Teste MIKROGEN DIAGNOSTIK

recomLine Borrelia IgG recomLine Borrelia IgM

1. Scop recomLine Borrelia este un test calitativ , in vitro , pentru detectarea anticorpilor de tip IgG şi / sau IgM anti- Borrelia burgdorferi sensu strictu, B. garinii, B. afzelii şi B. bavariensis (fosta B garinii OspA tip 4 = B. garinii 1) şi B. spielmanii în ser, plasmă sau LCR uman. 2. Domeniu de utilizare recomLine Borrelia este utilizat pentru confirmarea probelor care sunt pozitive sau necunoscute la testul de screening. Acesta poate fi, de asemenea, utilizat pentru detectarea anticorpilor IgG şi IgM umani formati intratecal în LCR (LCR / ser perechi) (s. 8.1). recomLine Borrelia facilitează identificarea sigură a anticorpilor specifici împotriva antigenelor selectate de specii patogene de B. burgdorferi umane. Anticorpii împotriva antigenelor pot da anumite indicaţii suplimentare privind stadiul infectiei. 3. Principiul testului Antigenele recombinante inalt purificate de purificate Borrelia burgdorferi sensu lato (OspA, OspC, p100, VIsE, p39, p58 p18 (= DbpA, proteina A care leaga decorin), p41 (fagellina) sunt fixate pe benzi de testare cu membrana de nitroceluloză. 1. Aceste benzi de testare sunt incubate cu proba diluată de ser sau plasmă, şi anticorpii

specifici se leaga de antigenele patogene de pe benzile de testare 2. Anticorpii nelegati sunt apoi eliminati. 3. Într-o a doua etapă, în care benzile sunt incubate cu anticorpi imunoglobulina anti-umani

(IgG şi / sau IgM), care sunt cuplate la peroxidaza de hrean. 4. Anticorpii conjugati nelegati sunt apoi eliminati. 5. Anticorpii legati în mod specific sunt detectati cu o reacţie de colorare catalizată de

peroxidază. Dacă a aparut o reacţie antigen-anticorp, pe banda va apărea o banda de culoare inchisa in punctul corespunzător.

Există benzi de control la capătul de sus a benzilor de testare: a) controlul reacţiei cu numărul benzii care trebuie să prezinte o reacţie pentru fiecare proba de ser / plasmă. b) controalele conjugatelor (IgG, IgM) sunt folosite pentru inspecţia clasei de anticorpi detectati. Dacă, de exemplu, testul este folosit pentru detectarea anticorpilor IgG, conjugatul IgG va prezenta o banda clara) c) "controlul de prag [cutoff]": intensitatea acestei benzi permite evaluarea reactivitatii fiecareia dintre benzile de antigen (a se vedea 9.2 Evaluare).

4. Reactivi 4.1 Conţinutul pachetului Reactivii dintr-un pachet sunt suficienti pentru a 20 (200) teste. Fiecare kit de testare conţine: DILUBUF 100 ml (500 ml), tampon de diluare (gata-de-utilizare)

Conţine tampon Tris, NaCl, detergent, MIT (0,01%) şi oxipirion (0,1%), conservanti şi proteina

WASHBUF A 10X 100 ml (500 ml) tampon de spalare A (de 10 ori concentratia) Conţine tampon de fosfat, NaCl, KCl, detergent, conservant: MIT (0,1%) şi oxipirion (0,2%)

SUBS TMB 40 ml (2x 200 ml) substrat cromogenic Tetrametilbenzidin (TMB, gata de utilizare)

MILKPOW 5 g (5x 5 g) lapte praf degresat INSTRU 1 Instrucţiuni de utilizare EVALFORM 1 (10) Formular de evaluare Obţinere la cerere: TEMPEVAL 1 sablon de evaluare 4.1.1 recomLine Borrelia IgG În plus faţă de componentele enumerate la punctul 4.1, fiecare set de test conţine: TESTSTR 2 (20) tuburi, fiecare cu 10 benzi de testare numerotate CONJ IgG 500 µl (3x 1,4 ml) conjugat IgG anti-uman(concentrat de o

sută de ori, capac cu filet verde) De la iepure, conţine NaN3, (<0,1%), MIT (<0,1%) şi clorazetamida (<0,1%)

4.1.2 recomLine Borrelia IgM În plus faţă de componentele enumerate la punctul 4.1, fiecare set de test conţine: TESTSTR 2 (20) tuburi, fiecare cu 10 benzi de testare numerotate CONJ IgM 500 µl (3x 1,4 ml) conjugat IgM anti-uman(concentrat de o

sută de ori, capac cu filet rosu) De la iepure, conţine NaN3, (<0,1%), MIT (<0,1%) şi clorazetamida (<0,1%)

4.2 Materiale necesare dar nefurnizate • tăvi de incubare (pot fi achiziţionate de la MIKROGEN) • apă deionizată (de înaltă calitate) • forceps din material plastic • agitator orizontal • mixer Vortex sau alte rotatoare • pompa de vid sau dispozitiv similar • cilindri volumetrici, 50 ml şi 1000 ml • micropipete cu varfuri de unică folosinţă, 20 µl si 1000 µl • pipeta sau distribuitor 10 ml • timer • prosoape absorbante de hârtie • mănuşi de protecţie de unică folosinţă • container de deşeuri pentru materiale bio-periculoase 5. Perioada de valabilitate şi manipulare - Stocati reactivii la +2 ÷ +8 °C, înainte şi după utilizare, a nu se congela. - Tineti toate ingredientele cel puţin 30 de minute la temperatura camerei (+18 la +25 °C)

înainte de începerea testului. Procedura de testare se efectuează la temperatura camerei. - Reactivi identici (a se vedea simbolul de imprimare-out) pentru teste recomLine, recomBlot şi Immunoblot diferiti pot fi utilizati pentru toti parametrii şi toate loturile. În acest proces, trebuie să fie respectate perioadele de valabilitate ale acestor componente.

- Se amestecă bine reactivii si probele concentrate înainte de utilizare. Evitaţi o acumulare de spumă.

- Deschideti tubul care conţine banda de test doar imediat înainte de utilizare, pentru a evita formarea condensului. Lăsati benzi neutilizate în tub şi continuati a le stoca la +2 ÷ +8 °C (reetansati bine tubul, benzile de test sa nu devena umede înainte de test!).

- Benzile sunt marcate cu numărul de ordine, precum şi codul de test. - Pachetele poartă o dată de expirare. După ce aceasta a fost atinsa nu poate fi oferita nici o

garanţie a calităţii. - Protejaţi componentele kitului fata de lumina directă a soarelui pe tot parcursul procedurii

de testare. Soluţia de substrat (TMB) este deosebit de sensibila la lumina. - Testul trebuie să fie efectuat numai de către personal calificat şi autorizat. - În cazul unor modificări substanţiale ale produsului sau a regulilor de utilizare de către

utilizator, aplicaţia se poate situa în afara scopului dat de MIKROGEN. - Contaminarea încrucişată a probelor sau conjugaţilor pacientului poate duce la rezultate

inexacte ale testelor. Adaugati cu atenţie probele pacientului, benzile de testare şi soluţia conjugata. Asiguraţi-vă că soluţiile de incubare nu deverseaza in alte cavitati. Îndepărtaţi cu grijă lichidele.

- Benzile trebuie să fie complet umezite şi scufundate pe parcursul întregii proceduri. - Automatizarea este posibila ; veţi primi informaţii suplimentare de la MIKROGEN. 6. Avertismente şi precauţii - Numai pentru uzul in diagnosticul in vitro

- Toate produsele din sânge trebuie să fie tratate ca potenţial infecţioase. - Benzile de testare au fost pregătite cu lizate de celule întregi inactivate, antigene

bacteriene sau virale. - După adăugarea eşantioanelor de pacienţi sau de control materialul benzii trebuie să fie

considerat infecţios şi tratat ca atare. - Se vor purta mănuşi adecvate de unică folosinţă pe parcursul întregii proceduri de testare. - Reactivii conţin agenţi si conservanti antimicrobieni, azidde sodiu, MIT

(metilisotiazolon), oxipirion şi cloroacetamida şi peroxid de hidrogen. Evitaţi contactul cu pielea sau mucoasele. Azida de sodiu poate forma o azidă exploziva la contactul cu metale grele, cum ar fi azida de cupru şi de plumb.

- Toate lichidele sifonate trebuie să fie colectate. Toate containerele de colectare trebuie să conţină dezinfectanţi adecvati pentru inactivarea agenţilor patogeni umani. Toţi reactivii şi materialele contaminate cu eşantioane potenţial infecţioase trebuie să fie tratate cu dezinfectante sau eliminate în conformitate cu reglementările dvs. de igienă. Trebuie să fie respectate concentraţiile şi perioadele de incubare prevazute de producător.

- Utilizati tăvile de incubaţie doar o singură dată. - Manevraţi cu grijă benzile utilizand pensete de plastic. - Nu se substituie sau se amestecă reactivii cu reactivi de la alţi producători. - Citiţi integral instrucţiunile de utilizare înainte de efectuarea testului şi urmaţi-le cu

atenţie. Abaterea de la protocolul de testare prevăzut în instrucţiunile de utilizare poate duce la rezultate eronate.

7. Prelevarea probelor şi prepararea reactivilor 7.1 Probe Proba poate fi ser sau plasmă (EDTA, citrat, heparină, DPC), care trebuie să fie separata cât mai curând posibil, din cheagul de sânge, după prelevarea de sânge pentru a evita o hemoliză. Poate fi, de asemenea, utilizat CSF ( LCR ). A se evita contaminarea microbiană a probelor. Substanţele insolubile trebuie să fie eliminate din proba înainte de incubare. Nu este recomandată.utilizarea de probe inactivate prin căldură, icterice, hemolitice, lipemice sau tulburi. Atenţie! În cazul în care testele nu sunt efectuate imediat, probele pot fi stocate timp de până la 2 săptămâni, la +2 ÷ +8 °C. Stocare prelungită a probelor este posibilă la -20 °C sau mai jos. Nu este recomandată congelarea şi dezgheţarea repetată a probelor din cauza riscului de rezultate inexacte. 7.2 Pregătirea soluţiilor 7.2.1 Tampon de diluare Tampon de diluare pentru dilutia serului este gata-de-utilizare. 7.2.2 Pregătirea tamponului de spalare A gata-de-utilizare Acest tampon este necesar pentru diluţia conjugatului, precum şi in etapele de spălare. Volumul tamponului de spălare A pentru un număr corespunzător de teste trebuie sa stabilit înainte de diluare. Laptele praf degresat este mai intai dizolvat în tamponul de spălare A concentrat şi apoi completat cu apă deionizata pana la volumul total (diluţie 1+9). Cantităţile necesare pentru

un număr definit de benzi de testare trebuie să fie stabilite matematic în conformitate cu următoarea formulă (nu se considera volumul mort specific al dispozitivului): Reactiv Formula Exemplu: 5 benzi Lapte praf degresat [g] = numărul de benzi x 0.1 0.5 g Concentrat de tampon de spalare A [ml] = numărul de benzi x 2 10 ml Apă deionizată [ml] = numărul de benzi x 18 90 ml Tampon de spălare A gata-de-utilizare [ml] = numărul de benzi x 20 100 ml Tamponul de spălare A gata-de-utilizare poate fi păstrat timp de patru săptămâni la +2 ÷ +8 °C. Tamponul de spălare A gata-de-utilizare este inodor şi uşor tulbure. 7.2.3 Pregătirea soluţiilor de conjugat Solutia de conjugat trebuie sa fie preparata chiar înainte de utilizare. Nu este posibil sa se stocheze soluţia de conjugat gata-de-utilizare. O parte de concentrat conjugat este diluata cu 100 părţi tampon de spalare A gata-de-utilizare (1 + 100). Cantităţile necesare pentru un număr definit de benzi de testare trebuie să fie calculate in conformitate cu formula urmatoare: Reactiv Formula Exemplu: 5 benzi Concentrat conjugat [µl] = numărul de benzi x 20 100 µl Tampon de spalare A gata-de-utilizare [ml] = numărul de benzi x 2 10 ml Cantităţile conjugate sunt calculate fără volum mort. În funcţie de manipulare (manual sau pe un dispozitiv), vă rugăm să se amestecă conjugat suplimentar pentru 1 până la 3 benzi. 8. Procedura de testare Nr. Executie Nota 1 Tineti toţi reactivii cel puţin 30 minute la 18-25

°C (temperatura camerei), înainte de începerea testului.

Procedura de testare se efectuează la temperatura camerei

2 Pregatirea benzilor de testare Puneti benzile în 2 ml, tampon de diluare gata- de-utilizare

Nu atingeţi benzile cu mainile goale - utilizati penseta. Numărul benzii trebuie sa fie indreptat în sus. Este necesară o cavitate în tava de incubare (a se vedea 4.2) pentru fiecare banda. Benzile trebuie să fie complet imersate..

3 Incubarea probelor a) 20 µl (IgG) sau 40 µl (IgM) din o proba

nediluata (ser sau plasma umana) se pun cu pipeta pe banda de testarepentru fiecare amestec de incubare (Dilutie 1+100 si/sau 1+50)

Proba se pune cu pipeta la un cap al benzii imersate in tamponul de dilutie de spalare si se amesteca cat mai repede posibil agitand cu grija tava

b) se incubeaza 1 ora cu agitare usoara Acoperiţi tava de incubare cu capacul de plastic şi puneti-o în

agitator. 4 Spalare a) Îndepărtaţi cu grijă capacul de plastic de la tava

de incubare. Realizati fazele de spalare 8.4a-8.4c de trei ori in total. Evitati contaminarea incrucisata

b) Sifonati cu grija dilutia de ser din cavitatile individuale

In cursul procesarii automate trebuie sa se respecte instructiunile producatorului

c) Puneti cu pipeta 2 ml de tampon de spalare A gata-de-utilizare in fiecare cavitate, spalati timp de 5 minute cu agitare usoara si apoi scoateti prin sifonare tamponul de spalare A

5 Incubarea cu conjugat Adaugati 2 ml de solutie de conjugat gata-de-utilizare si incubati timp de 45 minute cu agitare usoara

Acoperiţi tava de incubare cu capacul de plastic şi puneti-o în agitator.

6 Spalare vezi 8.4

Realizati fazele de spalare de trei ori in total (vezi 8.4a-8.4c.)

7 Reactia de substrat Adaugati 1,5 ml de solutie de substrat gata-de-utilizare si incubati timp de 8 minute cu agitare usoara

8 Stoparea reactiei Indepartati solutia de substrat Spalati cel putin de trei ori scurt cu apa deionizata

9 Uscarea benzilor Uscati banda intre doua straturi de hartie absorbanta timp de 2 ore inainte de citire.

Indepartati cu grija benzile din apa utilizand penseta din plastic. Depozitati benzile ferite de lumina

Atenţie! Soluţiile de incubare nu trebuie să contamineze probele. Stropirea trebuie să fie evitata în special la deschiderea şi închiderea capacului. 8.1 Analiza CSF/lcr/ser Pentru detectarea anticorpilor umani IgG şi IgM formati intratecal în LCR (LCR / perechi de ser), este disponibil un manual de instrucţiuni separat, fişa de date a pacientului şi software. Versiunile curente pot fi solicitate de la Mikrogen (+49 89 54801 -0) sau sunt disponibile pentru descărcare (www.mikrogen.de → Descarcare). 9. Rezultate Atenţie: Vă rugăm să nu folosiţi interpretarea automata, fără luarea în considerare a informaţiilor cu privire la interpretare date mai jos. 9.1 Validarea - controlul calităţii

Poate fi efectuata o analiză a testului în cazul în care au fost îndeplinite următoarele criterii: 1. Bandă de control a reacţiei (linia cea mai de sus) este în mod clar colorat, bandă închisa 2. Clasa de anticorpi (benzile a doua şi a treia): benzile de control de conjugat pentru IgG şi / sau IgM trebuie să prezinte o colorare clara. 3. Control cut-off de (banda a patra): colorare slaba, dar vizibila 9.2 Evaluarea Analiza benzilor de testare poate fi vizual sau asistată de calculator - cu ajutorul software de analiză banda de testare recom scan. Software-ul recom scan este conceput pentru a sprijini evaluarea benzilor de testare. Mai multe informaţii şi instrucţiuni legate de analiză asistată de calculator este disponibil la cerere de la MIKROGEN. Următoarele instrucţiuni se referă la analiza vizuală. 9.2.1 Evaluarea intensităţii benzii 1. Notati data şi numărul lotului, precum şi clasa de anticorpi detectat, pe formularul de

evaluare ataşat. 2. Introduceţi numerele de identificare probe în fişa de evaluare. 3. Lipiti acum banda de testare corespunzătoare pe câmpurile corespunzătoare de pe

formularul de evaluare folosind un stick de lipici. Aliniaţi banda de testare cu benzile de control de reacţie de-a lungul liniilor marcate. Apoi, utilizaţi o bandă adezivă transparentă pentru a ataşa banda de testare la stânga a liniilor marcate (nu aplicati banda transparenta pe banda de control a reacţiei!). Lipirea întregii benzi de testare cu ajutorul lipiciului sau benzii poate duce la modificări de culoare.

4. Acum identificati benzile dezvoltat pe banda de testare pe baza a benzii de control tipărită pe fişa de evaluare şi introduceţi acest lucru în fişa de evaluare. În acest scop, efectuati evaluarea intensitatii benzilor aparute pe baza de tabelul 1 separat pentru clasele immunglobulin corespunzătoare.

Tabelul 1: Evaluarea intensitatii benzii in relatie cu banda de prag [cut-off] Intensitatea de pata a benzilor Evaluare Nici o reacţie - Intensitate foarte scăzută (mai mică decât banda de cut-off) + / - Intensitate mica (echivalentul a benzii de cut off) + Intensitate puternica (mai puternic decât banda de cut off) + + Intensitate foarte puternica + + + 9.3 Interpretarea rezultatelor testelor Rezultatul testului se determină prin însumarea valorilor în puncte, în conformitate cu Tabelul 2, ale benzilor individuale reactive peste cut-off (respectiv, cu un grad minim de +). Suma rezultată este înscrisa în coloana cu simbolul Sigma (însumare). Evaluare pozitivă, necunoscut sau negativ a probei poate fi apoi determinată direct folosind tabelul 3 şi introdusa în coloana de evaluare a fişei de evaluare. Ce este de remarcat este faptul că valorile punctelor sunt calculate doar o singură dată pentru reacţia OspC şi benzile p18, indiferent de care şi cât de multe OspCs şi / sau p18 sunt.

Tabelul 2: Evaluare prin puncte a antigenilor Antigen Puncte IgG Puncte IgM p100 5 5 VIsE 5 5 p58 4 4 p41 1 1 p39 5 4 OspA 5 5 OspC 5 8 p18 5 5 Tabelul 3: Interpretarea testului Suma de puncte Evaluare IgG Evaluare IgM ≤ 5 negativ negativ 6 Neconcludent( de

granita ) Neconcludent( de granita )

≥ 7 pozitiv pozitiv 10. Limitări ale metodei – Restricţii • Rezultatele testelor serologice trebuie să fie întotdeauna interpretate în contextul tabloului clinic al pacientului. Consecinţele terapeutice ale rezultatelor serologice trebuie să fie întotdeauna luate în context cu datele clinice. • Un rezultat negativ pentru recomLine Borrelia nu se poate exclude o infectie cu Borrelia burgdorferi. În special, în faza timpurie a infecţiei, anticorpii pot sa nu fie prezenti sau sa fie prezenti în cantităţi nedetectabile. În stadiu incipient, un tratament cu antibiotice poate preveni dezvoltarea de anticorpi detectabili. Prelevarea de probe şi reluarea testarii ar trebui să se facă după trei săptămâni, atunci când există suspiciune clinică a bolii Lyme (Borelioza L.) şi constatare negativă şi / sau neconcludente privind serul. • Un rezultat pozitiv în recomLine Borrelia IgG şi / sau IgM nu se referă întotdeauna la prezenţa activă a bolii Lyme (Borelioza L.). Deoarece anticorpii IgG şi unii anticorpi IgM persista mai mult, poate fi dovedita prezenţa de anticorpi din infecţii anterioare. • Detectarea anticorpilor formati intratecal se va face la suspiciunea clinică de neuroborrelioza. În acest scop, este necesar de a testa LCR / ser perechi simultan într-un test de cuantificabil (de exemplu, recomwell Borrelia). Corespunzător diagnosticarii uzuale in 2-pasi a serului, pragul şi / sau rezultatele pozitive pot fi ulterior garantate cu recomLine Borrelia. Instrucţiunile de la MIKROGEN pot fi legate de aceste teste de diagnosticare (diagnosticele de Borrelia burgdorferi CSF/LCR). Un program Excel poate fi solicitat de la Mikrogen pentru facilitarea calculelor pentru diagnosticare CSF (conform Reiber) (s. 8.1). • O reacţie cu OspC este foarte caracteristica pentru un raspuns imunitar precoce (IgM). O reacţie puternică cu următoarele benzi apare mai ales in seruri din etape ulterioare ale infectiei (IgG): p100, VIsE, p58, p18 şi p39. Dimpotrivă, anticorpi anti- OSPA, sunt mai rar

intalniti. VIsE este un marker foarte timpuriu de raspuns IgG, dar, de asemenea, insoteste frecvent răspunsul imun la manifestare tardivă a infecţiei, şi apare pe langa p100 şi / sau p18. • Prin utilizarea selectivă a antigenilor recombinanti Borrelia burgdorferi, o reacţie încrucişată cu anticorpi, care sunt induse de infectia cu agenţi patogeni de sifilis (Treponema pallidum), febră recurentă (Borrelia recurrentis, Borrelia duttonii, Borrelia hermsii) sau leptospiroza (Leptospira sp.) sunt excluse în mare măsură. Într-o infecţie activă de sifilis şi / sau o cicatrice ser sifilis, s-au constatat activităţi izolate de anticorpi împotriva antigenului p41. O infectie sifilis ar trebui să fie exclusa pentru serologie Borrelia neclara. • O stimulare policlonala a limfocitelor B poate să apară în prezenţa unei mononucleoze infectioase (febra glandei lui Pfeiffer, infectie EBV). Acest lucru poate duce la reacţii nespecifice în timpul de detectare a anticorpilor de clasă IgM. În cazul în care istoricul medical este neclar şi în prezenţa unui răspuns IgM bun, este recomandat sa se excluda o infectie EBV prin diagnostic diferenţial. • Benzi intunecate de testare: Unele probe de pacient pot produce o colorare întunecată, uniforme sau model în întreaga bandă de nitroceluloză. Diversi factori din fiecare ser de pacient sunt responsabili pentru acest lucru. Evaluarea acestor benzi este de obicei doar parţial posibila. Astfel, benzile "inversă" (benzi albe pe fundal negru), de exemplu, ar trebui să fie evaluate ca fiind negative. Serul respectiv ar trebui să fie întotdeauna examinat prin alte metode serologice. 11. Performanţa testului 11.1 Sensibilitatea diagnosticului Număr IgG pozitiv IgM pozitiv IgG / IgM

pozitiv Artrita Lyme 28 27 (96%) 6 (21%) 27 (96%) ACA * 11 11 (100%) 1 (9%) 11 (100%) Neuroborrelioza 35 29 (83%) 18 (51%) 33 (94%) Eritemul Migrans 42 18 (43%) 30 (71%) 33 (79%) * Acrodermatita Chronica atrophicans 11.2 Specificitatea diagnosticului

Două teste de comparaţie negativ recomLine Borrelia IgG IgM Negativ 171 169 Neconcludent 0 0 Pozitiv 0 0 Specificitate 100% 100% 11.3 Rată de detectare Număr IgG pozitiv IgM pozitiv IgG / IgM

pozitiv Ser de la donatori de sange*

200 21 (10,5%) 5 (2,5%) 25 (12,5%)

* Din regiunea din sudul Germaniei 11.4 Specificitate analitică Specificitatea analitică este definită ca fiind capacitatea testului de a determina exact analitii în prezenţa unor factori de interferenţă potenţiali în matricea probei sau reacţii încrucişate cu anticorpi cu potenţial de interferenţă. a) Interferenţe: Studii de control asupra factorilor cu potenţial de interferenţă au arătat că performanţa de testare nu este influenţată de anticoagulante (citrat, EDTA, heparina, DPC), hemoliză sau lipaemia a probei. Au avut loc rezultate fals pozitive cu seruri icterice. b) Reacţii încrucişate:. În studiile de control sunt examinate interferenţele potenţiale ale anticorpilor împotriva altor organisme (Treponema SP). În plus, sunt testate condiţiile care pot fi atribuite unei activitati atipice a sistemului imunitar (anticorpi antinucleari autoimuni, factor reumatoid, sarcina, infectie EBV, infecţia cu CMV). Nu s-au evidentiat reacţii încrucişate. Instrucţiuni de utilizare în alte limbi pe site-ul nostru www. mikrogen.de