BIOTEHNOLOGIE GENERALA-curs 9Procese de sterilizare in industria biotehnologica

Un proces de biosinteza impune absenta totala a microorganismelor straine, care s-ar putea dezvolta in faza de fermentatie, infectand cultura pura a microorganismului util. Aceste microorganisme pot proveni din apa, materii prime, aer sau instrumentele folosite in timpul procesului biotehnologic.

Acesta cerinta tehnologica se poate realiza prin sterilizare.

Sterilizarea este operatia de distrugere sau indepartare a tuturor formelor vegetative si de rezistenta a microorganismelor patogene si nepatogene din substante preparate sau de pe obiecte.

Uneori se efectueaza pasteurizarea, care consta in incalziri repetate sud 100C(urmate de racire brusca pina la temperaturi de 4-5 grade Celsius) si avand drept scop distrugerea majoritatii microorganismelor, inclusiv a bacteriilor rezistente.

In industria biotehnologica, unde se cere distrugerea tuturor microorganismelor, adica reducerea totala a viabilitatii, nu distrugere in sens fizic, operatia de sterilizare este de neinlocuit si poate fi realizata prin urmatoarele metode:

Sterilizarea cu aer cald (140- 200C)

Sterilizarea cu vapori sub presiune (120 - 140C)

Sterilizarea prin incalziri repetate (70 - 100C)

Filtrarea prin materiale poroase

Utilizarea radiatiilor (UV, IR, X, ) Utilizarea agentilor chimici (formaldehida)Metoda de sterilizare se alege in functie de proprietatile fizico-chimice ale materialelor supuse sterilizarii, evitandu-se eventualele modificari calitative ale acestora.

In cadrul sterilizarii termice, exista o importanta deosebita intre incalzirea uscata si cea umeda, ultima fiind deosebit de eficienta.

In industria biotehnologica cea mai utilizata metoda este sterilizarea cu vapori sub presiune (incalzire umeda). In acest tip de sterilizare, eficienta se datoreaza faptului ca aburul si apa fierbinte actioneaza prin hidratatea, coagularea si hidroliza proteinei bacteriene. Pentru a realiza acelasi grad de sterilizare, in incalzirea uscata este necesara o temperatura mai ridicata si un timp mai mare.

Astfel, in sterilizarea umeda sunt suficiente temperaturi de 120 - 130C timp de 10 30 min, in timp ce in sterilizarea uscata sunt necesare temperaturi intre 140 - 200C, iar durata de sterilizare variaza intre 30 120 min.

Sterilizarea prin filtrare, pe materiale poroase se utilizeaza in cazul produselor termolabile (vitamine, enzime) sau daca din punct de vedere economic aceasta metoda se realizeaza cu energie mai mica decat sterilizarea termica. In procesul de sterilizare prin filtrare, se utilizeaza filtre poroase Jena G5, filtre de azbest celuloza numite filtre Seitz, sau filtre cu membrana.

Sterilizarea cu ajutorul radiatiilor este aplicata pentru sterilizarea produselor finite si a aerului din boxe.

Sterilizarea chimica, utilizeaza diferite substante cum ar fi: formaldehida, fenol, apa oxigenata. Instrumentele sau utilajele pot fi spalate cu aceste substante sau de exemplu fenolul poate fi utilizat ca antiseptic prin adaugare in substanta respectiva.

Pentru industria de biosinteza, operatia de sterilizare a mediului de cultura, a aerului tehnologic si a utilajelor, constituie un factor determinant in realizarea unei tehnologii.

Sterilizarea mediilor de cultura

La nivel de laborator s-au incercat metode de sterilizare termica, chimica cu radiatii. Din cauza volumului mare de lichid, la scara industriala nu a dat rezultate decat metoda sterilizarii termice si anume sterilizarea cu aburi.

Acest procedeu este usor de realizat si permite obtinerea unui grad inalt de sterilizare.

Acest procedeu, prezinta insa si inconveniente: Conduce la reactii secundare intre componentele mediului de cultura si anume:

denaturarea proteinelor si inactivarea enzimelor;

degradarea partiala a vitaminelor si anumitor factori de crestere;

oxidarea acidului ascorbic si a fenolilor;

caramelizarea glucidelor; condensarea gruparilor aldehidice din glucidele reducatoare cu grupele amino, libere din aminoacizi sau proteine (reactia Maillard).Produsii rezultati in urma reactiei Maillard, asemanatori bazelor Schiff, fiind toxici pentru majoritatea microorganismelor, formarea lor trebuie evitata in procesul de sterilizare. Din acest motiv, se recomanda sterilizarea separata a sursei de carbon si a sursei de azot si amestecarea lor in fermentator.

Acest mod de sterilizare este obligatoriu pentru mediile complexe.

Sterilizarea mediilor de cultura poate avea loc discontinuu

- continuuSterilizarea discontinua a mediilor de cultura consta in incalzirea acestora la o temperatura prescrisa, mentinerea acestei temperaturi o anumita perioada de timp si racirea in final pana la temperatura de cultivare indicata in tehnologie. Unele microorganisme (E. Coli) vor fi distruse in perioada de sterilizare, altele in perioada de mentinere iar o mica parte si in perioada de racire, astfel incat in final are loc reducerea totala a numarului de microorganisme. Timpul total de sterilizare poate fi considerat ca fiind egal cu suma timpilor de incalzire, mentinere si racire. Relatia timp-temperatura este in functie de marimea si tipul fermentatorului, de modul de incalzire si fluctuatiile agentului termic.Sterilizarea continua a mediilor de cultura

Sterilizarea directa in fermentator, prin procedeu discontinuu la 120C, necesita un timp mai mare, iar degradarea mediului este mai avansata.

Pentru sterilizarea unor cantitati mari de mediu se recomanda utilizarea proceselor continue de sterilizare care prezinta urmatoarele avantaje:

pastrarea proprietatilor nutritive ale mediului, datorita expunerii limitate la temperaturi limitate:

utilizarea mai rationala a consumului de abur;

productivitate si eficacitate sporita;

control automat;

In vederea posibilitatii de sterilizare continua, mediul trebuie sa spumeze mai putin si sa aiba o vascozitate mai mica.

Pentru sterilizarea continua a mediilor de cultura de folosesc instalatii industriale care lucreaza la 120C sau instalatii care lucreaza la temperaturi mai mari de (140C ) dar care permit o racire rapida a mediului supraincalzit.

Instalatia pentru sterilizarea continua a mediului de cultura la 120C este compusa din 3 parti distincte: coloana de sterilizare, mentinator si racitor (fig 1).

Coloana de sterilizare este formata din 2 tevi concentrice: prin teava interioara circula abur de 5 atm, iar prin spatiul inelar circula mediul supus sterilizarii. In coloana de sterilizare are loc incalzirea cu abur direct (timp de 4-5 sec) pana la 120C, dupa care acesta este trecut prin mentinatorul (2)si racitorul teava in teava (3) pentru definitivarea procesului de sterilizare si racire pana la 35-40C. Diagrama timp-timp arata astfel: T1 si T2 fiind mici se poate considera ca sterilizarea are loc, practic numai in mentinator(fig 2)

Sterilizarea continua se poate face si la temperaturi mai ridicate (140C) cu conditia, ca timpul de expunere sa fie foarte scurt si sa existe posibilitatea unei raciri rapide, pentru a se evita degradarea mediului. Aceste conditii se pot realiza industrial in instalatia de sterilizare prin injectie, sau in schimbatoare de caldura cu placi.Sterilizarea aerului

Sterilizarea aerului tehnologic necesar in fermentatiile aerobe, constituie o problema majora in ingineria biochimica. Dificultatea provine din faptul ca aerul furnizat de compresoare contine o varietate mare de microorganisme (bacterii, fungi, virusuri) rezistente.

Pentru sterilizarea aerului se utilizeaza urmatoarele metode:

sterilizare termica

sterilizare cu raze ionizate sau ultra violete

sterilizarea cu agenti chimici

sterilizare prin filtrare

Cele mai utilizate metode (la nivel industrial) sunt sterilizarea termica si sterilizarea prin filtrare mecanica.

La sterilizarea termica sunt necesare temperaturi 200-220C pentru ca sporii din aer sunt foarte rezistenti.

Sterilizarea aerului prin metoda filtrarii se realizeaza pe filtre mecanice, prevazute cu un strat de material fibros(fig 3).La inceput s-au folosit fibre de bumbac, dar acum se folosesc fibre de sticla (vata de sticla).

In prezent cea mai larga utilizare in industria biotehnologica o are procedeul de sterilizare a aerului bazat pe principiul filtrarii combinat cu efectul termic.

Astfel, aerul tehnologic este supus procesului de sterilizare, trece prin filtru cu saci pentru separarea particulelor solide, apoi este incalzit in schimbator de caldura sau compresor la 150-160C. aerul incalzit este trecut in continuare printr-un racitor de aer , separator de picaturi, filtru principal cu material fibros (prima treapta de purificare), filtrul individual cu material fibros (treapta a doua de purificare), dupa care patrunde in purificator.

Materialul filtrant asigura gradul de sterilizare dorit, numai daca se evita umezirea acestuia prin patrunderea umiditatii din aer sau a uleiului din compresor.

Pentru a nu favoriza patrunderea umiditatii in filtrul principal si individual, aerul comprimat se raceste sub valoarea temperaturii punctului de roua, se indeparteaza umiditatea separata, dupa care se incalzeste cu aer fierbinte pentru a depasi temperatura critica.

Sterilizarea utilajelor in industria biotehnologica

Procesele de biosinteza incep cu faza de inocul (desfasurata in inoculatoare) continua cu faza intermediar (desfasurata in intermediar) si sfarseste cu faza de regim (ce se desfasoara in fermentator). Utilajele in care se realizeaza acest proces, trebuie sa asigure posibilitatea evitarii pericolului de infectare a culturii microorganismului util. Pentru aceasta, linia tehnologica se sterilizeaza cu abur viu la 120 - 125C timp de 30 min, iar inocularea si transvazarea masei bacteriene se fac in conditii aseptice(fig 4).

Insamantarea aseptica se face fie prin utilizarea unei flacari, fie cu ajutorul aerului comprimat steril.

In primul caz, flacara trebuie sa asigure dezinfectarea capacului si a gurii de insamantare, iar in timpul cat se toarna suspensia, flacara trebuie sa cuprinda tot spatiul prin care ar putea patrunde orice masa de infectie.

Mai usoara si mai sigura este insamantatrea aseptica sub presiune de aer steril.

Metoda consta in sterilizarea traseului de conducte existent intre inoculator si fermentator si apoi trimiterea de aer steril in inoculator, care impinge astfel mediul de inocul din inoculator in fermentator prin conducta, intru-cat in inoculator este presiune de aer mai mare. Toti robinetii aferenti sunt prevazuti cu protectie de abur