grasiaciziGliceroldeTrigliceri Lipaza +⎯⎯ →⎯
ADPfosfatGlicerolATPGlicerol nazaGlicerolki +−⎯⎯⎯⎯ →⎯+ 3
2223 OHcetonaDihidroxiaOfosfatGlicerol asfatoxidazGlicerolfo +⎯⎯⎯⎯ →⎯+−fosfat
28
3. Corpi cetonici3. Corpi cetonici
Se formează în ficat prin oxidarea acizilor graşi liberi din depozitele adipoase
•
Acid acetil acetic•
Acid β
OH butiric
•
Acetona
Creşterea concentraţiei de corpi cetonici:•
Cetonemie (în sânge)
•
Cetourie
(în urină)
29
Determinarea corpilor cetonici
•
Nu există reactiv care să dea reacţie pozitivă cu toţi cei 3 corpi cetonici
•
R. cu nitroprusiat
de sodiu Na2
[Fe(CN)5
NO] – de 10 ori mai sensibilă pentru acidul acetil acetic (în m. amoniacal, coloraţie violetă)
30
•
Prezentaţi o metodă de determinare enzimatică a glucozei din sânge.
•
Ce
este
hemoglobina
glicată? Ce avantaj prezintă determinarea sa faţă de cea a glucozei din sânge?
•
Indicaţi o variantă pentru încetinirea procesului de glicoliză în sângele colectat pentru determinarea glicemiei.
•
Ce sunt lipoproteinele?
•
Explicaţi acronimele HDL, LDL şi semnificaţia lor ca predictori
ai afecţiunilor coronariene.
•
Ce forme ale colesterolului sunt determinate ca şi colesterol total în sânge?
•
Ce sunt trigliceridele?
•
Ce sunt corpii cetonici şi din ce provin în sânge?
Top Related