UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · corelat cu activitatea...
42
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII DUMITRIŢA OLIVIA RUGINĂ CARACTERIZAREA UNOR EXTRACTE VEGETALE BOGATE ÎN FLAVAN-3-OLI CU POTENŢIAL ANTIOXIDANT ŞI APOPTOTIC REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof. Dr. CARMEN SOCACIU Cluj-Napoca 2009 I
Transcript of UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · corelat cu activitatea...
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII
DUMITRIŢA OLIVIA RUGINĂ
CARACTERIZAREA UNOR EXTRACTE
VEGETALE BOGATE ÎN FLAVAN-3-OLI CU POTENŢIAL ANTIOXIDANT ŞI APOPTOTIC
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof. Dr. CARMEN SOCACIU
Cluj-Napoca 2009
I
CUPRINS CUPRINS....................................................................................................................................... II INTRODUCERE: SCOP ŞI OBIECTIVE.................................................................................... III REZULTATE EXPERIMENTALE..............................................................................................VI I. CARACTERIZAREA EXTRACTELOR DE CEAI VERDE ŞI EVALUAREA ACTIVITĂŢII LOR ANTIOXIDANTE.............................................................................................................. VII
MATERIALE ŞI METODE.................................................................................................... VII REZULTATE ŞI DISCUŢII .................................................................................................. VIII
Analiza cantitativă HPLC a extractelor de ceai verde........................................................ VIII Conţinutul total de polifenoli .............................................................................................. XII Corelarea metodelor HPLC şi Folin-Ciocâlteu ................................................................... XII Capacitatea de absorbţie a radicalului oxigenului (ORAC) ............................................... XIII Echivalentul Trolox al capacităţii antioxidante (TEAC)....................................................XIV Corelarea metodelor ORAC, TEAC şi Folin-Ciocâlteu...................................................... XV
CONCLUZII ..........................................................................................................................XVI II. EVALUAREA SISTEMULUI ANTIOXIDANT ÎN CULTURA CELULARĂ RPE ... XVII MATERIALE ŞI METODE................................................................................................ XVII
Cultura celulară şi extractul proteic total ......................................................................... XVII Viabilitatea celulelor D407 .............................................................................................. XVII Determinarea cantitativă a glutationului .......................................................................... XVII Determinarea activităţii glutation peroxidazei ................................................................. XVII Determinarea activităţii superoxid dismutazei ................................................................ XVIII Determinarea activităţii catalazei .................................................................................... XVIII Determinarea nivelului de specii reactive intracelulare .................................................. XVIII
REZULTATE ŞI DISCUŢII ............................................................................................... XVIII Morfologia celulelor D407 după tratamentul cu H2O2.................................................... XVIII Efectele induse de PolyphenonE asupra viabilităţii celulelor D407 ..................................XIX Determinarea nivelului de glutation...................................................................................XXI Determinarea activităţii glutation peroxidazei ................................................................. XXII Determinarea activităţii catalazei .................................................................................... XXIII Determinarea activităţii superoxid dismutazei ................................................................XXIV Determinarea nivelului speciilor reactive ale oxigenului................................................. XXV
CONCLUZII .......................................................................................................................XXVI III. EVALUAREA EFECTULUI ANTITUMORAL AL CEAIULUI VERDE....................XXVII
MATERIALE ŞI METODE...............................................................................................XXVII Testul viabilităţii ............................................................................................................XXVII Analiza ciclului celular...................................................................................................XXVII Determinarea concentraţiei proteinelor totale utilizând metoda Bradford.....................XXVII Metoda Western Blotting ...............................................................................................XXVII Determinarea activităţii caspazei-3 .............................................................................. XXVIII Analiza fragmentării ADN........................................................................................... XXVIII Tehnica colorării imunologice a clusterinei ................................................................. XXVIII
REZULTATE ŞI DISCUŢII ............................................................................................ XXVIII Morfologia celulelor PC-3 tratate cu PolyphenonE ..................................................... XXVIII Analiza proliferării celulare ............................................................................................XXIX Analiza ciclului celular..................................................................................................... XXX Colorarea nucleară cu DAPI ..........................................................................................XXXII Analiza fragmentării ADN-ului ................................................................................... XXXIV Caspaza-3, marker de identificare al apoptozei ........................................................... XXXIV
BIBLIOGRAFIA.......................................................................................................................XLII
II
INTRODUCERE: SCOP ŞI OBIECTIVE
În timpul metabolismului celular normal, aproximativ 98% din oxigenul molecular
este în totalitate redus la apă. Restul de 2% produce specii reactive de oxigen, afectând în
mod direct ţesuturile, prin oxidarea proteinelor celulare, a lipidelor şi a acizilor nucleici.
În condiţii fiziologice normale, există un echilibru între formarea radicalilor liberi şi
îndepărtarea lor de către sistemele de apărare antioxidantă ale corpului. Acestea includ
enzime ca superoxid dismutaza, glutation peroxidaza şi catalaza, dar şi antioxidanţi
neenzimatici ca gluationul, acidul ascorbic, tocoferolii, etc. În condiţii patologice,
producţia radicalilor liberi creşte, împreună cu o creştere a consumului şi o descreştere a
producţiei acestor molecule antioxidante de apărare, conducând la afecţiuni celulare sau
chiar la moarte. Flavan-3-olii, un subgrup al flavanoidelor, care include catechinele,
contribuie alături de sistemul antioxidant enzimatic la apărarea antioxidantă a celulelor.
Flavan-3-olii pot lupta de asemenea împotriva CANCERULUI, contribuind la
prevenirea acestei boli.
Scopul acestei teze a fost:
Utilizând tehnica Cromatografiei de Lichide de Înaltă Performanţă (HPLC) ne-am
propus să separăm, să identificăm şi să evaluăm conţinutul de catechine din extracte de
ceai verde. Pentru extractele caracterizate ne-am propus să monitorizăm şi să comparăm
activitatea antioxidantă utilizând diferite metode: ORAC, TEAC, DPPH. Metoda de
determinare a capacităţii de absorbţie a radicalului oxigenului, ORAC este o metodă nouă
de evaluare a activităţii antioxidante a alimentelor.
Ne-am propus să determinăm potenţialul antioxidant al extractelor de ceai verde
bogate în catechine şi capacitatea acestora de a proteja in vitro celulele epiteliale
pigmentate din retina umană, în scopul utilizării lor ca suplimente în prevenirea
degenerescenţei maculare senile. Am ales celulele RPE (linia D407) pentru a studia
mecanismul molecular la răspunsul adaptativ la stresul oxdativ. Acesta este primul studiu
ce evaluează efectul catechinelor asupra sistemului antioxidant de apărare al celulelor
RPE.
III
Asemeni altor cercetători, am încercat să găsim alte strategii pentru a controla
evoluţia cancerului de prostată, o abordare a acestei probleme fiind prevenirea şi/sau
intervenţia terapeutică a ceaiului verde şi a compuslui său majoritar EGCG, ca supliment
alimentar al dietei zilnice.
Datele recente demonstrează că polifenolii din ceaiul verde pot induce evenimente
ale semnalizării celulare, implicate în inhibarea creşterii celulare, progresia ciclului
celular, inducţia apoptozei, inhibiţia angiogenezei, a invaziei tumorii şi a metastazei
cancerului de prostată. Ca atare am elaborat diferite studii experimentale utilizând
extractul Polyphenon E ca potenţial agent chemopreventiv în cancerul de prostată. Am
fost interesaţi în mod special să urmărim căile moleculare şi mecanismele de acţiune ale
acestui extract asupra metabolismului celular.
Principalele obiective ale tezei au fost:
Extracţia flavan-3-olilor din cele 5 extracte de ceai verde. Ceaiurile au fost
procurate de pe piaţa românească (Vedda) şi de pe piaţa japoneză (ceai verde
japonez). Suplimentele alimentare au fost obţinute de la companiile comerciale
(Pharmanex; Teacalon; Japan; Polyphenon E);
Caracterizarea extractelor de ceai verde prin Cromatografia de Lichide de Înaltă
Performanţă;
Evaluarea activităţii antioxidante a extractelor de ceai verde, utilizând metodele
ORAC, TEAC şi DPPH şi determinarea conţinutului total de polifenoli;
Efectele extractului de ceai verde (Polyphenon E) asupra viabilităţii celulelor
epiteliale din retina umană (D407) şi determinarea nivelului de specii reactive de
oxigen intracelulare;
Evaluarea activităţii superoxid dismutazei, catalazei, glutation peroxidazei şi
cuantificarea glutationului, după tratamentul cu Polyphenon E şi catechine.
Studiul influenţei produsului Polyphenon E asupra morfologiei celulelor PC-3 în
funcţie de concentraţia şi durata tratamentului;
Efectele induse de Polyphenon E asupra proliferării, folosind metoda WST-1 şi
colorarea cu cristal violet;
Evaluarea apoptozei prin flow citometrie;
IV
Evaluarea efectelor induse de Polyphenon E asupra expresiei proteinei PCNA
utilizând analiza Western blot.
Structura tezei: teza este structurată pe două părţi, studiu de literatură şi contribuţii
originale (cu rezultate şi discuţii, precum şi o prezentare a metodelor de lucru).
Prima parte – Studiul bibliografic - conţine patru capitole (1-4):
Capitolul 1 şi 2 caracterizează flavan-3-olii, în funcţie de proprietăţile lor chimice
şi biochimice, şi trece în revistă metodele analitice de separare şi dozare a
acestora.
Capitolul 3 prezintă implicaţiile stresului oxidativ în etiologia degenerescenţei
maculare senile şi importanţa protejării epiteliului pigmentat al retinei
Capitolul 4 rezumă date referitoare la implicarea polifenolilor din ceaiul verde în
inducţia apoptozei, inhibarea invaziei tumorii şi metastazei cancerului de prostată.
Partea a doua a tezei – Cercetările proprii - cuprinde 3 capitole (5-7):
Capitolul 5 cuprinde un studiu comparativ privind conţinutul în flavan-3-oli
corelat cu activitatea antioxidantă a celor cinci extracte de ceai verde.
Capitolul 6 conţine un experiment realizat pe celule epiteliale din retina umană,
pentru evaluarea sistemului de apărare antioxidant, după tratamentul cu
Polyphenon E şi catechine pure.
Capitolul 7 prezintă efectul antitumoral indus de Polyphenon E în celulele
tumorale de prostată PC-3.
Această teză evidenţiază efectul chemopreventiv al ceaiului verde şi al compusului
său majoritar EGCG asupra cancerului uman de prostată şi asupra degenerescenţei
maculare senile.
Ca perspective, ar fi extrem de util să contribuim cu mai multe informaţii
referitoare la tratamentul catechinelor atât în cancerul de prostată, cât şi în
degenerescenţa maculară senilă, la complexitatea şi interconexiunile între căile de
semnalizare celulară, identificarea mai multor molecule ţintă, realizarea unor studii
epidemiologice şi clinice mai ample, atât pentru populaţia europeană, asiatică, africană şi
americană.
V
Această teză este rezultatul unei colaborări între Universitatea de Ştiinţe Agricole
şi Medicină Veterinară, Cluj-Napoca, Romania, Departamentul de Chimie şi Biochimie şi
Universitatea din Parma, Italia, Facultatea de Medicină, Departamentul de Medicină
Experimentală.
REZULTATE EXPERIMENTALE
În zilele noastre ceaiul este consumat în mai mult de 30 de ţări din întreaga lume,
cu un consum mediu per cap de locuitor de 120 ml/ zi, ca şi băutură ceaiul ocupând locul
doi în lume, după apă (Graham, H. N., 1992). În funcţie de procesul tehnologic de
obţinere ceaiurile sunt clasificate astfel: ceai verde ‘nefermentat’, ceaiul oolong ‘semi-
fermentat’ şi ‘fermentat’ ceaiul negru sau roşu.
Flavan-3-olii sunt un subgrup al flavonoidelor, care include catechinele. Frunzele
de ceai verde conţin şase catechine majoritare: (+)-catechina (C), (-)-epicatechina (EC),
(+)-galocatechina, (-)-epicatechin galat (ECG), (-)-epigalocatechina (EGC) şi (-)-
epigalocatechin galat (EGCG) (Fig.1).
Fig.1. Structurile reprezentative ale catechinelor din ceaiul verde; gruparea galat este încercuită (original) Fig.1. Representative structures of green tea catechin; the gallate moiety is rounded off (original)
Catechina (C) Epigalocatechina (EGC) Epicatechina (EC)
Galocatechina
1’
3’
4’
5’
1
4 3 5
7
1’
3’
4’ 1
3 4 5
7 1’
3’ 4’
5’ 1
3 4 5
7
1’
3’
4’ 1
4 3 5
7
B
A C
B
1’
3’ 4’
5’
1
3 4 5
7
D
3’
1’ 4’ 1
3 4 5
7
B
A C
B
A C B
A C
Epigalocatechin galatul (EGCG) Epicatechingalatul (ECG)
A C
B
A C
D
VI
I. CARACTERIZAREA EXTRACTELOR DE CEAI VERDE ŞI EVALUAREA
ACTIVITĂŢII LOR ANTIOXIDANTE
Conţinutul total de catechine a fost evaluat utilizând tehnica HPLC. Diferite
metode antioxidante au fost utilizate pentru a monitoriza şi compara activitatea
antioxidantă a extractelor de ceai verde: ORAC, TEAC, DPPH.
MATERIALE ŞI METODE
Extracţia: 0.2 g pudră (Pharmanex, Teacalon, Polyphenon E, Japan Green Tea)
sau frunze (Vedda) cu 10 ml apă Millipore fiartă, au fost sonicate, centrifugate şi filtrate.
Cromatografia de Înaltă Performanţă (HPLC) este o metodă uzuală utilizată
pentru separarea unor antioxidanţi ca şi catechinele. Analiza HPLC s-a realizat cu
ajutorul unui sistem Shimadzu, echipat cu detecţie cu fotodiodă. A fost utilizată o coloană
SUPELCOSIL TM LC-18, 5µm, 25 cm x 4.6 mm. S-a folosit un gradient de eluare: faza
mobilă A- metanol: acid acetic: apă bidistilată şi faza mobilă B, metanol: acid acetic: apă
bidistilată.
Conţinutul total de polifenoli: Compuşii albaştrii formaţi între fenolaţi şi
reactivul Folin-Ciocâlteu sunt independenţi de structura compuşilor fenolici, dezvoltând
astfel complexe între centrul metalic şi compuşii fenolici. Absorbţia a fost înregistrată la
lungimea de undă 765 nm. Conţinutul total de fenoli a fost exprimat în echivalenţi de
acid galic.
Capacitatea de absorbţie a radicalului oxigenului (ORAC) determină
capacitatea de inhibare a radicalului peroxil, inducând oxidarea, evidenţiind eliberarea
clasică radicalului, prin transferul atomului de H. Valorile ORAC au fost raportate ca
echivalenţi Trolox, fiind exprimate ca µmol TE/DW. Intensitatea fluorescenţei, ex.
485nm, em. 525 nm a fost monitorizată pentru 35 min.
Metoda echivalentului Trolox al capacităţii antioxidante (TEAC) se bazează
pe capacitatea de neutralizare a radicalului anion ABTS+ de către antioxidanţi. ABTS
este oxidat de către radicalii peroxil sau alţi oxidanţi la radicalul său cationic ABTS. +,
intens colorat (λmax = 734 nm). Capacitatea antioxidantă este exprimată ca şi potenţialul
VII
compuşilor testaţi de a decolora radicalul ABTS. + prin reacţie directă cu acesta.
Capacitatea antioxidantă a compuşilor testaţi a fost exprimată ca şi echivalenţi Trolox.
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Analiza cantitativă HPLC a extractelor de ceai verde
Fig. 2 evidenţiază separarea amestecului de catechine standard pure, în 22 minute.
Ordinea de eluare a fost: GC, C, EGC, EGCG, EC, GCG, ECG, CG.
Fig. 2. Separarea HPLC a opt catechine standard: GC, C, EGC, EGCG, EC, GCG, ECG şi CG. Pentru prescurtări, vezi lista abrevieri 1 Fig. 2. HPLC separation of pure standards of catechins: GC, C, EGC, EGCG, EC, GCG, ECG and CG. for abbreviations see abbreviation list 1
În acest experiment au fost luate în studiu cinci probe de ceai verde, două obţinute
de pe piaţa romanească (Vedda), respectiv japoneză (Japan green tea) şi trei suplimente
alimentare: Pharmanex, Teacalon, Polyphenon E. Cromatogramele extractelor de ceai
verde analizate sunt reprezentate in Fig. 3.
Conţinutul (mg/g) în catechine al probelor de ceai verde, conform determinării
HPLC şi calibrării cu standarde pure se regăseşte în Tabelul 1.
VIII
Conţinutul total de catechine a fost foarte scăzut în probele Vedda (12.03 mg/g) şi
Japan Green Tea (17.56 mg/g), posibil datorită oxidării polifenolilor şi /sau polimerizării
induse de fermentarea frunzelor de ceai. Acest fapt ar putea de altfel explica şi activitatea
antioxidantă redusă a acestora, evidenţiată cu ajutorul metodelor: ORAC, TEAC, DPPH.
Conţinutul total de catechine din suplimentele alimentare (Pharmanex, Teacalon and
Polyphenon E) este semnificativ mai ridicat, comparativ cu probele de ceai verde,
datorită concentrării probei în urma tehnologiei de extracţie prin pulverizare uscată.
EGCG, ECG şi EC sunt catechinele ce se regăsesc în concentraţie mai mare în
extractele de ceai verde. Suplimentul alimentar Teacalon conţine EC (134.67 mg/g), C
(22.83 mg/g) şi GCG (23.64 mg/g), compuşi identificaţi în cantităţi mici în alte două
suplimente alimentare Pharmanex şi Polyphenon E. Proba Pharmanex conţine 56.58
mg/g EC şi 42.07 mg/g ECG, în comparaţie cu Polyphenon E 11.62 mg/g EC şi 63.39
mg/g ECG. Conţinutul de GC din probele Pharmanex şi Teacalon a fost similar: 11.69 şi
respectiv 11.43 mg/g.
IX
Fig.3. Cromatogramele extractelor de ceai verde analizate: A).Pharmanex; B).Teacalon
X
Fig.3. Chromatograms of green tea extracts analyzed: A).Pharmanex; B).Teacalon
A).
B).
XI
Tabel 1.
Conţinutul (mg/g) în catechine al probelor de ceai verde, conform determinării HPLC şi calibrării cu standarde pure
Table 1.
Contents (mg/g) of catechins în green tea extracts, as determined by HPLC and calibrated with pure standards
mg/g extract Sample name
GC C EGC EGCG EC GCG ECG CG Total
mg/g extract Denumire probă
GC C EGC EGCG EC GCG ECG CG Total
Pharmanex 11.69±0.05 16.63 ±0.1 10.14 ±0.09 108.93±0.87 56.58±0.3 7.71±0.06 42.07±0.04 1.11±0.02 254.85
Teacalon 11.43±0.05 22.83±0.01 26.19 ±0.07 176.20±0.43 134.67±0.6 23.64±0.15 73.93±0.3 3.49±0.05 472.37
Polyphenon E 8.33±0.06 10.72±0.02 1.56 ±0.07 196.32±0.72 11.62±0.05 21.55±0.1 63.39±0.14 1.89±0.11 315.39
Vedda 1.30±0.05 4.28±0.02 0.86 ±0.11 1.95±0.04 3.43±0.02 - 0.21±0.05 - 12.03
Japan Green Tea 1.19±0.05 4.04±0.04 1.73 ±0.05 6.83±0.05 2.56±0.02 0.34±0.02 0.71±0.02 0.16±0.01 17.56
Conţinutul total de polifenoli
Conţinutul total de polifenoli variază de la 74 la 695 mg/g acid galic. Cel mai
redus conţinut de polifenoli s-a întâlnit în proba Japan green tea (74.43±1.60 mg/g acid
galic) în timp ce proba Teacalon (695.1±3.56 mg/g acid galic) înregistrează cel mai
ridicat conţinut de polifenoli, urmată de proba Polyphenon E (677.5±8.63 mg/g acid
galic). Conţinutul altor probe de ceai verde a fost 284.2±8.63, 75.38±2.56 mg/g acid galic
acid în proba Pharmanex, respectiv proba Vedda (Fig. 4). Conţinutul de polifenoli totali
variază considerabil între probele de ceai verde şi suplimentele alimentare.
Pharman
ex
Teaca
lon
Polyphen
onVed
daJa
pan0
200
400
600
800
Sample name
Gal
ic a
cid
(mg/
g D
W)
Fig. 4. Conţinutul total de polifenoli din cele cinci extracte de ceai verde: Pharmanex, Teacalon, Polyphenon, Vedda, Japan green tea. Valorile sunt exprimate ca media ± SEM. Fig. 4. Total polyphenol content of five different green tea extracts: Pharmanex, Teacalon, Polyphenon, Vedda, Japan green tea. Values are mean ± SEM.
Corelarea metodelor HPLC şi Folin-Ciocâlteu
Coeficientul de corelare Pearson pentru analiza cantitativă determinată prin
metoda HPLC şi conţinutul total de polifenoli a fost obţinut utilizând programul de
analiza statistică PRISM, versiunea 5 (GraphPad Software, San Diego, CA). Analiza
HPLC s-a corelat semnificativ cu analiza spectrofotometrică a conţinutului total de
polifenoli, Pearson r- 0.93, p < 0.01 (Fig. 5).
XII
0200
400600
8000
100
200
300
400
500HPLC
Pharmanex
Teacalon
Polyphenon
VeddaJapan
Galic acid (mg/ g DW)
Qua
ntit
y of
cat
echi
ns (m
g/g
extr
act)
Fig. 5. Corelarea analizei HPLC cu determinarea spectrofotometrică a conţinutului total de polifenoli (acid galic mg/g DW) Fig.5.Correlation between HPLC analysis and the spectrophotometric determination of of total tea polyphenol content (gallic acid mg/g DW)
Capacitatea de absorbţie a radicalului oxigenului (ORAC)
Polyphenon E şi Teacalon sunt extractele de ceai verde cu cele mai mari valori
ORAC (5143 mM TE/g probă, respectiv 4988 mM TE/g probă). Cel mai ridicat conţinut
în EGCG (după cum s-a obţinut în urma analizei HPLC) şi cele mai mari valori ORAC
au fost înregistrate pentru probele Teacalon şi Polyphenon E. EGCG este considerată
catechina cu cel mai mare potenţial antioxidant. Pharmanex conţine o cantitate redusă de
EGCG, ca atare prezintă o activitate antioxidantă mai redusă comparativ cu probele
Polyphenon E şi Teacalon. Probele de ceai verde Vedda şi Japan green tea au înregistrat
cele mai mici valori ORAC (1033 mM TE/g, respectiv 898 mM TE/g).
Valorile ORAC s-au corelat cu valorile obţinute în urma determinării conţinutului
total de polifenoli, după cum se observă în Fig. 5.
XIII
Pharman
ex
Teaca
lon
Polyphen
onVed
daJa
pan0
2000
4000
6000
8000
Sample name
mM
Tro
lox
Equ
ival
ent/
g D
W)
Fig.6. Valorile obţinute prin metoda capacităţii de absorbţie a radicalului oxigenului (ORAC) pentru cinci extracte de ceai verde. Valorile sunt prezentate ca medie ± SEM. Fig. 6. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay values of five different green tea extracts. Values are mean ± SEM.
Echivalentul Trolox al capacităţii antioxidante (TEAC)
Polyphenon E şi Teacalon sunt extractele de ceai verde cu cele mai mari valori
TEAC (179±6.6 mM TE/g probă, respectiv 201±3.6 mM TE/g probă). Pharmanex
prezintă o activitate antioxidantă mai redusă comparativ cu Polyphenon E şi Teacalon,
116.5 ± 1.97 mM TE/g. Vedda şi Japan green tea au înregistrat cele mai mici valori
TEAC (71±1.08 mM TE/g, respectiv 58.5± 1.28 mM TE/g). Valorile TEAC s-au corelat
cu conţinutul total de polifenoli, după cum se observă în Fig. 7.
XIV
Pharman
ex
Teaca
lon
Polyphen
onVed
daJa
pan0
50
100
150
200
250
Sample name
mM
Tro
lox
Equ
ival
ent/
g D
W)
Fig. 7. Capacitatea antioxidantă a echivalentului Trolox (TEAC) pentru cele cinci extracte de ceai verde: Pharmanex, Teacalon, Polyphenon, Vedda, Japan;
Fig. 7. Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay values of five different green tea extracts: Pharmanex, Teacalon, Polyphenon, Vedda, Japan;
Corelarea metodelor ORAC, TEAC şi Folin-Ciocâlteu
Coeficientul de corelare Pearson pentru activitatea antioxidantă determinat prin
metodele TEAC, ORAC şi conţinutul total de polifenoli, cu ajutorul programului de
analiză statistică PRISM. Activităţile antioxidante determinate prin metodele TEAC şi
ORAC s-au corelat semnificativ cu conţinutul total de polifenoli, Pearson r- 0.99, p =
0.0011, respectiv r- 0.98, p =0.0026 (Fig. 8).
0200
400600
8000
1000
2000
3000
4000ORAC
Pharmanex
Teacalon
Polyphenon
VeddaJapan
Galic acid (mg/ g DW)
mM
Tro
lox
Equ
ival
ent/
g D
W)
0200
400600
8000
50
100
150
200
250TEAC
Pharmanex
TeacalonPolyphenon
VeddaJapan
Galic acid (mg/ g DW)
mM
Tro
lox
Equ
ival
ent/
g D
W)
Fig. 8. Corelarea metodelor antioxidante TEAC, respective ORAC cu cantitatea de polifenoli totali din extractele de ceai verde. Valorile sunt exprimate ca media± SEM; Fig. 8. Correlation of antioxidant activity determined using TEAC or ORAC to total tea polyphenol content. Values are means ± SEM;
XV
Capacitatea antioxidantă determinată prin metoda TEAC şi ORAC evidenţiază
diferenţe reduse între probele Teacalon şi PolyphenonE (201 mM Trolox/g, reaspectiv
179 mM Trolox/g pentru TEAC) şi (4988 mM Trolox/g, reaspectiv 5143 mM Trolox/g
pentru ORAC).
Rezultate similare şi bine corelate cu metodele ORAC şi TEAC au fost obţinute şi
de alţi autori (Proteggente, A. R. et al., 2002). În studiul realizat de Navindra et al.
activitatea antioxidantă utilizând metodele TEAC şi ORAC variază de la 187 la 15340 şi
respectiv de la 166 la 13690 µmol Trolox Equiv/g capsulă. În concluzie, ambele metode
de determinare a activităţii antioxidante s-au corelat semnificativ cu conţinutul total de
polifenoli (r) 0.95, p < 0.0001) (Seeram, N. P. et al., 2006).
CONCLUZII
• 5 ceaiuri achiziţionate de pe piaţa romanească (Vedda) şi japoneză (Japan Green
Tea) şi trei suplimente alimentare (Pharmanex, USA; Teacalon, Japan;
Polyphenon E, USA) au fost analizate prin RP-HPLC, pentru cuantificarea
catechinelor din ceaiul verde (GC, C, EC, EGC, EGCG, ECG, GCG, GC);
• EGCG, ECG şi EC sunt catechinele majoritare din ceaiul verde şi suplimentele
alimentare, după cum s-a demonstrat prin analiza cantitativă HPLC;
• Conţinutul total de polifenoli din extracte variază de la 74 la 695 mg/g acid galic.
Cel mai scăzut conţinut a fost înregistrat pentru proba Japan green tea, în timp ce
proba Teacalon a înregistrat cel mai ridicat conţinut;
• Probele Teacalon, Polypheon E şi Pharmanex prezintă activitatea antioxidantă
(ORAC, TEAC, DPPH) cea mai ridicată şi cel mai mare conţinut total de
polifenoli;
• Metodele antioxidante (TEAC, ORAC) s-au corelat cu analiza spectrofotometrică
a conţinutului total de polifenoli;
• Analiza cinetică a DPPH evidenţiază că panta cea mai abruptă fost înregistrată
pentru proba Polyphenon E
XVI
II. EVALUAREA SISTEMULUI ANTIOXIDANT ÎN CULTURA CELULARĂ
RPE
Acesta este primul studiu realizat în vederea evaluării efectelor catechinelor asupra
sistemului de apărare antioxidant al celulelor RPE.
MATERIALE ŞI METODE
Cultura celulară şi extractul proteic total
Celulele epiteliale din retina umană D407 au fost cultivate în mediu Dulbecco
Eagle Medium suplimentat cu ser fetal 10%, la o temperatură de 37◦C, 5% CO2, şi
umditate relativă 90%. După atingerea confluenţei, celulele au fost tripsinizate şi
însămânţate în vase de cultură. Extractul, decafeinizat Polyphenon E a fost solubilizat în
apă, şi adăugat până la concentraţia finală în mediu de 100 μg/ml. După 24 de ore de la
tratamentul cu Polyphenon E, celulele au fost expuse unui tratament pentru 1h cu 500
µM H2O2 la 37 °C în medium DMEM fără roşu de fenol.
Determinarea proteinei totale s-a realizat prin metoda cu acid bicinconinic după
lizarea celulelor cu Triton X100. Concentraţia proteinei a fost calculată folosind o curbă
de calibrare cu opt concentraţii de albumină. Absorbanţa a fost citită la 562 nm, după 30
min.
Viabilitatea celulelor D407
Viabilitatea celulelor D407 a fost evaluată prin metoda MTT.
Determinarea cantitativă a glutationului
S-a utilizat o metoda prezentată în kitul GSH Cayman pentru cuantificarea GSH, metodă
ce utilizează glutation reductaza.
Determinarea activităţii glutation peroxidazei
Pentru determinarea activităţii glutation peroxidazei s-a utilizat kitul Cayman.
Glutationul oxidat (GSSH), produs de GPx după reducerea hidroperoxidului este reciclat
de glutation reductaza GR şi NADH. Oxidarea NADPH la NADP+ este însoţită de o
XVII
scădere a aborbanţei, la 340 nm. Activitatea GPx, înregistrează o descreştere a
absorbanţei la 340 nm, fiind proportională cu activitatea GPx din probă.
Determinarea activităţii superoxid dismutazei
O unitate de enzimă este definită ca şi cantitatea enzimei necesară să exercite o
dismutare a radicalului superoxid cu 50%. Activitatea SOD a fost determinată utilizând o
curbă standard SOD. Metoda a fost realizată conform instrucţiunilor din kit (Cayman).
Determinarea activităţii catalazei
Metoda folosită se bazează pe reacţia catalazei cu metanol, în prezenţa unei
concentraţii optime de H2O2. Formaldehida este măsurată colorimetric cu 4-amino-3-
hidrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol (Purpald) ca şi cromogen, care îşi schimbă culoarea
la purpuriu.
Determinarea nivelului de specii reactive intracelulare
Metoda determinării nivelului speciilor reactive de oxigen (ROS) se bazează pe
oxidarea 2’,7’-dichlorodihidrofluorescein (DCHF) de către speciile reactive de oxigen
generate intracelular cu formarea compusului fluorescent 2’,7’-diclorofluoresceina (DCF), a
cărei fluorescenţă a fost înregistrată cu ajutorul unui cititor de plăci.
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Morfologia celulelor D407 după tratamentul cu H2O2
Celulele D407 au fost tratate cu diferite concentraţii de H2O2: 100 µM, 500 µM,
2600 µM pentru 1h.
După cum se observă în Fig. 12 celulele îşi schimbă morfologia, la o formă
ovalară după un tratament cu 500 µM H2O2, însă rămân ataşate de microplacă. Detaşarea
de microplacă a fost observată doar la concentraţii mai mari de 2000 µM H2O2.
XVIII
Control
100 µM 500 µM 2600 µM
Fig. 9. Morfologia comparativă a celulelor netratate şi tratate cu H2O2 pentru 1 h. Morfologia celulelor a fost imortalizată utilizând microscopia cu inversie, magnificaţie 10X Fig. 9. Comparative morphology of D407 cells non-treated and treated with H2O2 for 1 h. The morphology of D407 cells was observed under înverted microscopy with magnification X10
Efectele induse de PolyphenonE asupra viabilităţii celulelor D407
Viabilitatea celulară este exprimată ca procent din control, aceasta fiind
considerată 100%. Prin această metodă s-a demonstrat că incubarea cu Polyphenon E nu
determină nici o scădere semnificativă a numărului de celule viabile, în intervalul de
concentraţii 0 µg/ml - 200 µg/ml. Polyphenon E este citotoxic la concentraţii mai mari de
200 µg/ml. Eroarea este reprezentată ca SEM (Fig. 10).
XIX
0 50 100 150 200 2500
50
100
150
200
PolyE concentration (μg/ml)
Via
bilit
y(%
)
Fig. 10. Rezultatele testului MTT de proliferare celulară (viabilitate %) epiteliale pigmentate din retina umană (D407) tratate cu Polyphenon E Fig. 10. Results of MTT proliferation assay (viability %) of retina pigmented epithelial human (D407) cells Polyphenon E treated
Viabilitatea celulelor D407 a fost testată şi pentru tratamentul cu H2O2. Cultura
celulară ajunsă la confluenţă a fost tratată cu diferite concentraţii de H2O2, în intervalul 0-
1800 µM, pentru 1 h (Fig. 11).
Concentraţia de 500 µM H2O2 induce stresul oxidativ celulelor epiteliale din retina
umană reducând viabilitatea cu 50%. Concentraţii mai mari de 1400 µM reduc
viabilitatea celulelor cu 80%, devenind citotoxice.
0 300 600 900 1200 1500 18000
20
40
60
80
100
Concentration of H2O2 (μ M)
Via
bilit
y(%
)
Fig. 11. MTT testul de proliferare (viabilitate %) a celulelor epiteliale pigmentate din retina umană tratate cu H2O2 Fig. 11. MTT proliferation assay (viability%) of retina pigmented epithelial human (D407) cells H2O2 treated
XX
Viabilitatea celulelor D407 a fost evaluată după tratamentul cu 50 µM EGCG.
Stresul oxidativ a fost indus cu 500 µM peroxid de hydrogen în celulele netratate şi
tratate cu EGCG. Metoda MTT a fost aplicată pentru 24h, respectiv 48h de tratament.
Probele netratate reprezintă procentul de 100%. Celulele D407 tratate cu EGCG
înregistrează o viabilitate de 95% după 24h de tratament. Stresul oxidativ a fost indus cu
500 µM peroxid de hidrogen pentru 1 h, determinând o scădere a viabilităţii cu 55% în
celulele D407. Tratamentul cu peroxid de hidrogen şi EGCG determină o descreştere a
viabilităţii, comparativ cu tratamentul H2O2, după 24h. Tratamentul cu EGCG după 48h a
produs efecte similare asupra viabilităţii celulelor D407 (Fig. 12).
24h 48h0
50
100
150 CC+H2O2
EGCGEGCG+H2O2
Time (hours)
Via
bilit
y(%
)
Fig. 12. MTT testul de proliferare (viabilitate %) a celulelor epiteliale pigmentate din retina umană tratate cu 50 µM EGCG Fig. 12. MTT proliferation assay (viability%) of retina pigmented epithelial human (D407) cells 50 µM EGCG treated
Determinarea nivelului de glutation
Pentru evaluarea efectului citoprotector indus de Polyphenon E s-a măsurat nivelul
de glutation intracelular. Concentraţia de glutation din celulele D407 a fost calculată
folosind o curbă de calibrare pentru standardul GSSG.
Tratamentul cu 500 μM peroxid de hidrogen determină o scădere a nivelului de
GSH. Preincubarea cu 100 µg/ml Polyphenon E determină o scădere a nivelului
intracelular al GSH, comparativ cu controlul netratat. 100 µg/ml Polyphenon E cu
peroxidul de hidrogen scad nivelul de GSH intracelular de 1.3 ori comparativ cu
Polyphenon E. Barele reprezintă SEM (Fig. 13).
XXI
CCox P
Pox0
2
4
6
8
10
Sample nameC - control; Cox - control + H2O2; P - Polyphenon E; Pox - Polyphenon E+H2O2
GSH
μM /
mg
prot
ein
Fig. 13. Nivele de concentraţii ale GSH în celulele epiteliale pigmentate din retina umană, tratate cu Polyphenon E Fig. 13. Levels of GSH concentrations în human retina pigmented epithelial cells, Polyphenon E treated
În concluzie, Polyphenon E cu H2O2 determină o scădere a conţinutului de
glutation de 1.3 ori, comparativ cu Polyphenon E, însă aceste rezultate nu sunt statistic
semnificative, poate datorită existenţei altor compusi bioactivi din extract.
A fost găsită această explicaţie din doua motive: rezultatele prezentate anterior nu
sunt semnificative din punct de vedere statistic, iar dintr-un alt experiment rezultă ca
tratamentul cu EGCG şi H2O2 aplicat celulelor D407 nu a modificat nivelul de glutation,
comparativ cu tratamentul cu EGCG (Fig. 13).
Determinarea activităţii glutation peroxidazei
Celulele D407 au fost tratate cu 100 μg/ml Polyphenon E pentru 24 h şi peroxid de
hidrogen. Polyphenon E reduce activitatea glutation peroxidazei de 3.7 ori, comparativ cu
celulele netratate. Activitatea glutation peroxidazei a fost redusă de peroxidul de
hidrogen de 1.2 ori, comparativ cu celulele netratate (Fig. 14). Polyphenon E şi peroxidul
de hidrogen nu exercită nici un effect asupra activităţii GPx, comparativ cu tratamentul
cu Polyphenon E. Polyphenon E nu a înregistrat nici un efect asupra activităţii GPx în
celulele D407. Tratamentul cu EGCG induce o scădere a activităţii GPx, dar fără nici un
efect asupra nivelului de GSH.
XXII
CCox P
Pox0
10
20
30
40
Sample nameC - control; Cox - control + H2O2; P - Polyphenon E; Pox - Polyphenon E
GPx
act
ivit
y nm
ol/m
in/m
g pr
otei
n
Fig. 14. Activitatea GPx în celulele epiteliale pigmentate din retina umană, tratate Polyphenon E Fig. 14. GPx activity în human retina pigmented epithelial cells, Polyphenon E treated
Determinarea activităţii catalazei
Celulele D407 netratate sau tratate cu 100 μg/ml Polyphenon E pentru 24 h şi
peroxid de hidrogen pentru 1h. Activitatea catalazei a fost semnificativ diminuată de
către peroxidul de hidrogen, comparativ cu cea din celulele netratate (Fig. 15). În proba
tratată doar cu Polyphenon E activitatea catalazei este mai scăzută comparativ cu proba
control, însă în celulele supuse stresului oxidativ şi tratate cu Polyphenon E se
înregistrează o creştere a activităţii enzimei comparativ cu cele netratate. În consecinţă,
extractul determină o stimulare a activităţii catalazei doar în condiţii de stres oxidativ.
XXIII
CCox P
Pox0
5
10
15
20
Sample nameC - control; Cox - control; P - Polyphenon E; Pox -Polyphenon E
CA
T a
ctiv
ity
nmol
/min
/mg
prot
ein
Fig. 15. Activitatea CAT în celulele epiteliale pigmentate din retina umană, tratate cu Polyphenon E Fig. 15. CAT activity în human retina pigmented epithelial cells, Polyphenon E treated
Determinarea activităţii superoxid dismutazei
H2O2 determină o scădere a activităţii SOD, în celulele D407, comparativ cu
controlul. Tratamentul cu Polyphenon E pentru 24h, determină o creştere semnificativă a
activităţii SOD, comparativ cu controlul. Mai mult, în celulele tratate cu Polyphenon E şi
peroxid de hidrogen, activitatea SOD a fost seminificativ mai ridicată decât în celulele ce
au fost tratate cu inductorul de stres oxidativ. În concluzie, extractul bogat în catechine
intensifică activitatea SOD, atât în condiţii normale cât şi în condiţii de stres oxidativ (Fig.
16).
XXIV
CCox P
Pox0
30
60
90
120
Sample nameC - control; Cox - control+H2O2; P - Polyphenon E; Pox - Polyphenon+H2O2
SOD
uni
ts (%
)
Fig. 16. Activitatea SOD în celulele epiteliale pigmentate din retina umană, tratate cu Polyphenon E Fig. 16. SOD activity în human retina pigmented epithelial cells, Polyphenon E treated
Determinarea nivelului speciilor reactive ale oxigenului
Ca urmare, am investigat dacă Polyphenon E ar putea contribui la inhibarea
generării speciilor reactive ale oxigenului în cultura de celule D407. Celulele au fost
incubate pentru 24 h cu sau fără Polyphenon E, iar cantitatea ROS a fost înregistrată cu
ajutorul unui cititor de microplăci. Cu 60 minute înainte de începerea măsurătorii celulele
au fost pretratate cu peroxid de hidrogen.
După cum se observă în Fig. 17, s-a înregistrat o creştere semnificativă a nivelului
fluorescenţei, deci generarea unei cantităţi mari de specii reactive de oxigen intracelular
şi instalarea stresului oxidativ. Celulele D407 tratate doar cu Polyphenon E prezintă o
fluorescenţă mai scăzută faţă de control, dar în mică măsură. Comparând însă probele
tratate cu peroxid de hidrogen, se poate observa că celulele tratate în prealabil cu
Polyphenon E au fluorescenţă semnificativ mai scăzută, ceea ce dovedeşte faptul că
extractul este capabil să inhibe generarea ROS intracelulare sau să le neutralizeze prin
reacţia directă cu acestea.
XXV
CCox P
Pox0
25
50
75
100
Sample nameC-control; C-control+H2O2; P-Polyphenon E; Pox-Polyphenon E + H2O2
DC
F fl
uore
scen
ce(a
rbit
rary
uni
ts)
Fig. 17. Efectul Polyphenon E asuspra ROS generate în celulele RPE
Fig. 17. The effect of Polyphenon E on ROS generation în RPE cells
CONCLUZII
1. Extractul Poly E extract nu este citotoxic pentru celulele RPE la concentraţii mai
mici de 200 µg/ml;
2. Peroxidul de hidrogen la 500µM H2O2 induce stresul oxidativ în celulele D407,
fără a avea efecte citotoxice;
3. Polyphenon E induce o creştere a activităţii SOD, atât în celule tratate cu
Polyphenon E, cât şi în cele tratate cu Polyphenon E şi H2O2;
4. Polyphenon E şi peroxidul de hydrogen scad semnificativ activitatea catalazei;
5. Polyphenon E neutralizează ROS, inhibând generarea peroxidului de hidrogen,
stimulată de ROS.
XXVI
III. EVALUAREA EFECTULUI ANTITUMORAL AL CEAIULUI VERDE
Acest capitol conţine date experimentale privind evaluarea efectului apoptotic al
catechinelor şi al extractului de ceai verde pe culturi celulare tumorale.
Scopul acestui capitol a fost investigarea tipului de moarte celulară, apoptoza,
indusă de Polyphenon E. S-a testat extractul Polyphenon E (PolyE), o mixtură
decafeinizată de catechine pe culturi celulare tumorale de prostată umană.
MATERIALE ŞI METODE
Celulele PC-3 derivă dintr-un adenocarcinom uman de grad IV, androgen-
independent. Această linie celulară a fost cultivată în mediu Ham’s F12 (ICN), conţinând
7% ser fetal bovin şi glutamină (2mM), în condiţii standard, atmosferă umidificată, 5%
CO2 şi 37ºC. Etoposidul, un agent antineoplastic, a fost folosit ca tratament pentru
celulele D407, în concentraţie de 400 µM.
Testul viabilităţii
Testul viabilităţii s-a realizat cu ajutorul reactivului WST-1 (Jatoi, A. et al.) şi
colorarea cu crystal violet.
Analiza ciclului celular
Iodura de propidiu se ataşează de ADN, intercalându-se între baze, aleator şi cu o
stoichiometrie de o molecula de colorant la 4-5 perechi de baze de ADN.
Determinarea concentraţiei proteinelor totale utilizând metoda Bradford
Metoda determinării proteinei totale s-a realizat cu ajutorul instrucţiunilor din kitul
Bio-Rad Bradford.
Metoda Western Blotting
Cu ajutorul analizei Western blot se poate identifica doar o singură proteină dintr-
un amestec proteic, numai pe baza informaţiei oferite de mărimea proteinei.
XXVII
Determinarea activităţii caspazei-3
Activitatea caspazei-3 a fost determinată utilizând kitul colorimetric MBL
International Corporation. Metoda colorimetrică pentru determinarea activităţii caspazei-
3 se bazează pe hidroliza substratului peptidic acetil-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilidei
(Ac-DEVD-pNA), având ca rezultat eliberarea p-nitroanilinei (pNA). p-Nitroanilina are
maximum absorbanţă maximă la 405 nm.
Analiza fragmentării ADN
Apoptoza este o formă de moarte celulară programată, caracterizată prin
condensarea citoplasmei, picnoză nucleară, conducând la o distrugere a ADN-ului
nuclear în fragmente oligonucleosomale multiple de ~200 bp. Probele au fost încărcate în
gel de agaroză 1.8 %.
Tehnica colorării imunologice a clusterinei
Localizarea clusterinei s-a realiyat cu ajutorul tehnicii de colorare imunologică a
clusterinei. Celulele au fost fixate cu paraformaldehidă, membrana celulară a fost
permeabilizată, celulele au fost incubate cu soluţie de blocare a situsurilor non –specifice
şi hibridizate cu anticorpul primar al clusterinei şi anticorpul secundar Alexa 488, dar şi
colorate cu DAPI. Fotografiile au fost realizate cu ajutorul microscopului Zeiss, utilizând
excitaţia de 495 nm, emisia de 519 nm.
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Morfologia celulelor PC-3 tratate cu PolyphenonE
Celulele PC-3 au fost tratate cu diferite concentraţii de Polyphenon E: 125 µg/ml,
145 µg/ml, 170 µg/ml, pentru 12h, 24h şi 48h. Pentru comparaţie, celulele PC-3 au fost
tratate cu inductorul de apoptoză, etoposid, la o concentraţie 400 µM. Celulele prezintă o
creştere în volum după 12h de tratament cu Polyphenon E, devenind celule gigant, cu 2-3
nuclei, după 72h de tratament, comparativ cu controlul. Membrana celulară este intactă,
forma celulei se schimbă, din forma alungită, caracteristică liniei celulare la o formă
poligonală sau ovală. Comparativ cu controlul, morfologia celulelor PC-3 se schimbă
proporţional cu creşterea concentraţiei extractului administrat. De exemplu morfologia
XXVIII
celulelor PC-3 tratate cu 170 µg/ml Polyphenon E după 24h este similară cu a celulelor
tratate cu concentraţia de 125 µg/ml Polyphenon E, după 48h, după cum se constată din
fotografiile preluate cu ajutorul microscopului cu fază inversată Zeiss. În concluzie,
celulele tumorale de prostată îşi schimbă morfologia în funcţie de concentraţia de extract
şi perioada de administrare a tratamentului.
Analiza proliferării celulare
IC50 sau concentraţia de tratament inhibitorie a fost calculată în vederea
identificării dozei care inhibă 50% din celulele tumorale de prostată PC-3. Utilizând
metoda proliferării celulare WST-1 şi metoda colorării cu cristal violet, s-a demonstrat că
Polyphenon E inhibă creşterea celulelor tumorale de prostată PC-3 cu o valoare IC50 de
145 µg/ml (echivalentul a 189 µmol/l EGCG) (Fig. 18). Polyphenon E conţine
aproximativ 60% EGCG, compus ce are aceeaşi capacitate de inhibare a celulelor
tumorale PC-3 ca şi extractul (Fig. 19). La doze mai mari de 230 µg/ml, atât Polyphenon
E şi EGCG sunt citotoxice pentru celulele PC-3. Rezultatele sunt exprimate ca procent al
creşterii, 100% reprezentând controlul celulelor netratate.
-1.5 -1.0 -0.50
50
100
150
log[mM] EGCG
% o
f via
bilit
y
-0.8 -0.6 -0.4 -0.20
50
100
150
log[mM] EGCG
% o
f via
bilit
y
Fig. 18. Inhibarea creşterii celulare de către Polyphenon E obţinută cu reactivul WST-1 pentru celulele umane tumorale de prostată PC-3. SD obţinută din 3 teste Fig. 18. Inhibition of cell growth by Polyphenon E în human prostate cancer cells PC-3 estimated with WST-1. Bars, SD of triplicate assays
Fig. 19. Inhibarea creşterii celulare de către EGCG obţinută cu reactivul WST-1 pentru celulele umane tumorale de prostată PC-3. SD obţinută din 3 teste Fig. 19. Inhibition of cell growth by EGCG în human prostate cancer cells PC-3 estimated with WST-1. Bars, SD of triplicate assays
XXIX
XXX
Analiza ciclului celular
Celulele au fost tratate cu 145 µg/ml Polyphenon E şi 400 µM etoposid şi
analizate prin citometria de flux a ADN-ului. Procentul celulelor aflate în fiecare fază a
ciclului celular a fost calculat şi evidenţiat în Fig. 20. În figura 20 se regăsesc rezultatele
obţinute în urma analizei citometriei de flux, ale celulelor PC-3 tratate cu Polyphenon E
şi iodura de propidiu (PI). PI legată de ADN emite o fluorescenţă roşie.
Pentru a specifica dacă inhibarea creşterii pe care observată pentru linia celulară
PC-3 a fost asociată cu modificările ciclului celular, s-a realizat analiza ADN-ului prin
citometria de flux. Procentul celulelor în fazele G0/G1, S, şi G2/M a fost calculat cu
ajutorul programului citometrului. În cazul în care celulele au fost tratate cu 145µg/ml
Polyphenon E pentru 48h, procentul celulelor în faza G0/G1 a crescut, această creştere
fiind asociată cu o descreştere a celulelor în fazele S şi G2/M ale ciclului celular (Fig. 20).
Procentul celulelor apoptotice creşte în funcţie de timpul de tratament aplicat. Totuşi,
procentul celulelor apoptotice a crescut foarte încet comparativ cu controlul, dovedind o
mare rezistenţă a celulelor tumorale de prostată PC-3, faţă de tratamentul cu Polyphenon
E.
Numărul celulelor apoptotice după 12h de tratament s-a dublat, însă după 72 h de
tratament cu Polyphenon E a crescut cu 20%, comparativ cu controlul. Tratamentul cu
etoposid a determinat inducerea apoptozei pentru 83% dintre celule.
XXXI
Control Etopoşi de
Polyphenon E 24h Polyphenon E 48h
Polyphenon E 72h
Fig. 20. Histogramele analizei ciclului celular, prezentând efectele induse de PolyphenonE asupra progresiei ciclului celular în celulele PC-3
Fig. 20. Histograms of the cell cycle analysis showing effects of Polyphenon E on cell cycle progress on PC-3 cells
Fig. 21. Expresia proteinei PCNA din celulele PC-3 analizată folosind metoda Western Blotting; Imaginile reprezintă bloturile evidenţiind efectul indus de Polyphenon E, după 24h, 48h, 72h şi tratamentul cu etoposid, asupra expresiei nivelului proteinei PCNA.
Antigenul nuclear de proliferare celulară (PCNA) este o proteină de 36 kDa
cunoscută sub denumirea de ciclină. PCNA este o proteină sintetizată în fazele G1 şi S
ale ciclului celular, cu rol în progresia ciclului celular, replicarea ADN şi repararea ADN.
XXXII
DAPI (diamidino-2-phenylindol) este un fluorofor care se ataşează de ADN-ul
dublu catenar. DAPI are o excitaţie maximă la 345 nm şi o emisie maximă la 455 nm. S-
au luat în studiu celule control (netratate) sau celule tratate cu diferite concentraţii de
Polyphenon E pentru 12h, 24h, 48h, 72h şi etoposid pentru 48h.
Colorarea nucleară cu DAPI
Fig. 21. Western Blot analysis of PCNA protein on PC-3 cells; The panels are representative Western blots showing the effect of Polyphenon E after 24h, 48h, 72h and etoposide treatment on the expresion of PCNA protein level.
Analiza ciclului celular prin Western blotting, demonstrează efectul indus de
Polyphenon E asupra expresiei proteinei PCNA. Celulele preconfluente au fost tratate cu
Polyphenon E pentru 24h, 48h şi 72h şi de asemenea cu inductorul de apoptoză etoposid
la concentraţia de 400 µM. Hibridizarea s-a realizat cu ajutorul anticorpului primar (anti-
PCNA) şi anticorpului secundar. Fig. 21 evidenţiază reducerea ciclului celular al
celulelor tratate, comparativ cu celulele netratate. Proliferarea celulară este dependentă de
timp, reducerea expresiei proteinei este vizibilă după 72h, intensitatea benzilor western
scade, explicaţia fiind blocarea ciclului celular în faza G1. Rezultatele se corelează cu
cele obţinute în urma citometriei de flux.
După cum se poate observa în Fig. 22, după 12h de tratament cu Polyphenon E s-
au identificat corpii apoptotici, însă schimbări proeminente ale morfologiei celulare s-au
putut observa după 48h şi 72h, o creştere nucleară, o agregare şi o condensare a ADN-
ului.
PCNA 36kDa
β-Actina 42kDa
C E 24h 48h 72h
XXXIII
Untreated
12h Polyphenon E
48h P
olyphenon E
Contrast phase DAPI nuclear Contrast phase DAPI nuclear
Fig. 22. Colorarea nucleilor cu DAPI Modificările morfologice nucleare ale celulelor PC-3 tratate şi netratate. Evaluarea stării de degradare a celulelor PC-3 s-a realizat folosind colorantul nuclear DAPI. Celulele tratate cu 400 µM etoposid şi 145 ug/ml Polyphenon E demonstrează o creştere nucleară, o agregare şi o condensare a ADN –ului. Morfologia celulelor PC-3 a fost observată cu ajutorul microscopiei de fluorescenţă, magnificaţie10X.
Etoposide treatm
ent 24h P
olyphenon E
tt
t72h P
olyphenon E
tt
t
Analiza fragmentării ADN-ului
O caracteristică distinctivă a apoptozei la nivel biochimic este fragmentarea ADN
în fragmente oligonucleosomale reprezentate de multiple perechi de baze 180-200.
Formarea fragmentelor de ADN în celulele PC-3 indusă de Polyphenon E, comparativ cu
martorul, începe să fie vizibilă după 12h de tratament. După 72h se observă o urmă lăsată
în gelul de agaroză de fragmentele de ADN, similară cu aceea a etoposidului, inductorul
apoptozei (400µM pentru 48h) (Fig. 23).
M C E 12h 24h 48h 72h
Fig. 23. Fragmentarea ADN de către Polyphenon E în celulele PC-3 M-marker (1k-Qiagen); C-control, netratat; E-etoposid (400µM); 12h, 24h, 48h, 72h-timp pentru tratamentul cu Polyphenon E Fig. 23. DNA fragmentation by Polyphenon E în PC-3 cell M-marker (1k-Qiagen); C-control, untreated; E-etoposid (400µM); 12h, 24h, 48h, 72h-time for Polyphenon E treatment
Caspaza-3, marker de identificare al apoptozei
Metoda colorimetrică de determinare a activităţii caspazei-3
Activarea caspazei-3 joacă un rol important în apoptoză, iniţiind procesul de
moarte celulară. Incubarea celulelor PC-3 cu Polyphenon E pentru 12h şi etoposid creşte
semnificativ activitatea caspazei-3, comparativ cu controlul. Contrar, tratamentul cu
XXXIV
Polyphenon E pentru 24h, respectiv 48h determină o scădere a activităţii caspazei-3,
comparativ cu tratamentul cu Polyphenon E pentru 12 h (Fig. 24).
Contro
l
Etopos
ide
Poly E
-12h
PolyE-24
h
PolyE-48
h0.00
0.01
0.02
0.03
Sample name
Cas
pase
3 u
nit
Fig. 24. Activarea caspazei-3 după tratamentul cu Polyphenon E (la 12h, 24h, 48h); Activitatea caspazei-3 a fost măsurată cu ajutorul metodei din Kitul Colorimetric Chemicon, în care caspaza-3 activă recunoaşte clivarea secvenţei DEVD Fig. 24. Activation of caspase-3 after Polyphenon E treatment (at 12h, 24h, 48h); The activity of caspase-3 was measured with a Colorimetric Assay Kit (Chemicon) that recognizes cleavage of the sequence DEVD by active caspase-3
Analiza Western Blotting a expresiei proteinei caspaza-3
Caspaza-3 este proteina apoptotică cea mai intens studiată. Caspaza-3 este
sintetizată ca o proenzimă (32 kDa) care este clivată în celulele ce intră în apoptoză, prin
autoproteoliză sau de către alte proteaze. Forma activă a caspazei-3 are două subunităţi,
una mare (17 kDa) şi alta mică (12 kDa).
Apoptoza a fost analizată şi prin analiza Western Blotting, evaluând efectul indus
de Polyphenon E asupra nivelului de expresie al proteinei caspaza-3. Celulele
preconfluente au fost tratate cu Polyphenon E pentru 12h, 24h, 48h, utilizând
concentraţiile de 125 µg/ml, 145 µg/ml and 170 µg/ml şi 400 µM etoposid. Hibridizarea
s-a realizat cu anticorpul policlonal iepure al caspazei-3 şi β-actinei, respectiv anticorpul
secundar anti-iepure. β-actina a fost folosită ca şi control.
Fig. 25 evidenţiază clivarea caspazei-3 în celulele tumorale de prostată, după 12h
şi 24h de tratament cu Polyphenon E în concentraţii de 125 şi 145 µg/ml. Activarea
XXXV
caspazei-3 este vizibilă şi după un tratament de 48h cu Polyphenon E în concentraţii de
125, 145 şi 170 µg/ml.
Caspaza-3 Clivată 19kDa
β-Actina 42kDa
1 2 3 4 2’ 3’ 4’
1-Control; 24h tratament: 2- 125µg/ml; 3- 145
µg/ml; 4-170µg/ml Polyphenon E; 48h
tratament: 2’- 125µg/ml; 3’- 145 µg/ml; 4’-
170µg/ml Polyphenon E;
Caspaza-3 Clivată 19kDa
β-Actina 42kDa
1 2 3 4
1-Control; 12h tratament: 2- 125µg/ml; 3- 145
µg/ml; 4-170µg/ml Polyphenon E;
Fig. 25. Analiza Western Blot a expresiei proteinelor caspaza-3 din celulele PC-3; Imaginile demonstrează efectul extractului Polyphenon E, după un tratament de 24h, 48h, 72h şi etoposid, asupra nivelului de expresie al proteinelor menţionate
Fig. 25. Western Blot analysis of caspase-3 protein expression in PC-3 cells; The panels are representative Western blots showing the effect of Polyphenon E after 24h, 48h, 72h and etoposide treatment on the expression of the protein level.
Imunocolorarea clusterinei
A fost evaluată expresia clusterinei şi localizarea acesteia, in urma declanşării
apoptozei în celulele PC-3. Celulele netratate evidenţiază o slabă localizare
citoplasmatică şi nucleara a clusterinei. Tratamentul cu 400µM etoposid pentru 48h pune
în evidenţă existenţa unor celule gigant, în care se observă o supraexpresie nucleară a
XXXVI
XXXVII
clusterinei (verde). Pentru a pune în evidenţă nucleii multipli s-a realizat colorarea cu
DAPI (albastru). O imagine a microscopiei în contrast de fază a acestor celule gigant este
prezentată în fotografia din stânga. Colorarea imunologică a celulelor PC-3 pentru
clusterină, după tratamentul cu 145 µg/ml Polyphenon E pentru 24h şi 48h, evidenţiază
existenţa corpilor apoptotici, prin colorarea cu DAPI şi o supraexprimare a clusterinei
nucleare (Fig. 26).
C
Contrast de fază 20X Imunocolorarea clusterinei Colorarea nucleară cu DAPI
E
Fig.
26.
Contrast de fază 20X Imunocolorarea clusterinei Colorarea nucleară cu DAPI
XXXVIII
24h
Contrast de fază 20X Imunocolorarea clusterinei Colorarea nucleară cu DAPI
48h
Contrast de fază 20X Imunocolorarea clusterinei Colorarea nucleară cu DAPI
Fig. 26. Colorarea imunologică a clusterinei din celulele PC-3; Evaluarea localizării clusterinei din celulele PC-3 a fost realizată utilizând anticorpul clusteinei (Upstate) şi fluorocromul Alexa 488. Celulele cu corpi apoptotici şi localizare nucleară a clusterinei sunt indicate prin săgeţi. Celulele PC-3 au fost analizate cu ajutorul microscopiei de fluorescenţă, magnificaţie
XXXIX
XL
20X. Rezultatele prezentate sunt cele mai reprezentative din două experimente; C-control; E-etoposid; 24h, 48h- tratament Polyphenon E pentru 24h, 48h. Fig. 26. Clusterin imunostaining in PC-3 tumor prostate cells; The assessment of clusterin localization in PC-3 cells was done using clusterin antibody (Upstate) and fluorescent Alexa 488. The cells with blebs and nuclear clusterin localization are indicated by arrows. PC-3 cells were observed under fluorescence microscopy, the magnification was X20. Presented results are from one representative experiment of two; C-control; E-etoposide; 24h, 48h- Polyphenon E treatment for 24h, 48h.
CONCLUZII
Datele experimentale relevă:
Celulele tumorale de prostată PC-3 îşi modifică morfologia în funcţie de concentraţia
de PolyphenonE, extractul de ceai verde decafeinat şi de perioada tratamentului
aplicat;
Polyphenon E inhibă creşterea celulelor tumorale PC-3 la o valoare IC50 de 145
µg/ml (echivalentul a 189 µmol/l EGCG);
Numărul celulelor apoptotice, determinat prin flow citometrie, se dublează după 12h
de tratament cu Polyphenon E, comparativ cu controlul. Un tratament mai îndelungat
(72 h) cu Polyphenon E determină o creşte cu 20% a celulelor apoptotice.
Tratamentul cu etoposid pentru 48h induce apoptoza în procent de 83% în celulele
tumorale de prostată PC-3.
Tratamentul cu Polyphenon E pentru 72h reduce expresia proteinei PCNA, aşa cum a
fost evidenţiat prin analiza Western blotting. În concluzie Polyphenon E determină
blocarea ciclului celular în faza G1.
• APOPTOZA este moartea celulară indusă de Polyphenon E, ce determină o creştere
în volum a nucleului, o agregare şi o condensare a ADN-ului, efecte demonstrate cu
ajutorul metodelor fragmentării ADN, colorarea clusterinei şi colorarea nucleară cu
DAPI.
Toate aceste rezultate aduc o contribuţie importantă în cercetarea românească şi
internaţională. Testarea acestor compuşi pe celulele tumorale şi celule epiteluale din retina
umană dovedesc că atât cancerul de prostată degenerescenţa maculară senilă pot fi prevenite.
XLI
BIBLIOGRAFIA
1. DI LORENZO, G., TORTORA, G., D'ARMIENTO, F. P., DE ROSA, G.,
STAIBANO, S., AUTORINO, R., D'ARMIENTO, M., DE LAURENTIIS, M., DE
PLACIDO, S., CATALANO, G., BIANCO, A. R. and CIARDIELLO, F., 2002. Expression
of epidermal growth factor receptor correlates with disease relapse and progression to
androgen-independence in human prostate cancer, Clin Cancer Res, 8(11): 3438-3444.
2. GRAHAM, H. N., 1992. Green tea composition, consumption, and polyphenol
chemistry, Prev Med, 21(3): 334-350.
3. JATOI, A., SUMAN, V. J., SCHAEFER, P., BLOCK, M., LOPRINZI, C., ROCHE,
P., GARNEAU, S., MORTON, R., STELLA, P. J., ALBERTS, S. R., PITTELKOW, M.,
SLOAN, J. and PAGANO, R., 2003. A phase II study of topical ceramides for cutaneous
breast cancer, Breast Cancer Res Treat, 80(1): 99-104.
4. PROTEGGENTE, A. R., PANNALA, A. S., PAGANGA, G., VAN BUREN, L.,
WAGNER, E., WISEMAN, S., VAN DE PUT, F., DACOMBE, C. and RICE-EVANS, C.
A., 2002. The antioxidant activity of regularly consumed fruit and vegetables reflects their
phenolic and vitamin C composition, Free Radic Res, 36(2): 217-233.
5. ROY, S., KHANNA, S., ALESSIO, H. M., VIDER, J., BAGCHI, D., BAGCHI, M.
and SEN, C. K., 2002. Anti-angiogenic property of edible berries, Free Radic Res, 36(9):
1023-1031.
6. SEERAM, N. P., HENNING, S. M., NIU, Y., LEE, R., SCHEULLER, H. S. and
HEBER, D., 2006. Catechin and caffeine content of green tea dietary supplements and
correlation with antioxidant capacity, J Agric Food Chem, 54(5): 1599-1603.
XLII
