INGINERIA CROMOZOMIAL I UTILIZAREA EI N AMELIORAREA PLANTELORVariabilitatea genetic la plante , poate fi cauzat i de mutaii genomice , care provoac variatii ale numrului de cromozomi din celule. n funcie de cromozomii afectai , mutaiile de genom pot fi: reprezentate de multiplicri ale ntregului set de cromozomi( EUPLOIDIE) sau modificarea unuia sau mai multor cromozomi din genom ( ANEUPLOIDIE). POLIPLOIDIE AUTOPOLIPLOIDIE EUPLOIDIE ALOPOLIPLOIDIEHAPLOIDIE MONOHAPLOIDIE POLIHAPLOIDIEOLIGOSOMIE MONOSOMIEANEUPLOIDIE NULISOMIEPOLISOMIE TRISOMIE TETRASOMIEVariaiile numrului de cromozomi apar natural , sub influena condiiilor de mediu , pe perioade mari de timp i su frecven relativ redus.Ingineria cromozomial se ocup cu manipularea cromozomilor ntregi sau a unor segmente a acestora n vederea folosirii genotipurilor astfel obinute n lucrri de genetic i ameliorare.POLIPLOIDIA I UTILIZAREA EI N AMELIORAREPoliploizii reprezint euploizi care au un multiplu al numrului de baz de cromozomi (x) seturi cromozomiale care provin de la formele parentale sau obinute n urma unor tratamente de multiplicare. Diversele variaii ale numrului de cromozomi determin lrgirea diversitii genetice i a bazei de selecie pentru activitatea de ameliorare. n funcie de originea i modul lor de obinere , poliploizii pot fi:AUTOPOLIPLOIZII : se obin prin multiplicarea numrului de baz al cromozomilor , astfel acetia vor avea trei sau mai multe garnituri de cromozomi. n funcie de gradul de ploidie , seturile de cromozomi sunt perfect omoloage . Pe cale natural s-au format diferite specii de cultur autotetraploide: lucerna , arahidele , cartoful , batatul (cartoful dulce) , arborele de cafea , unele forme de vi-de-vie.ALOPOLIPLOIZII : au seturi cromozomiale strine , obinute n urma unor hibridri interspecifice sau intergenice , urmate de dublarea numrului de cromozomi , caz n care seturile de cromozomi manifest ntre ele o omologie parial sau uneori sunt total diferite.ABAxBAABB

2n=4 2n=62n=5 2n=10Cele dou tipuri de poliploidie nu pot fi complet separate , existnd situaii n care formele poliploide au i seturi cromozomiale strine alturi de o multiplicare a seturilor proprii ale cromozomilor. Pe cale natural , se consider c aproximativ 30% din speciile vegetale sunt de natur poliploid.Poliploidia este , n general , asociat cu o cretere a dimensiunii celulelor i a organelor vegetative , caractere ce prezint interes pentru anumite specii de cultur.

AUTOPOLIPLOIDIA I UTILIZAREA EI N AMELIORAREA PLANTELORPrin multiplicarea seturilor de cromozomi , au loc modificri la nivelul morfo-fiziologic i biochimic , care se exteriorizeaz la nivelul fenotipic la majoritatea oragnelor plantei. Frunzele plantelor poliploide sunt mai mari , mai groase , prezentnd modificri ale culorii i formei sau a poziiei plantelor (culoare mai intens , limb grofat-ncreit ceea ce face ca absoria luminii s fie mai eficient). Tulpina poliploizilor este mai viguroas , iar sistemul radicular mai puternic dezvoltat. Florile , fructele i seminele poliploizilor sunt mai mari dar mai puine.Ritmul de cretere al poliploizilor este mai lent , plantele nfloresc mai trziu i au o perioad de vegetaie mai lung. n unele cazuri , poliploizii sunt superiori ca vigoare fa de formele din care provin , aprnd fenomenul numit gigantism , cu excepia poliploizilor care provin de la formele diploide cu numr mare de cromozomi , a cror vigoare este mai redus.Genotipurile prezint deosebiri evidente ntre ele n ceea ce privete reacia la poliploidizare , astfel este necesar testarea unui numr mare de genotipuri pentru a gsi forme poliploide viguroase. Comparativ cu formele diploide , poliploizii prezint fertilitate mai redus , datorit unor deranjamente ce apar n timpul fecundrii i formrii polenului. n ceea ce privete eficiena utilizrii poliploizilor n ameliorare , se iau n considerare urmtoarele principii: Autopoliploizii manifest o cretere superioar , asociat cu o fertilitate mai redus , astfel producia de semine a acestora este mai limitat , aceste forme prezint importan n ameliorarea speciilor furajere i a celor leguminoase sau ornamentale. Pretabilitatea la autopoliploidizare este mai mare la speciile cu numr mai mic de cromozomi , care permit obinerea unor forme valoroase fertile , n schimb la speciile cu numr mare de cromozomi , autopoliploidizarea determin o depire a numrului optim de cromozomi compatibili cu fertilitatea i productivitatea Speciile alogame ofer rezultate superioare prin aceast metod , fa de autogame n vederea identificrii unor genotipuri poliploide superioare , este necesar o populaie ct mai larg , care se obine mult mai uor la alogame comparativ cu autogamele.

ETAPELE AMELIORRII PRIN AUTOPOLIPLOIDIE

1. Inducerea ploidiei se realizeaz cu colchicin , extras din Colchicum autumnale sau Brndua de toamn (C22H25O6N) , care blocheaz activitatea fusului de diviziune , astfel nct cromozomii nu mai pot migra la poli. Colchicina se aplic pe regiuni meristematice prin pulverizare sau frecare cu past de lanolin. Aplicarea se realizeaz la semine germinate , plantule , rdcini sau muguri iar pentru a spori eficiena tratamentului i pentru a mpiedica evaporarea , soluiei i se adaug i agar sau glicerin. Tratamentul se aplic dimineaa , cnd frecvena diviziunii este maxim. La monocotiledonate (gru) se aplic o concentraie de 0,25% Colchicin , timp de 50-60 de minute , iar la dicotiledonate 1-2% timp de cteva ore. Protocolul tratamentului difer n funcie de specie i de stadiul de dezvoltare al organelor tratate. Seminele se imerseaz n soluie de Colchicin 12-24h n funcie de specie.2. Identificarea autopoliploizilor se poate realiza: Indirect : n funcie de anumite corelaii stabilite ntre gradul de ploidie i unele caractere ale plantei: dimensiunea i densitatea stomatelor , numrul i mrimea cloroplastelor ,etc. Direct : prin determinarea numrului de cromozomi cu ajutorul unor analize citologice3. Selecia i utilizarea autopoliploizilor : folosirea eficient a autoploizilor depinde de dimensiunea i variabilitatea materialului iniial , avnd n vedere c numai o mic parte din formele obinute sunt valoroase. Selecia aplicat este identic cu cea utilizat la formele mutanta, n F1 poliploizii fiind inferiori formelor diploide i avnd cerine aparte fa de condiiile de mediu. n F2 raporturile de segregare sunt mult mai complexe comparativ cu diploizii. Selecia la aceste forme necesit analizarea unui numr mare de indivizi , de unde pot fi reinute forme valoroase ce urmeaz a fi testate n vederea introducerii lor n producie , sau pot fi utilizate ca genitori n hibridare. La alogame , prin hibridarea autopoliploizilor , se pot obine forme superioare genitorilor , care manifest o vigoare asemntoare cu cea obinut prin heterozis , deoarece la autopoliploizi nivelul fertilitii este redus , selecia avnd ca scop i identificarea unor forme cu vitalitate superioar care s asigure fertilitate.La secar , formele tetraploide prezint boabe mai mari ns cu o producie de semine egal sau uor superioar formelor diploide , prezint un pai mai gros i mai rezistent la cdere iar nsuirile de panificaie ale boabelor sunt mai bune comparativ cu formele diploide.La orz , soiurile tetraploide au tulpina mai groas , frunze mai mari , spice mai lungi i boabe mai grele.Introducerea acestora n cultur este condiionat de sterilitatea spicului , fiind ns recomandate pentru cultura de furaj pentru mas verde.La trifoi , formele tetraploide prezint o mas vegetativ superioar , ns datoritmai multor factori , producerea de smn este foarte redus , astfel , numrul de flori este redus , corola are tub foarte lung , apare avortarea embrionilor i pierderea de cromozomi. Triploizii se obin prin fecundarea ovulului cu un numr redus de cromozomi (2x) de ctre un gamet mascul cu numr normal de cromozomi , astfel de forme se pot obine la specii unde exist diploizi i tetraploizi.

2n=2xx*2n=4x

n=x n=x n=2x n=2x

2n=3x sterilFormele triploide sterile pot fi utilizate n producie la speciile unde partea vegetativ prezint interes.La sfecl , triploizii prezint o suprafa foliar mai mare care determin o cretere a produciei de rdcini de 20-30% i o rezisten mai mare la secet i boli. Datorit sterilitii acestor forme , producerea de smn triploid se realizeaz n loturi de hibridare , prin cultivarea alternativ a formelor diploide i tetraploide , urmnd ca smna obinut s fie majoritar diploid. Obinerea unor forme triploide 100% presupune folosirea unor forme androsterile.La pepeni , formele triploide produc fructe fr semine , superioare ca valoare comercial formelor diploide.La via-de-vie se obin forme triploide i tetraploide prin colchinizare. Formele tetraploide au un numr redus de semine , numr redus de ciorchini pe butuc ns boabele sunt mai mari. Formele triploide nu prezint semine , fiind foarte valoroase pentru producerea de stafide sau consum.

ALOPOLIPLOIDIA I UTILIZAREA EI N AMELIORAREA PLANTELORAlopoliploizii se obin prin hibridare ndeprtat , interspecific sau intergenic , urmat apoi de dublarea numrului de cromozomi. Prin alopoliploidie se reface fertilitatea hibrizilor ndeprtai , asigurndu-se i o barier ntre noua form i formele parentale , eliminndu-se posibilitatea ncrucirii acestora.ntre genomurile unui aloploid poate exista o complet lips de omologie , sau poate exista o omologie parial , n cazul n care genomurile sunt diferite , n meioz , prin mperecherea genomurilor omoloage se formeaz cromozomi bivaleni i aloploidul se numete genomial-amfiploid.n cazul n care genomurile sunt parial omoloage , n meioz , pe lng bivaleni rezult i trivaleni , tretravaleni , care afecteaz fertilitatea.Alopoliploizii de segmentaie reprezint o mare parte din formele speciilor cultivate , care au aprut pe cale natural prin hibridare ndeprtat i prin restaurarea numrului de cromozomi: Triticale 2n=6x=42(hexaploid), 2n=8x=56(octaploid) Triticum durum AABB 2n=4x=28 Avena sativa AABBCC2n=6x=42 Solanum tuberosum2n=4x=48

UTILIZAREA ALOPOLIPLOIZILOR N AMELIORAEA PLANTELOR

Inducerea alopoliploizilor presupune o alegere atent a formelor parentale avndu-se n vedere relaiile dintre genomurile acestora. Speciile parentale trebuie s fie suficient de nrudite pentru a se putea realiza hibridarea , dar suficient de ndeprtate pentru ca genomurile s fie neomoloage i s formeze cromozomi univaleni , care prin colchinizare vor deveni bivaleni. De la fiecare printe se aleg genotipurile cele mai valoroase.Eliminarea caracterelor nedorite la aloploizi este foarte dificil , pentru c dublarea numrului de cromozomi inhib segregarea. Importana alopoliploidiei n ameliorare const n faptul c permite identificarea originii genetice a unei specii i stabilirea relaiilor dintre acestea. Este posibil crearea de noi genotipuri i specii de cultur care s mbine avantajele a dou specii parentale. Prin utilizarea acestor forme este posibil transferarea unor gene de la o specie la alta (gene de rezisten , adaptare).

UTILIZAREA HAPLOIZILOR N AMELIORAREA PLANTELORHaploizii posed n celulele somatice acelai numr de cromozomi ca n gamei , astfel ei au un singur cromozom din fiecare pereche , iar genele plasate pe acetia se manifest n totalitate(stare de homozigoie). Datorit acestei stri de homozigoie , haploizii au vigoare redus i sunt sterili , astfel c ei se folosesc pentru dublarea numrului de cromozomi i obinerea de organisme 100% homozigote.Haploidia n ameliorare permite scurtarea considerabil a duratei necesare formrii homozigoilor , care , n cazul plantelor alogame necesit 7-8 generaii de autopolenizare pentru a fi obinui. La speciile alogame incompatibile (secar,trifoi) , pe cale clasic , homozigoii se obin n numr foarte redus , au vitalitate redus , iar haploidia rezolv foarte eficient problema formelor homozigote.La autogame , haploidia permite scurtarea procesului de ameliorare , prin reducerea timpului necesar analizei generaiilor segregante. Liniile dublu haploide obinute se pot utiliza direct n ameliorare , se pot testa , n vederea obinerii de soiuri noi sau pot fi utilizate ca material iniial.n mod natural , obinerea haploidiei este o urmare a unor procese apomictice (partenogenez,apogamie) dar frecvena acestui fenomen este redus (1 la 10000) i astfel , artificial s-au elaborat diferite procedee care permit obinerea de randamente corespunztoare a haploizilor ( se formeaz natural i prin poliembrionie)La orz , se folosete cu succes metoda bulbosum, care presupune ncruciarea orzului cultivat cu Hordeum bulbosum , specie peren slbatic. Zigotul hibrid obinut pierde n primele stadii de dezvoltare cromozomii de la Hordeum bulbosum , iar embrionul devine haploid ,rmnnd doar cromozomii de la orz cultivat. Embrionul nu poate supravieui dect pe mediu de cultur , obinndu-se o plant haploid ce se poate trata cu colchicin. Se pot obine haploizi i prin hibridri interspecifice ca: gru x porumb , orz x secar ,etc.Androgeneza presupune obinerea de haploizi prin cultur in vitro de antere sau polen , printr-o mitoz ce formeaz un nucleu vegetativ i unul generativ care ulterior degenereaz = plantele haploide sau uneori prin mitoz anormal , formndu-se 2 nuclei identici iar unul dintre acetia degenereaz , cel rmas caluseaz i apoi determin apariia haploizilor. Eficiena depinde de: genotip , stadiul de dezvoltare al polenului , compoziia mediului de cultur i starea fiziologic a plantelor donor.Ginogeneza utilizeaz ovule , ovare sau flori nepolenizate pentru obinerea plantelor haploide in vitro. Reuita depinde de originea plantelor formate care uneori pot deriva din sacul embrionar i nu din gamei. Selecia haploizilor se face la nivel fenotipic pe baza unor observaii legate de vigoarea i vitalitatea acestora , iar la nivel citologic , se face analiznd numrul de cromozomi cu markeri moleculari de selecie.

UTILIZAREA GENELOR HAP N AMELIORAREA PLANTELORGenele hap au fost identificate la o linie mutant de orz , obinut n urma tratrii cu EMS (etil-metil-sulfonat) , ele sunt gene majore (oligogene) ce controleaz avortarea sau supravieuirea embrionilor i endospermelor anormale , favoriznd formarea i supravieuirea haploizilor. Genele hap se transmit doar pe linie matern ( citoplasmatice) i acioneaz fie mpiedicnd fecundarea nucleului , fie stimulnd nucleul respectiv s se divid prematur , rezultnd astfel embrioni haploizi. Linia mutant produce n descenden o frecven de 11-14% plante haploide (prin autopolenizare). Prin ncruciarea unei plante homozigote , pentru gena hap , utilizat ca genitor matern , cu un soi oarecare , se obine n descenden o frecven de 8% haploizi. ncruciarea reciproc a celor 2 forme nu produce haploizi. Prin diferite ncruciri ntre forme cu gene hap s-a observat c vigoarea si vitalitatea haploizilor obinui este diferit , fiind influenat de genotipul formei paterne. Avantajul acesti metode de obinere a haploizilor const n faptul c nu sunt necesare tehnici i echipamente speciale , iar plantele haploide pot fi obinute n orice generaie segregant a plantelor haploide.Eficiena haploidiei n ameliorarea plantelor depinde de msura asigurrii urmtoarelor condiii: Producerea unui numr mare de linii dublu haploide cu uurin i cu diferite genotipuri Populaia de linii dublu haploide s conin o prob randomizat a gameilor parentali Formele dublu haploide s fie normale din punct de vedere genetic i s fie stabile Frecvena haploizilor este influenat de genotip i de condiiile de mediu(fitohormoni , temperatur , lumin) astfel c exist situaii n care acelai genotip furnizeaz haploizi cu frecvene diferite sau nu produce haploizi n anumite condiii. Mediul de cultur i tratamentul cu colchicin determin adesea apariia unor variaii somaclonale , deviaii de la genotipurile originale , proces care complic uneori activitatea de ameliorare.

ANEUPLOIDIA I IMPORTANA EI N AMELIORAREA PLANTELOR

Aneuploidia este fenomenul prin care are loc o variaie a numrului de cromozomi din genom , nefiin afectate garniturile complete de cromozomi , ci doar anumii cromozomi care pot lipsi sau pot fi n exces. n funcie de abaterile numrului de cromozomi aneuploizii pot fi: nulisomi 2n-2:lipsete o pereche de cromozomi monosomi 2n-1: lipsete un cromozom dintr-o pereche trisomi 2n+1: prezint un cromozom n plus ntr-o pereche tetrasomi 2n+2: prezint o pereche n plusExist i aneuploizi care prezint abateri difereniate ale numrului de cromozomi, precum monosomii pentru o pereche de cromozomi i trisomi pentru alta 2n-1+1.Pe baza formelor aneuploide s-au stabilit poziiile unor gene pe cromozom , respectiv rolul cromozomilor n exprimarea fenotipic a caracterelor. Cele mai utilizate sunt seriile de monosomi. Formele aneuploide pot fi utilizate pentru adiia , substituia de cromozomi sau substituirea de gene , procedee ce completeaz hibridarea , n urma creia , alturi de genele utile se transmit i gene nevaloroase ameliorrii.Metoda adiiei de cromozomi const n adugarea unui cromozom nou sau a unei perechi de cromozomi de la o specie donor la o alta receptoare. Liniile de adiie se obin prin ncruciarea a dou specii din acelai gen sau din genuri diferite cu cromozomi neomologi. Hibridul iniial se colchinizeaz pentru a deveni fertil , obinndu-se un amfiploid (aloploid) care se back-croseaz de 3-4 ori cu forma receptoare. n generaiile de back-cross , pe lng plantele aloploide apar i cteva plante aneuploide care conin suplimentar unul sau mai muli cromozomi la specia donor. Valoarea acestor aneuploizi este dat de caracterele pe care le controleaz genele de pe cromozomii suplimentari. Aceste linii de adiie prezint stabilitate redus , astfel acestea trebuiesc periodic analizate citologic. S-au transferat prin aceast metod gene de rezisten la boli diferitelor specii de cultur.Metoda substituiei de cromozomi const n transferul unei gene valoroase de la o specie la alta , prin nlocuirea unei perechi de cromozomi de la specia receptoare , cu o pereche omoloag de cromozomi de la o specie donor , obinndu-se astfel linii de substituie. Substituia este mai important ca adiia n ameliorare , fiind pretabil la speciile la care absena unui cromozom sau a unei perechi de cromozomi este compatibil cu supravieuirea plantei. Realizarea substituiei presupune existena unei serii monosomice la forma receptoare i identificarea cromozomilor cu genele de interes la forma donor. Pentru obinerea unei linii de substituie, plantele din forma deficient cromozomal (receptorul) se polenizeaz cu forma valoroas, plantele din F1 se analizeaz citologic i se rein monosomii care ulterior sunt back-crosai cu forma receptoare pn cnd se reface genotipul acesteia , cu cromozomii transferai. Plantele monosomice se autopolenizeaz i 25% devin disomice (diploide-stare normal) i posed cromozomi cu genele valoroase.

METODELE NECONVENIONALE FOLOSITE N AMELIORAREA PLANTELOR

Ameliorarea neconvenional se bazeaz pe valorificarea prin selecie a variabilitii genetice naturale i artificiale la speciile de cultur. Aceast ramur a ameliorrii cuprinde tehnici pentru producerea variabilitii la toate categoriile de specii , urmate de identificarea i izolarea genotipurilor valoroase , ct i nmulirea controlat a descendenilor. Noile genotipuri obinute posed gene valoroase fie de la alte forme cultivate ale aceleiai specii , fie de la forme slbatice nrudite. Rezultatele ameliorrii clasice necesit un timp ndelungat , costuri ridicate i necesitatea selectrii unui volum mare de material n cmp i laborator.Biotehnologiile cuprind diferite tehnici care presupun utilizarea unor organisme sau componente al acestora pentru a mbuntii performanele genotipurilor cultivate. Implicarea biotehnologiilor n ameliorare se numete ameliorare neconvenional.Comparativ cu ameliorarea clasic , care se bazeaz pe manipularea ntregului genom , biotehnologiile manipuleaz materialul genetic la nivel molecular , completnd rezultatele ameliorrii clasice sau realiznd obiective pe care aceasta nu le poate ndeplini. Aportul biotehnologiilor n ameliorare a fost condiionat de capacitatea celulelor vegetale de a reconstitui pe mediu artificial , organismul din care provine.Biotehnologiile sunt superioare metodelor clasice de ameliorare din punct de vedere a sursei de gene , al gradului de modificare a genotipului i a posibilitii de evaluare a rezultatelor obinute. Dac metodele clasice folosesc surse de gene doar de la specii nrudite , compatibile sexual , prin biotehnologii , sursele de gene pot fi foarte variate , fiind astfel reprezentate prin orice organism pro sau eucariot. De asemenea metodele neconvenionale permit transferul doar a unei singure gene , reducndu-se astfel considerabil timpul necesar eliminrii genelor nedorite.Metodele biotehnologice permit evaluarea extrem de precis a rezultatelor , identificndu-se ntr-o perioad scurt de timp , genotipurile ce posed gene i caractere utile.

UTILIZAREA CULTURILOR IN VITRO N AMELIORAREA PLANTELORTehnicile de culturi in vitro au la baz totipotena celulelor vegetale , cumulate cu nsuiri de dedifereniere , astfel , n condiii de cultur in vitro , celulele i pierd specializarea i regreseaz spre o stare simpl , embrionar , recptndu-i capacitatea de diviziune i de a forma mai multe celule care pot fi organizate sau nu.Dediferenierea reprezint procesul prin care o colonie de celule nceteaz creterea nedefinit i se organizeaz n vederea formrii unor organe specializate ale unor plantule sau plante ntregi.Plantele regenerate din culturi in vitro implic dou procese: organogeneza i embriogeneza somatic.Organogeneza somatic presupune un proces de dedifereniere a calusului , n urma cruia , n masa celular apar primordii de muguri i rdcini.Prin dirijarea balanei hormonale , din muguri se obin lstari (caulogenez) , care n partea bazal formeaz rdcini (rizogenez).Embriogeneza somatic presupune iniierea formrii de embrioni din calus sau celule izolate , embrionii somatici , asemenea celor obinui pe cale sexuat , au aceleiai componente i pot genera plante ntregi. Aceste dou procese pot fi directe , dac se trece de la celulele explantelor la plantul i indirecte , cnd apare starea de calus sau suspensie celular. Tehnicile de culturi in vitro pot fi utilizate pentru completarea i accelerarea metodelor de ameliorare i pentru multiplicarea genotipurilor valoroase. Micropropagarea permite obinerea unui numr mare de indivizi , identici din punct de vedere genetic , mai ales n cazul n care cantitatea de material biologic este redus sau la speciile la care coeficientul de nmulire este redus. Pe lng multiplicarea rapid , micropropagarea este foarte eficient n cazuri speciale ale ameliorrii , precum nmulirea plantelor heterozigote sau autoincompatibile , androsterile, etc.Micropropagarea se poate realiza pe diferite ci : formarea de lstari adventivi , lstrirea axilar multipl i embriogenez somatic.Lstarii adventivi se pot obine prin organogenez direct i indirect. Lstarii axilari multiplii apar la nivelul vrfului tulpinii i a mugurilor laterali , cea mai eficient surs fiind din esut meristematic deoarece se reduc variaiile genetice aprute ulterior.Embriogeneza somatic reprezint calea cea mai eficient de accelerare a micropropagrii. Embrionii somatici astfel obinui pot fi utilizai pentru regenerarea de plante in vitro sau pentru obinerea seminelor artificiale.Producerea seminelor artificiale are la baz ideea ncapsulrii embrionilor somatici ntr-un mediu nutriional i ntr-o membran permeabil i biodegradabil care va permite seminei artificiale s germineze n sol i s dea natere la o plant identic cu cea de la care a fost prelevat explantul original.Aplicarea n practic a acestei metodologii necesit depirea unor impedimente practice i economice. O prim problem const n nesincronizarea proceselor de formare a embrionilor somatici ntr-o cultur i simultaneitatea redus a maturrii acestora. Trebuie avut n vedere ca mediul de cultur conine embrioni de diferite vrste i dimensiuni ( 1 ml suspensie celular -1x10la 6 celule -5000 embrioni)Alte probleme pot consta n stabilizarea embrionilor n vederea stocrii acestora , astfel , n interiorul seminei artificiale , embrionii s nu i continue dezvoltarea dar s rmn viabili. n vederea izolrii embrionilor s-au realizat sisteme de filtrare care permit trecerea doar a embrionilor cu un anumit grad de dezvoltare.Embrionii izolai au fost ncapsuli n polimeri biodegradabili care conin substane ce permit germinarea , creterea i dezvoltarea plantulelor n primele faze ( nutrieni , fungicid , pesticid).Smna artificial poate fi realizat ntr-o perioad scurt de timp (1-2 luni de la prelevarea explantului) , avnd i alte avantaje teoretice i practice. Din punct de vedere genetic , ofer posibilitatea obinerii de semine i de a spori variabilitatea la specii la care , n mod natural , nu se produc semine.Se permite meninerea formelor hibride valoroase fr a fi necesar meninerea formelor parentale i ncruciarea acestora. La speciile autogame , se permite obinerea de semine hibride la scar comercial. Sub aspect fitosanitar , multiplicarea in vitro , respectiv includerea embrionilor ntr-un nveli steril ar permite obinerea unor semine sntoase ( libere de viroze). Din punct de vedere nutriional , n capsulele protectoare se vor introduce diferii hormoni de cretere sau ngrminte , respectiv , bacterii simbiotice la leguminoase (Rhizobium).Producerea seminelor artificiale trebuie analizate foarte detaliat i sub aspect economic , n funcie de raportul dintre sporurile de producie obinute i cheltuielile necesare obinerii acestor semine.

OBINEREA SETURILOR GENETICE LIBERE DE AGENI PATOGENI

Producerea de plante prin micromultiplicare ofer posibilitatea eliminrii surselor de infectare i infestare cu ageni patogeni. n acest sens , clonarea din explante prelevate din vrfuri meristematice ofer plante libere de viroze. Practic , anumite viroze nu sunt eliminate total nici prin acest procedeu , motiv pentru care , la plantele obinute , trebuie efectuate teste pentru identificarea prezenei virusurilor. Micropropagarea din vrfuri meristematice se folosete pe scar larg pentru obinerea de plante sntoase la speciile ornamentale , pomi i arbuti fructiferi , vi-de-vie , deasemenea poate fi utilizat i pentru obinerea i multiplicarea unor linii ameliorate la specii unde infecia viral se transmite prin semine. Dup testarea plantelor n vederea identificrii nivelului de infestare , se iau msuri pentru evitarea reinfectrii , respectiv , protecia plantelor sntoase fa de vectori care transmit viroze (insecte fitofage).

UTILIZAREA CULTURILOR IN VITRO PENTRU PSTRAREA GERMOPLASMEIEficiena acestei tehnici este foarte mare n cazurile n care este nevoie de o multiplicare rapid a materialului valoros , ea permind pstrarea unui volum mare de material ntr-un spaiu redus , ns necesit o dotare tehnic i echipamente corespunztoare.Prelungirea duratei de pstrare se poate face pe o perioad ndelungat , necesitnd realizarea unor subculturi. Prelungirea longevitii materialului stocat necesit asigurarea unei rate minime cretere care se realizeaz prin folosirea unui inhibitor (acid abscisic) sau prin asigurarea unor condiii de ncetinire a metabolismului , pn la un prag minim , compatibil cu variabilitatea. Pe termen lung aceast metod de pstrare poate fi asociat cu o instabilitate genetic i o reducere a potenialului morfo-genetic al materialului. Instabilitatea genetic apare mai ales n cazul culturilor de calus motiv pentru care acestea nu sunt recomandate.Culturile de meristeme sunt suficiente pentru conservarea germoplasmei , necesitnd subculturi dup maxim 3 ani. Materialul obinut in vitro poate fi pstrat pe perioad ndelungat i prin crioconservare n azot lichid (-196 grade) . Materialul supus crioconservrii trebuie s aib un coninut redus de ap , n cazul esuturilor meristematice n prealabil , se trateaz cu glicerol sau dimetil-sulfoxid (crioprotectori). Utilizarea materialului obinut in vitro pentru extragerea de ADN permite stocarea la nivel genomial ( n bnci de gene).

VARIABILITATEA SOMACLONAL I UTILIZAREA EI N AMELIORAREA PLANTELOR

n mod obinuit , plantele obinute in vitro sunt identice fenotipic cu cele din care provin ,ns la unele caractere pot aprea modificri datorate variabilitii somaclonale. Aceast variaie poate fi att dominant ct i recesiv ,de natur genetic , meninndu-se n descenden. Variaia poate fi i epigenetic , instabil , care se pierde n generaiile viitoare.Intensitatea i frecvena variabilitii somaclonale depinde de mai muli factori: Vrsta celulelor din cultur Genotip Condiiile de microclimat Durata ciclului de cultur Natura explantului Tipul de culturAmplitudinea variabilitii este influenat pozitiv de folosirea unor culturi de calus nedifereniat i a suspensiilor de celule , manifestndu-se la un nivel redus , n cazul folosirii meristemelor sau vrfurilor de lstari.Varitiile somaclonale reprezentate prin modificri ale structurii i a numrului de cromozomi sunt cele mai frecvente , fiind instabile genetic i se elimin pe parcursul generaiilor de nmulire sexuat. ntr-o frecven considerabil , variaiile somaclonale produc i deficiene clorofiliene , care la majoritatea speciilor sunt nefavorabile , cu excepia unor plante ornamentale. Aceste variaii afecteaz att caractere calitative ct i cantitative. n ceea ce privete efectul asupra caracterelor cantitative s-a observat reducerea taliei , prelungirea perioadei de vegetaie , creterea numrului de tulpini , modificarea spicelor , rezisten la boli , erbicide sau factori de stres abiotici.

Inducerea i selecia variaiilor genetice utile prin culturi in vitro se poate face pe dou ci:1. Selecia la nivel de genotip : presupune ca soiurile sau clonele deficiente pentru un anummit caracter s fie cultivate in vitro , ulterior printe somaclonele obinute se urmrete identificarea unora la care respectivul caracter deficitat este corectat. Eficiena acestui tip de selecie se stabilete n funcie de msura n care specia respectiv rspunde pozitiv la regenerarea in vitro , existena unor tehnici adecvate de alegere a plantelor regenerate pentru deficiena ce trebuie corectat i de stabilitatea genetic a plantelor regenerate.2. Selecia la nivel celular presupune obinerea unor culturi de celule din genotipul valoros al unei specii care este deficient pentru o anumit nsuire de rezisten i pentru care exist o tehnic bine cunoscut de selecie n cultura de celule. Ulterior se aplic stresul respectiv tuturor celulelor cu scopul de a inhiba creterea i dezvoltarea lor , cu excepia celor rezistente la stres. Pe baza celulelor rezistente se vor regenera plante ce vor manifesta acest caracter de rezisten. Avantajul seleciei la nivel celular const n faptul c permite creterea unui numr foarte mare de celule ntr-un spaiu limitat , care pot fi expuse factorului de stres n conditii uniforme de microclimat , eliminndu-se n mare parte influena factorilor externi.Printscreeningul celulelor n cultur poate identifica doar caractere ce se exprim la nivel celular : rezisten la erbicide , antibiotice , metale grele , toxine patogene , temperaturi sczute ,etc. Genotipurile izolate se pot utiliza n ameliorare direct sau indirect , ca material iniial sau surs de gene.Variabilitatea somaclonal are ca principale dezavantaje: Caracterul ntmpltor , total nefavorabil Frecvena ridicat a formelor nevaloroase Nu influeneaz caracterele de interes agricol

Variabilitatea somaclonal poate fi folosit ca o surs potenial de mutante valoroasela speciile care au o baz genetic restrns ( vegetativ sau apomictice din pereii ovarului).Eficiena varaibilitii depinde de posibilitatea reducerii frecvenei formelor nevaloroase i sporirea randamentului seleciei formelor utile , care s se menin n generaiile viitoare (sexuat).

HIBRIDAREA SEXUAT I PARASEXUAT IN VITRO

Metodele sexuate i parasexuate in vitro permit obinerea de genotipuri recombinate , atunci cnd genitorii nu se pot hibrida sexuat.1. Metoda de hibridare sexuat in vitro se folosete atunci cnd exist barierele de incompatibilitate sau post zigotice.a) Polenizarea i fecundarea in vitro const n recoltarea ovarelor sau ovulelor nefecundate , cultivarea lor pe mediu nutritiv i pudrarea lor cu polen proaspt. Prin plasarea pe mediu de cultur a organelor sexuale de reproducere de la specii sau genuri diferite , n lipsa unor substane inhibitoare produse de sporofitul matern este posibil germinarea polenului i ulterior fecundarea i formarea unui embrion hibrid ce are structuri seminale normale. Prin aceiai metod poate fi depit autoincompatibilitatea plantelor alogame: hermafrodite i monoice ,obinndu-se forme consanvinizate.b) Cultura de embrioni imaturi se aplic n hibridri ndeprtate , unde exist bariere postzigotice care determin o stopare a dezvoltrii embrionale datorit incompatibilitii acestuia , cu endospermul , urmnd ca embrionul hibrid s fie avortat. Embrionul imatur este prelevat i cultivat pe un mediu adecvat dezvoltrii optime a acestuia. n unele cazuri , pentru a permite obinerea unor embrioni viabili , se adaug polen n cultura de embrioni. Tehnica de embriocultur poate elimina neajunsurile repaosului germinal (dormans) i implicit se scurteaz procesul de ameliorare.c) Cultura de ovule fecundate se folosete pentru a salva embrionii interspecifici , fr ca acetia s fie s fie scoi din ovul , permind cultura timpurie a ovulelor i embrionilor. Embrionii din ovul beneficiaz de un mediu de cretere mai favorabil dect cei prelevai din ovul.

Protoplatii se obin din celule somatice la care se ndeprteaz peretele celular , fie prin centrifugare , fie cu ajutorul unor enzime (celulaza , pectinaza). Numrul de protoplati ce pot fi obinui este foarte mare ( 10-15x10la a 6 per gram) , dup obinerea lor , protoplatii sunt cultivai pe medii ce le permit supravieuirea i dezvoltarea. n vedera fuzionrii este necesar parcurgerea mai multor etape :1. Obinerea de protoplati viabili de la speciile ce urmeaz a fi hibridate2. Cultivarea n amestec i centrifugarea protoplatilor de la cele dou specii , n prezena unui agent care s favorizeze fuziunea protoplatilor (PEG-polietilenglicol)3. Plasarea suspensiei de protoplati pe un mediu , n condiii optime de asepsie , lumin i temperatur. n suspensia respectiv se gsesc protoplati parentali , protoplati parentali fuzionai (de la acelai genitor) i protoplati hibrizi fuzionai. Ulterior , este necesar folosirea unor medii selective de cultur pe care protoplatii hibrizi supravieuiesc i ceilali sunt eliminai.Protoplatii hibrizi selecionai trebuie s i refac peretele celular , s se divid i s formeze o plantul. Asupra plantelor obinute trebuie s se efectueze analize citologice n vederea confirmrii originii hibride a acestora.Metoda obinerii i fuziunii protoplatilor permite hibridarea ntre specii foarte diferite , chiar dac hibrizii astfel obinui au utilitate redus pentru ameliorarea plantelor.

CIBRIDIZAREA SOMATIC I ROLUL EI N AMELIORAREA PLANTELOR

Cibridizarea const n folosirea protoplatilor pentru transferul organitelor celulare de la o specie la alta i obinerea unei populaii hibride de organite , care nu se poate obine prin hibridare sexuat. Organismele care posed citoplasm i organite celulare de la o alt specie i nucleul de la alta se numesc cibrizi. Prin aceast metod este posibil o sporire a variabilitii genetice , valorificndu-se materialul genetic extranuclear.

UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI N AMELIORAREA PLANTELORRezultatele i eficiena ameliorrii convenionale depind printre altele de posibilitatea de a identifica i cumula variaiile genetice utile , avnd n vedere c majoritatea caracterelor de interes sunt de natur poligenic fiind puternic influenate de mediu.Pentru a spori eficiena programelor de ameliorare , au fost folosite gene marcatoare sau markeri genetici. Markeri respectivi prezint gene care controleaz caractere fenotipice cu determinism genetic simplu i puin influenate de mediu , care sunt asociate cu unele caractere de interes urmrite de ameliorator.Markerii moleculari reprezint secvene scurte de ADN , strns nlnuite cu caracterul de interes , astfel nct selecia pentru acest marker asigur i selecia genelor implicate n determinismul caracterului de dorit.Strategia utilizrii markerilor moleculari se bazeaz pe evidenierea polimorfismului molecular , care la nivelul genomului este datorat variiei cantitii de ADN repetitiv.Unitile repetitive mici sub 10 bp se numesc minisatelii.Polimorfismul este considerat ca o diferen (la nivelul de ADN ) care apare frecvent , n timp ce o diferen care apare rar este considerat o mutaie.Markerii moleculari pot fi folosii pentru: Clonarea genelor Cartarea genomului Selecia asistat de markeri Determinarea amprentelor genetice n vederea identificrii soiurilor i hibrizilor

TIPURI DE MARKERI MOLECULARI

Acetia se mpart n 2 categorii: Markeri RFLP Markeri pe baz de PCR Markerii RFLP ( polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie) au cea mai larg utilizare la alctuirea hrilor genomice a speciilor cultivate.Analizele respective utilizeaz diferenele ntre scevene de nucleotide la nivelul crora endonucleazele de restricie taie ADN-ul genomic.Aceast tehnic include: Extracia ADN-ului genomic Digestia acestuia cu enzime de restricie slecionate Testarea probei cu secvene de ADN cunoscuten cazul hrilor genetice , aceast tehnic permite exprimarea numrului de loci implicai n determinismul unui caracter cantitativ (QTL) i poziia acestora , deasemenea este posibil i detectarea QTL-urilor cu efecte pleiotropice.Utilizarea acestor markeri este limitat de necesitatea de a folosi pentru analiz o cantitate mare de ADN genomic , care implic cheltuieli mari i o perioad mai lung de timp.

Tehnica pe baz de PCR ( reacia n lan a polimerazei) se folosete pentru studiul variaiei secvenelor de ADN prin amplificarea enzimatic pe baz de transcripie invers a unui segment specific de ADN din ADN-ul genomic sau ARN. Ea nu necesit construcii genomice i biblioteci de ADN complementar , fiind mai simplu de utilizat n cazul existenei a unui numr mare de probe. Markeri RAPD (polimorfismul ADN-ului amplificat randomizat) sunt utilizai pentru construirea hrilor i analiza linkage-ului , bazndu-se pe diferena dintre secvenele de ADN genomic , amplificat prin PCR , folosind primeri scuri de oligonucleotide , dominani. Aceast tehnic nu necesit primeri specifici ( primerii se pot folosi la diferite specii)Odat ce au fost identificate benzile de ADN pot fi secvenializate i clonate , generndu-se un marker cu o utilizare larg. Comparativ cu RFLP-ul aceast tehnic necesit o cantitae mic de ADN genomic , este mai simpl , mai ieftin , asigur un nivel ridicat de polimorfism , att la nivel intra ct i inter specific.Dezavantajul major al acestor markeri const n faptul c nu face distincie ntre homozigoi i heterozigoi. Markerii AFLP (polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate) sunt un produs rezultat prin amplificarea selectiv a fragmentelor de ADN digerate cu enzime de restricie.Dup fiecare reacie se produc benzi multiple. Este o tehnic de natur cantitativ , care pe baza intensitii de amplificare permite separarea homozigoilor i heterozigoilor. Folosete primeri dominani , fiind o tehnic mai costisitoare necesitnd echipamente care s asigure automatizarea operaiunilor. Markerii SSR (secvene scurte repetate) reprezint o surs eficient de polimorfism , utile pentru construirea hrilor genetice. Microsateliii sunt alctuii din secvene simple de nucleotide , fiecare cu lungime de 1-6 bp.Necesit probe reduse de ADN , fiind utilizai att n cartarea fenotipic ct i la identificarea speciilor sau n studii de genetcia populaiilor.

Alegerea markerilor moleculari depinde de obiectivul urmrit i anume: Construirea hrilor genetice Cartarea locilor pentru caractere cantitative (QTL) Selecia asistat de markeri Determinarea structurii populaiei Stabilirea diversitii genomului Preul de cost Echipamente necesareMarkeri RFLP cartai ntr-o populaie pot fi utilizai ca probe i pentru caracterizarea altei populaii din aceeai specie , n tmp ce markerii RAPD pot fi folosii pentru caracterizarea unor populaii i din specii diferite.n studiul de sistematic i evoluionism markerii RFLP prezint avantaje comparativ cu cei pe baz de PCR , deoarece ofer informaii pe baza unor fragmente lungi de ADN , n timp ce markerii pe baz de PCR evalueaz doar variaia unor fragmente de 20-40bp.n funcie de preul de cost pentru alegerea sistemului de markeri , trebuie avut n vedere: Timpul necesar pentru extragerea ADN-ului Cantitatea de ADN necesar pentru analize Necesitatea clonrii i secvenializrii ADN-ului Tipul i cantitatea de informaie genetic solicitat Tipul de markeri (dominant , recesiv) Echipamentele existente i necesare Alegerea sistemului de markeri pentru cartarea genelor i selecia asistat are n vedere n primul rnd costuri reduse i un timp scurt de analiz , avnd n vedere c trebuie evaluai muli indivizi din fiecare populaie.Oricare dintre sistemele de markeri folosite , trebuie s asigure o eficien sporit comparativ cu metodele convenionale de ameliorare , pentru a justifica cheltuielile necesare. 13