UNIVERSITATEA DE STIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

Biolog BALAZS ERIKA (CSETE)

CERCETĂRI PRIVIND SELEC ŢIA ASISTAT Ă DE MARKERI

MOLECULARI PENTRU REZISTEN ŢA CARTOFULUI LA

PHYTOPHTHORA INFESTANS

(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

Conducător Ştiinţific:

Prof. Dr. Constantin Botez

CLUJ-NAPOCA

2011

2

CUPRINS

CAPITOLUL I-IMPORTANŢA CULTURII CARTOFULUI.............................................. 3 1.1. IMPORTANŢA ŞI UTILIZĂRILE CARTOFULUI............................................................. 3 CAPITOLUL II - AGENTUL PATOGEN PHYTOPHTHORA INFESTANS..................... 4 2.1. BIOLOGIA AGENTULUI PATOGEN PHYTOPHTHORA INFESTANS........................... 4 2.2. METODE CLASICE DE AMELIORARE A REZISTENŢEI CARTOFULUI LA MANĂ..........................................................................................................................................

5

2.3. UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI ÎN AMELIORAREA REZISTENŢEI CARTOFULUI LA PHYTHOPHTHORA INFESTANS…………………………………………….

5

CAPITOLUL III-DETERMINISMUL GENETIC AL REZISTENŢEI CARTOFULUI LA MANĂ....................................................................................................................................

6

3.1. REZISTENŢA VERTICALĂ............................................................................................... 7 3.2. REZISTENŢA ORIZONTALĂ............................................................................................. 7 3.3. GENELE DE REZISTENŢĂ ALE CARTOFULUI LA P. INFESTANS............................. 8 CAPITOLUL IV-MARKERII MOLECULARI...................................................................... 10 4.1. CARACTERISTICILE MARKERILOR MOLECULARI................................................... 10 CAPITOLUL V-CERCETĂRI PROPRII PRIVIND SELECŢIA ASISTATĂ DE MARKERI MOLECULARI PENTRU REZISTENŢA CARTOFULUI LA PHYTOPHTHORA INFESTANS……………………………………………………………………………………………….

10

5.1. SCOP ŞI OBIECTIVE........................................................................................................... 10 5.2. MATERIALUL BIOLOGIC UTILIZAT.............................................................................. 12 5.3. METODE DE LUCRU.......................................................................................................... 12 5.3.1. Izolarea şi cuantificarea AND-ului.................................................................................. 12 5.3.2. Analiza ADN-ului de P infestans..................................................................................... 13 5.3.2.1. Amplificarea ADN-ului cu primeri ITS (Internal Transcribed Spacer).......................... 13 5.3.2.2. Amplificarea ADN-ului mitocondrial………………………………………………….. 13 5.3.3. Analiza ADN-ului de cartof.............................................................................................. 13 5.3.4. Convertirea markerilor RAPD în markeri de tip SCAR.............................................. 14 CAPITOLUL VI-REZULTATE ŞI DISCUŢII....................................................................... 15 6.1. REZULTATE PRIVIND ANALIZA MOLECULARĂ A P. INFESTANS.......................... 15 6.1.1. Rezultate privind amplificarea cu primerii ITS............................................................. 15 6.1.2. Rezultate privind amplificarea ADN-ului mitocondrial................................................ 16 6.2. REZULTATE PRIVIND ANALIZA MOLECULARĂ A ADN-ULUI DE CARTOF........ 16 6.2.1. Rezultate privind amplificarea ADN-ului cu primeri specifici genelor de rezistenţă RB la mană..................................................................................................................................

16

6.2.2. Rezultate privind convertirea markerilor RAPD în markeri SCAR........................... 17 6.3. REZULTATE PRIVIND HIBRIDAREA MOLECULARĂ................................................. 18 CONCLUZII................................................................................................................................. 20 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ................................................................................................. 22

3

CAPITOLUL I

IMPORTAN ŢA CULTURII CARTOFULUI

1.1. IMPORTANŢA ŞI UTILIZĂRILE CARTOFULUI

Cartoful (Solanum tuberosum spp. tuberosum) este una din cele mai importante plante

de cultură, cu utilizări variate în alimentaţie, ca furaj şi în diverse industrii. Datorită valorii

nutritive ridicate a tuberculilor de cartof, determinată de conţinutul ridicat în glucide,

proteine, lipide şi vitamine, a gustului plăcut şi a digestibilităţii ridicate, cartoful satisface

cele mai diversificate gusturi şi cele mai mari exigenţe. Valoarea energetică a cartofului

reprezintă o treime din cea a pâinii, jumătate din cea a ouălor şi a cărnii, fiind de două ori

mai mare decât a morcovilor şi de trei ori mai mare decât a verzei sau a tomatelor. Aceasta

se datoreşte conţinutului ridicat de amidon, a unor cantităţi însemnate de proteine, vitamine

sau săruri minerale în compoziţia tuberculului.

Consumul anual pe locuitor este cuprins, în general, între 30 şi 150 kg, în Europa

fiind în medie de 80 kg de cartofi pe an. În România, după datele Ministerului Agriculturii şi

Alimentaţiei consumul anual pe locuitor este de 100 kg de tuberculi.

În furajarea animalelor cartoful constituie un nutreţ deosebit de valoros, îndeosebi în

furajarea porcinelor, a vacilor cu lapte sau a păsărilor, folosit atât sub formă proaspătă cât şi

fiert sau opărit şi însilozat, sau fiert în amestec cu tărâţe sau cu făină de porumb.

Din punct de vedere fitotehnic cartoful este o foarte bună plantă premergătoare

pentru majoritatea culturilor, soiurile semitimpurii şi semitârzii care predomină în structura

sortimentului de soiuri din România fiind foarte potrivite ca premergătoare pentru încadrarea

semănatului în epoca optimă a cerealelor de toamnă, permiţând pregătirea bună a patului

germinativ într-o stare de afânare corespunzătoare şi lipsit de resturi vegetative grosiere

(MORAR, 2004).

4

CAPITOLUL II

AGENTUL PATOGEN PHYTOPHTHORA INFESTANS

2.1. BIOLOGIA AGENTULUI PATOGEN PHYTOPHTHORA INFESTANS

Mana cartofului este una din cele mai devastatoare boli din toată lumea. Ea este

provocată de Phytophthora infestans, un patogen care infectează plantele din familia

Solanaceae şi provoacă pierderi însemnate mai ales în culturile de cartof şi tomate.

Această ciupercă face parte din grupul Peronosporaceae, împreună cu multe alte

specii, care produc boli cunoscute sub numele de mană, multor plante cultivate.

Regnul: Chromista

Încrengătura: Oomycota

Ordin: Peronosporales

Familia: Peronosporaceae

Genul: Phytophthora

Specia: Phytophthora infestans

În cazul unei infecţii, P. infestans se răspândeşte prin sporangiofori care sunt purtaţi

de aer. În condiţii optime de temperatură (aprox. 20ºC) şi umiditate ridicată a aerului, un

număr mare de sporangiofori se pot forma pe o plantă infectată. Sporangioforii sunt de

obicei eliberaţi dimineaţa, când creşterea temperaturii provoacă o scădere a umidităţii

aerului. Sporangioforii sunt apoi răspândiţi de vânt, şi când ajung pe o plantă gazdă, în

conditii de umiditate, infectează. Temperatura optimă de formare a sporilor este de 18-220 C

(SCHOBER et al.,1986). În funcţie de temperatură, sporii germinează în două moduri: între

200 şi 260 C, optim 250 C, germinează direct prin tubul germinativ. Deci, un spor, o infecţie.

Sub 180 C-optim 120 C- conţinutul fiecărui spor se divide în 6-8 zoospori, care, eliberaţi,

sunt mobili, pot înota în apa de pe frunze ( DRENTH A, 1995).

P. infestans se poate înmulţii şi pe cale sexuată, existând două tipuri de incrucişare:

A1 şi A2. Înmulţirea sexuată apare doar atunci când cele două tipuri de încrucişare sunt

prezente pe aceeaşi plantă. Oosporii rezultaţi în urma ciclului sexual pot supravieţui în sol

5

mai mulţi ani. Totodată, inmulţirea sexuată permite o mai mare variabilitate genetică şi o

mai mare adaptabilitate a patogenului care se manifestă prin apariţia de noi tulpini mai

virulente capabile să învingă genele de rezistenţă (VERZAUX E. 2010). În general rasele de

mană rezultate în urma înmulţirii sexuate sunt mult mai agresive decât cele rezultate prin

înmulţire asexuată. (FRY, 2008).

2.2. METODE CLASICE DE AMELIORARE A REZISTENŢEI CARTOFULUI LA

MANĂ

Amelioarea rezistenţei la boli constituie un obiectiv principal în ameliorarea

cartofului. Constanţa în producţie şi calitatea acesteia sunt afectate mai mult decât la orice

plantă cultivată de atacul bolilor.

Rezistenţa la mana cartofului (Phytophthora infestans) se poate realiza prin obţinerea

unor forme cu rezistenţă extremă. Rezistenţa relativ ridicată, manifestată prin

hipersensibilitate, este determinată de patru factori de rezistenţă.

În strategia ameliorării rezistenţei cartofului la Phytophthora infestans există mai

multe căi de abordare. Hibridarea sexuată cu forme rezistente, de regulă specii sălbatice

(cum ar fi Solanum demissum, S. bulbocastanum, S. andigena) urmată de selecţia printre

segreganţi, în condiţii de infecţie artificială, a formelor rezistente.

2.3. UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI ÎN AMELIORAREA REZISTENŢEI

CARTOFULUI LA PHYTHOPHTHORA INFESTANS

Utilizarea markerilor moleculari, prin analiza genomurilor, a determinat o ascensiune

puternică a eficienţei activităţilor de ameliorare atât la plante cât şi la animale, precum şi

aplicabilitatea practică în: identificarea şi taxonomia genetică a indivizilor , realizarea

hărţilor genetice, clonarea unor gene importante, realizarea studiilor de filogenie.

Markerii moleculari pun în evidenţă diferenţele dintre secvenţele de nucleotide din

ADN extras din indivizi diferiţi, diferenţe care nu sunt neapărat vizibile în fenotip. O singură

6

nucleotidă diferită, dintr-o genă sau chiar din ADN repetitiv, poate determina formarea sau

dispariţia unui marker molecular.

Un astfel de program de selecţie asigură: scurtarea timpului de obţinere a unui nou

cultivar; reducerea decalajului dintre progresul genetic aşteptat şi cel observat, ca urmare a

îmbunătăţirii eficienţei şi preciziei metodei de selecţie.

Utilizarea tehnicilor moleculare nu implică renunţarea la metodele şi tehnicile clasice

de ameliorare, chiar dimpotrivă, fără observaţiile fenotipice făcute în câmpul experimental

este practic imposibilă stabilirea corelaţiilor dintre rezultatele obţinute la nivel molecular şi

materialul biologic utilizat.

. Două tehnologii pot sa îmbunatăţească eficienţa ameliorării cartofului, şi anume

selecţia asistată de markeri moleculari (MAS) şi tehnologia organismelor modificate genetic

(GMO).

CAPITOLUL III

DETERMINISMUL GENETIC AL REZISTEN ŢEI CARTOFULUI LA MAN Ă

Rezistenţa la mană în majoritatea speciilor de Solanum este calitativă, şi aproape

întotdeauna se bazează pe interacţiunea genă-pentru-genă. Ea se bazează pe reacţia de

hipersensibilitate a plantei pentru a stopa creşterea şi dezvoltarea patogenului (KAMOUN et

al., 1999; VLEESHOUWERS et al., 2000). Speciile sălbatice de Solanum sunt o sursă

bogată de gene de rezistenţă. Încă de la apariţia bolii în Europa, prin anul 1850, au început

cercetările privind rezistenţa naturală la P. infestans, şi s-au descoperit multe specii de

Solanum rezistente la mană. Dintre acestea, Solanum demissum este cea mai cunoscută şi

exploatată specie, fiind folosită în programele de ameliorare (VERZAUX, 2010). Mai recent

se încearcă cartarea şi clonarea genelor de rezistenţă la mană (Rpi) şi din alte specii sălbatice

de cartof (HEIN et al., 2009).

7

3.1. REZISTENŢA VERTICALĂ

Rezistenţa verticală este rezistenţa care se manifestă faţă de anumite rase fiziologice

ale unui agent patogen şi este neeficace faţă de alte rase ale aceluiaşi agent patogen

(VANDERPLANK, 1968 în CEAPOIU şi NEGULESCU, 1983 ).

Rezistenţa verticală este totală, ea asigură o protecţie completă împotriva bolii. Acest fapt a

făcut ca acest tip de rezistenţă să fie larg utilizat în agricultură. Pe de altă parte, lipsa

durabilităţii ei duce în cele din urmă la pierderea rezistenţei (ROBINSON, 1976). Aceasta

înseamnă că amelioratorii sunt în permanenţă obligaţi să creeze noi soiuri cu rezistenţa

verticală pentru a face faţă schimbărilor care au loc în populaţia acestui patogen. Acest lucru

îngreunează foarte mult munca de ameliorare, mai ales atunci când trebuie să încorporăm în

noile soiuri şi gene pentru alte însuşiri valoroase.

Din punct de vedere genetic, rezistenţa verticală se caracterizează de regulă prin

ereditate oligogenică. Ea are la bază teoria genă-pentru-genă: fiecărei gene pentru rezistenţă

sau sensibilitate din gazdă îi corespunde o genă pentru avirulenţă sau virulenţă din parazit.

Rezistenţa verticală, fiind controlată oligogenic, este un caracter calitativ, caracterizându-se

prin aceea că dă reacţii clare de segregare, fie de rezistenţă, fie de sensibilitate. De aceea se

mai numeşte rezistenţă calitativă.

3.2. REZISTENŢA ORIZONTALĂ

Rezistenţa orizontală reprezintă apărarea naturală a populaţiei gazdă. Ea se formează

în cursul filogeniei gazdei sub influenţa factorilor primari ai evoluţiei şi a coevoluţiei cu

parazitul.

Din punct de vedere agricol rezistenţa orizontală se caracterizează prin aceea că este

permanentă. Acest caracter rezultă din lipsa interacţiunii gazdă-patogen, ceea ce face ca ea

să se manifeste în mod egal faţă de toate rasele agentului patogen. Rezistenţa orizontală nu

se distruge datorită schimbărilor ce au loc în populaţia patogenă.

8

Rezistenţa orizontală nu asigură o protecţie completă a culturii aşa cum asigură

rezistenţa verticală, în schimb, este durabilă şi stabilă. Absenţa interacţiunii diferenţiale

dintre soiurile gazdă şi rasele parazite înseamnă că rezistenţa orizontală operează împotriva

tuturor raselor patogene, inclusiv împotriva celor foarte virulente.

Rezistenţa orizontală este universală . Ea se întâlneşte la toate plantele şi acţionează

împotriva tuturor raselor unui parazit, dar obişnuit este insuficientă în cazul multor soiuri.

Controlul genetic al rezistenţei orizontale este poligenic încadrându-se în ereditatea

poligenică a caracterelor cantitative.

3.3. GENELE DE REZISTENŢĂ ALE CARTOFULUI LA P. INFESTANS

Genele care controlează rezistenţa cartofului la mană sunt genele de tip R (R1-Rn)

care provin de la speciile sălbatice de cartof Solanum demissum, Solanum stoloniferum şi

alte specii. Toate genele de tip R sunt gene majore dominante. Ele produc reacţia de

hipersensibilitate şi sunt dotate cu o mare specificitate. Soiurile de cartof care conţin aceste

gene de tip R sunt rezistente doar împotriva raselor de Phytophthora infestans care conţin

genele de avirulenţă corespunzătoare genelor de virulenţă. Când perechea R-Avr este

prezentă atât în planta gazdă cât şi în patogen, rezultatul este reacţia de rezistenţă sau

incompatibilitatea. Când una dintre ele este inactivă sau lipseşte apare reacţia de sensibilitate.

Un total de 11 gene de tip R, toate provenind de la Solanum demissum, au fost

introduse în cartoful de consum (PEL et al., 2009). Din păcate, aceste gene au fost învinse în

câţiva ani de la introducerea lor pe piaţă de rasele noi de P. Infestans apărute

(TURKENSTEEN, 1993).

Până în prezent 20 de gene R de rezistenţă la mană au fost introduse într-o hartă

genetică. 11 gene (R1, R2, R3a, R3b, R5-R11) de la Solanum demissum, 4 gene (RB/Rpi-

blb1, Rpi-blb2, Rpi-blb3, Rpi-abpt) de la S. bulbocastanum, şi câte o genă de la S.

berthaultii (Rber/Rpi-ber), S. pinnatisectum (Rpi1), and S. mochiquense (Rpi-moc1)

(SIMKO et al., 2007).

9

Un studiu recent asupra bazelor genetice ale rezistenţei la mană în S. demissum a arătat că 8

din cele 11 gene de rezistenţă R, şi anume R3 ( HUANG et al., 2004 a descoperit că în

locusul R3 se află două gene R3a şi R3b), R5, R6, R7, R8, R9, R10 şi R11 sunt localizate pe

cromozomul 11, foarte aproape unul de celălalt (BRADSHAW et al., 2006; EL

KHARBOTHLY et al., 1994; HUANG et al., 2004,2005). De asemenea se ştie faptul că

gena R2 se află pe cromozomul 4 (LI et al., 1998) şi R1 pe cromozomul 5 (El

KHARBOTHLY et al., 1994; LEONARDS-SCHIPPERS et al 1992). Şi alte specii de

Solanum au fost folosite ca şi sursă de gene de rezistenţă. Astfel din grupul genelor de

rezistenţă la mană mai fac parte: Rpi-ber (iniţial cunoscut sub numele de Rber) de la Solanum

berhaulthii, situate pe cromozomul 10 (EWING et al., 2000); RB⁄Rpi-blb1, Rpi-blb2 şi Rpi-

blb3 de la S. bulbocastanum pe cromozomul 8, 6 şi respectiv 4 (NAESS et al., 2000; PARK

et al., 2005; van DER VOSSEN et al., 2003, 2005); Rpi-pnt1 (iniţial numit Rpi1) (KUHL et

al., 2001) de la S. pinnatisectum pe cromozomul 7; Rpi-mcq1 (iniţial numit Rpi-moc1)

(SMILDE et al.,2005) de la S. mochiquense pe cromozomul 9; şi Rpi-phu1 de la S. phureja

pe cromozomul 9 (SLIWKA et al., 2006). În plus, mai multe QTL-uri (Quantitative trait loci)

au fost raportate atât în cartoful de consum (GEBHARDT and VALKONEN, 2001) cât şi în

speciile sălbatice de cartof, cum ar fi S. microdontum (SANDBRINK et al., 2000; TAN et al.,

2008), S. paucissectum (VILLAMON and SPOONER, 2005), şi S. phureja pe cromozomul 7

şi 12 (GHISLAIN et al., 2001).

Până în present s-a reuşit clonarea a patru gene de rezistenţă a cartofului la mană, şi

toate fac parte din clasa de resistenţă CC-NBS-LRR: R1 (pe cromozomul 5) şi R3a (pe

cromozomul 11) de la S. demissum (BALLVORA et al., 2002; HUANG et al., 2005); Rpi-

blb1 şi Rpi-blb2 de la S. bulbocastanum aflate pe comozomul 8 şi respectiv 4) (NAES et al.,

2000; van DER VOSSEN et al., 2003, 2005).

Genele RB, clonate de la cartoful diplod S. bulbocastanum, conferă un spectru larg de

rezistenţă la mană (LIU and HALTERMAN, 2006; STAPLES, 2003).

10

CAPITOLUL IV

MARKERII MOLECULARI

4.1. CARACTERISTICILE MARKERILOR MOLECULARI

Selecţia asistată de markeri moleculari este foarte avantajoasă mai ales în ameliorarea

resistenţei la boli şi dăunători (LANGRIDGE et al., 2001). De asemenea markerii moleculari

permit introducerea mai multor gene de rezistenţă într-o singură varietate (piramidarea

genelor), ceea ce va creşte eficienţa şi durabilitatea rezistenţei la boli.

Utilizarea tehnicilor moleculare nu implică renunţarea la metodele şi tehnicile clasice

de ameliorare, chiar dimpotrivă, fără observaţiile fenotipice făcute în câmpul experimental

este practic imposibilă stabilirea corelaţiilor dintre rezultatele obţinute la nivel molecular şi

materialul biologic utilizat. În genetica populaţiilor, utilizarea metodelor moleculare are ca

scop detectarea diferenţelor ereditare dintre indivizi. Simpla punere în evidenţă a unui

polimorfism genetic, este un scop în sine.

.

CAPITOLUL V

CERCETĂRI PROPRII PRIVIND SELEC ŢIA ASISTAT Ă DE MARKERI

MOLECULARI PENTRU REZISTEN ŢA CARTOFULUI LA

PHYTOPHTHORA INFESTANS

5.1. SCOP ŞI OBIECTIVE

Scopul principal al cercetarii este identificarea unor markeri moleculari linkati cu

genele de rezistentă la Phytophthora infestans sau care aparţin genelor de rezistenţă, în

vederea utilizării lor în contextul selecţiei asistate de markeri moleculari.

Obiectivele tezei:

11

1.Procurarea materialului biologic aparţinând genului Solanum si agentului

patogen ce produce mana la cartof (Phytophthora infestans)

Activităţi:

- procurarea diferitelor provenienţe de Solanum, rezistente şi sensibile la

Phytophthora infestans

- menţinerea agentului patogen pe mediu de selecţie

- menţinerea agentului patogen prin criostocare

- menţinerea materialului biologic prin culturi in vitro si microtuberculi

2. Analiza agentului patogen Phytophthora infestans cu markeri specifici

Activităţi :

- izolarea ADN-ului din mană

- testarea ADN-ului cu primeri ITS

- determinarea haplotipului la mană cu primeri specifici ADN-ului mitocondrial

3. Marcarea moleculară a genelor de rezistenţă la Phytophtora infestans.

Activităţi:

- identificarea genelor RB de rezistenţă la mană la speciile de Solanum cu ajutorul

unor primeri specifici

- analiza polimorfismului molecular cu ajutorul markerilor moleculari nespecifici la

nivelul liniilor cu rezistenţă diferenţială la Phytophtora infestans comparativ cu forma

sensibilă, lipsită de gene de rezistenţă

- identificarea markerilor (benzilor polimorfe) linkati cu o anumită genă de rezistenţă.

4. Obţinerea materialului hibrid pentru analiza BSA

Activităţi:

- hibridarea formelor parentale de Solanum, polimorfe, rezistente si sensibile,

compatibile sexuat

5. Convertirea markerilor moleculari nespecifici (RAPD) în markeri specifici

SCAR ( de tip PCR ).

Activităţi:

- izolarea benzilor polimorfe si a ADN-ului din benzi

12

- reamplificarea benzilor polimorfe cu primerul ce le-a generat, clonarea intr-un

vector, secvenţierea şi construcţia de primeri specifici de tip PCR.

- verificarea specificităţii primerilor prin tehnica hibridarii moleculare, utilizând ca

sondă produsul de amplificare marcat (southern blotting şi hibridare moleculară)

5.2. MATERIALUL BIOLOGIC UTILIZAT

Materialul biologic utilizat este reprezentat de 3 specii de cartof, şi anume: Solanum

tuberosum, Solanum demissum şi Solanum bulbocastanum. Dintre acestea Solanum

tuberosum cu diferite gene de rezistenţă (de la R0 la R8) ne-a fost oferit de către Institutul

Naţional de Cercetare şi Dezvoltare a Cartofului şi Sfeclei de Zahăr, Braşov – România sub

formă de tuberculi iar Solanum tuberosum, Solanum demissum şi Solanum bulbocastanum

au fost trimise de NPGS (National Plant Germplasm Sistem) din Statele Unite ale Americii,

dintre care Solanum bulbocastanum, Solanum demissum şi Solanum tuberosum ssp.

andigenum sub formă de seminţe, iar Solanum tuberosum sub formă de 23 de plăntuţe in

vitro cu diferite gene de rezistenţă.

Patru izolate de P. infestans au fost trimise de către Geert Trudy de la Plant Research

International de la Universitatea din Wageningen, şi anume: izolatele NL08045, NL08012,

NL08009 şi NL08448, iar izolatele 80029 şi 88133 au fost trimise de către Weide Rob de la

Laboratory of Phytopathology. Aceste izolate au fost menţinute pe mediu de cultură cu

secară.

5.3. METODE DE LUCRU

5.3.1. Izolarea şi cuantificarea AND-ului

Izolarea ADN-ului a fost realizată utilizând protocolul descris de Lodhi şi colab.

(1994), modificat de Pop şi colab. (2003), protocol bazat pe utilizarea CTAB (cetil

trimetilammonium bromide) cu adaus de acid citric, PVP şi Dieca, utilizând frunze

proaspete.

13

Cuantificarea ADN-ului ( determinarea concentraţiilor de ADN şi a purităţii ) a fost

determinată cu ajutorul spectofotometrului şi cu ajutorul instrumentului NanoDrop Nd-1000

UV/Vis 1µ Spectrophotometer (Labtech International) conectat la PC.

5.3.2. Analiza ADN-ului de P infestans

5.3.2.1. Amplificarea ADN-ului cu primeri ITS (Internal Transcribed Spacer)

ITS-urile reprezintă două regiuni variate non-codate situate în ADNr. Regiunile ITS

sunt folositoare în caracterizarea fungilor datorită faptului că sunt scurte (500-800pb) şi pot

fi uşor amplificate prin PCR chiar şi din cantităţi foarte mici de ADN, sau din ADN degradat.

Regiunea ITS este foarte bine conservată în cadrul aceleiaşi specii şi poate fi foarte diferită

între specii diferite din punct de vedere morphologic (GOMEZ et al., 2002). În ultimii ani tot

mai mulţi cercetători folosesc primerii ITS pentru a analiza diferenţele între diferite specii de

P. infestans (LEE Y.S., 2001).

În analizele noastre am folosit trei primeri ITS care amplifică regiunea ITSII între genele

ribozomale 5.8S şi 28S.

5.3.2.2. Amplificarea ADN-ului mitocondrial

Pentru a determina haplotipul raselor de mană, am analizat ADN-ul cu primeri specifici de

tip CAPS care amplifică secvenţe specifice ADN-ului mitocondrial. În acest sens am utilizat

patru seturi de primeri: H1, H2, H3 şi H4.

5.3.3. Analiza ADN-ului de cartof

Pentru a amplifica secvenţe specifice genelor de rezistenţă RB de la Solanum

bulbocastanum am utilizat un număr de şapte seturi de primeri, selectaţi din literatura de

specialitate (SONG et al, 2003, van der VOSSEN et al, 2005, COLTON et al, 2006, van der

VOSSEN et al, 2003). Aceşti primeri au fost testaţi pentru a verifica prezenţa genelor RB

14

sau genelor omoloage în speciile de S. bulbocastanum primite din SUA, precum şi în

celelate specii de Solanum luate în studiu (S. demissum, S. tuberosum).

Pentru analiza RAPD al ADN-ului de cartof am utilizat 22 primeri decameri. După

amplificare produşii de amplificare au fost migraţi în gel de 1.4%agaroză şi vizualizaţi la

UV.

5.3.4. Convertirea markerilor RAPD în markeri de tip SCAR

După identificarea markerilor RAPD, pe baza cosegregării, aceştia au fost atribuiţi

genelor de rezistenţă. Pentru a putea fi convertiţi în markeri de tip SCAR, benzile polimorfe

au fost recuperate din gel şi clonate într-un vector şi secvenţiate. Pe baza secvenţei s-aut

construit noi primeri care sunt specifici secvenţei RAPD iniţiale.

Produşii de amplificare a benzilor recuperate considerate bune candidate pentru clonare, au

fost clonaţi într-un vector pJET 1.2/blunt (CloneJet PCR Cloning kit, Fermentas) care a

permis selecţia coloniilor bacteriene ce poartă produşii de amplificare integraţi în vector pe

baza supravieţuirii acestora, ţinând cont de faptul că vectorul poartă o genă letală care se

inactivează în urma integrării produsului de amplificare, permiţând supravieţuirea doar a

bacteriilor ce poartă vectorul cu insert. Pentru verificarea reuşitei clonării este necesară

izolarea ADN-ului plasmidial din coloniile care au insertul. Pentru fiecare bandă recuperată

din gel şi clonată am izolat 3 sau 4 colonii bacteriene din care s-a realizat extracţia ADN-

ului plasmidial. Noi am folosit 2 metode de izolare: un protocol de izolare şi un kit (ZR

Plasmid MiniprepTM- Clasic de la Zymo Research). Pentru a vedea dacă dimensiunea

secvenţei clonate în vector este aproximativ egală cu cea originală, sau pentru a verifica dacă

colonia bacteriană are insertul, se realizează analiza ADN-ului plasmidial prin metoda PCR

cu primeri specifici vectorului.

Pentru a se putea construi primeri PCR de tip SCAR specifici fragmentelor polimorfe,

este necesar să se cunoască secvenţa de nucleotide. Pentru aceasta, ADN-ul plasmidial

extras din coloniile bacteriene care prezintă insertul au fost trimise la secvenţiat la firma

Microsynth, Elveţia. Pe baza secvenţierii facute au fost proiectate cu programul NCBI/

15

Primer-BLAST un număr de 4-10 primeri pentru fiecare secvenţă. Pentru fiecare secvenţă

clonată s-a selectat şi comandat câte un primer.

S-a testat specificitatea acestor primeri faţă de gena de rezistenţă specifică fiecăruia prin

amplificarea ADN-ului de la forma rezistentă şi de la forma sensibilă, şi s-a urmarit

polimorfismul obţinut între aceste două variante.

ADN-ul clonat din benzile polimorfe recuperate din gel au fost marchate cu biotină şi

folosite ca sondă în hibridarea moleculară de tip Southern blotting.

CAPITOLUL VI

REZULTATE ŞI DISCUŢII

6.1. REZULTATE PRIVIND ANALIZA MOLECULARĂ A P. INFESTANS

6.1.1. Rezultate privind amplificarea cu primerii ITS

Au fost analizate de noi trei izolate de mană primite din Olanda şi 10 provenienţe de

mană din România izolate şi analizate anterior în cadrul cercetărilor de la USAMV.

În urma analizelor PCR cu primerii ITS3 şi ITS4 am obţinut banda specifică speciei

Phytophthora, de 650pb, dar, pe lângă această bandă s-a obţinut la unele variante şi o a doua

bandă, de aproximativ 380pb. Interesant este faptul că izolatele A11 şi A22 au amplificat

doar banda de 380pb. Se ştie faptul că A11 şi A22 sunt izolate de P. infestans, primite din

Olanda. În cazul amplificării PCR produşii de amplificare obţinuţi sunt specifici doar unei

specii, cu posibile variaţii de mică amplitudine.

Analizând şi profilul electroforetic obţinut cu setul de primeri ITS3 şi ITS4 unde

aceste două variante au amplificat o bandă de dimensiune diferită, putem spune, că este

posibil ca prin menţinerea timp îndelungat pe mediul de cultură cu secară să fi apărut o

mutaţie în regiunea de ataşare a primerilor. Acest lucru este confirmat și de faptul că setul de

primeri ITS3 și PISP1 nu au amplificat aceste două izolate.

16

6.1.2. Rezultate privind amplificarea ADN-ului mitocondrial

CARTER et al., (1990) a definit două tipuri (la nivel mitocondrial) I şi II, care la

rândul lor au fost diferenţiate, prin digestie cu diferite enzime de restricţie, în haplotipurile Ia

şi Ib şi haplotipurile IIa şi IIb (GRIFFITH et al., 1998). Mult mai operativă s-a dovedit

analiza PCR a polimorfismului la nivelul ADN-ului mitocondrial cu primeri specifici de tip

CAPS.

Fiecare set de primeri au generat produşi de amplificare monomorfi la toate

provenienţele de mană. Izolatele A11 şi A22 nu au fost amplificate de nici un set de primeri,

acest lucru intărind convingerea noastră că aceste isolate au suferit o mutaţie.

Pentru evidenţierea polimorfismului secundar s-a procedat la digestia cu enzime de restricţie

a produşilor de amplificare PCR obţinuţi cu primerii specifici ADN-ului mitocondrial.

Am folosit trei enzime de restricţie pentru digestia produşilor de amplificare, şi

anume Hha I pentru produşii de amplificare obţinuţi cu primerii H1, Msp I pentru produşii

de amplificare obţinuţi cu primerii H2 şi EcoRI produşii de amplificare obţinuţi cu primerii

H3 şi H4.

Digestia produşilor de amplificare obţinuţi cu primerii H2 a generat polimorfism la

provenienţele A23 şi 91. Numărul fragmentelor de restricţie (două) şi dimensiunea lor

(900pb şi 400pb) indică faptul că aceste două provenienţe aparţin haplotipului Ia, iar

celelalte priveniențe aparțin haplotipului IIa.

6.2. REZULTATE PRIVIND ANALIZA MOLECULARĂ A ADN-ULUI DE CARTOF

6.2.1. Rezultate privind amplificarea ADN-ului cu primeri specifici genelor de

rezistenţă RB la mană

Perechile de primeri Blb1, 517/1519 şi 1521/518 au fost construite pe baza secvenţei

omoloage al genei Rpi-blb1 (van der VOSSEN et al., 2003) şi ele vizează produsul specific

de amplificare al genei Rpi-blb1.

17

Două seturi de primeri (Blb1, 517/1519) au amplificat secvenţe specifice genelor RB

la ambele genotipuri de S. bulbocastanum. Trei seturi de primeri au generat produşi de

amplificare doar la genotipul 11 de S. bulbocastanum şi anume Blb2, 1/1 şi Blb3R.. Primerii

1521/518, RGA1 şi Blb3Ra au generat produşi de amplificare şi la celelalte specii de

Solanum (fig. 6). PANKIN et al., (2010) explică acest lucru prin faptul că diversitatea locilor

RB au apărut înainte de speciaţia genului Solanum. Fiecare grup combină variante alelice ale

genelor întrucât polimorfismul în interiorul grupului a fost indicativ pentru diferiți loci RB.

În ciuda funcţiilor de rezistenţă împotriva manei, prezenţa şi polimorfismul secvenţelor RB

în diferite specii de Solanum nu au fost imediat asociate cu o rezistenţă crescută la mană

(PANKIN et al., 2011).

6.2.2. Rezultate privind convertirea markerilor RAPD în markeri SCAR

Din totalul de 22 de primeri RAPD testaţi, 16 primeri au amplificat ADN-ul de cartof,

însă doar 4 primeri au prezentat polimorfism al genotipurilor de cartof cu gene de rezistenţă

faţă de cele sensibile. S-au identificat, pe baza cosegregării (prezenţa benzii la forma

rezistentă şi absenţa la forma fără rezistenţă) un număr de 34 de benzi polimorfe, posibil

markeri pentru genele de rezistenţă. Aceşti markeri au fost atribuiti genelor de rezistenţă.

Mai departe s-au izolat aceşti markeri în vederea convertirii lor în markeri SCAR, care sunt

specifici secvenţei clonate. Dintre acestea la 24 benzi polimorfe s-a reușit izolarea, iar

clonarea a reuşit la 13 dintre ele.

Secvenţele clonate au fost selectate, şi o parte din ele, au fost trimise la secvenţiat în

laboratoarele firmei Mycrosinth din Elveţia.

Pe baza secvenţelor de nucleotide au fost proiectate cu programul NCBI/ Primer-

BLAST un număr de 4-10 primeri pentru fiecare secvenţă. Dintre aceştia au fost selectaţi şi

comandaţi câte un singur primer pentru fiecare secvenţă (19 primeri SCAR).

Programul de amplificare a fost optimizat pentru fiecare primer.

Primerii SCAR nu au diferenţiat nici un polimorfism între genotipul sensibil şi cel

rezistent. Acest lucru poate fi explicat prin faptul că fragmentul amplificat de primerii

18

sintetizaţi este mai mic decât secvenţa polimorfă recuperată din gel şi clonată, şi este posibil

ca primerii SCAR să marcheze o secvenţă, aproximativ de aceeaşi dimensiune, atât la

genotipurile sensibile cât şi la cele rezistente.

În urma digestiei produşilor de amplificare obţinuţi cu enzima de restricţie HinfI, s-a

obtinut un polimorfism al genotipului 36 (R11) atât faţă de genotipurile sensibile R0 (15 şi 1)

cât şi faţă de genotipurile rezistente (33-R2, 28-R10, 26-R8,24- R5,27- R3 şi 34-R1) (fig. 1).

Faptul că enzima de restricţie Hinf I a generat fragmente de restricţie polimorfe, întăreşte

convingerea noastră că primerul a amplificat fragmente apropiate ca dimensiune la toate

genotipurile, dar că aceste fragmente diferă ca şi secvenţă de nucleotide.

Fig. 1. Fragmentele de restricţie obţinute prin digestia produşilor de amplificare al primerilor

33.2.2 cu enzima de restricţie HinfI

În concluzie, putem spune că fragmentul amplificat de setul de primeri 33.2.2 la

genotipul 36 cu gena R11 este diferit ca şi secvenţă de nucleotide de celelalte fragmente

amplificate, aşadar markerul 33.2.2 poate fi considerat marker pentru gena R11.

6.3. REZULTATE PRIVIND HIBRIDAREA MOLECULARĂ

Pentru a testa markerul 33.2.2, am recurs la hibridarea moleculară de tip Southern

blotting al ADN-ului genomal de la genotipul sensibil (15, R0) şi de la genotipul rezistent

(36, R11) la care s-a identificat markerul pentru gena de rezistenţă R11.

ADN-ul digerat a fost transferat pe membrana de nailon, folosind principiul capilarităţii, prin

sistemul de Southern blotting.

19

După transfer ADN-ul a fost fixat pe membrană prin expunere 4 min la UV.

Membrana a fost hibridată cu sonda marcată cu biotină. Hibridarea s-a realizat peste

noapte la 60˚C.

Probele biotinate sunt detectate de streptavidina conjugată cu alkalin fosfataza (AP),

streptavidina-AP legându-se în mod specific şi ireversibil de probele marcate cu biotină .

Probele sunt apoi vizualizate cu ajutorul unui substrat BCIP-T (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-

phosphate, p-toluidine salt) care este suplimentat cu NBT (nitro blue tetrazolium). Acest

substrat produce un precipitat insolubil albastru, care apare ca o pată sau bandă bine definită

la locul de reacţie de pe membrană. De aceea pentru vizualizare nu este nevoie de

echipament special.

În figura 2 este prezentată membrana hibridată cu sonda 33.2.2 după ce s-a realizat detecţia.

Fig. 2. Membrana de nailon hibridată cu sonda 33.2.2

După cum se poate observa, a apărut semnal la forma rezistentă în jurul dimensiunii

de ~1000pb. Acest lucru confirmă faptul că markerul 33.2.2 poate fi considerat marker

pentru gena R11 de rezistenţă.

20

CONCLUZII

� Izolarea ADN-ului, atât din plante cât şi din mană, s-a realizat conform protocolului

care utilizează CTAB, iar cantităţile şi purităţile obţinute au fost bune

� Primerii ITS3 şi PISP1, care sunt specifi speciei P. infestans, nu au prezentat produşi

de amplificare la nivelul ADNr al izolatelor A11 şi A22, acest lucru datorându-se

probabil unor mutaţii apărute în cadrul genomului acestor două izolate, ipoteză

întărită şi de lipsa produşilor de amplificare în urma amplificării acestor două izolate

cu primerii specifici ADNm.

� Primerii specifici ADNm au permis diferenţierea haplotipurilor pentru izolatele luate

în studiu. Această diferenţiere a fost evidenţiată datorită unui polimorfism secundar,

obţinut în urma digestiei cu enzime de restricţie a produşilor de amplificare.

� Primerii 1/1, Blb2, Blb3 (7.1) au prezentat specificitate speciei S. bulbocastanum,

genotipul 11, primerii Blb1, 517/1519 au fost specifici ambelor genotipuri de S.

bulbocastanum luate în studiu. Acest lucru evidenţiază prezenţa genelor de rezistenţă

RB la aceste două variante, aceste gene nefiind prezente la celelalte specii de

Solanum studiate.

� A fost observată prezenţa produșilor de amplificare obținuți cu primerii 1521/518,

RGA1 şi Blb3 (7.2) în majoritatea genotipurilor studiate. Prezenţa acestor secvenţe

presupune existenţa unor sisteme de rezistenţă la mană, însă unele gene, pe parcursul

evoluţiei speciei Solanum, au fost inhibate sau inactivate, pierzându-şi funcţia de

rezistenţă.

21

� Au fost identificaţi un număr de 34 markeri RAPD (benzi polimorfe) care aparţin (sau

sunt linkaţi) unor gene de rezistenţă a cartofului la Phytophthora infestans. Dintre

acestea 24 benzi polimorfe au fost izolate, iar clonarea a reuşit la 13 dintre ele.

� Ulterior secvenţierii au fost construiţi între 3 şi 10 primeri pentru fiecare secvenţă,

dintre aceştia fiind testaţi un număr de 18 primeri (câte o pereche de primeri pentru

fiecare secvenţă).

� În urma testării acestor primeri prin amplificare PCR nu s-a evidenţiat un polimorfism

primar între genotipurile resistente şi respectiv sensibile.

� La nivelul produşilor de amplificare al primerului 33.2.2 a fost observat un

polimorfism secundar între genotipurile sensibile şi cele rezistente la mană în urma

digestiei produşilor de amplificare cu enzima de restricţie HinfI, genotipul 36 (R11)

diferenţiindu-se de celelalte genotipuri, atât de cele sensibile (1 şi 15,R0) cât şi de

cele rezistente (33-R2, 28-R10, 26-R8, 24- R5,27- R3 şi 34-R1).

� În urma hibridării moleculare de tip Southern blotting a fost observată prezenţa unei

secvenţe complementare sondei, în ADN-ul genomal digerat al genotipului 36 (R11).

� Ca urmare a polimorfismului secundar observat şi a rezultatelor hibridării moleculare,

putem concluziona că markerul 33.2.2 este specific pentru evidenţierea genei R11 de

rezistenţă la mană, drept urmare poate fi folosit în programele de selecţie asistată de

markeri moleculari pentru rezistenţa cartofului la mană.

22

BIBLIOGRAFIE SELECTIV Ă

BALLVORA, A.,M.R. ERCOLANO, J. WEISS, K. MEKSEM, C.A. BORMANN, P.

OBERHAGEMANN, F. SALAMINI, AND C. GEBHARDT, 2002, The R1 gene for potato

resistance to late blight (Phytophthora infestans) belongs to the leucine zipper/NBS/LRR

class of plant resistance genes. Plant J. 30:361-71.

BRADSHAW, J. E., G.J. BRYAN, A.K. LEES, K. MCLEAN, AND R.M.

SOLOMON-BLACKBURN, 2006, Mapping the R10 and R11 genes for resistance to late

blight (Phytophthora infestans) present in the potato (Solanum tuberosum) R-gene

differentials of Black. Theor. Appl. Genet. 112:744-751.

CARTER D.A., S.A. ARCHER, K.W. BUCK, D.S. SHAW, R.C. SHATTOCK, 1990,

Restriction fragment length polymorphism of mitochondrial DNA of Phytophthora infestans

Mycol. Res. 94:1123-1128

CEAPOIU N., F. NEGULESCU, 1983, Genetica şi ameliorarearezistenţei la boli a

plantelor, Ed. Academiei Republicii Socialiste România, Bucureşti;

COLTON, M. LARA, I. H. GROZA, M. SUSAN WIELGUS, J. JIENG, 2006,

Marker asisted selection for the broad-spectrum potato late blight resistance conferred by

gene RB derived from a wild potato species, Published online february 1, 2006;

DRENTH, A., 1995, formation and survival of oospores of Phytophthora infestans

under natural conditions, Plant pathology, 44:86-94;

EL KHARBOTLY, A., C. LEONARDS-SCHIPPERS, D.J. HUIGEN, E.

JACOBSEN, A. PEREIRA, W.J. STIEKEMA, F. SALAMINI, AND C. GEBHARDT, 1994,

Segregation analysis and RFLP mapping of the R1 and R3 alleles conferring race-specific

resistance to Phytophthora infestans in progeny of dihaploid potato parents. Mol. Gen. Genet.

242:749-754.

EWING, E., I. SIMKO, C.D. SMART, M.W. BONIERBALE, E.S.G. MIZUBUTI,

G.D. MAY, AND W.E. FRY, 2000, Genetic mapping from field tests of qualitative and

quantitative resistance to Phytophthora infestans in a population derived from Solanum

tuberosum and Solanum berthaultii. Mol. Breed. 6:25-36.

23

FRY W. 2008. Phytophthora infestans: the plant (and R gene) destroyer. Molecular

Plant pathology 9: 1-18.

GEBHARDT, C., and J.P.T. VALKONEN, 2001, Organization of genes controlling

disease resistance in the potato genome. Annu. Rev. Phytopathol. 39:79-102.

GHISLAIN, M., B. TROGNITZ, M.A. HERRERA, R. DEL, J. SOLIS, G. CSALLO,

C. VASQUEZ, O. HURTADO, R. CASTILLO, L. PORTAL, AND M. ORRILLO, 2001,

Genetic loci associated with field resistance to late blight in offspring of Solanum phureja

and S. tuberosum grown under short-day conditions. Theor. Appl. Genet. 103:433-442.

GOMEZ E.A., M.C.M. KASUYA, E.G.de BARROS, A.C. BORGES, E.F. ARAUJO,

2002, Polymorphism in the internal transcribed spacer (ITS) of the ribosomal DNA of 26

isolates of ectomycorrhizal fungi, Genet. Mol. Biol. Vol 25,

GRIFFITH G.W., D.S.SHAW, 1998, Polymorphism in Phytophthora infestans: Four

Mitochondrial Haplotypes Are Detected after PCR Amplification of DNA from Pure Culture

or from Host Lesions. Appl.Environ.Microbiol.,64:4007-4014.;

HEIN, I., P.R.J. BIRCH, S. DANAN, V. LEFEBVRE, D.A. ODENY, C.

GEBHARDT, F. TROGNITZ, and G.J. BRYAN, 2009, Progress in mapping and cloning

qualitative and quantitative resistance against Phytophthora infestans in potato and its wild

relatives. Potato Research 52:215-227

HUANG, S., V.V.G.A. VLEESHOUWERS, J.S. WERIJ, R.C.B. HUTTEN, H.J.

VAN ECK, R.G.F. VISSER, AND E. JACOBSEN, 2004, The R3 resistance to Phytophthora

infestans in potato is conferred by two closely linked R genes with distinct specificities. Mol.

Plant-Microbe Interact. 17:428-435.

HUANG, S., E.A.G. VAN DER VOSSEN, H. KUANG, V.G.A.A.

VLEESHOUWERS, N. ZHANG, T.J.A. BORM, H.J. VAN ECK, B. BAKER, E.

JACOBSEN, AND R.G.F. VISSER, 2005, Comparative genomics enabled the isolation of

the R3a late blight resistance gene in potato. Plant J. 42:251-261.

KAMOUN, S., E. HUITEMA, and V.G.A.A. VLEESHOUWERS, 1999, Resistance

to oomycetes: A general role for the hypersensitive response? Trends in Plant Science 4:196-

201.

24

KUHL, J. C., R.E.JR. HANNEMAN, and M.J. HAVEY, 2001, Characterization and

mapping of Rpi1, a late-blight resistance locus from diploid (1EBN) Mexican Solanum

pinnatisectum. Mol. Genet. Genomics 265:977-985.

LANGRIDGE P., E.S. LAGUDAH, T. A. HOLTON, R. APPELS, P.J. SHARP, K.J.

CHALMERS, 2001, Trends in genetics and genome analyses in wheat: a review, Aust. J.

Agric. Res., 52, p. 1043-1077

LEE Y.S., 2001, New sensitive detection method for Phytophthora infestans in potato,

proceedind of the international workshop on potato late blight: solving a threat to global

food security, 15-19 october, session III, p. 66-83.

LEONARDS-SCHIPPERS, C., W. GIEFFERS, F. SALAMINI, and C. GEBHARDT,

1992, The R1 gene conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans in potato is

located on potato chromosome V. Mol. Gen. Genet. 233:278-283.

LI, X., H.J. VAN ECK, J.N.A.M. ROUPPE van der VOORT, D.J. HUIGen, P.

STAM, and E. JACOBSEN, 1998, Autotetraploids and genetic mapping using common

AFLP markers: The R2 allele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on

potato chromosome 4. Theor. Appl. Genet. 96:1121-1128.

LIU Z., D. HALTERMAN, 2006, Identification and characterization of RB

orthologous genes from the late blight resistant wild potato species Solanum verucosum,

Physiological and Molecular plant pathology, 69:230-239

MORAR G., 2004, în volumul de Fitotehnie ,Ed. Ion Ionescu de la Brad, Iaşi;

NAESS, S. K., J.M. BRADEEN, S.M. WIELGUS, G.T. HABERLACH, J.M.

MCGRATH, AND J.P. HELGESON, 2000, Resistance to late blight in Solanum

bulbocastanum is mapped to chromosome 8. Theor. Appl. Genet. 101:697-704.

PANKIM A. A., E. A. SOKOLOVA, E. V. ROGOZINA, M. A. KUZNETSOVA, K.

D. DEAHL, R. W. JONES, E. E. KHAVKIN (2011). Allel mining in the gene pool of wild

Solanum species for homologues of late blight resistance gene RB/Rpi-blb1. Plant Genetic

Resource: Characterization and Utilization. 1-4

PARK, T. H., V.G.A.A. VLEESHOUWERS, R.C.B. HUTTEN, H.J. VAN ECK,

E.A.G. VAN DER VOSSEN, E. JACOBSEN, AND R.G.F. VISSER, 2005, Highresolution

25

mapping and analysis of the resistance locus Rpi-abpt against Phytophthora infestans in

potato. Mol. Breed. 16:33-43.

PEL M.A., S.J. FOSTER, T-H. PARK, H. RIETMAN, G. VAN ARKEL,

J.D.G.JONES, H.J. VAN ECK, E. JACOBSEN, R.G.F. VISSER, E.A.G. VAN DER

VOSSEN (2009). Mapping and cloning of late blight resistant genes from Solanum venturii

using an interspecific candidate gene apptoach. Mol. Plant. Microbe. Interact. 22:601-615

ROBINSON, R. A., 1976, Plant pathosistem, Springer-Verlang, Berlin, New-York,

London;

SANDBRINK, J. M., L.T. COLON, P.J.C.C. WOLTERS, AND W.J. STIEKEMA,

2000, Two related genotypes of Solanum microdontum carry different segregating alleles for

field resistance to Phytophthora infestans. Mol. Breed. 6:215-225.

SCHOBER, B., G. BULLICH, 1986, Oospore formation by Phytophthora infestans

(Mont) de Bary, Potato Research, 29(3):395-398;

SIMKO I., S. JANSKY, S. STEPHENSON, D. SPOONER, 2007, genetics of

resistance to pests and disease, In: Vreugdenhil D. (ed) Potato Biology and Biotechnology:

advances and perspectives, Elsevier, Amsterdam, pp. 117-155.

SLIWKA, J., H. JAKUCZUN, R. LEBECKA, W. MARCZEWSKI, C. GEBHARDT,

AND E. ZIMNOCH-GUZOWSKA, 2006, The novel, major locus Rpi-phu1 for late blight

resistance maps to potato chromosome IX and is not correlated with long vegetation period.

Theor. Appl. Genet.113:685-695.

SMILDE, W. D.,G. BRIGNETI, L. JAGGER, S. PERKINS, AND J.D.G. JONES,

2005, Solanum mochiquense chromosome IX carries a novel late blight resistance gene Rpi-

moc1. Theor. Appl. Genet.110:252-258.

STAPLES R. C., 2003, Race nonspecific resistance for potato late blight, Trends in

Plant Science 9:5-6

TAN, M. Y. A., R.C.B. HUTTEN, B.C. CELIS GAMBOA, T.-H. PARK, R.E. NIKS,

R.G.F. VISSER, AND H.J. VAN ECK, 2008, The Rpi-mcd1 Locus from Solanum

microdontum involved in resistance to Phytophthora infestans, causing a delay in infection,

26

maps on potato chromosome 4 in a cluster of NBS-LRR genes. Mol. Plant-Microbe Interact.

21:909-918.

TURKENSTEEN, L. J. 1993. Durable resistance of potatoes against Phytophthora

infestans. Pages 115-124 in: Durability of Disease Resistance. T. Jacobs and J. E. Parlevliet,

eds. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands.

VAN DER VOSSEN, E.,A. SIKKEMA, B.L. HEKKERT, J. GROS, P. STEVENS,

M. MUSKENS, D. WOUTERS, A. PEREIRA, W. STIEKEMA, AND S. ALLEFS, 2003,

An ancient R gene from the wild potato species Solanum bulbocastanum confers broad-

spectrum resistance to Phytophthora infestans in cultivated potato and tomato. Plant J.

36:867-882.

VAN DER VOSSEN, E. A. G., J. GROS, A. SIKKEMA, M. MUSKENS, D.

WOUTERS, P. WOLTERS, A. PEREIRA, AND S. ALLEFS, 2005. The Rpi-blb2 gene

from Solanum bulbocastanum is an Mi-1 gene homolog conferring broadspectrum late blight

resistance in potato. Plant J. 44:208-222.

VERZAUX ESTELLE, 2010, Resistance and susceptibility to late blight in Solanum:

gene mapping, cloning and stacking, Thesis, Wageningen University.

VILLAMON, F. G., D.M. SPOONER, M. ORILLO, E. MIHOVILOVICH, W.

PEREZ, AND M. BONIERBALE, 2005, Late blight resistance linkages in a novel cross of

the wild potato species Solanum paucissectum (series Piurana). Theor. Appl. Genet.

111:1201-1214.

VLEESHOUWERS, V., W. VAN DOOIJEWEERT, F. GOVERS, S. KAMOUN,

AND L. T. COLON, 2000. The hypersensitive response is associated with host and nonhost

resistance to Phytophthora infestans. Planta 210:853-864.