UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

FACULTATEA DE FIZICA

STUDIUL PROPRIETATILOR OPTICE ALE POLUANTILOR MEDIULUI

TEZA DE DOCTORAT

Doctorand: Adriana-Loredana SMARANDACHE

Conducator Stiintific: Prof. Dr. Mihail-Lucian PASCU

BUCUREŞTI 2011

2

CUVANT INAINTE

Doresc, in primul rand sa multumesc domnului Profesor Doctor Mihail-Lucian

Pascu, ale carui indrumari au constituit elemente foarte pretioase in elaborarea acestei

lucrari si, in general pe parcursul intregii mele activitati stiintifice.

De asemenea, le datorez recunostinta mea tuturor colegilor din grupul de

Spectroscopie Laser al Institutului National de Cecetare-Dezvoltare pentru Fizica

Laserilor, Plasmei si Radiatiei pentru discutiile constructive, pentru incurajarea si

sustinerea de care am beneficiat. Apreciez in mod deosebit suportul stiintific si moral

oferit de catre domnisoara Dr. Angela Staicu, precum si sprijinul si bunavointa

domnilor Alexandru Pascu si Ionut Andrei. Le multumesc domnisoarei Andra Militaru

si domnilor Viorel Nastasa si Mihai Boni pentru colaborarea in cadrul unora dintre

sesiunile experimentale. Totodata, tin sa ii asigur de recunostinta mea pe doamna

Rodica Marin si domnul Mihai Cojocaru pentru incurajarile si voia buna emanata.

Nu in ultimul rand, doresc sa aduc multumiri familiei, fara de a carei sustinere

nu as fi reusit in activitatea mea.

Adriana Loredana Smarandache

3

CUPRINS

INTRODUCERE 5 Referinte bibliografice 8 1. PROPRIETATI SPECTRALE ALE POLUANTILOR MEDIULUI 1.1. Introducere 9 1.2. Surse de poluare a mediului 10 1.3. Proprietati optice ale poluantilor mediului 19 1.4. Efectele poluarii asupra biosferei 27 1.5. Referinte bibliografice 28 2. METODE SI TEHNICI OPTICE SI CONEXE DE MASURARE A POLUANTILOR

MEDIULUI

2.1. Introducere 32 2.2. Spectroscopia de absorbtie in UV/VIZ 33 2.3. Spectroscopia in Infrarosu cu Transformata Fourier (FTIR) 35 2.4. Fluorescenta Indusa cu Laser (LIF) 38 2.5. Spectroscopia Raman 40 2.6. Spectroscopia de Rezonanta Magnetica Nucleara (RMN) 43 2.7. Metode cromatografice de analiza 46 2.8. Referinte bibliografice 48 3. STUDIUL PROPRIETATILOR SPECTRALE ALE FENOTIAZINELOR 3.1. Introducere 50 3.2. Proprietatile fizice, chimice si farmacologice ale fenotiazinei si derivatilor de fenotiazina 51 3.3. Materiale si metode 54 3.4. Stabilitatea in timp a proprietatilor optice ale Tioridazinei 57 3.5. Comportarea Tioridazinei sub influenta radiatiei laser 64 3.6. Studii de RMN ale formatiunilor moleculare obtinute in urma expunerii la radiatie laser a

solutiilor de Tioridazina 66

3.7. Studii prin HPLC-MS ale formatiunilor moleculare obtinute in urma expunerii la radiatie laser a solutiilor de Tioridazina

68

3.8. Concluzii 72 3.9. Referinte bibliografice 73 4. STUDIUL PROPRIETATILOR SPECTRALE ALE DERIVATULUI QUINAZOLINIC

BG1188

4.1. Introducere 77 4.2. Caracterizarea substantei chimice si a solutiilor supuse studiului 77 4.3. Comportarea in timp a proprietatilor optice ale solutiilor de BG1188 78 4.4. Comportarea BG1188 sub influenta radiatiei laser 82 4.5. Studii de RMN ale formatiunilor moleculare obtinute in urma expunerii la radiatie laser a

solutiilor de BG1188 83

4.6. Studii de HPLC-MS ale formatiunilor moleculare obtinute in urma expunerii la radiatie laser a solutiilor de BG1188

86

4.7. Concluzii 88 4.8. Referinte bibliografice 88 5. STUDIUL PROPRIETATILOR SPECTRALE ALE UNOR SOLUTII DE ANTIBIOTICE 5.1. Introducere 90 5.2. Proprietatile fizice, chimice si farmacologice ale Doxorubicinei si Vancomicinei 91 5.3. Proprietati optice ale medicamentelor selectate 94 5.4. Comportarea solutiilor de antibiotice sub influenta radiatiei laser 97 5.5. Studii RMN si HPLC-MS ale formatiunilor moleculare obtinute in urma expunerii la radiatie

laser a solutiilor de antibiotice 99

5.6. Concluzii 103 5.7. Referinte bibliografice 104

4

6. STUDIUL PROPRIETATILOR OPTICE ALE AETHOXYSKLEROLULUI 6.1. Introducere 106 6.2. Proprietati fizice, chimice si farmacologice ale Aethoxysklerolului 107 6.3. Comportarea la interactia cu radiatia laser 112 6.4. Discutii si concluzii 118 6.5. Referinte bibliografice 120 7. CONCLUZII GENERALE 123 7.1. Contributii originale 124 Anexa 1. LISTA LUCRARILOR PUBLICATE Anexa 2. COPII ALE LUCRARILOR PUBLICATE IN REVISTE DE SPECIALITATE

INDEXATE ISI

5

INTRODUCERE Mediul inconjurator este constituit din totalitatea factorilor naturali si a celor creati prin activitati umane care, in stransa interactiune, influenteaza echilibrul ecologic, determinand conditiile de viata pentru om si de dezvoltare pentru societatea umana. Monitorizarea factorilor de mediu si, respectiv, a gradului de poluare a acestora precum si gasirea unor tehnologii avansate de depoluare constituie interese majore ale momentului actual, in concordanta cu preocuparile la nivel national si international de asigurare a unei dezvoltari durabile si de incadrare in standardele de calitate a mediului prevazute de legislatia in vigoare.

Poluant este socotit orice factor natural sau produs de om, care provoaca disconfort sau are acţiune toxica asupra organismelor si/sau degradeaza componentele abiotice ale mediului, producand dezechilibre ecologice. In decursul ultimilor 50 de ani efortul intelegerii proceselor de aparitie, comportare, disparitie, precum si efectele asupra factorilor de mediu ale substantelor chimice de provenienta antropogena s-au axat in special pe compusii industriali si cei din agricultura. Modul de a pune accentul pe aceasta directie era potrivit, tinand cont de productia acestor substante pe scara larga, utilizarea lor concentrata, raspandirea la un nivel ridicat in mediu, persistenta si efectele toxice acute sau cancerigene ale compusilor de acest tip.

Recent (in ultima decada) substantele chimice reprezentand ingredientele active in produsele farmaceutice au iesit in evidenta ca si contaminanti ai mediului ce prezinta pericol potential raspandit, captand atentia autoritatilor si a comunitatii stiintifice. Prin contrast cu poluantii obisnuiti (NOx, SOx, pesticide, hidrocarburi policiclice aromatice, petrol si produse petroliere etc.) care au adesea timp de injumatatire mare, continua introducere a produselor farmaceutice in mediu le poate situa pe acestea drept substante pseudo-persistente [0.1]. Compusii activi farmaceutic sunt destinati sa aiba efecte farmacologice si fiziologice la doze mici. Ei pot suferi diferite reactii chimice, fotolitice si biologice care sa le modifice structura si transportul in mediu. Reziduurile farmaceutice si/sau metabolitii lor sunt, de regula, detectati in mediu la nivel de urme (de la cateva zeci de ng/ℓ pana la sute de μg/ℓ), dar, chiar si asa, aceste nivele scazute de concentratie pot induce efecte toxice. Aparitia frecventa a acestor medicamente cumulate in factorii de mediu pot induce o adversitate ireversibila prin afectarea directa a ecosistemului, crescand rezistenta bacteriilor la medicamente si raspandind genele rezistente la tratamente [0.2-0.6].

Exista studii care demonstreaza ca produsele de natura farmaceutica nu sunt eliminate complet in cursul proceselor de tratare a deseurilor si nu sunt biodegradate in mediu [0.7-0.13]. Selectia tehnologiilor de tratare a deseurilor depinde de poluantul tinta, de natura sursei deseurilor si de intentiile de folosire ulterioara a acestora. In cele mai multe cazuri este necesara o combinatie a secventelor de tratare in cazul procesului de epurare ce implica poluanti de natura farmaceutica.

Studierea proprietatilor optice (absorbtie a radiatiei luminoase, emisie de fluorescenta si fosforescenta, imprastiere a luminii) ale compusilor ce alcatuiesc prezentarea farmaceutica a medicamentelor constituie o veriga foarte importanta in procesul de monitorizare a calitatii aerului, apei, solului si biosferei datorita tendintei ascendente actuale pe care o prezinta metodele optice de detectie. De asemenea, data

6

fiind capacitatea de fotodegradare a acestor compusi, expunerea fluxului de deseuri la radiatie optica emisa de surse conventionale sau laser poate constitui un subiect ce merita a fi aprofundat. In acest context, termenul de fotostabilitate a produselor de natura farmaceutica serveste la studierea comportarii acestor substante in urma expunerii la radiatie optica fie naturala, fie emisa de diferite surse de lumina. Aceasta comportare se refera nu numai la degradarea produsului, dar si la alte procese care pot avea loc, cum ar fi formarea de radicali, transfer de energie, emisie optica, etc. [0.14].

Aceasta lucrare este structurata in 7 capitole de-a lungul carora mi-am propus sa studiez proprietatile optice ale unor medicamente selectate din mai multe domenii terapeutice, precum si modul in care se comporta acestea la interactia cu lumina, atat cea naturala, cat si cea provenita din surse artificiale, in special sub actiunea fasciculelor laser. Scopul final este acela de a demonstra ca expunerea solutiilor de medicamente la diferite doze de iradiere poate constitui un mijloc de indepartare a acestora din solutie, fie prin degradarea lor completa, fie prin inducerea de modificari ale structurii moleculare, care sa genereze subprodusi mai putin toxici pentru ecosistem.

Primul capitol face o sinteza a surselor din care provin elementele ce se constituie in factori poluanti ai mediului, accentul fiind pus pe poluantii de natura farmaceutica, precum si proprietatile optice ale acestora (absorbtie, emisie, imprastiere a luminii). De asemenea, sunt discutate efectele evacuarii in mediu a deseurilor continand urme de astfel de substante asupra biosferei.

Cel de-al doilea capitol cuprinde o trecere in revista a metodelor si tehnicilor optice de monitorizare a poluantilor mediului. De asemenea sunt prezentate o serie de metode analitice conexe care pot oferi date suplimentare necesare unei analize avansate a proceselor implicate. Accentul este pus pe tehnicile folosite de noi in aplicatiile practice descrise in capitolele urmatoare. Astfel, sunt prezentate cateva metode spectroscopice de analiza si calibrare de laborator a poluantilor mediului, cum sunt cele care folosesc proprietatile de absorbtie, emisie si imprastiere a luminii: Spectrofotometria de absorbtie, Spectrofotometria in IR cu Transformata Fourier - FTIR, Fluorescenta Indusa cu Laser – LIF, Spectroscopia Raman si cea de Rezonanta Magnetica Nucleara – RMN. De asemenea este prezentata si tehnica analitica de Cromatografie in faza Lichida cuplata cu Spectroscopia de Masa (HPLC-MS), care poate oferi informatii precise privind existenta unor anume substante aflate intr-un amestec complex.

Urmatoarele capitole cuprind rezultatele originale obtinute in urma experimentelor efectuate in laboratorul de Spectroscopie Laser al Institutului National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica Laserilor, Plasmei si Radiatiei, precum si intr-un stagiu de cercetare COST efectuat la Facultatea de Farmacie a Universitatii din Ankara, Turcia. Am selectat cateva medicamente din diferite domenii terapeutice, dupa cum urmeaza:

a) Tioridazina, care este un medicament antipsihotic derivat de fenotiazina apartinand grupei piperidinelor;

b) Derivatul chinazolinic sub denumirea generica de BG1188, a fost sintetizat si pus la dispozitie spre analiza de catre Facultatea de Medicina si Farmacie de la Universitatea Mediteraneana din Marsilia, Franta. Studiile initiale indica proprietati farmacologice specifice ale acestui compus si anume: diuretic, antihipertensiv, antitumoral, antialergic, antifungic si anti-infectios;

c) Doxorubicina, care este un antibiotic antraciclinic citostatic; d) Vancomicina, antibiotic glicopeptidic triciclic;

7

e) Aethoxysklerol sau Polidocanol, eterul polietilen glicol al alcoolului Lauryl, care este un agent sclerozant folosit in scleroterapia venelor varicoase.

Astfel, este foarte important sa se stabileasca si sa se promoveze metode analitice sensibile si selective, precum si procedee de detectare, identificare, determinare si eliminare a poluantilor de provenienta farmaceutica. Unele dintre cele mai sensibile astfel de metode se bazeaza pe studierea proprietatilor optice ale acestor substante.

Capitolul al treilea prezinta un studiu al proprietatilor spectrale ale fenotiazinelor, axandu-se in special pe caracterizarea unuia dintre derivatii de fenotiazina si anume Tioridazina. Astfel, dupa o analiza a proprietatilor fizice, chimice si farmacologice ale fenotiazinei si ale derivatilor sai, lucrarea prezinta un studiu al stabilitatii in timp a proprietatilor optice ale solutiilor de Tioridazina in apa ultra pura si comportarea acestora in urma expunerii la radiatie laser. De asemenea, acest capitol include o analiza a spectrelor RMN si HPLC-MS ale Tioridazinei si aprecieri asupra procesului de fotodegradare suferit de acest medicament.

Cel de-al patrulea capitol al tezei ia in discutie o alta categorie de medicamente si anume derivatul chinazolinic denumit generic BG1188, pentru care se face o analiza spectrala a solutiilor continand acest medicament, precum si studiul stabilitatii in timp a proprietatilor optice. Solutii ce contin BG1188 la diferite concentratii in apa ultra pura sunt expuse la radiatie laser, fiind discutate si procesele moleculare ce intervin in urma iradierii. De asemenea, sunt analizate spectrele RMN si HPLC-MS si sunt trase concluzii privind comportarea medicamentului in urma iradierii cu fascicul de lumina coerenta.

Investigarea proprietatilor spectrale ale unor antibiotice aflate in solutie apoasa este prezentata in capitolul cinci. Dupa analiza proprietatilor fizice, chimice si farmacologice ale fiecaruia dintre cele doua medicamente este realizat un studiu al proprietatilor de absorbtie si emisie optica ale acestora inainte si dupa iradierea cu fascicule laser emise la diferite lungimi de unda. Examinarea comportarii solutiilor de Doxorubicina si Vancomicina in urma expunererii la radiatie laser este urmata de studiul spectrelor RMN si HPLC-MS ale acestor antibiotice in stare initiala si dupa procesul de iradiere laser.

Urmatorul capitol (al saselea) este destinat studiului optic al unui reprezentant al clasei agentilor sclerozanti, pentru care reprezentativ este fenomenul de imprastiere a radiatiei luminoase. Dat fiind faptul ca acest medicament prezinta capacitati de spumare, el fiind un co-surfactant, autoarea face o comparatie a spectrelor Raman obtinute in probe de solutie si, respectiv, spuma de Polidocanol.

Fiecare capitol contine referintele bibliografice necesare realizarii unei documentari cat mai precise si formularii unor opinii pertinente in ceea ce priveste studierea medicamentelor luate in discutie prin prisma considerarii lor ca potentiali factori perturbatori ai mediului.

Concluziile in urma studiilor efectuate sunt sistematizate in capitolul al saptelea, aici fiind inclusa si o sinteza a contributiilor originale aduse de catre autoare in ceea ce priveste studierea proprietatilor optice ale poluantilor de natura farmaceutica ai mediului.

Teza mai contine doua anexe care cuprind: - Anexa 1, sintetizeaza rezultatele obtinute in urma aplicatiilor practice discutate

in aceasta lucrare sub forma articolelor publicate si a prezentarilor atat sub forma orala, cat si poster in cadrul unor manifestari stiintifice;

- Anexa 2, prezinta in copie lucrarile publicate in reviste ISI cu factor de impact atribuit.

8

REFERINTE BIBLIOGRAFICE: [0.1] Barcelo, D.; Petrovic, M. (Ed.). The Handbook of Environmental Chemistry, Vol.5/S1.

Emerging Contaminants from Industrial and Municipal Waste. Occurrence, Analysis and Effects, Springer-Verlag, Berlin, Germania, 2008;

[0.2] Mompelat, S.; Le Bot, B.; Thomas, O. Occurrence and fate of pharmaceutical products and by-products, from resource to drinking water. Environment International, Vol. 35, pag. 803–814, 2009;

[0.3] Xia, K.; Bhandari, A.; Das, K.; Pillar, G. Occurrence and Fate of Pharmaceuticals and Personal Care Products (PPCPs) in Biosolids. J. Environ. Qual. Vol. 34, pag. 91–104, 2005;

[0.4] Lishman, L; Smyth, S.A.; Sarafin, K.; Kleywegt, S.; Toito, J.; Peart, T.; Lee, B.; Servos, M.; Beland, M.; Seto, P. Occurrence and reductions of pharmaceuticals and personal care products and estrogens by municipal wastewater treatment plants in Ontario, Canada. Science of the Total Environment, Vol.367, pag. 544–558, 2006;

[0.5] Huerta-Fontela, M.; Galceran, M.T.; Ventura, F. Occurrence and removal of pharmaceuticals and hormones through drinking water treatment. Water Research, Vol. 45, pag. 1432-1442, 2011;

[0.6] Karnjanapiboonwong, A.; Suski, J.G.; Shah, A.A.; Cai, Q.; Morse, A.N.; Anderson, T.A. Occurrence of PPCPs at a Wastewater Treatment Plant and in Soil and Groundwater at a Land Application Site. Water Air Soil Pollut, Vol.216, pag. 257–273, 2011;

[0.7] Stackelber, P.E.; Furlong, E.T.; Meyer, M.T.; Zaugg, S.D.; Henderson, A.K.; Reissman, D.B. Persistence of pharmaceutical compounds and other organic wastewater contaminants in a conventional drinking-watertreatment plant. Science of the Total Environment, Vol. 329, pag. 99–113, 2009;

[0.8] Gibs, J.; Stackelberg, P.E.; Furlong, E.T.; Meyer, M.; Zaugg, S.D.; Lippincott, R.L. Persistence of pharmaceuticals and other organic compounds in chlorinated drinking water as a function of time. Science of the Total Environment, Vol. 373, pag. 240–249, 2007;

[0.9] Ellis, J.B. Pharmaceutical and personal care products (PPCPs) in urban receiving waters. Environmental Pollution, Vol.144, pag. 184-189, 2006;

[0.10] Jones, O.A.; Lester, J.N.; Voulvoulis, N. Pharmaceuticals: a threat to drinking water? TRENDS in Biotechnology, Vol.23, Nr.4, pag. 163-167, 2005;

[0.11] Larsen, T.A.; Lienert, J. Joss, A.; Siegrist, H. How to avoid pharmaceuticals in the aquatic environment. Journal of Biotechnology, Vol.113, pag. 295–304, 2004;

[0.12] Kummerer, K. Antibiotics in the aquatic environment – A review – Part I. Chemosphere, Vol.75, pag. 417–434, 2009;

[0.13] Kummerer, K. Antibiotics in the aquatic environment – A review – Part II. Chemosphere, Vol.75, pag. 435–441, 2009;

[0.14] Albini, A.; Fasani, E. Photochemistry of Drugs: An Overview and Practical Problems. Publicat pe 01 Ianuarie1998 si disponibil la http://pubs.rsc.org.

9

CAPITOLUL 1

PROPRIETATI SPECTRALE ALE POLUANTILOR MEDIULUI

1.1. INTRODUCERE Pentru a trai in conditii cat mai bune, omul a utilizat permanent resursele

naturale. Din folosirea acestor resurse primare au rezultat si produse neutilizabile, cum sunt: gaze, prafuri, produse lichide, solide, ce au fost permanent evacuate in natura. Unele dintre aceste produse au putut sa se integreze in ciclurile naturale ale unor elemente sau substante, altele insa se tot acumuleaza, producand perturbatii ecologice.

Activitatile antropice au provocat schimbari topografice si de clima, ce au avut puternice repercusiuni asupra mediului, unele pozitive (impaduriri, indiguiri), altele insa negative (eliberarea unor produsi nocivi in mediu, defrisari, asanari, eroziunea solului etc).

Cauzele aparitiei poluarii pot fi sintetizate astfel: utilizarea haotica a rezervelor naturale; acumulari in mediu de substante neutilizabile; aparitia de substante noi, la care ritmul de consum si reciclare de catre organisme este mult inferior ritmului de aparitie; cresterea demografica vertiginoasa, in special in ultimele doua secole; dezvoltarea intensa a industriei, transporturilor si agriculturii; aparitia centrelor urbane suprapopulate.

Se poate realiza o clasificare a tipurilor de poluare, tinand cont de urmatoarele aspecte: 1.Dupa provenienta: Poluare naturala: biologica, fizico-chimica si menajera. Poluare antropica: industriala, agricola si din transporturi. 2. Dupa natura poluantilor: Poluare fizica: termica, fonica (sonora), radioactiva, electromagnetica (in particular luminoasa). Poluare chimica, cu: carbon si derivatii lui; compusi de sulf, azot etc.; compusi de metale grele; compusi de fluor; materiale plastice; pesticide; materii organice fermentabile; produse farmaceutice etc. Poluare biologica prin: contaminarea mediilor inhalate si ingerate; modificari ale biocenozelor si invazii de specii animale si vegetale (de exemplu insecte nedorite, buruieni etc.). Poluare estetica: degradarea peisajelor din cauza urbanizarii; sistematizarea eronat conceputa; industrializare etc. 3. Dupa starea fizica a poluantului: poluare cu gaze si pulberi in suspensie; poluare cu lichide; poluare cu substante solide.

Acest capitol isi propune sa faca o trecere in revista a principalilor factori de risc pentru mediu, tinand cont de provenienta lor. Astfel, sunt prezentati principalii poluanti de origine naturala si cei creati prin activitatile umane.

Rezultatele acestei lucrari se axeaza pe analiza proprietatilor optice ale unei anumite categorii de poluanti antropici de natura chimica si anume produsele farmaceutice. De aceea, aceasta clasa de impurificatori, care de cativa ani este recunoscuta ca prezentand grad de risc ridicat este supusa unei discutii mai amanuntite.

10

Studierea proprietatilor optice (absorbtie a radiatiei luminoase, emisie de fluorescenta si fosforescenta, imprastierea luminii) ale elementelor si substantelor care se constituie in poluanti ai factorilor de mediu constituie o veriga foarte importanta in procesul de monitorizare a calitatii aerului, apei, solului si biosferei datorita tendintei actuale ascendente pe care o prezinta metodele optice de detectie. De aceea, pe langa prezentarea surselor de introducere in mediu, in acest prim capitol sunt analizate si proprietatile optice ale compusilor ce se constituie in poluanti ai naturii inconjuratoare, precum si efectele pe care introducerea, transportul si degradarea acestora le poate avea asupra biosferei. 1.2. SURSE DE POLUARE A MEDIULUI

1.2.1. POLUANTI DE ORIGINE NATURALA

a) Pulberile reprezinta termenul generic utilizat pentru un tip de poluanti ai aerului, care constau intr-un amestec variabil complex de particule suspendate in aerul respirabil si care variaza ca dimensiune si compozitie. Acestea provin dintr-o gama larga de activitati naturale si antropice.

Surse naturale majore de poluare cu pulberi sunt furtunile de praf si incendiile naturale. Marimea particulelor variaza (P2,5 si P10 pentru particule cu diametrul aerodinamic mai mic de 2,5 μm, respectiv 10 μm) si au fost definite urmatoarele categorii: particule ultrafine, cu diametrul mai mic de 0,1 μm, particule fine, cu diametrul cuprins intre (0,1 ÷ 1) μm si particule grosiere, cu diametrul mai mare de 1 μm. Dimensiunile particulelor determina locul din tractul respirator in care vor fi depozitate: P10 vor fi depozitate in special in tractul respirator superior, in timp ce particulele fine si ultrafine ajung in alveolele pulmonare.

Printre parametrii care joaca un rol important in provocarea unor efecte asupra sanatatii se afla marimea si suprafata particulelor, precum si numarul si compozitia lor.

Compozitia pulberilor difera tinand cont ca acestea pot adsorbi si transporta o multitudine de poluanti. In orice caz, sunt in principiu metale, compusi organici, material biologic, ioni, gaze reactive si particule cu miez de carbon.

In mod evident, particulele fine si ultrafine sunt mai periculoase decat cele grosiere in ceea ce priveste efectele respiratorii, cardiovasculare si mortalitatea. In plus, continutul in metale, prezenta hidrocarburilor aromatice persistente si a altor compusi organici, cum sunt endotoxinele, contribuie substantial la toxicitatea pulberilor.

Cea mai comuna dintre poluarile naturale este aceea cu pulberi provenite din erodarea straturilor superficiale ale solului ridicate de vant pana la o anumita altitudine. In anumite conditii meteorologice s-au semnalat transporturi masive de praf pana la distante apreciabile fata de locul de producere, gradul de poluare fiind puternic influentat de viteza si directia vantului, precum si de mineralogia zonei.

Fierul este un component major al prafului atmosferic, influentand capacitatea de absorbtie a luminii de catre particulele minerale si un important micronutrient care afecteaza biogeochimia apelor. Distributia regionala a concentratiei de fier in norii de praf este foarte importanta in studiile climatice. Este insa dificil de stabilit aceasta distributie deoarece necesita probe in-situ sau simulari ale proceselor naturale, care sunt foarte complexe. Studii simultane privind compozitia chimica si masuratori ale proprietatilor optice ale aerosolilor, care au fost efectuate pe parcursul a cca. 10 ani (octombrie 1995 – mai 2006) in desertul Negev (Israel) sugereaza existenta unei relatii intre compozitia chimica si proprietatile de absorbtie a radiatiei, in special in ceea ce priveste coeficientul de imprastiere spectrala (SSA sau ω0) [1.1].

11

Praful eolian transportat poate interactiona cu aerosolii antropici, care contin noxe rezultate in urma arderii combustibililor in industrie sau in motoarele cu ardere interna, precum si produsi rezultati in urma arderii biomasei. Astfel de aerosoli contin carbon, care este un puternic absorbant al radiatiei, ceea ce contribuie la cresterea efectului de sera [1.2, 1.3]. Dubovik s. a. (2002) au aratat ca absorbtia spectrala a aerosolilor poluanti este diferita de cea a prafului mineral [1.4, 1.5]. Proprietatile de absorbtie ale carbonului depind de originea materialului si conditiile de combustie [1.6, 1.7]. Particulele de funingine puternic absorbante sunt denumite carbon negru (BC) si se caracterizeaza printr-o absorbtie deplasata spre lungimi de unda mai mari, proportionala cu 1/λ (unde λ este lungimea de unda de absorbtie) [1.8]. In plus, arderea materiei organice, cum ar fi biomasa, poate produce particule ce contin compusi organici mai putin absorbanti. Aceste particule au o absorbtie relativ puternica in spectrul UV si sunt cunoscuti sub denumirea de carbon brun. Acest tip de poluant are o relevanta crescuta in regiunile putin industrializate si in cazul in care absorbtia luminii nu este realizata in mod dominant de BC [1.6]. Evaluarea gradului de poluare cu Fe sau BC in atmosfera se poate realiza fie prin samplinguri in-situ (ceea ce necesita un efort considerabil si poate fi chiar imposibil sa se obtina rezultate satisfacatoare in timp si spatiu), fie prin simularea modelului de transport. Insa cea mai eficienta cale de monitorizare o reprezinta modelarea proprietatilor optice ale aerosolilor [1.9] ca dependenta intre caracteristicile optice masurabile ale aerosolilor si concentratia elementelor chimice pe care le contin. Modelarea indicelui de refractie, a coeficientilor de absorbtie si imprastiere a aerosolilor a fost recent imbunatatita [1.10] prin studierea unor amestecuri de praf atmosferic ce contin o serie de minerale cheie, incluzand hematita si goethitul (numit si „mineral acicular de fier”), care se gasesc cu precadere in soluri si aerosoli.

b) O alta sursa naturala de poluare o reprezinta eruptiile vulcanice care elibereaza in atmosfera fragmente de roca si particule fine (cenusa) si o serie de gaze cum sunt: CO2, SO2, HCl, HF, H2S etc. De regula fragmentele de roca revin rapid pe suprafata solului. Cenusa si gazele se pot ridica pana in troposfera si chiar pana in straturile joase ale stratosferei (15 - 20 Km) in functie de puterea de eruptie a vulcanului [1.11]. Intr-un studiu efectuat in anul 2004 de un grup de cercetatori de la Universitatea Cambridge asupra compozitiei chimice a particulelor prezente in cenusa rezultata in urma eruptiei a trei vulcani diferiti situati in nordul Siciliei s-a constatat existenta urmatoarelor specii de ioni: SO42-, Cl-, F-, NO3-, H+, K+, Na+, NH4+, Ca2+ si Mg2+, avand diametre cuprinse intre 0,069 si 25,5 μm.

Monitorizarea gazelor vulcanice serveste ca indicator al activitatii vulcanului, ca metoda de diagnostic al proceselor din interiorul acestuia si, de asemenea, pentru cuantificarea emisiilor de gaze si a influentei lor in atmosfera [1.12].

Dupa cum se cunoaste, aerosolii sulfurosi au un impact major asupra climatului. Scaderea temperaturii suprafetei Pamantului, care survine in urma unei eruptii vulcanice majore este proportionala cu procentul de sulf degajat in atmosfera [1.13]. Remanenta compusilor sulfurosi in stratosfera este de circa un an. Speciile de sulf emise reactioneaza cu H2O si radicalii OH- formand H2SO4 in aproximativ o zi, produs ce este responsabil de efectul radiativ dominant al eruptiilor vulcanice.

Una dintre marile probleme ale cercetarilor in acest domeniu o constituie accesibilitatea foarte anevoioasa si periculoasa in centrul vulcanului. Astfel, metodele optice de la distanta in UV si IR ofera mari avantaje.

Masuratorile FTIR au fost utilizate pentru prima data in monitorizarea emisiilor vulcanice in 1991, obtinandu-se date privind prezenta in gazele vulcanice a SO2, HCl,

12

CO, CO2, SiF4 si HF [1.14 - 1.16]. Experimentele au fost realizate utilizand surse artificiale de lumina sau direct radiatia solara.

O alta metoda ce prezinta reale avantaje este spectroscopia UV, in particular tehnica DOAS (Spectroscopia de Absorbtie Optica Diferentiala) [1.17], care ofera posibilitatea de detectie a urmelor de gaze – chiar molecule specifice, nu doar elemente – cum ar fi SO2, BrO, NO2, HCHO. Recent tehnica a fost imbunatatita prin combinarea unui mic spectrometru de imagine cu sistemul de scanare si analiza spectrala a DOAS rezultand o noua metoda denumita IDOAS (Imaging DOAS) [1.18].

c) Incendiile din perioadele secetoase reprezinta o alta categorie a surselor naturale de poluare cu impact asupra calitatii aerului si a bugetului radiativ regional.

Concentratii mari de gaze care includ CO, NOx, SO2, O3 sunt tipic asociate cu procesele de combustie a biomasei.

O3 este produs fotochimic in prezenta NOx, a hidrocarburilor nonmetan si CO. Temperatura de combustie nu este suficient de ridicata pentru a fixa azotul in atmosfera, astfel incat azotul reactiv generat in urma arderii biomasei rezulta mai degraba din continutul de azot al speciilor arse. Multe dintre specii contin sulf, dar se observa o concentratie scazuta de SO2 in pana de fum.

Particulele generate de arderea vegetatiei sunt dominate de carbonul organic (OC) si carbonul negru (BC), ceea ce determina o reducere a fluxului radiativ prin absorbtia si imprastierea radiatiei solare [1.19].

In cazul particulelor de SO2 predominanta este imprastierea radiatiei solare, efectul fiind acela de racire atat a atmosferei, cat si a suprafetei terestre. Gradul de absorbtivitate a particulelor de carbon prezente in fum depinde de materialul combustibil (in functie de regiune si tipul vegetatiei), varsta particulelor si faza de ardere (flacara sau ardere mocnita). Transformarile fizice si chimice apar, de regula, pe directia vantului predominant. In pana de fum coagularea particulelor, conversia gaz-particula, reactiile heterogene si procesele noroase influenteaza concentratia gazelor si proprietatile optice ale particulelor. Astfel, sunt necesare masuratori in-situ in apropierea sursei si in directia vantului, care sa permita stabilirea unor algoritmi necesari validarii simularilor numerice.

Particulele prezente in fum devin mai putin absorbante odata cu varsta lor. Intr-o pana densa de fum, mici variatii ale coeficientului de imprastiere spectrala (ω0) pot avea un impact considerabil asupra bugetului radiativ. Balanta energetica a sistemului suprafata-atmosfera este astfel alterata de gradul de imprastiere si absorbtie. Aerosolii puternic absorbanti conduc la incalzirea atmosferei si racirea suprafetei, generand o mai mare stabilitate la nivele joase ale atmosferei, cu impact asupra ciclului hidrologic. Aceasta afecteaza mixajul pe verticala al aerosolilor si mecanismele potentiale de indepartare a acestora [1.20].

1.2.2. SURSE ANTROPICE DE POLUARE

Poluarea antropica provine din diverse activitati umane desfasurate in industrie, transporturi, agricultura, activitati menajere, activitati militare.

a) Transporturile auto, navale, feroviare si aeriene emit o serie de poluanti rezultati din arderea combustibililor (benzina sau motorina): CO, NOx, hidrocarburi nearse, SO2, aldehide. Pe langa acestia, mai rezulta si oxizi de plumb la arderea benzinei cu plumb si fum, in special la arderea motorinei.

Determinarea concentratiilor de agenti poluanti emisi in diferite etape de mers ale motoarelor au pus in evidenta valori diferite. Astfel, mersul incet in gol si franarea elimina cantitatile cele mai mari de oxid de carbon la motoarele cu aprindere prin

13

scanteie, iar la motoarele cu aprindere prin comprimare, sau Diesel, emisia este maxima la oxizii de azot.

Motoarele in patru timpi, cu aprindere prin scanteie elimina cantitati mari de CO si hidrocarburi nearse RmHn, iar daca utilizeaza si benzina cu plumb, poluarea creste si datorita oxizilor de plumb evacuati in gaze. Motoarele cu aprindere prin comprimare, datorita arderii cu exces de aer produc cantitati mici de poluanti. Consideratiile sunt valabile la starile standard de functionare ale motoarelor; evident, la motoarele cu timp mare de functionare, uzate, emisiile de poluanti sunt mult sporite [1.21].

Agentii poluanti emisi au diferite influente asupra mediului si sanatatii oamenilor [1.22]. Astfel, oxidul de carbon se combina cu hemoglobina producand oxicarbonism, cu manifestari de cefalee, ameteala, astenie, tulburari de vedere, de indemanare, asfixie. Produce leziuni ireversibile in sistemul nervos si aparatul circulator. La expuneri continue de (8 – 14) ppm, posibile in marile aglomerari urbane se observa cresterea mortalitatii prin infarct miocardic. Oxizii de azot distrug alveolele pulmonare in orice concentratii, deci toxicitatea lor este foarte mare. La animale, dioxidul de azot este de patru ori mai toxic decat monoxidul. Hidrocarburile au efecte diferite, la depasirea unor anumite limite de concentratii provocand narcoza, ameteli, crampe, deces. Ozonul peste 30 ppm, inhalat 10 - 15 min produce tulburari respiratorii. Peroxiacetilnitratul (PAN) peste 0,5 ppm produce tulburări respiratorii. Se formeaza in atmosfera, in prezenta energiei solare, din hidrocarburi nearse si oxizi de azot. Plumbul din gaze patrunde direct in organism prin ingerarea apei, a alimentelor, ori prin piele. In organism ajunge la nivelul sangelui, provocand hematii incomplet mature, dereglarea matabolismului albuminelor, glucidelor, vitaminelor, inhibarea activitatii enzimelor, chiar la concentratii de (0,2 - 0,4) ppm. La copii, in doze mici actioneaza sinergetic cu endotoxinele bacteriene, producand deces. Se apreciaza o amplificare a efectului de 105 ori la copii fata de adulti. La adulti, plumbul produce tulburari nervoase, anemie, colita, saturnism, predispozitie la tuberculoza, avorturi si chiar deces. Deoarece oxizii de plumb se depun si pe plante se recomanda sa nu se consume plante cultivate la distante mai mici de 50 m (dupa unii biologi sub 100 m) de la autostrada. Oxizii de sulf in concentratii mici, sub 5 ppm produc iritatii; peste 5 ppm afecteaza aparatul respirator, ducand la decese. In marile orase, unde concentratia medie anuala de oxizi de sulf depaseste 0,046 ppm sunt afectati mai mult copiii. Fumul conţine particule de carbon si hidrocarburi diverse. Reduce vizibilitatea, irita ochii, aparatul respirator. Acumulat, poate provoca scaderea temperaturii planetei, daca nu ar fi contracarat de alte efecte. CO2 nu este toxic, dar produce scaderea concentratiei in O2 a aerului si efect de sera.

Poluantii proveniti din transporturi au si alte efecte: altereaza peisajul, constructiile, operele de arta, aduc modificari climatului. Astfel, sub acţiunea SOx, CaCO3 din constructii se transforma in CaSO4 solubil. NOx absorb partial radiatiile ultraviolete si vizibile si afecteaza animalele la concentratii de (0,5 – 1) g/m3. SO2 modifica culoarea plantelor spre galben, deoarece afecteaza clorofila. Impreuna cu O3 si NO2 prezinta efect sinergetic puternic asupra plantelor, chiar la concentratii scazute de (100 -500) g/m3.

Mijloacele de transport produc si efecte sonore, puternic poluante pentru aparatul auditiv si indirect, pentru intregul organism uman.

b) Agricultura afecteaza mediul natural prin: lucrarile de imbunatatiri funciare, pesticidele si fertilizantii utilizati in exces, dezvoltarea haotica a sectorului zootehnic, preindustrializarea si industrializarea produselor agricole.

14

Pesticidele sunt substante chimice utilizate in agricultura pentru distrugerea daunatorilor, sau sunt regulatori de crestere, antractanti si repelanti. Aceste substante se utilizează pentru protectia materialelor si a produselor stocate si pentru combaterea agentilor de raspandire a bolilor [1.23]. Pesticidele se folosesc singure, sau in amestec. Dupa natura lor prezinta toxicitati diferite. Au continuturi diferite in substanta activa si impurificatori, in functie de procesul tehnologic de obtinere. Ele pot genera produsi toxici in urma unor procese metabolice. Actiunea lor poluanta cuprinde toate trei mediile: aer, apa, sol, circulatia lor efectuandu-se si prin intermediul vietuitoarelor prezente in mediul respectiv.

Din cantitatea de pesticid aplicata, doar o mica parte actioneaza, restul pierzandu-se in sol, in aer, sau pe plante. De exemplu, la fungicide actioneaza doar 3% din cantitatea imprastiata, la ierbicide doar (5 – 40)%, etc. Analizele de sol, vietuitoare din sol si plante pun in evidenta cantitatile de pesticide ramase in exces.

Pesticidele actioneaza in sol asupra microorganismelor, prin inhibarea unor enzime, scaderea populatiei de micromicete (microciuperci parazite), diminuarea capacitatii de retinere a azotului prin influentarea microorganismelor nitri- şi denitrificatoare. Efectele toxice sunt diferite, in functie de natura si concentratia pesticidului aplicat. Astfel, ierbicidele au un efect toxic lent, iar insecticidele si fungicidele un efect mai rapid. Datorita persistentei, procentului scazut de actionare, toxicitatii ridicate la animale si om, unele pesticide au fost interzise prin conventie internationala si prin legea protectiei mediului. Cateva exemple de pesticide interzise atat in Romania cat si pe plan international sunt: Aldrin, DDT, Dieldrin (insecticide), Dinaseb, Silvex (ierbicide), Dibromocloropropan (fumigant) s.a. [1.24].

Fertilizantii (ingrasamintele chimice) sunt substante ce contin cel putin un element nutritiv de baza pentru sol: azot, fosfor, potasiu (N:P:K). Fertilizantii simpli contin doar cate un element nutritiv, cei micsti contin amestecuri de fertilizanti simpli, iar cei complecsi contin in aceeasi formula chimica doua elemente nutritive (exemplu, fosfatul de amoniu, ce contine si azot si fosfor).

Fertilizantii trebuie aplicati dupa analiza chimica a solului, care arata carenta in elemente si microelemente. In caz contrar, dozele mari de azotat de amoniu produc acidifierea solului. Azotatul trece din sol in plante si de aici la om si animale, provocand methemoglobinemia, sau maladia albastra, ce provoaca cresterea mortalitatii infantile cu (2 - 5)%. Furajele cu (0,21 - 0,48)% azotat provoaca tetania de lapte la vaci, deoarece azotatul stimuleaza absorbtia potasiului din plante si nu a calciului si magneziului. Unele vegetale, ca: morcovul, sfecla, ceapa, telina, cartoful, spanacul, salata s.a. acumuleaza azotat. Prin consumul lor, la om se formeaza nitrozamine, substante cu potential cancerigen [1.25].

Folosirea fertilizantilor provoaca si carente de microelemente in sol, cum sunt: Zn, Fe, Cu, B, Mg, Mn, Mo etc. Efectele aparute la plante sunt legate de scaderea rezistentei la factorii climatici si aparitia unor maladii. Maladiile plantelor, ca: cloroza, pigmentarea frunzelor, necroza unor tesuturi etc. se datoresc in mod cert dezechilibrelor de nutritie.

Fertilizantii impurifica apele de suprafata si pe cele subterane, deoarece ajung in decursul a (10 – 50) ani la adancimi de peste 30 m in strat. De aceea se impune ca statiile de tratare a apei in vederea obtinerii apei potabile sa fie dotate si cu analizoare de azotat, pentru controlul permanent al acestui indicator de calitate [1.26].

c) Industria polueaza prin emisii in atmosfera, in efluenti, prin depozitare de materiale nocive pe sol, in subsol, contaminari biologice, radioactive, riscuri atat in exploatare, cat

15

si prin posibilitatea producerii unor accidente. In cele ce urmeaza, este prezentata o descriere a rolurilor/efectelor diferitelor ramuri industriale in poluarea mediului.

1) Industria extractiva polueaza mediul atat in faza de extractie, cat si in fazele de preparare, respectiv la maruntire, clasare, concentrare, preparare termica s.a. Pe durata extractiilor in subteran sau la suprafata se elimina praf cu continut de silicati, carbune etc., vegetatia este distrusa pe mari suprafete, pot aparea surpari, alunecari de teren. Din operatiile de preparare rezulta halde de steril, ape poluate, praf. Haldele contamineaza solul cu metale grele, praf de carbune si ii schimba pH-ul.

Apele poluate deversate in cele naturale produc cresterea continutului in metale grele, praf de carbune, diferite substante chimice anorganice si organice si trebuie tratate pentru reducerea agentilor poluanti sub limitele admise de lege.

2) Industria de extractie si prelucrare a titeiului afecteaza mediul prin hidrocarburile gazoase si lichide "pierdute" in timpul extractiei, transportului si depozitarii titeiului si produselor petroliere. Din procesele de prelucrare in rafinarii rezulta produse inflamabile, cu grade diferite de toxicitate, unele explozive sau cancerigene, deci necesita conditii speciale, sigure la prelucrare, transport si depozitare.

3) Industria energetica polueaza termic, fonic, electromagnetic, chimic si estetic mediul. Astazi energia electrica se obtine din surse conventionale prin arderea titeiului, carbunilor, gazelor naturale, din procese nucleare si din apa. Procesele de combustie au o mare pondere, atat pentru obtinerea energiei electrice, cat si a celei termice si constituie principala sursa de poluare din cadrul acestei categorii.

Termocentralele elimina cenusa, pulberi, gaze, aer cald si abur. Cenusa poate reprezenta (40 – 50)% la lignit, carbune brun, turba, sau chiar peste 80% in cazul arderii sisturilor bituminoase. Din ardere rezulta gaze cu continut de CO2, oxizi de sulf, de azot, compusi cu arsen, fluor. Producerea energiei contribuie cu 57% la efectul de sera, deoarece emite 55% din totalul CO2, 15% din CH4, 6% din N2O, 7% din CFC. Detine primul loc la emisiile de oxizi de sulf si de azot si locul al doilea, dupa materialele de constructii, la emisiile de pulberi.

Numai termocentralele emit 60% din SOx total si 30% din NOx total. Pulberile se regasesc aruncate la (10 – 20) km distanta, iar oxizii de sulf si de carbon la peste 1000 km, fata de locul emisiei.

Centralele nucleare prezinta un risc de poluare radioactiva ca urmare a accidentelor care pot surveni. Pericolul este foarte mare in cazul expunerii miezului radioactiv.

4) Industria siderurgica elimina pulberi metalice (oxizi de fier), cancerigene, precum si pulberi nemetalice de SiO2, calcar, carbune, cu alte efecte asupra aparatului respirator, a ochilor si a pielii.

Uzinele cocsochimice elimina compusi toxici cu fluor, arsen, hidrocarburi policiclice condensate, cu efecte cancerigene, fenoli caustici, gaze cu SO2, CO, H2S, cu efecte acide si asfixiante. Emisiile in atmosfera (pulberi si gaze) se regasesc la distante de cativa kilometri de combinatele siderurgice.

5) Metalurgia neferoasa elimina o serie de produsi toxici, ca de exemplu: As, Cd, Cr, Pb, Hg, Ni, V, Mn, Ba, F, SO2 etc.

6) Industria materialelor de constructii polueaza mediul in special prin cantitatile mari de pulberi, ce pot ajunge si la 200 g/m2 in 24 ore. Aceste pulberi contin oxizi de calciu, de magneziu, de siliciu, azbest (au proprietati cancerigene si radioactive).

7) Industria celulozei si hartiei utilizează compusi cu sulf (sulfura de carbon, dioxid de sulf), iar din procesele tehnologice rezulta H2S, mercaptani, impreuna cu produsii volatili utilizati in proces. Albirea celulozei se poate face si cu clor, in care caz

16

rezulta combinatii organoclorurate deosebit de toxice, printre care si dioxina. Din proces rezulta si ape reziduale cu continut ridicat de reactivi si fibre celulozice putrescibile, ce produc pe langa disconfort si iritatii, imbolnaviri ale ochilor, aparatului respirator, etc.

8) Industria alimentara polueaza aerul, apa, solul cu resturile vegetale si animale rezultate din procesele tehnologice, cu detergenti utilizati la spalari, sau cu alte materiale si produse reziduale. Freonii utilizati ca agenti frigorifici, eliberati in atmosfera, contribuie la distrugerea stratului de ozon.

9) Industria chimica emite o multitudine de substante, cu diferite toxicitati pentru oameni si mediu. Se elimina in atmosfera compusi cu sulf, ca: dioxid si trioxid de sulf din industria acidului sulfuric, mercaptani din rafinarii si petrochimie, hidrogen sulfurat, sulfura de carbon. Compusii cu azot, ca oxizi si amoniac se elimina din industria acidului azotic si a fertilizantilor cu azot. Din productia de clorosodice se elimină clor, acid clorhidric in atmosfera, clorura de calciu in ape etc. Din diferite procese de sinteza se elimina compusi cu fluor, clor, pesticide, produsi intermediari de sinteza, negru de fum. Din procesele de valorificare a titeiului si a gazului metan se elimina fenoli, alcooli, cetone, eteri, diferite hidrocarburi. Produsele reziduale se elimina ca atare in aer, apa sau pe sol, sau se ambaleaza si depoziteaza, sau se ard, fiecare varianta prezentand forme specifice de poluare a mediului.

Efectele substantelor chimice asupra mediului biotic si abiotic sunt multiple. Ele actioneaza prin aciditatea sau bazicitatea lor, prin reactia cu umiditatea atmosferica producand ceata (oxizii de sulf, clorura de aluminiu), sau compusi toxici (clorul, oxizii de sulf, azot), prin potentialul inflamabil, chiar la temperaturi relativ scazute, al unor compusi (benzinele usoare), prin potentialul exploziv al altora (azotatul de amoniu), prin toxicitatea lor chiar la concentratii extrem de scazute in aer sau apa (dioxina). Efectele sunt multiple, amplificate de cele mai multe ori de prezenta in mediu a unui amestec de poluanti.

Pana la inceputul anilor 1990 clasele de poluanti chimici prezentati mai sus erau considerati prioritari in ceea ce priveste supravegherea puritatii factorilor de mediu. In zilele noastre acesti compusi sunt mai putin relevanti pentru tarile industrializate, de cand reducerea drastica a emisiilor a fost realizata gratie adoptarii unor masuri agresive de eliminare a surselor dominante de poluare.

O gama variata de substante chimice destinate utilizarii in industrie, agricultura sau ca bunuri de larg consum, precum si cele produse secundar in procesele industriale sau de combustie sunt considerate ca prezentand risc de contaminare a mediului. Termenul “pericol de contaminare” se refera nu numai la substantele noi introduse in mediu. Poate prezenta risc de poluare orice constituent neinclus in mod curent in programele de monitorizare de rutina si care poate fi un candidat pentru viitoare regularizari pe baza studiilor de cercetare stiintifica privind eco-toxicitatea lor, a efectelor potentiale asupra sanatatii, a perceptiei publice si a datelor privind aparitia si comportarea lor in diferite compartimente ale mediului [1.27].

Luand in considerare acest aspect, grupurile de poluanti considerati de risc actual pot fi sintetizati (in ordine alfabetica) astfel:

- aditivi ai benzinei; - compusi organometalici si perfluorati; - hormoni si alti compusi de perturbare a sistemului endocrin; - materiale ignifuge bromurate si organofosforate; - pesticide polare si produsii secundari proveniti din degradarea acestora; - produse farmaceutice si de ingrijire personala; - surfactantii si metabolitii lor;

17

- toxinele provenite din alge si cianobacterii. Pentru cele mai multe dintre elementele mentionate mai sus introducerea in

mediu, evaluarea riscului si datele ecotoxicologice nu sunt disponibile, astfel incat este dificila predictia relativ la efectele asupra factorilor de mediu. De aceea sunt necesare eforturi conjugate in scopul realizarii unei baze stiintifice de informatii relativ la sursele de introducere, transportul potential, modul de comportare si metodele de indepartare a acestor noi clase de poluanti din aer, apa, sol si biosfera.

Reziduurile farmaceutice: Compusii activi farmaceutic (CAF) reprezinta un grup important de

contaminanti periculosi ai mediului, in special ai apei si solului, care au captat interesul comunitatii stiintifice internationale in ultimii 20 de ani. In Uniunea Europeana aproximativ 3000 de diferiti CAF sunt utilizati in medicina umana (analgezice, antiinflamatoare, β-blocante, regulatori lipidici, antibiotice, citostatice etc.) al caror circuit in mediu (Fig.1.1) este ingestia urmata de excretie si dispunerea deseurilor aferente pe sol sau evacuarea lor in ape. Dupa administrare, CAF pot fi excretati ca metaboliti, fara a suferi modificari, sau ca o combinatie de acid gluconic si sulfuric (prin urina si fecale). Prin analiza cailor de excretie a 212 CAF, Lienert s.a. [1.28] au gasit ca aproximativ 64% din fiecare CAF au fost excretati via urina si 35% via fecale. In urina, 42% din fiecare CAF s-a regasit ca metabolit.

Productie

Deseuri

Depunere pe sol

Ape de suprafata

Ape subterane

Apapotabila

Medicinaveterinara

Gunoi de grajd

Sol

Sedimente

Medicina umana

Canalizare

Tratare

Fig.1.1. Circuitul produselor farmaceutice in natura.

Metabolitii medicamentelor sunt bioactivi si chiar mai persistenti decat medicamentele originare din cauza polaritatii lor crescute. De asemenea, conjugati ai compusului originar pot fi separati inapoi in medicamentul din care provin in timpul tratarii deseurilor [1.29].

Alte cai de expunere a factorilor de mediu, in afara tratarii incomplete a deseurilor in statiile de tratare si de epurare a apelor sunt reprezentate de fabricile de medicamente si de efluentii spitalelor, aplicarea pe sol (biosolid si reutilizarea apei pentru irigatii), procesul de hranire a animalelor, precum si dispunerea directa in mediu (de exemplu, un studiu efectuat in SUA raporteaza ca marea majoritate a populatiei arunca medicamentele la gunoi sau in canalizare [1.30]).

Comparativ cu principalii poluanti conventionali, CAF sunt destinati sa aiba efecte specifice farmacologice si fiziologice la doze mici. Ei pot suferi diverse reactii

18

chimice, fotolitice si biologice care sa le modifice structura si transportul fizic in mediu. Mai mult, o serie de CAF nu au o toxicitate acuta, dar au efect cumulat semnificativ asupra metabolismului organismelor altele decat cele tinta si a ecosistemului, in general [1.31]. Unele medicamente (antidepresivele, β-blocantele, sau regulatorii lipidici) pot fi predispusi la bioconcentrare/bioacumulare in organismele acvatice [1.32-1.34]. Aceste rezultate au tras un semnal de alarma in ceea ce priveste expunerea continua la CAF ca rezultat al utilizarii constante de catre pacienti. De asemenea, putine lucruri sunt cunoscute in ceea ce priveste transportul si comportarea in mediul natural [1.35].

Exista doar cateva studii referitoare la distributia produselor farmaceutice in medii poroase [1.36-1.38]. Astfel, aparitia acestor contaminanti de risc in diferite compartimente ale mediului (ape naturale, ape uzate, sol, namoluri uzate, sedimente) a devenit o problema serioasa a comunitatii stiintifice.

d) Armele de distrugere in masa constituie un alt domeniu, inspaimantator, privind siguranta mediului si a vietii. Cea de-a treia arma de distrugere in masa – arma biologica – a fost folosita inca din Evul Mediu, cand soldatii catapultau cadavre in tabara inamica in scopul declansarii unor epidemii sau macar ca metoda de demoralizare a trupelor dusmane. Agentii biologici sunt de mare interes in parte datorita usurintei cu care se creaza, se transporta si se imprastie. Din cauza timpului relativ lung scurs intre atacul biologic si aparitia primelor simptome la persoanele expuse, aceste arme sunt devastatoare; sute sau chiar mii de oameni se pot imbolnavi si muri in urma unui atac biologic nu numai in zona vizata, dar si in alte locatii, datorita mobilitatii foarte mari din zilele noastre. Tehnologiile actuale atat pentru agentii biologici cat si pentru cei chimici sunt mai degraba folosite in scopul detectiei pentru raspuns sau reactie decat pentru avertizare. Cele mai multe raspund cand amenintarea este deja prezenta. Instrumentele mai sofisticate pot detecta natura si/sau concentratia agentilor prezenti in mediu. Agentii biologici se prezinta sub diverse forme si marimi, de la filovirusi, pana la spori (cum este bacteria Bacillus anthracis). Acest lucru constituie o provocare in sensul crearii unui singur detector pentru toate tipurile de agenti biologici [1.39]. In ultima vreme se utilizeaza metodele optice de detectie de la distanta, cum este LIDAR (LIght Detection And Ranging). Metoda a fost imbunatatita cu posibilitatea discriminarii agentilor biologici de materialul nonbiologic prin folosirea proprietatilor fluorescente ale compusilor intracelulari. Cei mai vizati compusi sunt aminoacidul triptofan, coenzima nicotinamid-adenindinucleotid (NADH), molecula de stocare a energiei celulare adenosine-trifosfat (ATP) si riboflavina (vitamina B2). Identificarea acestor compusi verifica daca proba este de origine biologica. Recent s-a dezvoltat tehnica Laser Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) ce permite detectia de la distanta a bacteriilor aerosolizate sau adsorbite pe sol, roca etc. Aceasta tehnica nu numai ca indica prezenta agentului, dar face si diferenta dintre speciile de bacterii si potentialii interferenti (de exemplu polenul). Ca si in cazul detectiei agentilor biologici, aspectul cel mai provocator al identificarii agentilor chimici consta in separarea agentului de interes de alti compusi chimici din mediu. Trebuie facuta precizarea ca la o temperatura de aproximativ 1000C unele lichide trec in stare gazoasa, devenind vapori. La presiunea si temperatura ambianta (250C), agentii chimici se pot prezenta sub cele trei forme de agregare: gaze, lichide si solide. De exemplu, clorul si fosgenul (oxiclorura de carbon, CCl2O) sunt gaze, acidul cianhidric (HCN) si sarinul (sau GB dupa denumirea NATO, cu formula chimica C4H10FO2P, 2-(fluoro-metil-fosforil)oxipropan, actioneaza ca agent al

19

sistemului nervos, avand structura si activitatea biologica similara cu cea a unor insecticide, cum ar fi Malathionul) sunt sub forma de lichid. Presiunea vaporilor – o masura a vaporizarii, este mult mai mare pentru acidul cianhidric decat pentru sarin. Presiunea vaporilor in cazul lichidelor contribuie la persistenta agentului in mediu. Sarinul este mai persistent decat acidul cianhidric, insa VX (o-etil-S-[2(diizopropilamino)etil]metilfosfonoetiolat, cu formula chimica C11H26NO2PS este o substanta extrem de toxica, agent al sistemului nervos, clasificata de catre Natiunile Unite in Rezolutia 687 ca arma de distrugere in masa), cu presiunea vaporilor similara cu cea a uleiului de motor (0,0007 mmHg la 250C) este cel mai persistent lichid din gama agentilor chimici. Agentii lacrimogeni, cum sunt cloroactofenon (CN sau sub denumirea Mace) si 3-quinuclidinil benzilat (BZ) sunt substante solide. Exista mai multe metode de detectie a agentilor chimici in cazul eliberarii lor in mediu, dintre care metodele optice ocupa un loc foarte important. Astfel, putem mentiona spectroscopia in IR, spectroscopia Raman, fotometria in flacara, fotoionizarea (folosind ca sursa radiatia UV) etc. Lungimile de unda de vibratie caracteristice ale celor mai multi agenti chimici se incadreaza in regiunea IR a spectrului electromagnetic. Cand un fascicul de o astfel de lungime de unda trece printr-un nor de gaz sau vapori el este absorbit datorita structurii chimice a compusilor care formeaza norul. Un instrument de masura in IR determina cantitatea de lumina absorbita la o lungime de unda specifica, identificand grupul chimic caracteristic, cum ar fi de exemplu legatura P-O a VX. Spectrometrele mai sofisticate scaneaza regiunea IR a spectrului pentru a identifica amprentele caracteristice mai multor substante chimice, cu ajutorul carora se creaza o baza de date. Limitele metodelor spectroscopice in IR sunt date de cost, complexitate si marimea instrumentelor [1.40].

Problema poluantilor cu grad ridicat de risc este strans legata de capabilitatile analitice. Sensibilitatea crescuta a metodelor optice si a celor conexe (cum sunt metodele cromatografice) de detectie si analiza au permis identificarea oricarui nou potential contaminant, chiar si la nivele de concentratie foarte scazute. Astfel, un numar de noi poluanti, nerecunoscuti ca atare sau ignorati au fost supusi monitorizarii in diferite compartimente ale mediului. Studii aditionale privitoare la aceste substante recent recunoscute ca si contaminanti potentiali, unii dintre acestia fiind produsele farmaceutice, sunt necesare nu numai pentru confirmarea prezentei lor in natura, dar si pentru evaluarea riscului, in combinatie cu date relevante ecotoxicologice, precum si pentru identificarea unor metode mai eficiente de indepartare a lor din mediu. Relativ la aparitia noilor grupe de poluanti ai mediului, integrarea tehnicilor fizice, chimice si ecologice de monitorizare, tratare si epurare joaca un rol important, constituind cea mai potrivita cale de rezolvare a problemelor complexe ale poluarii factorilor de mediu.

1.3. PROPRIETATI OPTICE ALE POLUANTILOR MEDIULUI

1.3.1. NATURA RADIATIEI ELECTROMAGNETICE

Radiatia electromagnetica prezinta atat proprietati de unda cat si de particula/ corpuscul si contine energie radianta.

Proprietati de unda:

O unda electromagnetica (Fig.1.2) are o componenta electrica si una magnetica. Cele doua componente oscileaza in planuri perpendiculare unul fata de altul si fata de directia de propagare a radiatiei.

20

Ea este caracterizata de lungimea de unda, λ si de frecventa, υ. Acestea sunt raportate la viteza luminii prin relatia:

λυ = c/n (1.3.1) unde c este viteza luminii in vid (2,9976 108 m/s) si n este indicele de refractie.

In unele cazuri este mai avantajos sa se foloseasca numarul de unda, υ~ [cm-1], care reprezinta numarul de lungimi de unda pe 1 cm.

cnυ

λυ ==

1~ (1.3.2)

Fig.1.2. Unda electromagnetica. Intensitatea undei electromagnetice, I, reprezinta energia care trece prin unitatea de suprafata in unitatea de timp si este data de relatia:

π8

2cAI = (1.3.3)

unde A este amplitudinea undei electromagnetice. Proprietati de particula:

Pentru a descrie modul in care interactioneaza radiatia electromagnetica cu materia, este util de a imagina fasciculul de radiatie ca o succesiune de fotoni. Energia fiecarui foton este proportionala cu frecventa radiatiei si este data de relatia:

E = hυ = λn

hc (1.3.4)

unde E[J] este energia fotonului, υ[Hz] este frecventa radiatiei electromagnetice, h este constanta lui Planck (h = 6,626 10-34 J·s-1) si n este indicele de refractie al mediului.

1.3.2. TIPURI DE INTERACTII ALE RADIATIEI ELECTROMAGNETICE CU MATERIA

Interactiile radiatiei electromagnetice cu proba de analizat pot fi ne-elastice si/sau elastice (cvasielastice).

In cazul interactiilor elastice nu are loc un transfer al energiei undei catre componentele probei de analizat. In contextul lucrarii de fata vor fi luate in discutie numai interactiile inelastice, care stau la baza metodelor de analiza folosite in mod practic in sectiunile experimentale descrise in teza.

Prin interactii ne-elastice are loc un schimb de energie bine definit intre radiatie si particulele din proba (atomi, ioni, molecule), care poate fi descris pe baza legilor mecanicii cuantice. La efectuarea analizei se obtin semnale corespunzatoare unor tranzitii intre anumite stari energetice, care, ordonate in functie de energie (λ sau υ), ne dau spectrul probei de analizat. In domeniul de energii larg care reprezinta spectrul electromagnetic, vor aparea anumite discontinuitati caracteristice.

21

1.3.2.1. ABSORBTIA SI EMISIA RADIATIEI OPTICE DE CATRE UN MEDIU

Absorbtia si emisia radiatiei optice de catre atomi in domeniul spectrului electromagnetic se datoreaza unor tranzitii intre stari energetice ale electronilor periferici. Energia radiatiilor absorbite sau emise are valori discrete. Frecventa acestor radiatii este functie de diferenta de energie, ΔE, intre starile energetice intre care are loc tranzitia:

υλ

υ ~hcchhE ===Δ (1.3.5)

unde: c este viteza luminii (in vid ~ 3x108 m/s) si υ~ este numarul de unda exprimat in cm-1.

Fiecare tranzitie corespunde unei anumite linii spectrale atat pentru absorbtie cat si pentru emisie. Miscarea unui electron in jurul nucleului si in jurul axei sale este caracterizata prin cele patru numere cuantice: n - numarul cuantic principal, ℓ – numarul cuantic secundar, m – numarul cuantic magnetic si s - numarul cuantic de spin. Se mai foloseste si numarul cuantic intern, j = ℓ + s, care nu are un caracter de sine statator.

La atomii cu mai multi electroni in invelisul exterior are loc o insumare vectoriala a momentelor cinetice orbitale si de spin. Aceasta datorita interactiei spin-orbita si interactiei dintre electroni. Starea energetica a atomului va fi caracterizata prin numerele cuantice totale L, S si J. L este numarul cuantic secundar total rezultand din insumarea numerelor cuantice care caracterizeaza momentele cinetice orbitale ale electronilor si corespunde momentului cinetic orbital total al atomului. S, numarul cuantic de spin total, se obtine prin insumarea algebrica a spinilor tuturor electronilor si corespunde momentului cinetic de spin total al atomului. J este dat de (L + S) si reprezinta numarul cuantic intern total, corespunzand momentului cinetic total al atomului. Diferitele valori ale lui J vor determina scindarea nivelelor energetice ale atomului.

In spectroscopie, prezinta o importanta deosebita regulile de selectie pentru numerele cuantice J si m. Aceste reguli sunt legate de simetria sferica si de cea axiala a sistemului considerat si corespund legii de conservare a momentului cinetic [1.41]. Ele sunt sistematizate in Tabelul 1.1.

Tabel 1.1

Dipol electric Dipol magnetic Cvadripol ΔJ = 0, ± 1 Δm = 0, ± 1

J=0 ↔J=0 interzis

ΔJ = 0, ± 1 Δm = 0, ± 1

J=0 ↔J=0 interzis

ΔJ = 0, ± 1, ± 2 Δm = 0, ± 1, ± 2

J=0 ↔J=0 interzis J=1/2 ↔J=1/2 interzis

J=0 ↔J=1 interzis Linia de absorbtie a saltului de pe nivelul energetic cel mai de jos pe nivelul

energetic superior permis se numeste linie de rezonanta. Din punct de vedere analitic, de mare importanta sunt liniile de rezonanta ce apar in urma tranzitiilor intre starea fundamentala si primul nivel excitat, ele fiind, in general, cele mai intense.

In ceea ce priveste absorbtia radiatiei optice de catre molecule, in urma acestui proces se poate modifica directia sau marimea momentului de dipol electric al moleculei care interactioneaza. Vor avea loc tranzitii intre stari energetice de rotatie, vibratie sau electronice, al caror studiu constituie baza spectroscopiei moleculare. Din starile excitate aparute in urma interactiei moleculelor cu radiatii electromagnetice, o

22

parte dintre acestea pot reveni la stari cu energie mai mica prin emisie de energie [1.42, 1.43].

Diferentele de energie intre nivelele electronice moleculare sunt mult mai mari decat intre starile de vibratie si diferentele de energie intre starile de vibratie sunt semnificativ mai mari decat intre starile de rotatie, cand nivele de vibratie-rotatie sunt asociate cu aceeasi stare electronica. In mod obisnuit, la absorbtia radiatiei electromagnetice de catre molecule, aceasta interactioneaza prin componenta sa electrica. Pentru ca radiatia sa poata fi absorbita, ea trebuie sa aiba energia egala cu diferenta intre doua nivele energetice ale moleculei si in plus, tranzitia moleculara trebuie sa fie insotita de o modificare a pozitiei centrului ei electric, a momentului de dipol. Numai astfel, molecula poate interactiona cu componenta electrica a radiatiei electromagnetice.

Energiile necesare pentru a provoca tranzitii intre stari energetice ale electronilor din orbitalii moleculari sunt cele mai mari si corespund domeniului spectral UV, (100 - 400) nm si VIZ, (400 - 800) nm. Pentru a putea provoca tranzitii intre stari energetice de vibratie sunt necesare energii mai mici, deci vor fi absorbite radiatii cu lungimi de unda mai mari, corespunzand, de regula, domeniului IR apropiat. Tranzitiile intre stari energetice de rotatie vor fi excitate de radiatii cu energie mai mica, corespunzatoare domeniului IR indepartat si microundelor.

Frecventele de vibratie depind de masele atomilor si de taria legaturilor. Toate sunt vibratii normale la care participa toti atomii dintr-o molecula. La unele vibratii energia este concentrata in anumite legaturi ceea ce le face caracteristice pentru anumite grupari de atomi.

Exista doua tipuri principale de vibratii: - de intindere (ν), numite si vibratii de valenta intrucat au loc de-a lungul legaturii; - de deformare (δ), prin care se deformeaza unghiul dintre legaturile de valenta.

Vibratiile de intindere sunt fie vibratii izolate (de exemplu in gruparea carbonil), fie sunt vibratii cuplate (de exemplu in gruparea metilen). Acestea din urma pot fi simetrice sau antisimetrice. Vibratiile de intindere necesita, in general, energii mai mari decat vibratiile de deformare si in consecinta, absorbtia radiatiilor electromagnetice are loc pentru frecvente mai mari. Pentru o molecula poliatomica, fiecare tip de vibratie are o frecventa definita.

Energiile corespunzatoare vibratiilor moleculare sunt cuantificate. Atunci cand o radiatie electromagnetica cu aceeasi frecventa cu cea corespunzatoare vibratiei unor atomi intr-o legatura vine in contact cu aceasta, poate sa aiba loc absorbtia radiatiei. Absorbtia are loc numai daca atomii care vibreaza in cadrul legaturii determina aparitia unui moment de dipol oscilant care poate interactiona cu campul electric al radiatiei. Vor absorbi radiatii in domeniul IR al spectrului numai acele vibratii pentru care are loc o variatie a momentului de dipol [1.43].

In procesul de absorbtie are loc o marire a amplitudinii uneia dintre vibratiile moleculare. Cand molecula revine la starea fundamentala energia absorbita este disipata sub forma de caldura. Vibratiile pe care le executa o molecula in ansamblul ei cu pastrarea imobila a centrului sau de masa se numesc vibratii normale sau fundamentale. O molecula neliniara, avand n atomi, are un numar de 3n-6 vibratii normale. O molecula liniara cu n atomi are 3n-5 vibratii normale. Numarul real de benzi de absorbtie din spectru poate fi mai mare sau mai mic (de obicei este mai mic) decat cel rezultat din relatia de mai sus. Cresterea numarului de benzi fata de cel teoretic se datoreaza armonicelor, benzilor de combinare sau rezonantei Fermi. Frecventa corespunzatoare unui sistem format din doi atomi care vibreaza in cadrul legaturii poate fi calculata pe baza legii miscarii armonice simple si este data de relatia:

23

μπυ f

21

= (1.3.6)

unde: f este constanta de forta si μ masa redusa a sistemului μ = mAmB/(mA + mB) (1.3.7)

unde mA şi mB reprezinta masele nucleelor celor doi atomi. In cazul moleculelor nu este indeplinita o conditie esentiala a unui oscilator

armonic: valoarea lui f nu este constanta in raport cu elongatia iar energia de vibratie a unei legaturi este data de relatia:

222

)21(

4)

21()( +−+= v

DhvhvE υυ (1.3.8)

Unde ν = 0, 1, 2, ... sunt numere cuantice de vibratie, iar D este energia de disociere. Absorbtia moleculara in domeniul UV si VIZ este utilizata in special pentru

determinari cantitative pe baza legii Lambert-Beer, informatiile calitative si structurale care pot fi obtinute fiind destul de reduse. Absorbtia moleculara in domeniul IR este utilizata in special pentru determinari calitative, de structura a moleculelor, dar pot fi facute si determinari cantitative.

In sensul general, absorbtia de radiatie electromagnetica constituie un proces elementar preliminar emiterii oricarui tip de radiatie. El presupune de fapt inmagazinarea unei cantitati de energie care sa permita popularea starilor electronice de pe care, prin dezexcitare radiativa, se emite radiatie electromagnetica luminoasa. Excitarea unui atom sau a unei molecule consta in absorbtia unei cuante de energie sub diferite forme (termica, chimica, radianta) de catre electronul de pe un anumit nivel fundamental S0 si trecerea sa pe un nivel superior S1. Aceasta stare de excitatie dureaza extrem de putin (∼10-10 s), dupa care electronul revine pe nivelul initial al starii fundamentale prin eliberarea energiei absorbite sub forma de radiatie luminoasa (foton). Energia cuantei implicate in absorbtie si excitatie trebuie sa fie egala cu diferenta de energie ΔE dintre cele doua nivele S0 si S1. Revenirea pe nivelul initial S0 este insotita de emisia unui foton a carui energie este egala cu ΔE. Fluorescenta este emisia de radiatie de catre molecule sau agregate moleculare de pe nivelele excitate in urma absorbtiei de radiatie electromagnetica. Fiecarei stari electronice ii este asociat un cvasicontinuu de stari vibrationale si rotationale. Tranzitiile optice au loc intre astfel de stari, care dau benzile de fluorescenta si fosforescenta. Energiile fotonilor sunt strans corelate cu structura moleculelor corpului iradiat. Revenirea moleculei la starea initiala (dezexcitarea) se poate face pe mai multe cai: se poate produce radiativ, prin emiterea unui foton de energie comparabila cu energia fotonului absorbit (fluorescenta) sau neradiativ, prin relaxare vibrationala si conversie interna. Avand in vedere ca durata medie a dezexcitarii prin fluorescenta este mult mai lunga (10-9 ÷ 10-7 s) decat duratele medii ale celorlalte procese de dezexcitare, rezulta ca fluorescenta se produce, practic, intotdeauna de pe cea mai joasa stare vibrationala a unei stari electronice excitate, de singlet (Fig.1.3).

Eficienta cu care au loc procesele de disipare a energiei acumulate se numeste eficienta cuantica si este data de relatia:

ΦE=(nr. cuante emise/nr. cuante absorbite) ≤ 1 (1.3.9) Eficienta cuantica a celor mai multe molecule complexe este independenta de lungimea de unda de excitare si emisia va fi in relatie directa cu coeficientul molar de extinctie al compusului.

24

Fig.1.3. Diagrama Jablonski: absorbtia si emisia radiatiei optice de catre molecule.

Cu alte cuvinte, spectrul de excitatie al substantei va fi acelasi cu spectrul de absorbtie [1.44].

La popularea starilor excitate prin promovarea unui electron pe un orbital superior, directia spinului electronic este pastrata. Pentru ca cele mai multe molecule au un anumit numar de electroni care sunt aranjati in mod normal in perechi cu spini opusi, excitarea unui electron nu perturba aceasta paritate. Oricum, este posibil ca spinul electronului excitat sa fie inversat, astfel incat sa nu mai aiba pereche si molecula sa aiba doi electroni independenti cu acelasi spin pe orbitali diferiti. Teoria cuantica spune ca o astfel de molecula exista in trei nivele de energie foarte putin diferite, practic nedistinctibile, numita stare de triplet. Procesul indirect de conversie de pe starea excitata – stare de singlet, pe o stare de triplet este cunoscut sub denumirea de trecere intersistem (Fig.1.3) si poate aparea, la multe substante, cand cel mai scazut nivel vibrational al starii excitate de singlet, S1, are acelasi nivel de energie ca cel al starii de triplet apropiate in scara energetica.

Tranzitia directa de pe starea fundamentala, de obicei o stare de singlet, a unei molecule cu un numar dat de electroni, pe o stare excitata de triplet este teoretic interzisa, ceea ce inseamna ca trecerea inversa de pe starea de triplet pe cea fundamentala va avea loc cu o mica probabilitate. In timp ce tranzitia de pe starea excitata de singlet (de exemplu S1) pe starea fundamentala cu emisie de fluorescenta poate avea loc in 10-9 – 10-6 s, tranzitia de pe starea excitata de triplet pe starea fundamentala cu emisie de fosforescenta dureaza cel putin 10-4 s si poate lua cel mult 102 s. Aceasta intarziere poate caracteriza procesul de fosforescenta, dar o definire mai precisa o constituie aceea ca fosforescenta este procesul de tranzitie directa de pe starea excitata de triplet pe nivelul fundamental. Starea de triplet are o energie mai scazuta decat starea de singlet corespunzatoare, astfel incat tranzitia pe starea fundamentala insotita de emisia de fosforescenta presupune o energie mai mica decat cea necesara tranzitiei de pe starea excitata de singlet pe starea fundamentala; fosforescenta apare la lungimi de unda mai mari decat fluorescenta. Deoarece timpul de ocupare a starii de triplet este relativ lung, moleculele isi pot pierde energia prin alte procese decat fosforescenta (de exemplu prin coliziuni cu moleculele solventului). Moleculele solutului cu electroni liberi (cum ar fi O2) sunt foarte susceptibile la distrugerea starii de triplet chiar si la concentratii scazute. De aceea, fosforescenta in solutii la temperatura camerei este un fenomen rar, dar prin dispersarea probei intr-o matrice rigida sau prin inghetarea solutiei, acest proces poate fi observat pentru multi compusi [1.45].

25

Capacitatea unui mediu de a absorbi energie depinde de un numar de factori, in special de constitutia electronica si nucleara a atomilor si moleculelor mediului absorbant, de lungimea de unda a radiatiei incidente, de grosimea stratului absorbant si de o serie de variabile ce determina starea mediului, dintre care cele mai importante sunt temperatura si concentratia acestuia. In unele cazuri absorbtia poate fi influentata de campul electric si/sau magnetic inconjurator. Starea de polarizare a radiatiei influenteaza capacitatea de absorbtie a mediului in cazul in care acesta contine structuri orientate, cum ar fi cristalele sau enantiomerii. Legea Lambert-Beer coreleaza capacitatea de absorbtie a unui material cu proprietatile lui.

Scaderea dI a intensitatii luminii la strabaterea unui strat absorbant elementar de grosime dx este proportionala cu grosimea stratului absorbant, cu intensitatea initiala a fasciculului si depinde de natura mediului si de lungimea de unda a luminii (Fig.1.4).

Fig.1.4. Absorbtia radiatiei electromagnetice de catre un corp material.

dI ~ I , dI ~ dx ⇒ dI = – kλ⋅I⋅dx (1.3.10)

xkIIdxk

IdIdxk

IdI l

I

I

xl

⋅−=⋅−=⋅−= ∫ ∫ λλλ00

ln;;0 (1.3.11)

xkeII ⋅−⋅= λ01 (1.3.12)

In aceasta relatie I0 şi I1 sunt intensitatile fasciculului incident, respectiv emergent din mediul absorbant de grosime x si kλ coeficientul de absorbtie care depinde de lungimea de unda si de natura mediului absorbant. In cazul solutiilor, trebuie sa se tina seama si de concentratia acestora. Daca se neglijeaza efectul solventului, intensitatea luminii dupa parcurgerea unui strat de grosime x dintr-o solutie de concentratie c, este:

xc0l eII ⋅⋅ε− λ⋅= (1.3.13)

unde ελ este coeficientul de extinctie natural iar c - concentratia solutiei. Relatia obtinuta reprezinta legea lui Beer, care se aplica la absorbtia luminii de catre solutii.

0

lxcxk

0

xcxk0

solvent

solutie

II

eeI

eeIII

==⋅

⋅⋅= ⋅⋅ε−

⋅−

⋅⋅ε−⋅−

(1.3.14)

Pentru gaze, coeficientul de absorbtie este dat de produsul dintre sectiunea eficace de absorbtie (σ) si densitatea speciilor absorbante (N), astfel incat legea Lambert-Beer se exprima prin relatia:

xNl eII ⋅⋅−⋅= σ

0 (1.3.15) Raportul:

0

l

II

=τ (1.3.16)

dx

x

Il I0 I

26

se numeşte coeficient de transmisie, iar marimea:

0

l

II

lg1lgE =τ

= (1.3.17)

se numeşte extinctie. Aceste doua marimi sunt folosite la studiul experimental al absorbtiei. Analizele prin absorbtie se folosesc pentru determinarea concentratiilor solutiilor sau pentru studiul structurii mediilor care absorb anumite lungimi de unda caracteristice.

1.3.2.2. IMPRASTIEREA RADIATIEI OPTICE Imprastierea luminii este un alt proces optic major, alaturi de absorbtie si emisie si presupune ca o radiatie incidenta este fortata sa-si schimbe traiectoria de catre una sau mai multe neuniformitati (centri de imprastiere) prezente in mediul pe care il traverseaza.

Spre deosebire de absorbtie si emisie, imprastierea sau difuzia radiatiei nu implică tranzitii intre stari cu energie cuantificata ale unei particule.

Fenomenul se explica prin producerea undelor secundare in mediul difuzant, a caror directie este diferita de cea a undei primare. Cand frecventa undelor secundare este aceeasi cu a undei primare, avem de-a face cu imprastierea elastica (Rayleigh, Mie), iar cand frecventa undelor secundare este diferita de a undelor primare, difuzia este inelastica (Brillouin, Raman, imprastierea de raze X inelastica, Compton).

Din perspectiva acestei lucrari important de retinut este fenomenul de imprastiere Raman. Astfel, fiind considerata o molecula aflata initial in starea fundamentala de vibratie, υ0, dupa cum se poate vedea din Fig.1.5, la interactia cu radiatia electromagnetica, molecula va fi polarizata, intrand in oscilatie.

Energia primita suplimentar este E0, energia radiatiei incidente. Molecula nu va fi insa intr-o stare excitata in sensul conventional, desi energia ei a crescut in urma interactiei cu radiatia incidenta. Molecula nu a fost excitata pe nici un nivel cuantificat de energie si ramane cu energia suplimentara numai atata timp cat trece unda electromagnetica. Dupa trecerea undei, molecula polarizata revine pe un nivel cuantificat de energie vibrationala, incetand sa oscileze. Daca nivelul cuantificat este altul decat cel ocupat initial de molecula, υ0, pierderea de energie ER va fi mai mica decat energia primita, E0.

a) Imprastiere Stokes b) Imprastiere anti-Stokes

Fig.1.5. Reprezentarea nivelelor energetice ale unei molecule si a tranzitiilor corespunzatoare la difuzia radiatiei prin efect Raman.

Dupa cum se observa din Fig.1.5.a, diferenta E0 – ER este egala cu diferenta de

energie intre starea de vibratie fundamentala si starea de vibratie excitata. Ev este extrasa din radiatia incidenta, astfel incat radiatia difuzata va contine o componenta cu frecventa υR egala cu diferenta intre frecventa υ0 a radiatiei incidente si υv a vibratiei moleculare active in Raman.

27

Difuzia Raman de catre moleculele aflate deja in stari vibrationale excitate este prezentata in Fig.1.5.b. In acest caz, molecula se afla pe un nivel de excitare vibrationala (de exemplu υ1). Interactionand cu radiatia incidenta, energia ei creste cu valoarea E0, egala cu hυ0. Daca molecula revine la nivelul de vibratie fundamental, energia pierduta va fi ER’ = E0 + Ev. Frecventa υR’ a acestei radiatii difuzate va fi egala cu suma frecventelor radiatiei incidente υ0 si a vibratiei moleculare υv.

Efectul Raman este aplicabil nu numai tranzitiilor de vibratie ci si altor tranzitii care implica o schimbare in polarizabilitate, ca de exemplu tranzitii de rotatie sau electronice. Deplasarea Raman a liniilor spectrale este independenta de frecventa radiatiei incidente folosite. Intensitatea radiatiei imprastiate variaza insa cu puterea a patra a frecventei radiatiei incidente.

Spectrul Raman este, in general, asemanator cu spectrul in IR pentru moleculele complexe [1.46-1.48].

1.4. EFECTELE POLUARII ASUPRA BIOSFEREI

Efectele toxice ale poluantilor, in general, nu sunt pe deplin intelese sau apreciate uneori de catre medici si de populatie. Unele substante chimice, cum ar fi azbestul, clor-vinilul si plumbul au fost dovedite ca promotori ai unor boli grave. De asemenea, exista o evidenta a cresterii incidentei cancerului, astmului si a dereglarilor de dezvoltare, toate acestea fiind puse pe seama expunerii la substante chimice poluante in special a copiilor. Studierea efectelor expunerii subiectilor umani la factori poluanti este dificila din cauza conditiilor etice. Pe cat de greu este de stabilit o conexiune intre expunerea la contaminanti si efectele asupra sanatatii populatiei, pe atat de greu, daca nu chiar mai greu, este de realizat un astfel de studiu la nivel de ecosistem, dat fiind numarul foarte mare de specii implicate la diferite nivele de organizare biologica si numarul factorilor de mediu. Studii recente au identificat multe dintre produsele farmaceutice ca fiind potentiali contaminanti ai mediului, care pot afecta reproducerea si dezvoltarea factorului biotic de-a lungul mai multor generatii [1.31]. Unele dintre aceste substante nu sunt indepartate in timpul procesului de tratare a apelor uzate [1.49, 1.50], ele fiind identificate in efluentii tratati si in apa potabila, ceea ce demonstreaza ca in mod frecvent tratarea deseurilor nu afecteaza structura chimica si, implicit toxicitatea medicamentelor [1.51-1.53]. Desi substantele de natura farmaceutica sunt introduse in mediu in concentratii foarte scazute, continua expunere, in special la varste fragede, poate avea efecte semnificative asupra indivizilor, populatiilor sau ecosistemului, in general. Impactul ecologic al expunerii pe termen lung la amestecuri complexe de astfel de substante nu este cunoscut inca. Multe dintre aceste chimicale sunt cunoscute ca fiind persistente atat in timpul sesiunilor de tratare a deseurilor, cat si in natura. Recent a fost dezvoltat servicul “Produse farmaceutice in mediu; informatii pentru evaluarea riscului” administrat de Centrul National pentru Stiinta Oceanului (NOOA) si Centrul pentru Protectia Mediului si Cercetari Biomoleculare din S.U.A [1.54]. Baza de date furnizeaza informatii privitor la cantitatile prescrise, nivelele detectate in mediul acvatic, structura chimica, greutatea moleculara, solubilitatea in apa, persistenta in mediu, informatii generale privind toxicitatea si nivele specifice de toxicitate ale produselor farmaceutice asupra unor grupe de organisme: alge, moluste, crustacee si animale terestre. Toate informatiile sunt obtinute din literatura de specialitate si sunt destinate cercetarilor de identificare a locatiilor celor mai expuse.

28

Medicamentele de uz veterinar au beneficiat de mai putina atentie din partea cercetatorilor in ceea ce priveste studiile de eco-toxicitate. Practicile curente de crestere a animalelor si de acvacultura presupun folosirea unei largi game de medicamente (antibiotice, potentiatori de crestere, suplimente alimentare, etc.) necesare mentinerii sanatatii animalelor, precum si unei produceri eficiente de hrana. Recent, nivele scazute de medicamente de uz veterinar (concentratii situate in gama de valori ppb pana la ppm) au fost detectate in sol, ape de suprafata si ape subterane din multe regiuni agricole [1.55]. Cu toate ca prezenta si impactul asociat al catorva compusi antibacterieni au fost studiate, impactul unei mari majoritati de substante farmaceutice de uz veterinar asupra sanatatii biodiversitatii ecosistemului nu este inca pe deplin inteles. A fost identificata prezenta mai multor antibiotice in hrana destinata pestilor la o pastravarie. Astfel, studiile efectuate concluzioneaza ca ormetoprim si sulfadimethoxine persista in apa perioade de timp mai lungi decat oxitetraciclina [1.56]. In plus, este sugerat faptul ca recircularea apei in cadrul fermei piscicole poate conduce la expunerea neintentionata a pestilor sanatosi la nivele scazute de concentratie de antibiotic. 1.5. REFERINTE BIBLIOGRAFICE: [1.1] Derimian, Y.; Karnieli, A.; Kaufman, Y.J.; Andreae, M.O.; Andreae, T.W.; Dubovik,

O.; Maenhaut, W.; Koren, I. The role of iron and black carbon in aerosol light absorption. Atmospheric Chemistry and Physics Discussions, Vol.7, pag. 8159-8192, 2007;

[1.2] Jacobson, M. Z. Climate response of fossil fuel and biofuel soot, accounting for soot’s feedback to snow and sea ice albedo and emissivity. J. Geophys. Res., Vol.109, D21201, pag. 15, 2004;

[1.3] Chung, S. H.; Seinfeld, J. H. Climate response of direct radiative forcing of anthropogenic black carbon. J. Geophys. Res., Vol.110, D11102, pag. 25, 2005;

[1.4] Dubovik, O.; Holben, B.; Eck, T. F.; Smirnov, A.; Kaufman, Y. J.; King, M. D.; Tanre, D.; Slutsker, I. Variability of absorption and optical properties of key aerosol types observed in worldwide locations. J. Atmos. Sci., Vol.59, Nr.3, pag. 590–608, 2002;

[1.5] Dubovik, O.; Holben, B.; Lapyonok, T.; Sinyuk, A.; Mishchenko, M.I.; Yang, P.; Slutsker, I. Non-spherical aerosol retrieval method employing light scattering by spheroids. Geophys. Res. Lett., Vol.29, Nr. 10, pag. 1415, 2002;

[1.6] Andreae, M.O.; Gelencser, A. Black carbon or brown carbon? The nature of light absorbing carbonaceous aerosols. Atmos. Chem. Phys.,Vol. 6, pag. 3131–3148, 2006;

[1.7] Schkolnik, G.; Chand, D.; Hoffer, A.; Andreae, M.O.; Erlick, C.; Swietlicki, E.; Rudich, Y. Constraining the density and complex refractive index of elemental and organic carbon in biomass burning aerosol using optical and chemical measurements. Atmos. Environ., Vol.41, Nr. 5, pag. 1107–1118, 2007;

[1.8] Kirchstetter, T. W.; Novakov, T.; Hobbs, P.V. Evidence that the spectral dependence of light absorption by aerosols is affected by organic carbon. J. Geophys. Res., Vol.109, D21208, pag. 12, 2004;

[1.9] Sokolik, I.N.; Toon, O.B. Incorporation of mineralogical composition into models of the radiative properties of mineral aerosol from UV to IR wavelengths. J. Geophys. Res., Vol.104, Nr. D8, pag. 9423–9444, 1999;

29

[1.10] Lafon, S.; Sokolik, I.N.; Rajot, J.L.; Caquineau, S.; Gaudichet ,A. Characterization of 30 iron oxides in mineral dust aerosols: Implications for light absorption, J. Geophys. Res., Vol.111, D21207, pag. 19, 2006;

[1.11] Svanberg, S. Geophysical gas monitoring using optical techniques: volcanoes, geothermal fields and mines, Optics and Lasers in Engineering, Vol.37, Nr.2-3, pag. 245-266, 2002;

[1.12] USGS Volcano Hazards Program. Disponibil la: http://volcanoes. usgs.gov; [1.13] Pinto, J.P.; Turco, R.P.; Toon, O.B. Self-limiting physical and chemical effects in

volcanic eruption clouds. J. Geophys. Res., Vol. 94, pag. 11165– 11174, 1989; [1.14] Mori, T.; Notsu, K. Remote CO, COS, CO2, SO2 and HCl detection and

temperature estimation of volcanic gas. Geophys. Res. Lett., Vol. 20, pag. 1335–1358, 1997;

[1.15] Francis, P.; Maciejewski, A.; Oppenheimer, C.; Chaffin, C.; Caltabiano, T. SO2:HCl ratios in the plumes from Mt Etna and Vulcano determined by Fourier transform spectroscopy. Geophys. Res. Lett. Vol. 22, pag 1717–1720, 1995;

[1.16] Burton, M.R.; Oppenheimer, C.; Horrocks, L.A.; Francis, P.W. Remote sensing of CO2 and H2O emission rates of Masaya volcano, Nicaragua. Geology, Vol.28, pag. 915– 918, 2000;

[1.17] Platt, U. Differential Optical Absorption Spectroscopy (DOAS) in Air Monitoring by Spectroscopic Techniques, Sigrist, M. (Ed.), pag. 27– 83, 1994;

[1.18] Bobrowski, N.; Honninger, G.; Lohberger, F.; Platt, U. IDOAS: A new monitoring technique to study the 2D distribution of volcanic gas emissions. Journal of Volcanology and Geothermal Research, Vol.150, pag. 329-338, 2006;

[1.19] Balis, D.S.; Amiridis, V.; Zerefos, C.; Gerasopoulos, E.; Andreae, M.; Zanis, P.; Kazantzidis, A.; Kazadzis, S.; Papayannis, A. Raman lidar and sun photometric measurements of aerosol optical properties over Thessaloniki, Greece during a biomass burning episode. Atmospheric Environment, Vol.37, pag. 4529–4538, 2003;

[1.20] Taubman, B.F.; Marufu, L.T.; Vant-Hull, B.L.; Piety, C.A.; Doddridge, B.G.; Dickerson, R.R.; Li, Z. Smoke over haze: Aircraft observations of chemical and optical properties and the effects on heating rates and stability. Journal of Geophysical Research, Vol.109, D02206, pag. 16, 2004;

[1.21] Twigg, M.V. Progress and future challenges in controlling automotive exhaust gas emissions. Applied Catalysis B: Environmental, Vol.70, Nr. 1-4, pag. 2-15, 2007;

[1.22] Kagawa, J. Health effects of diesel exhaust emissions—a mixture of air pollutants of worldwide concern. Toxicology, Vol.181-182, pag. 349-353, 2002;

[1.23] National Pesticide Information Center. Disponibil la: http://npic.orst.edu/; [1.24] Cadariu, A. Raportul de Tara privind Poluantii Organici Persistenti. Disponibil la

http://eea.ngo.ro/materiale/CSR_final_rom.pdf; [1.25] Weisenburger, D.D. Human health effects of agrichemical use. Human Pathology,

Vol.24, Nr. 6, pag. 571-576, 1993; [1.26] Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency,

Washington, D.C. 20460. The Incorporation of Water Treatment Effects on Pesticide Removal and Transformations in Food Quality Protection. Disponibil la http://www.epa.gov/oppfead1/trac/science/water_treatment.pdf

[1.27] Petrovic, M.; Radjenovic, J.; Postigo, C.; Kuster, M.; Farre, M.; López de Alda, M.; Barceló, D. Emerging Contaminants in WasteWaters: Sources and Occurrence, in The Handbook of Environmental Chemistry, Vol.5 Water Pollution Partea S/1, Ed. Hutzinger, O.;·Barceló, V;·Kostianoy, V., Springer, Germania, 2008;

30

[1.28] Lienert, J.; Bürki, T.; Escher, B.I. Reducing micro-pollutants with source control: substance flow analysis of 212 pharmaceuticals in faeces and urine. Water Sci Technol, Vol.56, pag. 87-96, 2007;

[1.29] Drillia, P.; Dokianakis, S.N.; Fountoulakis, M.S.; Kornaros, M.; Stamatelatou, K.; Lyberatos, G. On the occasional biodegradation on pharmaceuticals in the activated sludge process: the example of the antibiotic sulfamethoxazole. J Hazard Mat, Vol.122, pag. 259-265, 2005;

[1.30] Kuspis, D.A.; Krenzelok, E.P. What happens to expired medications? A survey of community medicine disposal. Vet Hum Toxicol, Vol.38, pag. 48-49, 1996;

[1.31] Daughton, C.G.; Ternes, T.A. Pharmaceuticals and personal care products in the environment: agents of subtle change? Environ Health Perspect, Vol.107, pag. 907-937, 1999;

[1.32] Mimeault, C.; Woodhouse, A.J.; Miao, X.S.; Metcalfe, C.D.; Moon, T.W.; Trudeau, V.L. The human lipid regulator, gemfibrozil bioconcentrates and reduces testosterone in the goldfish, Carassius Auratus. Aquat Toxicol, Vol.73, Nr. 1, pag. 44-54, 2005;

[1.33] Cleuvers, M. Initial risk assessment for three β-blockers found in the aquatic environment. Chemosphere, Vol.59, pag.199-205, 2005;

[1.34] Brooks, B.W.; Chambliss, C.K.; Stanley, J.K.; Ramirez, A.; Banks, K.E.; Johnson, R.D.; Lewis, R.J. Determination of select antidepressants in fish from an effluent-dominated stream. Environ Toxicol Chem, Vol.24, Nr. 2, pag. 464-469, 2005;

[1.35] Kolpin, D.W.; Furlong, E.T.; Meyer, M.T.; Thurman, E.M.; Zaugg, S.D.; Barber, L.B.; Buxton, H.T. Pharmaceuticals, hormones and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000 – A national reconnaissance. Environ Sci Technol, Vol.36, Nr. 6, pag. 1202-1211, 2002;

[1.36] Tolls, J. Sorption of veterinary pharmaceuticals—a review. Environ Sci Technol 35, pag. 3397–3406, 2001;

[1.37]. Boxall, A.B.A.; Blackwell, P.; Cavallo, R.; Kay, P.; Tolls, J. The sorption and transport of a sulphonamide antibiotic in soil systems. Toxicol Lett, Vol.131, pag. 19-28, 2002;

[1.38]. Jones, O.A.H.; Voulvoulis, N.; Lester, J.N. Partitioning Behavior of Five Pharmaceutical Compounds to Activated Sludge and River Sediment. Arch Environ Contam Toxicol, Vol.50, pag. 297-305, 2006;

[1.39] Scientific Aspects of Control of Biological Weapons, Report of a Royal Society Study Group, The Royal Society, UK, 1994;

[1.40] Lawrence Livermore National Laboratory, Reducing the Threat of Biological Weapons. Chemical/Biological Nonproliferation Program, June 1998. Disponibil la: http://www.llnl.gov/str/Milan.html;

[1.41] Martin, W.C.; Wiese, W.L. Atomic Spectroscopy in Atomic, Molecular, and Optical Physics Handbook, Drake, G.W.F. (Ed.), AIP Press, Woodbury, NY, 1996;

[1.42] Svanberg, S. Atomic and Molecular Spectroscopy: Basic Aspects and Practical Applications, Springer, Germania, 2004;

[1.43] Eliasevici, M.A. Spectroscopia atomica si moleculara, Ed. Academiei R.S.R., 1966; [1.44] Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, 1983; [1.45] Schulman, S. Fluorescence and Phosphorescence Spectroscopy: Physicochemical

Principles and Practice, Pergamon Press, Oxford, Anglia, 1977; [1.46] Jonasz, M.; Fournier, G. Light Scattering by Particles in Water, Elsevier, Olanda,

2007; [1.47] Mishchenko, M.; Hovenier, J.W.; Travis, L. Light Scattering by Nonspherical

Particles, Academic Press, U.S.A., 2000;

31

[1.48] Fabelinskii, I.L. Molecular Scattering of Light, Plenum Press, New York, 1968; [1.49] Ternes, T.A.; Meisenheimer, M.; McDowell, D.; Sacher, F.; Brauch, H.-J.; Haist-

Gulde, B.; Gudrun Preuss, G.; Wilme, U.; Zulei-Seibert, N. Removal of pharmaceuticals during drinking water treatment. Environ. Sci. Technol., Vol.36, pag. 3855-3863, 2002;

[1.50] Webb, S.; Ternes, T.; Gibert, M.; Olejniczak, K. Indirect human exposure to pharmaceuticals via drinking water. Toxicol Lett, Vol.142, Nr. 3, pag. 157-167, 2003;

[1.51] Ternes, T.; Stumpf, M.; Mueller, J.; Haberer, K.; Wilken, R.D.; Servos, M. Behaviour and occurrence of estrogens in municipal sewage treatment plants-I. Investigations in Germany, Canada and Brazil. Sci Total Environ, Vol.225, pag. 81-91, 1999;

[1.52] Metcalfe, C.D.; Koenig, B.G.; Bennie, D.T.; Servos, M.; Ternes, T.A.; Hirschet, R. Occurrence of neutral and acidic drugs in the effluents of canadian sewage treatment plants. Environ Toxicol Chem, Vol.22, pag. 2872-2880, 2003;

[1.53] Metcalfe, C.D.; Miao, X.S.; Koenig, B.G.; Strugeret, J. Distribution of acidic and neutral drugs in surface water near sewage treatment plants in the lower Great Lakes, Canada. Environ Toxicol Chem, Vol.22, Nr. 11, pag. 2881-2889, 2003;

[1.54] Pharmaceuticals in the Environment, Information for Assessing Risk website. National Centers for Coastal Ocean Science, Center for Coastal Environmental Health and Biomolecular Research. Disponibil la: http://www.chbr.noaa.gov/peiar/default.aspx.

[1.55] Boxall, A.B.A.; Kolpin, D.W.; Halling-Sorensen, B.; Tolls, J. Are veterinary medicines causing environmental risks? Environ Sci Technol, Vol.37, Nr. 286A, pag. 286-294, 2003;

[1.56] Thurman, E.M.; Dietze, J.E.; Scribner, E.A. Occurrence of antibiotics in water from fish hatcheries. US Geological Survey Fact Sheet, Vol.120, Nr. 2, pag. 4, 2002.

32

CAPITOLUL 2

METODE SI TEHNICI OPTICE SI CONEXE DE MASURARE A POLUANTILOR MEDIULUI

2.1. INTRODUCERE Monitorizarea mediului a devenit o problema stringenta din cauza evolutiei poluarii la scara locala, regionala si globala. In ceea ce priveste aplicatiile la nivel atmosferic, gaurile de ozon si emisiile gazoase cu efect de sera necesita o monitorizare atenta la scara larga prin evaluarea nivelelor de poluare din zonele industriale si din orase. De asemenea, apele sunt afectate prin deversarea unor substante nocive rezultate in urma proceselor de productie. In acelasi timp, depozitarea reziduurilor pe sol sau in subsol si folosirea fara discernamant in agricultura a unor substante prezinta un risc important in ceea ce priveste contaminarea acestui factor de mediu. Stresul provocat de poluare nu este un atribut exclusiv uman, ci se extinde si la celelalte componente biotice ale mediului. Asa incat plantele si animalele raspund prin mecanisme proprii la actiunea nociva a factorilor poluanti, facand obligatorie o activitate constanta de masurare a acestora. Metodele optice reprezinta un domeniu important in cadrul tehnicilor de masura si control a poluarii tuturor factorilor de mediu, fie biotici, fie abiotici. Aceste metode indeplinesc cerintele de non-intrusivitate si selectivitate, permitand controlul on-line si in timp real al nivelului de poluare. In scopul obtinerii unor informatii mai complete, acestea pot fi cuplate si cu alte procedee de masurare, cum sunt tehnicile cromatografice.

Baza tuturor tehnicilor spectroscopice o constituie procesele de interactie a radiatiei cu materia. In cadrul acestui capitol vor fi trecute in revista cateva dintre aceste tehnici de masura, care se bazeaza pe proprietatile substantelor de a absorbi sau emite radiatie electromagnetica: spectroscopia de absorbtie in UV/VIZ, spectroscopia de absorbtie in IR cu Transformata Fourier (FTIR), Fluorescenta Indusa cu Laser (LIF), spectroscopia de emisie Raman si spectroscopia de Rezonanta Magnetica Nucleara (RMN). De asemenea, va fi prezentata succint tehnica analitica de Cromatografie in faza Lichida cuplata cu Spectrometria de Masa (HPLC-MS). Dintre interactiile optice, absorbtia are cea mai mare sectiune eficace. Cele mai sensibile metode de masura sunt bazate pe absorbtie pentru a detecta specii atomice si moleculare. Spectrele de absorbtie prezinta o banda larga, pornind din regiunea microundelor, unde tranzitiile rotationale sunt responsabile pentru absorbtie, pana in vacuum UV, pentru care tranzitiile electronice caracterizeaza procesul de absorbtie. Pentru analizele chimice si detectia spectroscopica a poluantilor, principalele intervale de lungimi de unda utilizate sunt in IR (2,5 – 25 μm) si UV/VIZ (250 – 700 nm). Sectiunea eficace moleculara de absorbtie in IR mediu este tipic de ordinul a 10-18 cm2, cu 6-8 ordine de marime mai mare decat sectiunea eficace Raman, care are ca rezultat cresterea considerabila a sensibilitatii de detectie [2.1, 2.2]. Desi sursele de radiatie necoerenta sunt folosite cu succes in domeniul monitorizarii mediului, dezvoltarea laserilor constituie un impuls in aplicatiile

33

metodelor optice in controlul poluarii datorita acoperirii spectrale si divergentei mici ale acestor surse [2.3]. Diferite scheme sunt aplicate pentru masurarea absorbtiei in cadrul detectiei urmelor de poluanti. Cele mai multe pornesc de la cunoscuta lege Lambert-Beer, conform careia intensitatea radiatiei transmise la lungimea de unda λ, I2(λ) depinde de intensitatea incidenta I1(λ) (Capitolul 1). 2.2. SPECTROSCOPIA DE ABSORBTIE IN UV/VIZ

Inregistrarea datelor furnizate prin intermediul spectroscopiei de absorbtie se realizeaza cu ajutorul spectrofotometrului [2.4]. In Fig.2.1 se prezinta schema generala a unui spectrofotometru de absorbtie.

Fig.2.1. Schema generala a unui spectrofotometru de absorbtie cu dublu fascicul.

Partile esentiale sunt: sursa stabilizata de radiatii electromagnetice, monocromatorul, care separa radiatiile in functie de lungimea de unda, celule transparente care contin proba de analizat si proba de referinta, detector si sistemul de evaluare/afisare a rezultatului.

Celula ce contine proba este plasata dupa monocromator la instrumentele care opereaza in domeniul UV/VIZ, pentru a diminua o eventuala descompunere sau fluorescenta a probei datorata radiatiilor cu energie mare neseparate din fasciculul incident.

Sursele de radiatii constau dintr-un material care este excitat la stari cu energie ridicata printr-o descarcare electrica la tensiune mare sau prin incalzire electrica. Prin revenirea materialului la stari cu energie mai mica sau la starea fundamentala are loc o emisie de radiatie electromagnetica. Pentru domeniul UV al spectrului, cele mai utilizate surse sunt lampile de hidrogen sau deuteriu si emit o radiatie continua in domeniul (180 – 350) nm. Pentru domeniul VIZ si NIR se utilizeaza lampi cu filament de wolfram. Radiatia continua emisa este in domeniul (350 – 2500) nm.

Separarea radiatiilor de mai multe lungimi de unda ale unei surse in benzi inguste sau chiar in radiatii monocromatice se poate face utilizand filtre sau monocromatoare.

Un filtru este caracterizat prin latimea efectiva a benzii ce reprezinta domeniul de lungimi de unda pentru care transmitanta este cel putin jumatate din valoarea maxima. Filtrele colorate permit transmiterea radiatiilor cu o latime a benzii spectrale efective cuprinsa in mod obisnuit intre (20 – 50) nm.

34

Monocromatoarele separa radiatiile policromatice in functie de lungimea de unda permitand obtinerea unor radiatii cu o banda spectrala foarte ingusta, practic monocromatica. Componentele unui monocromator sunt: o fanta de intrare prin care patrunde radiatia monocromatica de la sursa, un colimator cu una sau mai multe lentile, sau cu o oglinda concava, un sistem de dispersie, prisma sau retea de difractie care separa radiatiile in functie de lungimea de unda, un sistem de focalizare alcatuit din una sau mai multe lentile, sau o oglinda concava si o fanta de iesire, care izoleaza banda spectrala dorita blocand toate celelalte radiatii. Largimea de banda efectiva a radiatiei ce paraseste monocromatorul depinde, in principal de elementul dispersiv utilizat si de largimea fantelor atat de la intrarea cat si de la iesirea acestuia.

Sistemele de dispersie sunt caracterizate de: dispersia unghiulara, dispersia liniara si puterea de rezolutie.

Dispersia unghiulara este data de raportul dθ/dλ, dθ fiind unghiul pe care il fac intre ele doua radiatii ce parasesc sistemul de dispersie si dλ fiind diferenta de lungime de unda dintre ele.

Dispersia liniara se defineste in planul de focalizare al spectrului, fiind data de raportul dℓ/dλ, dℓ fiind distanta intre doua linii spectrale si dλ diferenta de lungime de unda dintre ele.

Puterea de rezolutie este data de raportul λ/dλ, λ fiind lungimea de unda medie a doua linii spectrale plasate alaturat si pentru care se mai obtine o imagine distincta si dλ diferenta dintre lungimile de unda ale acestor linii.

Drept elemente de dispersie se utilizeaza prisme si retele de difractie. Dispersia in prisma se realizeaza datorita variatiei indicelui de refractie al

radiatiilor in functie de lungimea de unda. Puterea de rezolutie a prismelor este data de relaţia:

λλλ

ddnt

dRp == (2.1)

unde t este baza prismei, iar dn/dλ este dispersia indicelui de refractie. Puterea de rezolutie este limitata de unghiul la varf al prismei si de puterea de dispersie a materialului dn/dλ care nu este constanta, fiind functie de lungimea de unda.

Materialele din care sunt realizate prismele depind de domeniul spectral in care acestea se utilizeaza. Ele trebuie sa fie transparente si sa aiba o dispersie suficient de mare. Pentru domeniul UV se utilizeaza prisme din cuart sau dioxid de siliciu topit, care sunt transparente pana la aproximativ 200 nm. Fluoritul (CaF2) este transparent pana la 125 nm putand fi utilizat in ultravioletul de vid. Pentru domeniul VIZ si IR apropiat prismele se fac din sticla de diferite calitati.

Retelele de difractie pot lucra in transmisie sau in reflexie. Suprafata retelei este puternic reflectorizanta si prezinta un mare numar de santuri (zgarieturi) echidistante, in mod obisnuit (600 – 2000) pe mm, in functie de domeniul spectral in care se utilizeaza. Radiatiile reflectate de reteaua de difractie sufera un fenomen de interferenta pozitiva sau negativa in functie de lungimea de unda a acestora si de diferenta de drum strabatuta.

Separarea radiaţiilor se face prin rotirea retelei de difractie, in fata fantei de iesire a monocromatorului fiind aduse radiatiile de diferite lungimi de unda ce apartin spectrului de ordinul 1. Retelele de difractie prezinta, spre deosebire de prisme, o dispersie unghiulara liniara pe intreg domeniul de lungimi de unda utilizat, ceea ce constituie un avantaj.

Un detector de radiatii absoarbe energia fotonilor receptionati si o transforma intr-o cantitate masurabila. Orice detector trebuie sa genereze un semnal care sa poata fi corelat cantitativ cu intensitatea radiatiei receptionate.

35

Cerintele cele mai importante pentru un detector sunt: 1) sensibilitate mare si un zgomot de fond cat mai mic; 2) timp scurt de raspuns; 3) stabilitatea raspunsului in timp; 4) dependenta liniara intre raspunsul detectorului si intensitatea radiatiei receptionate.

In domeniul UV/VIZ se pot utiliza detectorii fotoelectrici (celule fotovoltaice, celule fotoemisive, fotodiode si tuburi fotomultiplicatoare).

Semnalul electric furnizat de un detector poate fi masurat fara amplificare si de cele mai multe ori este necesara o astfel de amplificare. In aparatele moderne sistemul de evaluare se bazeaza in mare masura pe utilizarea calculatoarelor care pot prelua semnalul de la amplificator, il compara cu semnalele corespunzatoare ale unor probe etalon, stocate in memorie, apoi dau direct datele analitice [2.4].

Desi toate spectrofotometrele au partile componente prezentate in Fig.2.1, sunt multe deosebiri intre ele, depinzand de producator, domeniul spectral pentru care au fost concepute, rezolutia acestora etc.

In instrumentele cu doua fascicule se realizeaza cu ajutorul unui dispozitiv optic o separare a radiatiilor provenite de la sursa in doua fascicule. Un fascicul este trecut prin proba de referinta, iar celalalt prin proba de analizat. Intensitatile celor doua fascicule sunt apoi comparate, fie continuu, fie alternativ, de mai multe ori pe secunda. Astfel, in cazul instrumentelor cu doua fascicule are loc o compensare a fluctuatiilor intensitatii sursei, a raspunsului detectorului si a amplificarii, masurandu-se numai diferenta celor doua semnale.

Spectrofotometrele moderne sunt controlate de un calculator care usureaza foarte mult operarea acestora, spectrele de absorbtie sau valorile masurate fiind afisate pe monitor.

2.3. SPECTROSCOPIA IN INFRAROSU CU TRANSFORMATA FOURIER (FTIR)

Scopul aplicatiilor spectroscopiei in IR este sa determine grupurile chimice functionale pe care le contine o anumita substanta. Fiecare grup functional absoarbe radiatie IR pe o frecventa caracteristica. Astfel, un set de perechi intensitate a radiatiei/frecventa (lungimea de unda in IR) identifica grupurile chimice cunoscute.

Unele spectrofotometre disponibile comercial opereaza cu surse conventionale de radiatie, cuplate cu monocromatoare sau interferometre in scopul stabilirii rezolutiei spectrale dorite. Ultimul dispozitiv, cunoscut ca spectrometru cu transformata Fourier (FTIR), poseda o eficienta optica si temporala crescuta in comparatie cu spectrometrele dispersive.

Comportarea specifica si disponibilitatea benzilor in IR fac din spectrometria FTIR o metoda de laborator sensibila pentru analiza amestecurilor de poluanti. Ea se bazeaza pe interferenta radiatiei dintre doua fascicule care produc o interferograma [2.3].

Componentele de baza ale unui spectrometru FTIR sunt prezentate schematic in Fig.2.2.

Radiatia provenita de la sursa IR este trimisa spre proba prin intermediul unui interferometru inainte de a fi masurata de un detector. Dupa amplificarea semnalului, la care componenta de frecventa inalta este eliminata de un filtru, datele sunt convertite in semnale digitale de un convertor analog digital si apoi transferate computerului pentru procesare matematica.

36

Fig.2.2. Schema unui spectrometru FTIR.

Cel mai comun interferometru utilizat este interferometrul Michelson (Fig.2.3), care este format din doua oglinzi plane perpendiculare, una dintre ele mobila intr-o directie perpendiculara pe plan [2.5]. Un film semireflectator, divizorul de fascicul, imparte spatiile acestor doua oglinzi. Materialul din care este confectionat acesta este ales in conformitate cu regiunea ce urmeaza a fi examinata.

Fig.2.3. Interferometrul Michelson.

Materiale precum Ge sau Fe2O3 sunt acoperite cu un substrat de KBr sau CsI pentru a produce divizarea regiunii spectrale din infrarosu in domeniul spectral mediu sau apropiat. Filmele organice – polietilentereftalat – sunt utilizate pentru regiunea IR indepartat. Daca un fascicul colimat de radiatie monocromatica de lungime de unda λ este trecut printr-un divizor ideal de fascicul, 50% din radiatia incidenta va fi reflectata pe una din oglinzi si 50% va fi transmis prin ea catre cealalta oglinda. Cele doua fascicule sunt reflectate de oglinzi, intorcandu-se la divizorul de fascicul unde se recombina si interfera. 50% din fasciculul reflectat de oglinda fixa este transmis prin divizorul de fascicul si 50% este reflectat inapoi in directia sursei. Fasciculul emergent din interferometru la 900 fata de fasciculul incident este denumit fascicul transmis si aceasta este partea detectata, pe ea bazandu-se spectroscopia FTIR. Oglinda mobila produce o diferenta de drum optic (δ) intre cele doua brate ale interferometrului. Pentru o diferenta de drum optic egala cu un numar intreg de lungimi de unda (nλ), interferenta este constructiva, in timp ce in cazul unei diferente

37

de drum optic de (n+21 )λ (unde n este un numar intreg, pozitiv), cele doua fascicule

interfera intr-un mod distructiv. Modelul interferentei rezultate este unul sinusoidal, el fiind redat in Fig.2.4 pentru o sursa de radiatie monocromatica (a) si pentru o sursa policromatica (b).

Fig.2.4. Interferograme pentru radiatie monocromatica (a) si pentru radiatie policromatica (b).

In ceea ce priveste procesul matematic de conversie a modelului de interferenta intr-un spectru, cele doua ecuatii interconvertibile prin metoda transformatei Fourier, sunt urmatoarele [2.6]:

I(δ) = ∫ ∫∞ ∞

+=0 0

~)]~2cos(1)[~(21~)~,( υδυπυυυδ dIdI (2.2)

I( ∫∞

=0

)~,()~ δυδυ dI (2.3)

Interferograma este detectata sub forma unui semnal analog, dupa care el trebuie digitizat pentru a avea loc procesarea matematica in scopul convertirii intr-un spectru. Spectrometrele FTIR folosesc surse Nernst (care contin amestecuri de oxizi de Zr, Y sau Er, astfel incat filamentele conduc electricitate la temperaturi ridicate) sau Globar (SiC) pentru domeniul IR mediu sau lampa cu Hg pentru IR indepartat. Ca detectori, exista doua tipuri mai des intalnite:

• Detector normal pentru utilizari de rutina, care este un dispozitiv piroelectric ce incorporeaza sulfat triglicin-deuteriu (DTGS) intr-o fereastra din halogenuri de metal alcalin rezistenta la temperatura;

• Pentru analize mai sensibile se utilizeaza telura de mercur si cadmiu (HgCdTe), dar detectorul necesita racire cu azot lichid [2.7]. Spectrometria FTIR prezinta cateva avantaje semnificative fata de instrumentele

dispersive. Unul dintre ele se datoreaza unei imbunatatiri a raportului semnal-zgomot pe unitatea de timp, care este proportional cu radacina patrata a numarului de elemente de rezolutie ce pot fi monitorizate. In plus, deoarece spectrometria FTIR nu necesita utilizarea unei fante sau a altui dispozitiv restrictiv, in particular la rezolutie mica, iesirea totala a sursei poate fi trecuta in mod continuu prin proba. Acest fapt duce la un castig substantial a energiei detectorului care imbunatateste raportul semnal/zgomot (avantaj Jacquinot).

a)

b)

38

Un alt avantaj al spectrometriei FTIR il reprezinta viteza. Oglinda are abilitatea de a parcurge rapid distante mici si aceasta, impreuna cu raportul semnal/zgomot mare face posibila obtinerea de spectre pe o scala a timpului de ordinul milisecundelor (avantaj Felgett sau multiplex).

In interferometrie, factorul care determina precizia pozitiei unei benzi IR este dat de precizia cu care este cunoscuta pozitia oglinzii de scanare. Prin utilizarea unui laser He-Ne ca referinta, pozitia oglinzii este cunoscuta cu o foarte buna precizie (avantaj Connes).

Aceste avantaje, impreuna cu multe altele derivate din posibilitatea procesarii matematice rapide, permit situarea tehnicii de spectroscopie in IR prin transformata Fourier printre cele mai fiabile metode de analiza atat calitativa, cat si cantitativa. Metode avansate de sampling (ATR, care foloseste proprietatea de reflexie totala interna a radiatiei intr-un cristal, conducand la aparitia unei unde evanescente) au extins posibilitatile de investigare oferite de echipamentele existente, probele putand fi evaluate direct, in orice stare de agregare, fara necesitatea pregatirii lor. 2.4. FLUORESCENTA INDUSA CU LASER (LIF)

In anumite conditii un corp poate emite radiatie electromagnetica in domeniul optic al spectrului. Emisia de radiatie poate avea diverse cauze. La obtinerea proprietatilor spectrale de emisie a moleculelor (fluorescenta, fosforescenta) un rol important il are absorbtia de radiatie electromagnetica. Acesta este un proces elementar preliminar emiterii oricarui tip de radiatie. El presupune de fapt inmagazinarea unei cantitati de energie care sa permita popularea starilor electronice de pe care, prin dezexcitare radiativa, se emite radiatie electromagnetica luminoasa. Tehnica de fluorescenta indusa cu laser se bazeaza pe procesele elementare specificate in Capitolul 1. Spectroscopia LIF s-a dovedit a fi una dintre cele mai sensibile metode de monitorizare a componentelor mediului datorita sensibilitatii sale (cantitati mici de proba, concentratii mici ale fluoroforilor) si a caracterului nondistructiv al masuratorilor, cu posibilitatea monitorizarii la distanta prin intermediul fibrelor optice [2.2-2.4, 2.8].

Un sistem experimental LIF (Fig.2.5) cuprinde in mare doua sub-sisteme oarecum independente si anume [2.9]: - sub-sistemul laser de excitare a fluorescentei probei, - sub-sistemul de culegere si prelucrare a fluorescentei probei. Proba de masurat este plasata, functional si geometric, chiar intre cele doua sub-sisteme.

Fig.2.5. Schema generala a sistemului experimental LIF.

Sub-sistemul de excitare laser a fluorescentei probei cuprinde in principiu o sursa de radiatie laser, radiatie care se aplica asupra probei de masurat fie direct, printr-un sistem adecvat de oglinzi si lentile, fie cu ajutorul unei fibre optice corespunzator alese.

39

Sub-sistemul de culegere si prelucrare a semnalului de fluorescenta (prezentat schematic in Fig.2.6 si Fig.2.7) asigura initial culegerea semnalului optic de fluorescenta prin fibra optica, semnal care este transmis unui monocromator, unde este prelucrat prin descompunere spectrala.

Fig.2.6. Sub-sistem 1 de culegere si prelucrare a fluorescentei.

Benzi foarte inguste din semnalul initial sunt extrase succesiv prin fanta de iesire a monocromatorului si transformate in semnal electric in fotodetectorul cuplat cu monocromatorul. Semnalul electric astfel obtinut, care corespunde intensitatii de fluorescenta emise de proba la lungimea de unda la care este acordat monocromatorul, este masurat cu ajutorul unui osciloscop. Fibra optica, ce poate fi monofibra sau manunchi de monofibre, asigura flexibilitatea si mobilitatea necesara transmisiei semnalului de fluorescenta pana la echipamentul de prelucrare. Alegerea tipului de fibra optica utilizabil depinde de spectrul potential al fasciculului optic care trebuie transmis si de eficienta acestei transmisii [2.10]. Monofibra contine un mediu optic dielectric transparent pentru radiatia optica (miez) de lungime mare si sectiune (circulara) relativ mica, avand indicele de refractie constant sau radial variabil; miezul este inconjurat de un material cu indice de refractie mai mic, astfel incat undele luminoase care se propaga in miez sa sufere o reflexie totala la zona de separare dintre cele doua medii. Nu orice unda luminoasa propagandu-se in miez va suferi reflexia totala, care este indeplinita numai pentru undele care patrund in miezul fibrei dupa unghiul limita de acceptanta al fibrei, specific fiecarei fibre si depinzand atat de geometria sistemului (diametrele celor doua medii cu sectiuni concentrice) cat si de indicii de refractie ai celor doua medii. Unghiul maxim de acceptanta al fibrei optice este extrem de important pentru a asigura un cuplaj optim - un transfer optim de energie - de la fibra catre echipamentele la care aceasta este cuplata. Divergenta fasciculului care patrunde in fibra nu trebuie sa depaseasca unghiul de acceptanta al acesteia; pentru a indeplini aceasta conditie fasciculul care se cupleaza la fibra trebuie prelucrat corespunzator cu un sistem de lentile. Mai multe monofibre pot fi asamblate impreuna, capetele ansamblului fiind prelucrate in bloc, pentru a se obtine un manunchi de fibre optice.

Monocromatorul asigura analiza spectrala, dupa lungimile de unda, a unui fascicul de lumina. Aceasta analiza permite recunoasterea unor benzi specifice sau lungimi de unda specifice care se gasesc in radiatia de fluorescenta emisa de un amestec de fluorofori.

40

Radiatia de analizat este introdusa in echipament printr-o fanta de intrare, cuplata cu o fanta de iesire din echipament. Cele doua fante au dimensiuni care pot fi selectate intre 0,05 mm si 1,5 mm ceea ce permite alegerea largimii benzii radiatiei care trece prin echipament. Elementul dispersiv, prisma sau retea de difractie, este plasat intr-un dispozitiv mecanic, prin a carui rotire se “acorda” monocromatorul pe diferite lungimi de unda. Fibra optica este cuplata la monocromator cu ajutorul unui mecanism cu deplasare dupa doua dimensiuni pentru optimizarea transferului radiatiei optice de fluorescenta intre fibra si monocromator. Fotomultiplicatorul (fotodetectorul) cuplat la monocromator, transforma fluxul luminos al radiatiei de fluorescenta intr-un semnal electric proportional cu acel flux. El permite analiza unor fluxuri luminoase de mica intensitate, deoarece ofera o amplificare interna foarte mare (x107.) Osciloscopul este utilizat pentru a vizualiza si masura semnalele electrice care provin de la fotomultiplicator (si care sunt proportionale cu emisia de fluorescenta a probei). Sistemul (2) de culegere si prelucrare a fluorescentei (Fig.2.7), este un aranjament a carui functie este, in general, similara celei a sistemului de culegere si prelucrare a fluorescentei descris mai sus.

Fig.2.7. Sub-sistem 2 de culegere si prelucrare a fluorescentei.

Spre deosebire de cel din urma, ansamblul monocromator-fotomultiplicator este aici miniaturizat la dimensiuni de ordinul a 100 mm, iar fotodetectorul – cunoscut ca si “camera CCD” - este constituit dintr-un sir de 2048 detectori cu semiconductori avand dimensiuni de ordinul a 10 μm fiecare. Un sistem electronic dirijat de un soft dedicat, culege semnalul emis de cei 2048 detectori, il prelucreaza si il afiseaza pe ecranul monitorului unui PC - impreuna cu care sistemul lucreaza.

Pentru primul sistem de prelucrare a fluorescentei, in scopul masurarii intensitatii fluorescentei emise la 100 de valori diferite ale lungimii de unda este nevoie de 100 masuratori individuale (si deci de 100 pulsuri laser de excitare a fluorescentei). In schimb, sistemul cu camera CCD face aceasta masuratoare “dintr-o data” la un singur puls laser care induce fluorescenta; cei 2048 detectori individuali masoara simultan informatia.

2.5. SPECTROSCOPIA RAMAN

Efectul Raman este aplicat pentru elucidarea structurii unor molecule, pentru identificarea unor grupari functionale sau legaturi chimice si pentru analiza cantitativa a unor amestecuri complexe.

41

Spectrul Raman apare in urma unor tranzitii intre stari energetice de vibratie ale moleculelor, insa intr-un mod cu totul diferit fata de spectrul in IR. Aceasta face ca spectrometria Raman si spectrometria de absorbtie in IR sa fie tehnici complementare.

Un spectru Raman este excitat prin iradierea unei probe cu o radiatie monocromatica necoerenta sau coerenta in intervalul spectral UV, VIZ sau NIR. Printr-un proces elementar (descris in Capitolul 1.3.2.2), proba emite o radiatie de obicei necoerenta: linia puternica Rayleigh la frecventa radiatiei excitatoare si semnale slabe la frecvente deplasate finit fata de frecventa radiatiei de excitare – spectrul Raman.

Efectul Raman clasic genereaza doar semnale slabe. Exista insa posibilitatea de a imbunatati acest efect prin folosirea a doua tehnici: spectroscopia de rezonanta Raman – in care se practica excitarea moleculelor in domeniul spectral al absorbtiei electronice si spectroscopia de imprastiere Raman amplificata de suprafata (SERS) - in care semnalul este optimizat prin folosirea unor nanoparticule metalice. Aceste doua metode pot fi chiar combinate, rezultand tehnica de spectroscopie de imprastiere rezonanta Raman amplificata de suprafata (SERRS), in care spectrele Raman sunt inregistrate folosind aceleasi spectrometre ca si in cazul metodei clasice, cu diferente in ceea ce priveste conditiile de excitare si de prezentare a probelor [2.11].

La inregistrarea unui spectru Raman este important ca radiatia difuzata prin efect Rayleigh sa fie indepartata in cat mai mare masura. Radiatiile obtinute prin efect Raman fiind foarte slabe, acestea sunt masurate la un unghi de 900 fata de radiatia excitatoare, asa cum este ilustrat in Fig.2.8. Un dispozitiv de spectroscopie Raman contine o sursa de radiatie pentru excitarea efectului Raman, un aranjament al probei, un dispozitiv pentru dispersia spectrala sau selectia radiatiei si un detector conectat la un dispozitiv de inregistrare si evaluare dotat cu un soft corespunzator.

Fig.2.8. Schema generala a unui dispozitiv experimental de spectroscopie Raman.

Sursa de radiatie ideala pentru generarea imprastierii Raman este laserul, a carui emisie este monocromatica. Deoarece largimea unei benzi Raman este o convolutie a benzilor vibrationale cu linia laser, o sursa de excitatie de frecventa extinsa ar genera un spectru Raman cu benzi largi, slab rezolvate. Beneficii practice ale utilizarii laserilor ca sursa de excitare a efectului Raman le constituie si posibilitatea indepartarii eficiente a semnalului Rayleigh precum si intensitatea puternica a radiatiei emise de acestia. In acelasi timp, divergenta scazuta caracteristica fasciculelor laser permite optimizarea unei varietati de parametri de analiza. Progresul inregistrat in domeniul tehnologiei laserilor, cuplat cu cresterea calitatii componentelor optice aditionale permit utilizarea unei game largi de astfel de echipamente drept sursa de generare a efectului Raman. Pentru acest gen de studii, in

42

prezent se folosesc laserii cu emisie incepand din domeniul spectral UV, pana in NIR. In special sunt implicati laserii cu argon ionizat (488 nm si 515 nm) iar pentru excitarea spectrului Raman in NIR se utilizeaza cu precadere laserii Nd:YAG (1064 nm) [2.12]. Alaturi de sursa de excitare a imprastierii Raman, exista o serie de dispozitive si concepte foarte importante in ceea ce priveste analiza acestui proces. Astfel, multe inovatii au fost aplicate cu scopul optimizarii si amplificarii semnalului prin imbunatatirea interfetei dintre fasciculul laser si spectrometru. Semnalul Raman relativ slab presupune folosirea unui spectrofotometru cat mai eficient posibil pentru a colecta si detecta fotonii imprastiati prin efect Raman. Pentru mentinerea rezolutiei spectrale, focalizarea fasciculului laser pe proba trebuie realizata in mod optim. Introducerea fibrelor optice in scopul transmiterii fasciculului laser incident pe proba si a semnalului generat in urma iradierii catre spectrofotometru ofera avantaje in ceea ce priveste stabilitatea geometriei si flexibilitatea analizei. Valorile tipice ale aperturii numerice ale fibrelor optice specifice domeniului spectral NIR se situeaza intre (0,12 – 0,22), alegerea corecta a tipului de fibra optica fiind unul dintre parametrii critici in construirea sistemului experimental Raman. Marea majoritate a instrumentelor Raman folosesc spectrometre dispersive sau cu transformata Fourier, fiecare dintre solutii prezentand avantaje si dezavantaje care le recomanda pentru aplicatii specifice. In timp ce monocromatoarele traditionale sunt dotate cu fante ajustabile, cele moderne folosesc ca deschidere de admisie diametrul fibrei optice de intrare, iar ca deschidere efectiva de iesire dimensiunea pixelului camerei CCD, ceea ce stabileste limita de rezolutie a echipamentului. Una dintre cele mai importante functii ale spectrometrului Raman este aceea de eliminare a radiatiei laser imprastiate, care poate fi mult mai intensa decat semnalul de interes si care nu poate fi indepartata spatial, astfel ca puterea de separare a aparatului este un parametru critic. Solutia acestei probleme consta in folosirea monocromatoarelor in cascada (duble sau triple) cu rezolutie spectrala ridicata, precum si a filtrelor notch [2.13, 2.14]. Spectrometrele cu transformata Fourier masoara simultan intreg spectrul in forma unei interferograme, limita de rezolutie fiind data de cursa oglinzii mobile [2.15]. Un alt mecanism de selectare a lungimii de unda este filtrul trece-banda acordabil, disponibil comercial sub forma filtrului acusto-optic (AOTF) si a filtrului acordabil cu cristale lichide (LCTF). Fiecare dintre aceste dispozitive se bazeaza pe diferite mecanisme de actiune: AOTF utilizeaza unda acustica generata intr-un cristal clar pentru a modifica unghiul fasciculului incident functie de lungimea de unda, in timp ce LCTF foloseste cristale lichide orientate in scopul intarzierii selective a fasciculului, producand interferenta distructiva a tuturor lungimilor de unda cu exceptia celei de interes. Dispozitivul cel mai des folosit ca detector in cadrul unui sistem de spectroscopie Raman este circuitul cu cuplaj de sarcina (CCD), care transforma semnalul luminos intr-unul electric. Imbunatatirea semnalului poate fi realizata prin intermediul unui circuit multiplicator de electroni (EMCCD), care functioneaza pe acelasi principiu ca si fotodioda cu efect de avalansa. Pentru aplicatii ce necesita viteze de achizitie foarte inalte se folosesc dispozitive CCD cuplate cu intensificatoare de imagine (ICCD), acestea fiind in esenta tuburi fotomultiplicatoare multicanal.

Cele mai intense linii in spectrul Raman corespund vibratiei unor atomi legati prin legaturi relativ nepolare, cu o distributie simetrica a sarcinii.

Spectrometria Raman are multe avantaje fata de spectrometria de absorbtie in IR. Ea poate fi utilizata pentru a identifica si analiza molecule care nu absorb in IR ca de

43

exemplu molecule diatomice homonucleare. Un alt avantaj il constituie faptul ca spectrele Raman pot fi obtinute pentru solutii apoase, spectrul Raman al apei fiind putin intens. In IR insa apa absoarbe puternic mascand numeroase benzi de absorbtie ale compusilor studiati. Spectrometria Raman poate fi astfel aplicată la studiul unor solutii de natura farmaceutica, apa insotind foarte frecvent acesti compusi.

Spectrometria Raman prezinta insa si unele inconveniente. De obicei spectrul Raman nu poate fi obţinut pentru o proba care absoarbe radiatia excitatoare. De asemenea, daca proba este fluorescenta sau contine particule in suspensie spectrul Raman va fi mascat de spectrul de fluorescenta sau de radiatia difuzata prin efect Tyndall [2.11]. 2.6. SPECTROSCOPIA DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA (RMN)

Dintre toate metodele fizice, rezonanta magnetica nucleara (RMN) este aceea care ofera cea mai bogata si completa informatie structurala asupra compusilor organici. Dezvoltata prin analogie cu rezonanta electronica de spin, rezonanta magnetica nucleara de inalta rezolutie, aplicata initial pentru studiul protonilor si extinsa ulterior pentru o serie de alti nuclizi: 13C, 19F, 31P, 17O etc., a devenit in prezent cea mai importanta metoda de studiu a structurii si configuratiei compusilor organici.

2.6.1. MAGNETISMUL NUCLEAR

Intocmai ca si electronul, protonul efectueaza o miscare rapida de rotatie in jurul axei sale, miscare numita spin nuclear. Miscarii de rotatie a protonului (sarcina electrica) i se asociaza un moment magnetic de spin.

Magnetismul nuclear este caracterizat prin numarul cuantic de spin nuclear, I, care, spre deosebire de cel al electronului, poate avea valori diferite pentru nuclee diferite.

Unitatea de moment magnetic nuclear este asa-numitul magneton nuclear, μn, (analog cu magnetonul Bohr-Procopiu al electronului) definit prin relatia:

4 cm

he

pn ⋅⋅⋅

⋅=

πμ (2.4)

in care e reprezinta sarcina elementara, h - constanta lui Planck, mp – masa protonului iar c – viteza luminii.

Intre valoarea teoretica a momentului magnetic, calculata din impulsul de rotatie si valoarea reala exista o nepotrivire, ceea ce face necesara introducerea asa-numitului factor giromagnetic nuclear, gn, reprezentand raportul intre valoarea reala si cea teoretica a momentului magnetic:

nn IIg μμ ⋅+= )1(I (2.5)

2.6.2. ORIENTAREA NUCLEELOR IN CAMP MAGNETIC EXTERIOR

Momentul magnetic foarte mic al nucleelor se poate pune in evidenta prin interactiunea sa cuantificata cu un camp magnetic exterior. Vectorul momentului magnetic al nucleului se orienteaza in raport cu directia campului exterior. Orientarea se cuantifica, in sensul ca proiectia momentului magnetic nuclear pe directia campului poate avea numai anumite valori. In general momentul magnetic al nucleului poate adopta (2I+1) orientari. Pentru nucleele cel mai des intalnite 1H, 13C, 19F, 31P, spinul nuclear I are valoarea 21 , astfel incat rezulta numai 2 orientari posibile: una aproximativ in sensul campului numita si orientare paralela si alta aproximativ opusa sensului campului - orientare antiparalela. Pentru a se putea mentine la aceasta

44

inclinatie constanta vectorul momentului magnetic nuclear executa o miscare de precesie (Larmor) de frecventa proportionala cu intensitatea H a campului magnetic exterior.

In cele doua orientari posibile ale nuclizilor care au I=1/2 apare o diferenta de energie ΔE, data de relatia:

Hgn ⋅⋅=Δ nE μ (2.6)

2.6.3. FENOMENUL DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA

In mod asemanator spectroscopiei optice trecerea de la nivelul energetic inferior (orientarea paralela) pe cel superior (orientarea antiparalela) se poate realiza prin absorbtia unei cuante de radiatie electromagnetica de energie egala cu ΔE:

hHg

hhE nn ⋅⋅

=Δ

==Δμυυ E ; (2.7)

Spectroscopia RMN se bazează tocmai pe acest fenomen de trecere de pe un nivel energetic pe altul (simultan cu inversarea spinului in raport cu campul magnetic exterior) atunci cand nucleul situat in camp magnetic este iradiat cu o sursa de radiatii electromagnetice de frecventa adecvata, υ. Tranzitia din orientarea paralela in cea antiparalela este insotita de absorbtia de energie electromagnetica.

Ecuatia (2.7) este relatia fundamentala de rezonanta (egalitate a energiei radiatiei absorbite, hv, cu diferenta de energie ΔE a starilor nucleului) magnetica nucleara; cu ajutorul ei se poate determina marimea frecventei de rezonanta pentru diferiti nuclizi.

Populatiile celor doua nivele, fundamental, N0, si excitat, N1, sunt corelate prin ecuatia lui Boltzmann (2.8):

kTE

eNN Δ

−=

0

1 (2.8)

unde T este temperatura in K, ∆E diferenta de energie a nivelelor, iar 231038,1 −⋅==

NRk J/K este constanta Boltzmann.

Din cele de mai sus rezulta ca spectroscopia RMN are un principiu fundamental comun cu spectroscopia IR sau UV si anume aparitia unor tranzitii intre nivele diferite de energie, caracteristice sistemului (atomi sau molecule). Diferentele de energie dintre nivele, frecventele si respectiv lungimile de unda ale radiatiilor excitante au insa valori mult diferite de la un tip de spectroscopie la altul.

Prin absorbtia de energie radianta se tinde catre egalizarea populatiei celor doua nivele. Revenirea la echilibrul initial se realizeaza prin fenomene de relaxare, neradiative, in care se cedeaza energia absorbita (de exemplu sub forma de caldura). Daca relaxarea se face rapid, proba continua sa absoarba energie electromagnetica dar daca relaxarea este lenta, populatiile se egalizeaza usor si absorbtia de energie (semnalul) dispare, aparand saturatia semnalului RMN.

2.6.4. PRINCIPIUL APARATULUI

Pentru a putea avea loc inversarea orientarii momentului magnetic nuclear, la o anumita frecventa v a radiatiei electromagnetice, intensitatea H a campului magnetic exterior trebuie sa aiba o valoare bine precizata. In mod asemanator, pentru o intensitate de camp magnetic data, radiofrecventa trebuie sa prezinte o anumita valoare. Instalatia experimentala RMN trebuie sa realizeze acest acord intre camp si frecventa, permitand in acelasi timp declararea absorbtiei (extrem de mici) de energie, care are loc in momentul “rezonantei”.

45

Realizarea experimentelor RMN se poate face fie cu ajutorul unor aparate de baleiaj in camp, lucrand la frecventa fixa, fie in aparate cu baleiaj de frecventa, la camp magnetic fix.

Schita de principiu, mult simplificata a unui spectrometru RMN cu baleiaj in camp este prezentata in Fig.2.9.

Fig.2.9. Schema generala a unui spectrometru RMN.

Proba se introduce in fiola care este plasata in campul magnetic omogen dat de electromagnet (sau de un magnet permanent). In scopul uniformizarii pozitiei tuturor protonilor in raport cu campul magnetic, proba se roteste in jurul axei verticale cu circa 20-30 rotatii/secunda. Generatorul produce un camp de radiofrecventa (cu frecventa constanta, v) din care o parte trece prin bobina iradiind proba iar cealalta parte se transmite detectorului amplificator.

La atingerea valorii critice corespunzatoare rezonantei, se produce o inversare a spinilor nucleari, bobina absorbind un surplus de energie. In acest timp la amplificator ajunge o energie micsorata, luand nastere un semnal care dupa o amplificare corespunzatoare este inregistrat.

Pentru o proba obisnuita sunt necesare (50 – 100) mg substanta care se dizolva in solventi adecvati, realizandu-se solutii de concentratie (10 – 15)%.

Spectrul RMN este curba absorbtiei de energie radiata de catre nucleele probei, in functie de campul magnetic aplicat (in cazul baleiajului de camp) sau in functie de frecventa (in cazul baleiajului de frecventa).

In momentul plasarii probei in campul magnetic, circulatia electronilor de legatura este modificata, in sensul ca, in conformitate cu principiul actiunii si reactiunii, ei incep sa se miste astfel incat sa genereze un camp magnetic opus ca sens campului exterior H. Apare astfel un efect de ecranare diamagnetica, ce diminueaza campul exterior care patrunde pana la nucleul respectiv. Intr-un spectru RMN nucleele mai puternic ecranate dau semnale la camp mai mare (respectiv frecventa mai mica in cazul baleiajului de frecventa) comparativ cu nucleele mai putin ecranate.

Diferenta valorilor campurilor magnetice de rezonanta (la baleiajul de camp) sau a frecventelor de rezonanta (la baleiajul de frecventa) in functie de vecinatatile structurale se numeste deplasare chimica. Deplasarea chimica indica deci pozitia din spectru a semnalului fiecarui nucleu. Se recurge la exprimarea deplasarii chimice ca diferenta relativa de ecranare a nucleului in raport cu un standard. Standardul uzual este tetrametilsilanul (CH3)4Si (TMS), care are un semnal unic (al celor patru atomi de

46

carbon, respectiv al celor 12 protoni echivalenti) ce apare la extremitatea de camp magnetic maxim a spectrului (nuclee foarte ecranate).

Deplasarea chimica se exprima in valori δ definite de relatia: 66 10

standard standard -nucleu 10

standard Hnucleu H - standard H][ ×=×=

νννδ ppm (2.9)

Ecranarea δ este suma efectelor mai multor factori, interni sau externi: • Ecranarea locala diamagnetica este o functie a densitatii electronice reale in

jurul nucleului studiat, • Ecranarea locala paramagnetica, este dependenta de influenta naturii

legaturilor chimice asupra circulatiei electronice, • Ecranarea indepartata care reflecta efectul circulatiei electronice de la atomi

mai departati asupra nucleului studiat. Spre deosebire de spectrele IR sau UV-VIZ, unde coeficientii de extinctie depind

mult sau foarte mult de natura, in rezonanta magnetica nucleara 1H RMN intensitatea semnalului unui proton este aceeasi indiferent de natura acestuia. Marimea caracteristica pentru intensitatea semnalului RMN este aria de sub curba. Aparatele RMN au posibilitatea de a trasa nu numai spectrul ci si curbele integrale.

Semnalul oricarui nucleu dintr-o molecula este influentat in mod caracteristic de nucleele vecine (dar neechivalente) cu el.

In momentul inregistrarii semnalului primului proton (A) spinul protonului vecin (X) poate fi orientat fie “paralel” fie “antiparalel” cu campul. Intrucat s-a vazut mai inainte ca populatiile celor doua nivele sunt practic egale, rezulta ca se poate considera proba ca fiind formata din doua specii diferite: intr-una dintre specii (care reprezinta 50% din total) protonul X are spinul paralel iar in cea de-a doua specie (de asemenea in proportie de 50%) acelasi proton are spinul antiparalel cu campul exterior. Ca urmare, pentru protonul A vor aparea in spectru doua semnale, egale, situate la o oarecare diferenta de camp (de frecventa), corespunzatoare diferentei de ecranare ce rezulta pentru cele doua specii diferite, mentionate. Reciproc, in mod corespunzator semnalul protonului X va fi scindat de catre spinul protonului A (scindarea spin-spin) in doua semnale egale, separate prin aceeasi diferenta de camp (sau de frecventa) ca si semnalele protonului A. Diferenta de frecventa, exprimata in Hz (se masoara direct pe spectru) se numeste constanta de cuplaj si se noteaza cu J. Cuplajele se transmit prin intermediul electronilor de legatura, de aceea protonii despartiti de un numar mare de legaturi, chiar vecini in spatiu, nu se cupleaza reciproc. Cuplajele protonilor de tipul H–C–H se numesc cuplaje geminale, cele de tipul H–C–C–H se numesc cuplaje vicinale, iar cele de tipul H–(C)n>0 –H se numesc cuplaje la distanta [2.16]. 2.7. METODE CROMATOGRAFICE DE ANALIZA

Cromatografia grupeaza o variata si importanta grupa de metode care permit separarea compusilor foarte asemanatori din amestecuri complexe. In toate separarile cromatografice proba este dizolvata intr-o faza mobila: gaz, lichid sau fluid supercritic.

Metodele cromatografice sunt bazate pe adsorbtia amestecului de substante (solid-lichid; lichid-lichid; gaz-lichid) pe un material adsorbant, urmata de desorbtia succesiva (cu ajutorul unui dizolvant adecvat) a componentelor din amestec. Separarea compusului de analizat de potentialele interferente este unul din pasii esentiali in analiza chimica. Cromatografia este una dintre cel mai frecvent utilizate metode pentru a realiza aceste separari analitice.

O analiza cromatografica se rezuma in general la urmatoarele concepte fundamentale:

47

• proba este dizolvata in faza mobila; • faza stationara este cel mai frecvent un lichid adsorbit la suprafata unor particule de

solid utilizate pentru a impacheta coloana; • faza mobila este trecuta peste faza stationara nemiscibila (elutie); • solutul care are o mare afinitate fata de faza mobila se va misca prin coloana foarte

incet; • componentii probei se vor separa in benzi discrete vizibile la detector, generand

cromatograma. Cromatografia a devenit principalul instrument pentru separarea speciilor

asemanatoare. Ea poate fi de asemenea utilizata pentru determinari cantitative si calitative ale speciilor separate. In termeni de informatie calitativa, o cromatograma furnizeaza timpul de retentie al speciilor sau pozitiile acestora pe faza stationara dupa un timp de elutie specific. Cromatografia poate fi extrem de utila pentru recunoasterea prezentei sau absentei unor componenti in amestec ce contine un numar limitat de specii cunoscute. Confirmarea identitatii serveste si pentru alte investigatii si nu in ultimul rand cromatografia serveste ca precursor pentru alte analize chimice calitative sau pentru analize spectroscopice. In aceasta sectiune este prezentata doar una dintre variantele disponibile de separare cromatografica. Cromatografia de adsorbtie in faza lichida (LC) utilizeaza o faza stationara solida si o faza mobila, care este un lichid. Solutul poate fi adsorbit la suprafata particulelor solide, unde echilibrul dintre starea adsorbita si solutie produce separarea moleculelor solutului. Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC) se refera la noile proceduri de cromatografie de lichide bazate pe o instrumentatie sofisticata [2.17]. Schema generala a unui echipament HPLC este prezentata in Fig. 2.10.

Fig.2.10. Schema unui echipament tipic de HPLC.

Foarte multe detectoare sunt angajate in separarile cromatografice [2.18]. Detectia absorbantei moleculare UV-VIZ este cea mai comuna. Detectorul ideal este necesar sa aiba: sensibilitate adecvata; buna stabilitate si reproductibilitate; timp de raspuns scurt; raspuns liniar la diferite ordine de concentratie; stabilitate pe un larg domeniu de temperatura; durata lunga de viata si usurinta in utilizare.

Metoda standardului intern furnizeaza cea mai mare precizie pentru cromatografia cantitativa deoarece ea elimina incertitudinile introduse de simpla injectie. Metoda normalizarii ariilor este o alta aproximare utilizata pentru eliminarea incertitudinilor asociate cu simpla injectie.

O cromatograma:

48

• ilustreaza raspunsul detectorului la un compus de analizat din proba la iesirea acestuia din coloana ca functie de timp sau de volum de faza mobila adaugata;

• este utila atat pentru determinarile cantitative cat si calitative; • furnizeaza o serie de picuri, unde aria de sub picuri determina informatia cantitativa

(despre cantitatea de component) iar pozitia picului serveste la identificarea compusului din proba.

Exista patru parametri care caracterizeaza in general viteza de migrare: timpul de retentie, coeficientul de partitie, factorul de capacitate si factorul de separare. Acesti parametri descriu echilibrul de distributie care exista si implicit, transferul solutiei in cele doua faze.

a) Timpul tR la care apare maximul unui pic, masurat din momentul introducerii probei se numeste timp de retinere sau retentie si caracterizeaza calitativ componentul respectiv. Inaltimea picului h sau aria lui, A, sunt caracteristici cantitative, proportionale cu cantitatea componentului din proba. Se notează cu tM timpul in care eluentul si componentele care nu interactioneaza cu faza stationara parcurg distanta pana la detector. Astfel putem exprima viteza componentului din faza stationara (v) si a eluentului (u) prin urmatoarele ecuatii:

v = L/tR (2.10) u = L/tM (2.11)

unde L este lungimea coloanei. b) Coeficientul de partitie K reprezinta raportul dintre concentratia molara (cS) a

substantei in faza stationara si concentratia in faza mobila (cM): K = cS/cM (2.12)

c) Factorul de capacitate reprezinta raportul dintre cantitatea totala de substanta aflata in faza stationara si cantitatea totala de substanta aflata in faza mobila.

d) Factorul de separare α pentru o anumita coloana de separare este un parametru utilizat pentru descrierea diferentelor ce apar intre vitezele de migrare a componentilor. Se defineste ca fiind raportul dintre factorii de capacitate kA si kB ai componentului B (care trece mai greu prin coloana) si A (componentul care se elueaza mai repede) aflati in amestec. Pentru caracterizarea separabilitatii a doi componenti s-a introdus notiunea de rezolutie, notata RS. In expresia rezolutiei s-a cautat sa se lege marimile care caracterizeaza proprietatile termodinamice ale fazelor si componentilor precum si marimile care caracterizeaza dinamica proceselor din coloana. Rezolutia este o notiune mai cuprinzatoare, continand si marimile care caracterizeaza eficacitatea precum si selectivitatea coloanei [2.19]. 2.8. REFERINTE BIBLIOGRAFICE

[2.1] Danet, A.F. Analiza instrumentala Partea I. Ed. Universitatii Bucuresti, 2010; [2.2] Svanberg, S. Applied Laser Spectrocopy. Demtröder, W.; Inguscio, M. (Ed.), Plenum

Press, New York, 1990; [2.3] Optical and Spectroscopic Techniques in Handbook of Lasers and Optics, Trager, F.

(Ed.), Springer, New York, 2007; [2.4] Parson, W. Modern Optical Spectroscopy, Springer, New York, 2007; [2.5] Gray, D. American Institute of Physics Handbook Ed. A 3-a, McGraw-Hill, New York,

1982;

49

[2.6] van de Weert, M.; Hering, J.A.; Haris, P.I. Fourier Trnasform Infrared Spectroscopy in Methods for Structural Analysis of Protein Pharmaceuticals, Jiskool, W.; Crommelin, D. (Ed.), AAPS Press, USA, 2005;

[2.7] Davis, S.; Abrams, M.; Brault, J. Fourier Transform Spectrometry, Elsevier, 2001; [2.8] Pascu, M.L.; Moise, N.; Smarandache, A. Laser monitoring of pesticides in water,

SPIE 3405, pag. 1202-1214, 1998; [2.9] Pascu, M.L.; Moise, N.; Staicu, A. Tunable dye laser applications in environment

pollution monitoring, Journal of Molecular Structure, Vol. 598(1), pag. 57-64, 2001; [2.10] Advanced Optical Components in Handbook of Lasers and Optics, Trager, F. (Ed.),

Springer, New York, 2007; [2.11] Infrared and Raman Spectroscopy. Methods and Applications, Schrader, B. (Ed.) VCH,

R.F.G., 1995; [2.12] LaPlant, F. Lasers, Spectrographs and Detectors in Emerging Raman Applications

and Techniques in Biomedical and Pharmaceutical Fields, Moris, M.; Matousek, P. (Ed.), Springer, 2010;

[2.13] Matousek, P.; Clark, I.P.; Draper, E.R.C.; Morris, M.D.; Goodship, A.E.; Everall, N.; Towrie, M.; Finney, W.F.; Parker, A.W. Subsurface Probing in Diffusely Scattering Media Using Spatially Offset Raman Spectroscopy. Appl. Spectrosc. Vol.59, pag. 393, 2005;

[2.14] Deckert, V.; Fickert, C.; Gernet, D.; Vogt, P.; Michelis, T.; Kiefer, W. Stray Light Rejection in Double Monochromators with Multichannel Detection. Appl. Spectroscopy, Vol.49, Nr. 2, pag. 253-255, 1995;

[2.15] Chase, D. B. Fourier transform near-infrared Raman spectroscopy in Handbook of Vibrational Spectroscopy, Chalmers, J. C.; Griffiths P. R. (Ed.), Wiley, England, 2002;

[2.16] de Graaf, R. In vivo NMR Spectroscopy. Principles and Techniques, Wiley, 2007; [2.17] Cappiello, A.; Famiglini, G.; Mangani, F.; Angelino, S.; Gennaro, M. C.

Simultaneous Determination of Acidic and Basic-Neutral Pesticides in Water at ppt Concentration Level by Ion-Interaction Micro-HPLC/MS. Environmental Science & Technology, Vol. 33, Nr. 21, pag. 3905-3910, 1999;

[2.18] Marquardt, B.J.; Vahey, P.G.; Synovec, R. E.; Burgess, L.W. A Raman Waveguide Detector for Liquid Chromatography. Analytical Chemistry, Vol.71, Nr.21, pag. 4808-4814, 1999;

[2.19] Jantschi, L.; Nascu, H.I. Chimie Analitica si Instrumentala, Academic Pres & AcademicDirect, 2009.

50

REZULTATE ORIGINALE

CAPITOLUL 3

STUDIUL PROPRIETATILOR SPECTRALE ALE FENOTIAZINELOR 3.1. INTRODUCERE Fenotiazina si derivatii sai isi gasesc aplicatii in multe domenii, printre care chimia medicala, chimia polimerilor, senzori, stiinta materialelor, etc. [3.1]. Derivatii fenotiazinelor au facut obiectul unor studii biologice, chimice si fizico-chimice gratie proprietatilor si aplicatiilor lor farmacologice [3.2]. Separat de activitatea biologica largita a fenotiazinelor [3.3], acestea au fost descrise ca avand un rol important in ceea ce priveste modelarea rezistentei multiple la tratamente. In ultimii ani noi derivati ai fenotiazinei au fost sintetizati si supusi unor studii extensive cu privire la proprietatile si modul lor de actiune [3.4-3.8]. Folosirea tot mai frecventa a medicamentelor a dus la o preocupare in ceea ce priveste riscul aparitiei lor in mediu, prezenta compusilor farmaceutici in apele de suprafata constituind subiectul multor raportari din ultimii ani [3.9-3.11]. Transformarile abiotice care pot interveni in apele de suprafata se petrec via oxidare, hidroliza si fotoliza. In ceea ce priveste insa transformarile biotice, putine lucruri sunt cunoscute inca referitor la toxicitatea fotoderivatilor si metabolitilor fenotiazinelor in organismele acvatice. Interesul recent manifestat de chimisti in ceea ce priveste proprietatile starilor electronice excitate ale compusilor de uz farmaceutic a crescut rapid [3.12-3.14]. Sensibilitatea unor medicamente la actiunea luminii poate comporta riscuri in utilizarea lor intrucat fotoexcitarea electronica ar avea efecte atat in ceea ce priveste degradarea propriu-zisa a medicamentelor, cu afectarea performantelor farmaceutice, cat si in generarea unor produsi adiacenti care pot avea efecte nedorite (fototoxice, fotoalergenice, fotomutagene si fotocarcinogene). Fotosensibilizarea pielii indusa de expunerea la medicamente topice si/sau sistemice reprezinta un efect secundar scos in evidenta in ultimii cativa ani si care este rezultatul cresterii numarului de medicamente ce intra in ecosistem (atat din cauza cresterii consumului de medicamente cat si ca urmare a lipsei unei legislatii clare de tratare si dispunere a deseurilor farmaceutice) si schimbarea obiceiurilor cotidiene (petrecerea unui timp mai indelungat de expunere atat la lumina naturala cat si artificiala) [3.15, 3.16]. Medicamentele antipsihotice, in mod particular cele care trateaza hiperactivitatea si anxietatea sunt cunoscute ca avand reactii fototoxice si fotoalergenice asupra subiectilor, chiar in cazul expunerii la doze foarte scazute de substanta [3.17-3.19]. Dozele crescute si expunerea prelungita pot produce dermatite severe, insotite frecvent de inchiderea la culoare a pielii asociata cu depunerea melaninei in straturile joase ale dermului si, de asemenea, deteriorari ale retinei si chiar pierderea vederii [3.18]. Acest capitol prezinta un studiu al evolutiei in timp a proprietatilor optice ale Tioridazinei, unul dintre derivatii de fenotiazina utilizati in terapia bolilor psihice, atat in stare nativa cat si sub influenta luminii. Procesul de fotodegradare este pus in

51

evidenta prin masuratori ale proprietatilor de absorbtie si emisie a luminii, dar si prin metode adiacente, cum sunt spectroscopia de rezonanta magnetica nucleara (RMN) si cromatografia de inalta performanta in faza lichida cuplata cu spectrometria de masa (HPLC-MS). 3.2. PROPRIETATILE FIZICE, CHIMICE SI FARMACOLOGICE ALE FENOTIAZINEI SI DERIVATILOR DE FENOTIAZINA Fenotiazina, S(C6H4)2NH (masa molara 199,27 g/mol) este un compus organic prezent in diferite medicamente neuroleptice si antihistaminice, fiind cunoscuta actiunea sa antimutagena prin protejarea AND-ului. Structura ei moleculara (Fig.3.1) este aceea a unui inel triciclic, avand cate un atom de azot si unul de sulf atasati inelului central. Fenotiazinele se prezinta fizic sub forma de pudra de culoare alba pana la galben-pal si sunt solubile in acid acetic, benzen, eter, chloroform si mai putin in apa si etanol. Acesti compusi provin din clasa tiazinelor a compusilor heterociclici.

Fenotiazinele au fost folosite pentru studiul solutiilor de micele prin fotoliza laser in picosecunde [3.20], in complecsi cu β-ciclodextrina [3.21, 3.22] si pentru obtinerea chimica modificata a electrozilor din Au prin metode electrochimice redox [3.23]. Interese in ceea ce priveste proprietatile fenotiazinelor, cum ar fi semiconductivitatea [3.24] si conductivitatea electrica [3.25] au deschis noi campuri practice de investigare. Potentialul folosirii fenotiazinei si a derivatilor sai in aplicatiile energiei solare au facut, de asemenea, obiectul unor cercetari recente [3.26].

Terminologia de fenotiazina descrie cea mai cuprinzatoare clasa din cele cinci ale medicamentelor antipsihotice. Pe langa utilizarea lor in afectiunile psihice, derivatii fenotiazinelor sunt folositi in cazurile de insuficienta cardiaca congestiva, iar studii recente dovedesc proprietati antibacteriene ale acestor medicamente, ceea ce permite luarea lor in discutie in contextul invingerii rezistentei bacteriilor la tratamente [3.27].

NH

S

Fig.3.1. Structura moleculara a fenotiazinei.

Derivatii fenotiazinelor sunt utilizati pe scara larga ca medicamente. Printre primii astfel de compusi se numara albastrul de metilen, testat pentru prima data de catre Paul Ehrlich (1854-1915), care a pus bazele utilizarii acestuia ca si colorant in aplicatiile sale bacteriologice si a descoperit afinitatea lui pentru sistemul nervos central si periferic. Plecand de la aceste rezultate, medicul italian Pietro Bodoni, in 1899 a incercat folosirea albastrului de metilen in tratarea a diferite forme de psihoze. Derivati mai complicati ai fenotiazinei au fost introdusi dupa 1950 in tratarea afectiunilor nervoase. Medicamentele neuroleptice care contin derivati de fenotiazina sunt clasificate in trei grupe diferite, in functie de elementul substituent in pozitia azotului: compusii alifatici (grupari aciclice), piperidinele (derivati ai piperidinei) si piperazine (substituenti ai derivatilor de piperizina), asa cum este sintetizat in Tabelul 3.1.

52

Tabelul 3.1. Clasificarea medicamentelor neuroleptice care contin dervati de fenotiazina.

Grup

Actiune la nivelul

sistemului nervos central

Exemple Efect sedativ

Efecte secundare extrapira-

midale

Clorpromazina (comercializata ca Thorazine, Chlor-PZ, Klorazine, Promachlor,

Promapar, Sonazine, Chlorprom, Chlor-Promanyl, Largactil,

Clordelazin)

puternic moderate

Promazina (marca inregistrata Sparine) moderat moderate

Triflupromazina (marci inregistrate Stelazine, Clinazine,

Novaflurazine, Pentazine, Terfluzine, Triflurin, Vesprin)

puternic moderate

spre puternice

Compusi alifatici moderata

Levomepromazina in Germania si Methotrimeprazine in America

(marci inregistrate Nozinan, Levoprome)

foarte puternic slabe

Mesoridazina (marca inregistrata Serentil) puternic slabe

Piperidine puternica Tioridazina (denumire comerciala Mellaril,

Novoridazine, Thioril) puternic slabe

Flufenazina (marci inregistrate Prolixin, Permitil, Modecate,

Moditen)

slab-moderat puternice

Perfenazina (nume comerciale Trilafon, Etrafon, Triavil,

Phenazine)

slab-moderat puternice

Proclorperazina (marci inregistrate Compazine, Stemetil) - -

Piperazine slab

Trifluoperazina (nume comercial Stelazine) moderat puternice

In Tabelul 3.2 sunt ilustrate cateva exemple de derivati ai fenotiazinelor, unul dintre acestia – Tioridazina, facand obiectul de studiu al acestui capitol. Datele furnizate de literatura de specialitate dovedesc faptul ca fotofizica si fotochimia compusilor fenotiazinici sunt influentate de natura substituentilor in pozitiile 1 si 2 (Tabelul 3.2), de natura solventului si energia de excitare [3.28].

53

Tabel 3.2. Structura catorva derivati fenotiazinici.

N

S

R1

R2 Compus R1 R2

Prometazina - CH2CH(CH3)N(CH3)2 Promazina H - (CH2)3N(CH3)2

Clorpromazina Cl - (CH2)3N(CH3)2 Triflupromazina CF3 - (CH2)3N(CH3)2

Tioridazina SCH3 N(CH2)2

CH3 Trifluoperazina CF3 N N (CH2)3H3C

Tioridazina (Fig.3.2), 10-[2-(1-metil-2-piperidil)etil]-2-(metiltio)fenotiazina (C21H26N2S2, masa molara 370,575 g/mol), este un medicament antipsihotic derivat de fenotiazina apartinand grupei piperidinelor, folosit in trecut pentru tratarea schizofreniei si a psihozelor. Din cauza cardiotoxicitatii prezente la doze mari, acest medicament nu mai este prescris in mod curent, el fiind rezervat pacientilor care nu au raspuns la (sau au contraindicatii pentru) tratamentul cu alte medicamente antipsihotice. Tioridazina (Thr) este un compus chiral (punctul de chiralitate este notat cu asterix -*- in Fig.3.2), moleculele enantiomere fiind imaginea in oglinda a uneia fata de cealalta. Acesti enantiomeri au aceleasi proprietati fizice, cu exceptia comportarii la interactia cu lumina polarizata, care determina rotirea planului de polarizare.

N

S

CH2CH2

N

CH3

SCH3

*

Fig.3.2. Structura moleculara a Tioridazinei. Aceasta proprietate este folosita pentru caracterizarea compusilor chirali, directia de rotatie fiind notata cu (+) pentru sensul spre dreapta si (-) pentru cel contrar acelor de ceasornic. Suma gradelor de polarizare pentru compusul racemic este nula. Am luat in considerare pentru acest studiu atat compusul racemic, Thr(rac), cat si cei doi enantiomeri: Thr(-) si Thr(+).

Rezultatele medicale au demonstrat ca Thr(-) are cea mai scazuta activitate asupra creierului si toti cei trei compusi chirali – Thr(rac), Thr(-) si Thr(+) prezinta proprietati antimicrobiene [3.29]

54

Datele farmacocinetice indica faptul ca Tioridazina este rapid si complet absorbita de tractul gastrointestinal. Concentratia plasmatica maxima este atinsa in (2 – 4) h dupa ingerare. Biodisponibilitatea sistemica medie este de aproximativ 60%. Volumul de distributie relativ este in jur de 10 ℓ/kg si legarea de proteine este ridicata (>95%). Timpul de injumatatire a dozei pentru organismul uman este de (30 ± 7) h. Tioridazina este metabolizata in ficat si are ca rezultat o serie de metaboliti (Fig.3.3): Tioridazina-2-sulfoxid (Thr-2-SO) si Tioridazina-5-sulfoxid (Thr-5-SO).

Fig.3.3. Profilul metabolic al Thr(rac) in cazul subiectilor umani.

Pentru fiecare dintre acestia sunt posibile doua perechi de enantiomeri: (Rc, Rs) (Sc, Ss) si (Rc, Ss) (Sc, Rs), prima si a doua pereche fiind diastereoizomeri. Configuratiile (R) si (S) si metabolitii lor corespund punctului de chiralitate din pozitia 2 a atomului de carbon din inelul piperidil (c) si din pozitia atomului de sulf a metabolitilor sulfoxid (s). Atat Thr-2-SO cat si Thr-5-SO sunt activi terapeutic, dar prezinta efecte adverse nedorite, care pot fi atribuite actiunii stereoizomerilor. In plus, Thr-5-SO contribuie la cardiotoxicitatea medicamentului [3.30]. Excretia se realizeaza in principal prin intermediul fecalelor (50%), dar si prin intermediul rinichilor (mai putin de 4% ca medicament nemetabolizat si 30% ca metaboliti). Timpul de injumatatire plasmatic este de aproximativ 10 h. Tioridazina depaseste placenta si intra in laptele matern. 3.3. MATERIALE SI METODE

Pentru aplicatiile expuse in aceasta lucrare am folosit Thr HCl, cu masa molara 407,04 g/ℓ sub forma de compus racemic-Thr(rac), precum si cei doi enantiomeri: Thr(-) si Thr(+), pusi la dispozitie prin intermediul Departamentului de Chimie al Universitatii din Copenhaga, Danemarca, unde a fost realizata separarea acestora.

Solventul folosit este apa ultra pura, deionizata, obtinuta in urma filtrarii sterile de catre un echipament TKA Pacific UP/UPW6 (Thermo Electron LED GmbH, Germania) prevazut cu un sistem TKA Genpure, cu rata de curgere (la 150C) de 6 ℓ/h si grad de retentie a particulelor si bacteriilor de 99%. Continutul de bacterii este

55

<1 CFU/ml, continutul de particule <1 la o rezistivitate de 18,22 MΩxcm si 0,055 μS/cm conductivitate, la 25°C.

Au fost preparate solutii de Thr(rac), Thr(-) si Thr(+) in apa ultra pura, deionizata, intr-un interval de concentratii de (10-5 – 5x10-2) M, la un pH ≈ 6. Aceste solutii au fost pastrate in trei conditii de temperatura si lumina: la 40C si intuneric, la 220C si intuneric si la 220C la lumina zilei.

In scopul caracterizarii din punct de vedere optic a acestui medicament au fost realizate masuratori ale spectrului de absorbtie in volum mare (bulk), folosind celule optice de quart cu ajutorul unui spectrofotometru de absorbtie Lambda 950 (Perkin Elmer, SUA), ce lucreaza in domeniile spectrale UV-VIZ-NIR (175 – 3300 nm), avand o rezolutie ≤ 0,05 nm pentru UV/VIZ si ≤ 0,20 nm pentru NIR si o limita de eroare de 0,004%. Acest spectrofotometru cu dublu fascicul, dublu monocromator, controlat de microcomputer contine un sistem optic acoperit cu SiO2, cu retea de difractie cu 1440 linii/mm UV/VIZ la 240 nm si 360 linii/mm NIR la 1100 nm, in montura Littrow. Sistemul de divizare a fasciculului este un choper de 46 Hz, cu ciclu intuneric/proba/intuneric/referinta, cu corectia semnalului. Detectia se realizeaza cu fotomultiplicatorul R6872 pentru o energie foarte mare pe intreg domeniul UV/VIZ si racire Peltier a detectorului PbS pe domeniul NIR. Sursa este o lampa de tungsten-halogen si o lampa de deuteriu, ambele prealiniate.

Achizitia spectrului de absorbtie a luminii ambiante a fost realizata cu ajutorul unui spectrometru de inalta rezolutie HR4000CG-UV-NIR (Ocean Optics, SUA) care lucreaza in intervalul spectral (200 – 1100) nm cu rezolutia spectrala de 0,75 nm. Masuratorile optice au fost efectuate prin intermediul unei fibre optice monomod cu diametrul intern de 1 mm. Transmisia fibrei optice este >0,2 dB/m in intervalul spectral (400 – 800) nm si >0,6 db/m in intervalul spectral (300 – 900) nm.

In scopul detectarii eventualelor modificari induse in moleculele de medicament de fasciculul de lumina coerenta am expus probele de solutie de Thr la radiatie laser. Sistemul experimental de iradiere folosit este schitat in Fig.3.4 si foloseste o unitate Laser “Surelite II”, Excel Technology (Continuum, SUA), cu frecventa 10 Hz, care consta dintr-un laser pulsat cu Nd:YAG, pompat cu lampi flash.

Fig.3.4. Dispozitivul experimental de iradiere; expunerea probelor in celule de quart (2 ml).

*obturator cu control manual; viteza obturatorului: < 1ms; **divizor de fascicul cu reflexia < 1% Pentru Q-switch se utilizeaza o celula Pockels si optica Gaussiana. Laserul

genereaza patru lungimi de unda (fixe), fiind dotat cu cristale neliniare: 1064nm, 532nm, 355 nm si 266 nm.

56

Caracteristicile principale de emisie a fasciculului generat sunt redate in Tabelul 3.3.

Tabel 3.3. Caracteristicile principale de emisie ale fasciculului generat de laserul Nd:YAG.

Lungimea de unda Caracteristica 1064 532nm 355nm 266nm

Energia (mJ) 450 250 120 60 Durata puls (ns) 5-7 4-6 4-6 4-6 Largimea de banda (cm-1) 1 1 1 1 Divergenta (mrad) 0,6 0,6 0,6 0,6 Jitter (ns) +/- 0,5 +/- 0,5 +/- 0,5 +/- 0,5

Pentru controlul si reproducerea conditiilor de expunere (energia fasciculului si alinierea, focalizarea), radiatia laser a fost trecuta printr-un filtru neutru, apoi colimata cu un telescop si focalizata asupra probei cu ajutorul unor lentile cu distanta focala lunga.

Accesul fasciculului laser la proba a fost realizat prin intermediul unui obturator cu posibilitate de manevrare manuala sau prin intermediul unui PC, astfel incat fluorescenta indusa cu laser (LIF) emisa de proba sa poata fi colectata dupa un numar cunoscut de pulsuri cu ajutorul monocromatorului HR4000CG-UV-NIR folosit si in scopul monitorizarii nivelului luminii ambiante. Colectarea semnalului LIF s-a realizat printr-o fibra optica monomod, cu diametrul interior de 1 mm, apertura numerica 0,22 ± 0,02 si unghi de acceptanta de 25,40 in aer. Concret, intr-o prima sesiune de iradiere, solutiile de Thr(rac), Thr (-) si Thr (+) 10-5 M in apa deionizata au fost expuse la radiatie laser cu lungimea de unda de 266 nm timp de 1 h, 2 h si 3 h. Fasciculul laser a avut frecventa de repetitie a pulsurilor 10 pps, durata pulsului la jumatatea inaltimii 5 ns si energia medie pe puls 3,3 mJ (0,263 mJ prin BS). Pentru masurarea spectrului de absorbtie inainte si dupa iradiere s-au folosit celule cu drum optic de 10 mm. Cea de-a doua sesiune de iradiere s-a realizat asupra unor probe de solutii mai concentrate (5 x 10-2 M), cu fascicul laser pulsat emis la lungimea de unda de 355 nm, pentru intervale de timp intre 1 min si 30 min si energie medie a pulsului pe proba de 30 mJ (1,45 mJ prin BS). Masurarea proprietatilor spectrale de absorbtie ale probelor atat inaintea iradierii cat si dupa expunerea la radiatia laser pulsata a fost efectuata in bulk, drumul optic fiind de 1 mm. Spectrele 1H RMN au fost inregistrate cu un spectrometru cu transformata Fourier VARIAN MERCURY (Fig.3.5) ce lucreaza la o frecventa fixa de 400 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) folosind ca solvent DMSO-d6.

Fig.3.5. Spectrometrul RMN (VARIAN MERCURY - Varian Inc., Palo Alto, CA, USA).

57

Deplasarile chimice (δ) sunt exprimate in ppm relativ la Tetrametilsilan (TMS) si constantele de cuplaj (J) sunt exprimate in Hz.

Proba de analizat este introdusa intr-un tub special cu diametrul de 5 mm si asezata intre polii magnetului, unde i se imprima o miscare de rotatie. Radiatia de radiofrecventa cu o energie corespunzatoare este aplicata probei prin intermediul unei bobine. O bobina receptoare inconjoara tubul ce contine proba, iar emisia energiei absorbite este monitorizata de catre dispozitive electronice dedicate si computer. Spectrul RMN este inregistrat prin observarea semnalului de radiofrecventa emis de esantion in urma variatiei campului magnetic intr-un interval scurt.

Spectrele de masa au fost inregistrate prin intermediul unui echipament Water Micromass ZQ cuplat cu un cromatograf Water Corporation (Milford, MA, USA), folosind metoda ESI(+), cu coloana C-18, a carui imagine este prezentata in Fig.3.6.

Fig.3.6. Echipamentul HPLC-MS Water Micromass ZQ cuplat cu cromatograful Water Corporation, Milford, MA, USA.

Faza mobila a fost constituita din: 15% apa, 65% ACN, 10% MeOH si 10% acid formic (0,1%) in apa. Rata de curgere a fost de 0,55 mℓ/min la temperatura camerei, iar detectia a fost realizata la o lungime de unda de 254 nm de catre un dispozitiv cu matrice de diode. 3.4. STABILITATEA IN TIMP A PROPRIETATILOR OPTICE ALE TIORIDAZINEI Comportarea fotochimica a fenotiazinelor a generat interes odata cu observarea efectului fotosensibilizator asupra pacientilor aflati sub tratament cu aceste medicamente [3.31, 3.32]. In urma iradierii, fenotiazinele pot accesa prima stare electronica excitata de singlet, S1 sau sau o alta stare excitata, Sn, in functie de energia de excitare si de solvent [3.33]. Popularea starii excitate de singlet Sn poate avea loc prin procese de absorbtie bifotonice sau monofotonice, iar depopularea acesteia se poate produce prin conversie interna (Sn → S1 si S1 → S0 plus caldura), fluorescenta (S1 → S0 plus hυ) si trecere intersistem (S1 → T1 sau S2 → T2 si T2 → T1, via conversie interna). Depopularea primei stari excitate de triplet poate avea loc prin emisia de fosforescenta. Derivatii de fenotiazina au randamente cuantice de fluorescenta scazute, iar randamentul cuantic de fosforescenta ia valori cuprinse in intervalul (0,3 – 1). Astfel, se poate deduce ca eficienta cuantica a procesului de trecere intersistem pentru derivatii de fenotiazina este in jur de 1 [3.34]. In afara emisiei de fosforescenta, doua mecanisme pot fi, de asemenea, responsabile de dezexcitarea starii de triplet: a) transferul de energie catre oxigenul molecular, care duce la generarea de oxigen singlet si b) procesul de fotoionizare. Fotoionizarea derivatilor de fenotiazina (PTH) poate genera radicali

58

cationici si electron solvatat (ecuatia 3.1) sau fenotiazina neutra (PT) si radicali hidrogen (ecuatiile 3.2 si 3.3) [3.2].

−+ +•→⎯→⎯ sh ePTHPTHPTH *ν (3.1)

•+•→⎯→⎯ HPTPTHPTH h *ν (3.2)

(clivaj homolitic monofotonic)

•+•→+•→⎯→⎯ −+ HPTePTHPTHPTH sh *ν (3.3)

(deprotonare termica sau fotolitica a PTH•+)

Fotoionizarea fenotiazinelor prin procesul de colectare pe starea de singlet, care duce la cedarea radicalului cationic, in competitie cu procesele de trecere intersistem si ruperea legaturilor au facut obiectul de studiu al mai multor cercetari [3.35]. Radicalul cationic poate reactiona cu oxigenul molecular generand derivatul de fenotiazina sulfoxid [3.36].

In scopul evaluarii comportarii in timp a proprietatilor de absorbtie ale Tioridazinei au fost realizate masuratori ale spectrului de absorbtie in bulk, folosind celule optice de quart cu drum optic de 10 mm, cu ajutorul spectrofotometrului de absorbtie Perkin Elmer Lambda 950, descris in subcapitolul 3.3. Spectrul de absorbtie al tioridazinei (Fig.3.7) este caracterizat de benzi largi in UV centrate pe 262 nm si, respectiv, 314 nm si semnale foarte slabe in domeniul NIR, cu maxime la 966 nm, 1153 nm si 1240 nm.

Fig.3.7. Spectrele de absorbtie ale celor trei compusi ai Tioridazinei.

Spectrele de absorbtie ale celor trei compusi prezinta diferente de intensitate (Fig.3.8) care depasesc valoarea erorii de masurare a spectrofotometrului. Trebuie tinut cont de faptul ca erorile de masurare cumulate (eroarea intrinseca de masurare a spectrofotometrului: ± 0,004% si eroarea de pozitionare a cuvei: ± 1,041%) sunt de ± 1,045 [3.37].

In ceea ce priveste alura spectrului de absorbtie al compusului Thr (-) in intervalul spectral (900 – 1300) nm, aceasta se poate explica prin comportarea diferita a enantiomerilor la interactia cu lumina polarizata si, de asemenea, printr-o emisie de

59

fluorescenta mai accentuata a acestui enantiomer, care poate perturba procesul de absorbtie in acest domeniu spectral.

Fig.3.8. Spectrele de absorbtie (bara de eroare inclusa) ale celor trei compusi ai Tioridazinei.

In cazul studiului stabilitatii in timp (pana la 192 h) a proprietatilor de absorbtie

efectuat in lipsa luminii in doua conditii de pastrare a probelor: la 40C si la temperatura ambianta (220C), se observa o modificare a valorilor intensitatii de absorbtie ce depaseste domeniul erorilor de masura acceptate pentru concentratii intre (10-5 - 10-3)M in cazul celor trei compusi luati in discutie. In Fig.3.9a, b, c sunt exemplificate rezultatele acestui studiu pentru concentratia de 10-5M.

Fig.3.9.a. Spectrele de absorbtie ale Thr (rac) 10-5M pastrate in intuneric, la 40C.

Comportarea Thr (-) este diferita de cea a Thr (+), in sensul ca in cazul primului

enantiomer absorbanta scade in timp, pe cand in cazul Thr (+) aceasta creste. In cazul amestecului racemic efectul este combinat, probabil ca urmare a unei componente in procente inegale a celor doi enantiomeri.

60

Fig.3.9.b. Spectrele de absorbtie ale Thr (-) 10-5M pastrate in intuneric, la 40C.

Fig.3.9.c. Spectrele de absorbtie ale Thr (+) 10-5M pastrate in intuneric, la 40C.

Expunerea la lumina naturala comporta efecte distructive asupra multor

produse, atat naturale cat si fabricate. Reactiile fotochimice pe care aceste produse le sufera sunt complexe si depind de structura lor fizica si chimica. In urma interactiei medicamentului cu lumina pot lua nastere, in multe cazuri, fotoprodusi cu energie superioara, cum sunt radicalii ionici. Prin intermediul unor reactii termice, acestia se pot stabiliza intr-o forma finala. De asemenea, unele substante active sau chiar excipienti continuti in prezentarea farmaceutica prezinta un efect fotosensibilizator, putand initia reactii in mediul in care sunt prezenti [3.38].

In conditii de lumina ambianta, solutiile celor trei compusi in concentratie de 10-3M isi schimba culoarea dupa cum urmeaza: dupa aproximativ 45 h probele devin albastru-deschis, dupa 70 h – turcoaz, dupa 96 h – in galben pal si dupa 150 h se stabilizeaza la maro-deschis. Aceste modificari sunt asociate cu o deplasare a maximului de absorbtie de la 314 nm la 341 nm si aparitia a doua noi maxime de absorbtie la lungimile de unda de 635 nm si 886 nm, dupa cum se poate observa in Fig.3.10.

61

Fig.3.10. Spectrul de absorbtie al Thr(rac) 10-3M la 220C in conditii de lumina ambianta. De asemenea si pentru concentratii mai mici (10-5 – 10-4) M se inregistreaza o deplasare a maximelor de absorbtie din domeniul UV catre lungimi de unda mai mari, in special la 72 h (Fig.3.11), fara a se constata insa aparitia de maxime suplimentare in VIZ.

Fig.3.11. Spectrul de absorbtie al Thr(rac) 10-3M la 220C in conditii de lumina ambianta.

Distributia spectrala a radiatiei luminoase ambiante inregistrate in laboratorul in care s-au facut masuratorile, este data in Fig.3.12.

62

Fig.3.12. Distributia spectrala a luminii ambiante.

Un studiu al modului in care cresterea concentratiei are influenta asupra aparitiei structurilor polimerice in solutiile de Tioridazina a fost efectuat in detaliu si este prezentat in continuare.

Legea Beer - Lambert, dupa care coeficientul molar de absorbtie este independent de concentratie explica absorbtia unui foton de radiatie de catre o specie moleculara izolata; totusi pentru foarte multe specii moleculare se semnaleaza abateri de la aceasta lege, astfel incat exista un domeniu limitat de concentratii in cadrul caruia legea este satisfacuta.

Odata cu cresterea concentratiei pot sa apara modificari importante ale spectrului de absorbtie datorate aparitiei in solutie a asociatiilor moleculare.

In cazul in care legea Beer – Lambert ar fi satisfacuta, raportul E/c·d (unde E este extinctia, c este concentratia solutiei si d este drumul optic pe care il parcurge radiatia luminoasa) ar trebui sa nu depinda de concentratie. In solutii foarte diluate medicamentul se gaseste numai sub forma de monomer. Faptul ca la concentratii mari raportul E/c·d tinde catre o valoare constanta, indreptateste sa se considere ca la aceste concentratii in solutie se gasesc practic numai polimeri.

Notand cu E1 si cu E2 extinctiile din dreptul palierelor de la concentratii foarte mici si, respectiv, foarte mari, cu εm si εp coeficientii molari de absorbtie ai monomerului si polimerului si cu x gradul de polimerizare, se poate scrie:

E1= εm·c·d (3.4)

E2= εp·xc d (3.5)

Pentru o concentratie intermediara, la care coexista molecule de monomer si de polimer,

E= cm·εm d + cp·εp d (3.6)

cp= xcc m− (3.7)

E = d·[cm·εm+xcc pm ε)( −

] (3.8)

Formarea asociatiilor moleculare prin concentrarea solutiei este un rezultat al ciocnirilor frecvente intre molecule la concentratii mari. Ca atare, fenomenul se petrece in conformitate cu legea actiunii maselor, dupa care constanta K este data de relatia:

K= p

xm

cc sau K=

xcc

cm

xm

− (3.9)

63

Logaritmand ultima expresie, se obtine: lgK-lg x +lg (c-cm) = x lg cm (3.10)

si reprezentand grafic lg cm functie de lg (c-cm) si calculand panta dreptei obtinute se afla gradul de polimerizare al substantei in solutie.

Calculul gradului de polimerizare al solutiilor de Tioridazina, efectuat pentru un interval de concentratii (10-6 – 10-3) M a demonstrat ca pentru concentratii de pana la 10-3M avem de-a face numai cu monomeri (Fig.3.13) [3.39].

Fig.3.13. Gradul de polimerizare al Tioridazinei. (C = concentratia probei; Cm = concentratia de monomer)

Este posibil ca la concentratii scazute sa fie dificila agregarea mai multor

monomeri, dar pe masura ce creste concentratia, odata cu formarea dimerilor, acestia sa actioneze ca nuclee la care monomerii de Tioridazina sa adere. Cresterea concentratiei de Tioridazina duce la cresterea numarului de mici agregate si corespunzator la cresterea absorbantei la 635 nm. Fenomenul de saturare apare, probabil, datorita faptului ca numarul de molecule de medicament ce se stabilizeaza sub forma de radical cationic in agregate mari este semnificativ mai mic decat acela al moleculelor stabilizate in agregate mai mici [3.40]. Expunerea solutiilor la lumina ambianta a condus la modificari spectrale ale probelor investigate, care sugereaza formarea derivatului Tioridazina sulfoxid [3.41]. Datele din literatura sugereaza ca lanturi laterale mai scurte din structura derivatilor de fenotiazina pot favoriza procesul de dimerizare, conducand la hidroxilare, indiferent de prezenta nucleofilelor externe [3.42]. De asemenea, exista studii care au demonstrat ca derivatii oxidati de fenotiazina se formeaza prin reactia dintre radicalul cationic cu oxigenul molecular, astfel incat conditiile care favorizeaza aparitia radicalului neutru pot impiedica formarea acestor derivati. In acelasi timp, unele raportari au exclus participarea oxigenului singlet in procesul de foto-oxidare, deoarece prezenta extinctorilor acestuia nu modifica rata de formare a sulfoxidului [3.43]. Cele doua noi maxime de absorbtie au fost atribuite radicalului cationic stabilizat sub forma de agregate moleculare. Aparitia benzilor in VIZ ca urmare a fotoionizarii se intampla deoarece indepartarea unui electron de pe cel mai inalt orbital molecular ocupat (HOMO) schimba structura orbitalului molecular imediat inferior (SOMO) intr-un nou HOMO, care permite o energie mica de tranzitie SOMO → HOMO [3.44].

Formarea radicalului cationic Thr este acompaniata de modificari ale spectrului de absorbtie ale compusilor in UV, ceea ce sugereaza ca formarea agregatelor moleculare si procesul de fotoionizare afecteaza tranzitiile S0 → S1 si S0 → Sn, respectiv conduc la modificari structurale ale moleculelor de medicament.

64

3.5. COMPORTAREA TIORIDAZINEI SUB INFLUENTA RADIATIEI LASER

Solutiile de Tioridazina in apa ultra pura, in diferite concentratii au fost expuse la radiatie laser emisa de armonica a treia (355 nm) si a patra (266 nm) a laserului pulsat cu Nd:YAG, dupa o schema de iradiere descrisa in subcapitolul 3.3. Inainte si dupa expunere au fost inregistrate spectrele de absorbtie ale probelor cu ajutorul spectrofotometrului Perkin Elmer Lambda 950 UV/VIZ/NIR, descris de asemenea in sectiunea 3.3. cu scopul detectarii eventualelor modificari induse la nivel molecular de catre radiatia laser. Ulterior primei sesiuni de iradiere cu lungimea de unda de 266 nm, se observa ca spectrul de absorbtie se aplatizeaza, lucru ce poate fi explicat prin scaderea concentratiei de medicament (Fig.3.14).

Fig.3.14. Spectrul de absorbtie al solutiei de Thr (rac) 10-5 M neiradiata si iradiata cu armonica a patra a laserului Nd:YAG.

Studiul stabilitatii in timp a solutiei iradiate timp de 3h bazat pe masurarea

spectrelor de absorbtie conduce la concluzia ca degradarea celor trei compusi ai Tioridazinei – Thr(rac), Thr(-) si Thr(+) continua chiar si la 113 h dupa expunerea la radiatie laser (Fig.3.15).

Fig.3.15. Stabilitatea in timp a proprietatii de absorbtie a Thr (rac) 10-5 M iradiat

cu lungimea de unda 266 nm timp de 3 h.

65

Degradarea medicamentului este evidentiata si de comportarea emisiei de fluorescenta indusa cu laser (Fig.3.16).

Fig.3.16. Spectrul LIF al Thr (rac) 10-5 M excitat cu lungimea de unda de 266 nm.

Un alt set de iradiere a probelor de solutii de Thr (rac) / Thr(-) / Thr(+) a fost realizat folosind armonica a treia a laserului Nd:YAG pulsat. Expunerea solutiilor mult mai concentrate la radiatie laser favorizeaza aparitia a noi maxime de absorbtie la 485 nm, 638 nm si 890 nm (Fig.3.17). Se observa cresterea intensitatii de absorbtie pentru o expunere pana la 5 min urmata de o descrestere a acesteia dupa 11 min de iradiere.

Fig.3.17. Spectrele de absorbtie ale solutiilor de Thr (rac) 5x10-2 M expuse la radiatie

laser pulsata Nd:YAG emisa la 355 nm.

Aceste caracteristici ale proprietatilor optice (aparitia noilor maxime de absorbtie in VIZ) sunt tranzitorii, spectrele de absorbtie revenind la forma initiala in cateva ore dupa sesiunea de iradiere (Fig.3.18).

66

Fig.3.18. Caracterizarea stabilitatii in timp a solutiei de Thr (rac) iradiata cu 355 nm

timp de 5 min.

In ceea ce priveste comportarea in urma iradierii timp de 5 min a celor trei compusi investigati, se poate observa ca solutia de Thr (+) atinge un maxim de absorbtie (Fig.3.19.a), iar in timpul procesului de degradare dupa 11 min de iradiere, compusul Thr (-) prezinta cea mai ridicata absorbanta in VIZ, dar deplasata cu 8 nm spre lungimi de unda mai mici fata de situatia expunerii la radiatie laser pulsata timp de 5 min (Fig.3.19.b) [3.45].

a) b)

Fig.3.19. Comparatia spectrelor de absorbtie ale Tioridazinei iradiata 5min (a) si 11min (b).

3.6. STUDII DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA ALE FORMATIUNILOR MOLECULARE OBTINUTE IN URMA EXPUNERII LA RADIATIE LASER A SOLUTIILOR DE TIORIDAZINA Au fost analizate prin tehnica de spectroscopie 1H RMN probe de Thr (rac), Thr (-) si Thr (+). Cei doi enantiomeri prezinta aceleasi caracteristici spectrale.

Spectrul 1H RMN al compusului racemic prezinta benzi largi datorita suprapunerii caracteristicilor celor doi enantiomeri prezenti in solutie. In spectrul 1H RMN al Thr (-) poate fi identificata prezenta a 22 de protoni alifatici in intervalul (1,35 – 4,2) ppm si 7 protoni aromatici in intervalul (6,88 – 7,28) ppm (Fig.3.20).

67

Fig.3.20. Spectrul 1H RMN al Thr (-).

Rezolvarea spectrului 1H RMN al compusului analizat este: 1H NMR(DMSO-d6) δ[ppm]: 6,88 (dd, 1H, Jo=8 Hz, Jm=2 Hz, H3),

6,95 (d, 1H, Jm=1,6 Hz, H1), 6,99 (t, 1H, J=7,2 Hz), 7,08 – 7,264 (alti protoni aromatici, 4H).

Probe continand solutie de Thr (-) 5x10-2 M in apa ultra pura, expusa in prealabil la radiatie laser emisa de armonica a treia (355 nm) a laserului pulsat Nd:YAG, cu energia medie a fasciculului de 30 mJ au fost investigate dupa ce, in prealabil au fost uscate si tinute intr- o camera de vacuum timp de 60 min. Spectrul 1H RMN obtinut indica modificari atat in regiunea protonilor alifatici cat si in cea a protonilor aromatici (Fig.3.21.a si b).

Fig.3.21.a. Spectrul 1H RMN al Thr (-) (detaliu zona protonilor aromatici).

68

Fig.3.21.b. Spectrul 1H RMN al Thr (-) 5x10-2 M solutie in apa ultra-pura iradiata 11 min cu Nd:YAG 355nm (detaliu zona protonilor aromatici).

O explicatie posibila a alterarii stucturii moleculare a medicamentului ar fi data de procesul de oxidare, care afecteaza zona radicalului (-SCH3), generand formarea compusului Tioridazina-2-sulfoxid. 3.7. STUDII PRIN HPLC-MS ALE FORMATIUNILOR MOLECULARE OBTINUTE IN URMA EXPUNERII LA RADIATIE LASER A SOLUTIILOR DE TIORIDAZINA Cromatograma din Fig.3.22.a. a Thr (rac) arata o buna separare la un timp de retentie de 3,12 min.

Fig.3.22.a. Cromatograma Thr (rac). Spectrul de masa redat in Fig.3.22.b identifica in mod clar acest compus, avand masa molara 371,8 g/mol. Desi experimental s-a folosit Tioridazina HCl, echipamentul detecteaza masa compusului pur, la care se adauga incarcarea unui atom de H ([M+H]+= 371,8 m/z).

69

Fig.3.22.b. Spectrul de masa al Thr (rac).

O solutie de Thr (rac) 10-3 M in apa ultra-pura expusa la lumina naturala pana la 980 h a fost analizata prin tehnica HPLC-MS pentru a pune in evidenta modificarile induse de actiunea luminii asupra compusului. Inregistrarile au fost realizate dupa intervale de timp de 40 h, 70 h, 90 h, 240 h si 980 h. Cromatograma solutiei expuse timp de 40 h, redata in Fig.3.23.a, este de asemenea bine rezolvata, timpul de retentie fiind de 3,20 min.

Fig.3.23.a. Cromatograma Thr (rac) expus 40 h la lumina naturala. In spectrul de masa (Fig.3.23.b) se poate observa, pe langa masa atribuita Tioridazinei, un component destul de important, a carui incarcare are valoarea 387,8 m/z si care poate fi asociat cu aparitia compusului Tioridazina-2-sulfoxid, a carui structura moleculara este data in Fig 3.24.

70

Fig.3.23.b. Spectrul de masa al Thr (rac) expus 40 h la lumina naturala.

Thr-2-SO, C21H26N2OS2, cunoscuta ca si Mesoridazina, 10-[2-(1-metil-2-piperidil)etil]-2-(metilsufinil)fenotiazina, masa molara 386,6 g/mol, ia nastere in urma procesului de oxidare a Thr, prin atasarea preferentiala a unui atom de oxigen la radicalul din pozitia 2 (-SCH3).

a) b)

Fig.3.24. Structura moleculara a Thr-2-SO in reprezentare 2D (a) si 3D (b). Analiza cromatografica a solutiei expuse 90 h la lumina naturala arata, ca si in celelalte cazuri o separare buna, timpul de retentie fiind la 3,10 min, asa cum se observa in Fig. 3.25.a.

Fig.3.25.a. Cromatograma Thr (rac) expus 90 h la lumina naturala.

71

Spectrul de masa (Fig.3.25.b) obtinut permite identificarea a doi compusi si anume: Thr-2-SO, cu incarcarea 387,9 m/z si Tioridazina-2-sulfon (Thr-2-SO2) cunoscut ca si Sulforidazina, cu incarcarea 404 m/z.

Fig.3.25.b. Spectrul de masa al Thr (rac) expus 90 h la lumina naturala.

Sulforidazina, C21H26N2O2S2, 10-[2-(1-Metil-2-piperidinil)etil]-2-(metilsulfonil)-10H-fenotiazina, avand masa molara 402,5 g/mol este un alt derivat de Tioridazina, care se formeaza in urma procesului de oxidare al Mesoridazinei. Structura moleculara a compusului este data in Fig.3.26.

a) b)

Fig.3.26. Structura moleculara a Sulforidazinei in reprezentare 2D (a) si 3D (b).

Datele din literatura demonstreaza ca metabolismul Thr-2-SO2 este mult mai simplu decat cel al Thr, caile diferite de eliminare (via fecale sau urina) putand contribui la reducerea sulfoxidului dar nu si al sulfonului de catre bacteriile prezente in intestin [3.44]. Dupa 10 zile de expunere la lumina naturala procentul in care Thr-2-SO2 este prezent in solutie se micsoreaza, astfel ca dominanta este prezenta Mesoridazinei (Fig.3.27) si acest rezultat se perpetueaza pana la sfarsitul studiului (980 h).

72

Fig.3.27. Spectrul de masa al Thr (rac) expus 240 h la lumina naturala. 3.8. CONCLUZII Fotodegradarea fenotiazinelor cauzata de expunerea la radiatie optica (naturala, artificiala necoerenta sau radiatie laser) poate fi considerat un element major in ceea ce priveste procesul de eliminare a acestor compusi din mediu. Comportarea fotofizica si fotochimica a fenotiazinelor a captat interesul comunitatii datorita efectelor fotosensibilizatoare pe care acestea le pot induce in cazul subiectilor umani. Concluziile studiilor prezentate in cadrul acestui capitol pot fi sintetizate dupa cum urmeaza [3.45]:

• Expunerea solutiilor ce contin Tioridazina la lumina ambianta conduce la modificari spectrale ale probelor investigate, care sugereaza formarea derivatilor sulfoxid ;

• Radicalii cationici generati pe cale fotochimica prezinta benzi de absorbtie situate in VIZ/NIR datorate tranzitiilor HOMO → SOMO;

• Formarea radicalilor cationici este insotita de modificari ale spectrului de absorbtie in UV ale medicamentului, ceea ce sugereaza faptul ca procesele de agregare si fotoionizare induc alterari ale structurii medicamentului si, in consecinta, afecteaza tranzitiile S0 → S1 si S0 → Sn;

• Dupa 3h de expunere la radiatie laser pulsata emisa de laserul Nd:YAG la 266 nm se observa o degradare totala, ireversibila a medicamentului, ceea ce permite considerarea acestei metode ca mijloc potential de indepartare a acestor compusi din mediu;

• Expunerea solutiilor de Tioridazina mai concentrate la radiatie laser pulsata emisa la 355 nm conduce la aparitia de noi maxime de absorbtie situate in regiunile VIZ/NIR ale spectrului electromagnetic. Cresterea concentratiei solutiei are ca efect cresterea numarului de mici agregate si, respectiv, cresterea maximelor de

73

absorbtie de la 638 nm si 890 nm. Saturatia intervine, probabil, deoarece numarul moleculelor de Tioridazina care pot fi stabilizate sub forma de radical cationic in agregate mari este semnificativ mai mic decat acela stabilizat in agregate mici.

Spectrul 1H RMN al Thr identifica prezenta a 22 de protoni alifatici in intervalul (1,35 – 4,2) ppm si 7 protoni aromatici in intervalul (6,88 – 7,28) ppm.

Spectrul 1H RMN al solutiei de Thr (-) 5x10-2 M in apa ultra pura, expusa in prealabil la radiatie laser emisa de armonica a treia (355 nm) a laserului pulsat Nd:YAG, cu energia medie a fasciculului de 30 mJ indica modificari atat in regiunea protonilor alifatici cat si in cea a protonilor aromatici. Cromatograma Thr (rac) arata o buna separare la un timp de retentie de 3,12 min. Spectrul de masa identifica in mod clar acest compus, avand masa molara 371,8 g/mol. Inregistrarile HPLC-MS ale unei solutii de Thr (rac) 10-3 M in apa ultra-pura expusa la lumina naturala pana la 980 h realizate dupa intervale de timp de 40 h, 70 h, 90 h, 240 h si 980 h permit identificarea a doi compusi, si anume: Thr-2-SO (Mesoridazina), cu incarcarea 387,9 m/z si Thr-2-SO2 cunoscut ca si Sulforidazina, cu incarcarea 404 m/z. Dupa 10 zile de expunere la lumina naturala procentul in care Thr-2-SO2 este prezent in solutie se micsoreaza, astfel ca dominanta este prezenta Mesoridazinei si acest rezultat se mentine pana la finalul studiului (980h). 3.9. REFERINTE BIBLIOGRAFICE: [3.1] Pinero, L.; Calderón, X.; Rodríguez, J.; Nieves, I.; Arce, R.; García, C.; Oyola, R.

Spectroscopic and electrochemical properties of 2-aminophenothiazine. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, Vol.198, Nr. 1, pag. 85-91, 2008;

[3.2] Rodrigues, T.; dos Santos, C.G.; Riposati, A.; Barbosa, L.R.S.; Di Mascio, P.; Itri, R.; Baptista, M.S.; Nascimento, O.R.; Nantes, I.L. Photochemically Generated Stable Cation Radical of Phenothiazine Aggregates in Mildly Acid Buffer Solutions. J.Phys.Chem, B, Vol.110, pag. 12257-12265, 2006;

[3.3] Ramu, A.; Ramu, N. Reversal of multidrug resistance by phenothiazines and structurally related compounds. Cancer Chemother Pharmacol, Vol.30, pag. 165-173, 1992;

[3.4] Molnar, J.; Molnar, A.M.; Mucsi, I.; Pinter, O.; Nagy, B.; Varga, A.; Motohashi, N. Reversal of multidrug resistance in mouse lymphoma cells by phenothiazines. In Vivo Vol.17, pag.145-150, 2003;

[3.5] Molnar, J.; Hever, A.; Fakla, J.; Oscovski, I.; Aszalos, A. Inhibition of the transport function of membrane proteins by some substituted phenothiazines in E. coli and multidrug resistant tumor cells. Anticancer Res, Vol.17, pag. 481-486, 1997;

[3.6] Molnar, J.; Puszati, R.; Hever, A.; Nagy, S.; Motohashi, N. Effects of two benzo[a]phenothiazines on multidrug resistance (mdr) and tumor antigen expression. Anticancer Res, Vol.15, pag. 2013-2016, 1995;

[3.7] Motohashi, N.; Kurihara, T.; Kawase, M.; Hever, A.; Tanaka, M.; Szabo, D.; Nacsa, J.; Yamanaka, W.; Kerim, A.; Molnar, J. Drug resistance reversal, anti-mutagenicity and antiretroviral effect of phthalimido- and chloroethyl-phenothiazines. Anticancer Res, Vol.17, pag. 3537-3543, 1997;

[3.8] Wesolowska, O.; Molnar, J.; Motohashi, N.; Michalak, K. Inhibition of P-gp glycoprotein transport function by Nacylphenothiazines. Anticancer Res, Vol.22, pag. 2863-2868, 2002;

[3.9] Ternes, T.A. Analytical methods for the determination of pharmaceuticals in aqueous environmental samples. Trends Anal Chem, Vol.20, pag. 419–434, 2001;

74

[3.10] Hilton, M.J.; Thomas, K.V. Determination of selected human pharmaceutical compounds in effluent and surface water samples by high-performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. J Chromatogr A, Vol.1015, pag. 129–141, 2003;

[3.11] Fent, K.; Weston, A.A.; Caminada, D. Ecotoxicology of human pharmaceuticals. Aquat Toxicol, Vol.76, pag. 122–159, 2006;

[3.12] Bensasson, R. V.; Land, E. J.; Truscott, T. G. Excited States and Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford University Press, Oxford, UK, 1993;

[3.13] Beijersbergen van Henegouwen, G. M. J. Medicinal photochemistry (phototoxic and phototherapeutic aspect of drugs). In Advances in Drug Research, Vol. 29, Testa, B.; Mayer, U. (Ed.), 79–170. Academic Press, New York, 1997;

[3.14] Drugs: Photochemistry and Photostability, Albini, A.; Fasani, E. (Ed.). pag. 134–149. Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK. 1998;

[3.15] Epstein, J. H.; Wintroub, B. U. Photosensitivity due to drugs. Drugs, Vol.30, pag. 42–57, 1985;

[3.16] Gonzales, E.; Gonzales, S. Drug photosensitivity, idiopathic photodermatoses, and sunscreens. Dermatol. Vol.35, pag. 871–885, 1996.

[3.17] Kochevar, I. E. Phototoxicity mechanisms: Chlorpromazine photosensitized damage to DNA and cell membranes. J. Invest. Dermatol., Vol.76, pag. 59-64, 1981;

[3.18] Zelickson, A. S.; Zeller, H. C. New and unusual reaction to chlorpromazine. J. Am. Med. Assoc. , Vol.188, pag.394-396, 1964;

[3.19] Epstein, J. H.; Brunsting, L. A.; Peterson, M. C.; Schwartz, B. E. Study of photosensitivity occurring during chlorpromazine therapy. J. Invest. Dermatol., Vol. 28, pag. 329-338, 1957;

[3.20] Ghosh, H. N.; Sapre, A. V.; Palit, D. K.; Mittal, J. P. Picosecond Flash Photolysis Studies on Phenothiazine in Organic and Micellar Solution. J. Phys. Chem. B, Vol.101, Nr. 13, pag. 2315–2320, 1997;

[3.21] Guerrero-Martínez, A.; Montoro, T.; Viñas, M.H.; Tardajos, G. Complexation and chiral drug recognition of an amphiphilic phenothiazine derivative with beta-cyclodextrin. J Pharm Sci., Vol.97, Nr.4, pag. 1484-1498, 2008;

[3.22] Qing-Xiang, Guo; Hai-Yan, Liu; Xiu-Qin, Ruan; Xiao-Qi, Zheng; Yun-Yu, Shi; You-Cheng, Liu. Experimental and Theoretical Studies on the Inclusion Complexation of β-Cyclodextrin with Phenothiazine Derivatives. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, Vol. 35, Nr. 3, pag. 487-496, 1999;

[3.23] Masayuki, Ohtani; Susumu, Kuwabata; Hiroshi, Yoneyama. Electrochemical oxidation of reduced nicotinamide coenzymes at Au electrodes modified with phenothiazine derivative monolayers. Journal of Electroanalytical Chemistry, Vol. 422, Nr.1-2, Pag. 45-54, 1997;

[3.24] Ortiz, A.; Fernández-Alonso, J.I.; Pardo, A.; Llabrés, J. Semiconductivity, optical properties, and EPR spectra of phenothiazine derivatives in the solid state. Journal of Solid State Chemistry, Vol. 33, Nr. 3, Pag. 397-402, 1980;

[3.25] Berges, P.; Kudnig, J.; Klar, G.; Sánchez Martínez, E.; Díaz Calleja, R. Structure, electrical conductivity and dielectric relaxation of the phenothiazine-tetracyanoethene 1:1 complex. Synthetic Metals, Vol. 46, Nr. 2, Pag. 207-219, 1992;

[3.26] Wenjun, Wu; Jiabao, Yang; Jianli, Hua; Jin, Tang; Lei, Zhang; Yitao, Long; He, Tian. Efficient and stable dye-sensitized solar cells based on phenothiazine sensitizers with thiophene units, J. Mater. Chem., Vol.20, pag. 1772-1779, 2010;

[3.27] Martins, M.; Dastidar, S.G.; Fanning, S.; Kristiansen, J.E.; Molnar, J.; Pages, J.M.; Schelz, Z.; Spengler, G.; Viveiros, M.; Amaral, L. Potential role of non-antibiotics (helper compounds) in the treatment of multidrug-resistant Gram-negative

75

infections: mechanisms for their direct and indirect activities. International Journal of Antimicrobial Agents, Vol.31, pag. 198–208, 2008;

[3.28] Ortiz, A.; Poyato, I.; Fernandez-Alonso, J.I. Influence of environment and substituents on the stability of the radical cations of several phenothiazine derivatives. J. Pharm. Sci., Vol.72, pag. 50-55, 1983;

[3.29] Hendricks, O.; Molnar, A.; Sorensen Butterworth, T.; Butaye, P.; Kolmos, H.J.; Bolstad Christensen, J.; Kristiansen, J.E. In vitro Activity of Phenothiazines Derivatives in Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. Clinical Pharmacology and Toxicology, Vol.96, pag. 33-36, 2005;

[3.30] Bertuccia, C.; Lopes Guimarães, L.F.; Bonato, P.S.; Borges, K.B.; Okano, L.T.; Mazzeod, G.; Rosini, C. Assignment of the absolute configuration at the sulfur atom of thioridazine metabolites by the analysis of their chiroptical properties: The case of thioridazine 2-sulfoxide, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol.52, pag. 796–801, 2010;

[3.31] Elisei, F.; Latterini, L.; Aloisi, G.G.; Mazzucato, U.; Viola, G.; Mioio, G.; Vedaldi, D.; Dall’Acqua, F. Excited-state properties and in vitro phototoxicity studies of three phenothiazine derivatives. Photochem. Photobiol., Vol.75, pag.11-21, 2002;

[3.32] Viola, G.; Latterini, L.; Vedaldi, D.; Aloisi, G.G.; Dall’Acqua, F.; Gabellini, N.; Elisei, F.; Barbafina, A. Photosensitization of DNA Strand Breaks by Three Phenothiazine Derivatives. Chem. Res. Toxicol., Vol.16, pag. 644-651, 2003;

[3.33] Ghosh, H.N.; Sapre, A.V.; Palit, D.K.; Mittal, J.P. Picosecond Flash-Photolysis Studies on Phenothiazine in Organic and Micellar Solution. J. Phys. Chem. B, Vol.101, pag. 2315-2320, 1997;

[3.34] Alkaitis, S.A.; Beck, G.; Gratzel, M. Laser photoionization of phenothiazine in alcoholic and aqueous micellar solution. Electron transfer from triplet states to metal ion acceptors. J. Am. Chem. Soc., Vol.20, pag. 5723-5729, 1975;

[3.35] Hall, R.D.; Buettner, G.R.; Chignell, C.F. The biphotonic photoionization of chlorpromazine during conventional flash photolysis: Spin trapping results with 5,5-dimethylpyrroline-N-oxide. Photochem Photobiol., Vol.54, pag. 167-173, 1991;

[3.36] Galzigna, L.; Schiappelli, M.P.; Scarpa, M.; Rigo, A. A peroxidase catalyzed sulfoxidation of promethazine. Free Radical Res. Vol.27, pag. 501-504, 1997;

[3.37] Militaru, A.; Smarandache, A.; Mahamoud, A.; Alibert, S.; Pagès, J.M.; Pascu, M.L. Time Stability Studies of Quinazoline Derivative Designed to Fight Drug Resistance Acquired by Bacteria. Letters in Drug Design &Discovery, Vol.8, Nr. 2, pag. 124-129, 2011;

[3.38] Moan, J.; Juzenas, P. Biological Effects of Combinations of Drugs and Light, in Photostability of drugs and drug formulations. Hanne Hjorth Tønnesen (Ed.), CRC Press, USA, 2004;

[3.39] Sackett, P.H.; Mayausky, J.S.; Smith, T.; Kalus, S.; McCreery, R.L. Side-chain effects on phenothiazine cation radical reactions. J. Med. Chem., Vol.24, pag. 1342-1347, 1981;

[3.40] Saucin, M.; Van de Vorst, A. Photodynamic potentialities of some phenothiazine derivatives. Radiat. Environ. Biophys, Vol.17, pag. 159-168, 1980;

[3.41] Van Haare, J.A.E.H.; Van Boxtel, M.; Jansen, R.A.J. Pi-Dimers of Prototype High-Spin Polaronic Oligomers. J. Chem. Mater., Vol.10, pag. 1166-1175, 1998;

[3.42] Pascu, M.L.; Nastasa, V.; Smarandache, A.; Militaru, A.; Martins, A.; Viveiros, M.; Boni, M.; Andrei, I.R.; Pascu, A.; Staicu, A.; Molnar, J.; Fanning, S.; Amaral, L. Direct Modification of Bioactive Phenothiazines by Exposure to Laser Radiation. Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, Vol.6, pag. 147-157, 2011;

76

[3.43] Pascu, M.L.; Smarandache,A.; Boni, M.; Kristiansen, J.; Nastasa, V.; Andrei, I.R. Spectral properties of some molecular solutions. Romanian Reports in Physics. Vol. 63, Supplement, pag. 1267–1284, 2011;

[3.44] Papadopoulos, A. S.; Crammer, J. L. Sulphoxide metabolites of thioridazine in man, Xenobiotica. Vol. 16, Nr. 12, pag. 1097, 1986;

[3.45] Smarandache, A.; Kristiansen, J.; Christensen, J.B.; Pascu M.L. Optical studies of the Spectral Properties of Phenothiazines, acceptat spre publicare in Letters in Drug Design &Discovery, Vol.9, Nr.4, 2012.

77

CAPITOLUL 4 STUDIUL PROPRIETATILOR SPECTRALE ALE DERIVATULUI CHINAZOLINIC

BG1188

4.1. INTRODUCERE

Din clasa largita a compusilor heterociclici, aceia care contin azot joaca un rol important. Dintre ei, clasa chinazolinelor este cea mai importanta si s-a bucurat de o mare atentie din partea chimistilor in special datorita proprietatilor lor farmacologice: efect diuretic, anti-hipertensiv, anti-tumoral, anti-alergic, anti-fungic si anti-infectios [4.1-4.7]. De asemenea, acesti compusi isi gasesc intrebuintari in diverse alte domenii, de exemplu ca agenti corozivi in electronica si electrochimie, ca polimeri sau markeri fluorescenti in secventierea ADN [4.8-4.12]. Chinazolina este un compus format prin fuzionarea a doua inele aromatice simple: un inel benzenic si un inel pirimidinic. Formula sa chimica este C8H6N2, iar structura moleculara este data in Fig.4.1. Este o substanta cristalina, de culoare galbena. Orice derivat de chinazolina poate fi descris ca un compus chinazolinic.

Fig.4.1. Structura moleculara a chinazolinei.

Derivatii chinazolinici sunt sintetizati in principal pornind de la acidul antranilic si benzonitril, continuand cu diversi substituenti in scopul obtinerii unei functionalitati si activitati specifice [4.13]. In ultimii ani au fost realizate studii de caracterizare a chinazolinei si a unora dintre derivatii sai din punct de vedere fotofizic si fotochimic [4.10, 4.14, 4.15]. Acest capitol trateaza studiul stabilitatii derivatului chinazolinic denumit generic BG1188 pe baza variatiei in timp a proprietatilor de absorbtie. De asemenea, influenta expunerii la radiatie laser este discutata, iar studiul este completat cu date obtinute prin metodele de spectroscopie de rezonanta magnetica nucleara (RMN) si HPLC-MS. 4.2. CARACTERIZAREA SUBSTANTEI CHIMICE SI A SOLUTIILOR SUPUSE STUDIULUI Derivatul chinazolinic sub denumirea de BG1188, avand formula chimica C12H14N4O3 (3[2(dimetilamino)etil]-6-nitrochinazolin-4(3H)-unu) a fost sintetizat si pus la dispozitie spre analiza de catre specialisti din cadrul Facultatii de Medicina si Farmacie de la Universitatea Mediteraneana din Marsilia, Franta. Substanta se prezinta sub forma galben-cristalina, pastrand caracteristicile compusului de provenienta [4.16]. Structura chimica este data in Fig.4.2.a in reprezentare bi-dimensionala. Pe baza formulei chimice a fost propusa o reprezentare tri-dimensionala (Fig.4.2.b), care sa poata fi folosita in studiile de interactie a compusului cu radiatia laser.

78

a) b)

Fig.4.2. Structura moleculara a derivatului quinazolinic BG1188 in reprezentare 2D (a) si 3D (b).

Proprietatile fizico-chimice ale substantei sunt date in cele ce urmeaza:

Compozitie = C(54,96%)H(5,38%)N(21,36%)O(18,30%) Masa molara = 262,26456 g/mol Volum molar = 196,0 ± 7,0 cm3 Densitate = 1,33 ± 0,1 g/cm3 Refractivitate molara: 69,85 ± 0,5 cm3 Parachor: 532,1 ± 8,0 cm3 Indice de Refractie: 1,631 ± 0,05 Tensiune superficiala= 54,3 ± 7,0 dyne/cm Polarizabilitate = 27,69 ± 0,5 x10-24 cm3

In scopul caracterizarii proprietatilor spectrale si a comportarii sub influenta radiatiei laser au fost preparate solutii. Solventul utilizat a fost apa ultra pura, deionizata, obtinuta in urma filtrarii sterile de catre un echipament TKA Pacific UP/UPW6, ale carui performante sunt prezentate in Capitolul 3.

S-au preparat solutii in intervalul de concentratii (10-6 – 10-3) M, care au fost pastrate la intuneric, atat la temperatura de 40C, cat si la temperatura camerei (220C). In vederea efectuarii masuratorilor, solutiile tinute la frigider au fost expuse la temperatura camerei timp de o jumatate de ora, iar inregistrarea spectrelor de absorbtie s-a efectuat la 220C.

In unele cazuri, pentru a se evita fenomenul de precipitare in timpul experimentelor, solutiile au fost expuse la ultrasunete si incalzite in acelasi timp la 500C; timpul de expunere a fost de pana la 15 min la 35 KHz si 240 W. Aceste manevre nu au adus nici o modificare in comportarea optica a solutiilor studiate [4.17]. 4.3. COMPORTAREA IN TIMP A PROPRIETATILOR OPTICE ALE SOLUTIILOR DE BG1188 Spectrele de absorbtie au fost inregistrate in intervalul spectral (200 – 450) nm cu ajutorul spectrofotometrului Perkin-Elmer Lambda 950 UV-VIZ-NIR. Au fost utilizate celule de quart cu drum optic de 1 mm, a caror eroare de pozitionare in cele doua compartimente ale spectrofotometrului conduce la o erorare totala a masuratorilor situata intre ±1,041% pentru o concentratie de 10-3 M si ±19,493% pentru concentratia de 10-6 M [4.17]. Au fost masurate proprietatile de absorbtie ale unor solutii de BG1188 in apa ultra-pura la concentratii intre 10-6 M si 2x10-3 M. Dependenta acestora de concentratie este redata in Fig.4.3. Spectrul caracteristic substantei prezinta o banda larga de absorbtie in intervalul (275 – 375) nm, centrata in jurul lungimii de unda de 314 nm, iar intre (200 – 250) nm se gasesc mai multe benzi, partial rezolvate, cu maxime la 207 nm si 224 nm.

79

Fig.4.3. Spectrele de absorbtie ale BG1188 in intervalul de concentratii (10-6 – 2x10-3) M.

Se observa o deplasare a maximului de la 314 nm catre lungimi de unda mai

mici odata cu descresterea concentratiei. Astfel, pentru o concentratie de 10-3 M maximul de absorbtie se situeaza la 314 nm, in timp ce pentru 10-5 M, acesta se afla la o lungime de unda de 310 nm. In acelasi timp, maximele de la 207 nm si 224 nm isi pastreaza pozitia in spectru de-a lungul gamei de concentratii investigate.

Maximul de absorbtie situat in jurul lungimii de unda de 314 nm a fost folosit pentru calculul gradului de polimerizare (dupa metoda expusa in Capitolul 3), care indica prezenta in solutie doar a monomerilor (Fig.4.4). Acelasi set de solutii, pastrate la temperatura camerei (220C) timp de o luna fost folosit pentru recalcularea gradului de polimerizare. De asemenea, rezultatul (1,018) nu indica aparitia altor formatiuni moleculare.

Fig.4.4. Gradul de polimerizare calculat pentru solutii in intervalul de concentratii (10-6 – 2x10-3) M, imediat dupa preparare.

(C = concentratia probei; Cm = concentratia de monomer)

In scopul aprecierii stabilitatii solutiilor de BG1188 in apa ultra pura s-a luat in evidenta comportarea in timp a proprietatilor de absorbtie [4.18]. Astfel, au fost inregistrate spectrele de absorbtie ale unei solutii de medicament cu concentratia de 10-3 M in primele 12 h de la preparare, folosind o celula optica de 1 mm; asa cum se poate observa din Fig.4.5, in care este reprezentata si eroarea de masura, solutia este stabila in intervalul de timp luat in considerare.

80

Fig.4.5. Evolutia in timp a spectrelor de absorbtie ale BG1188 solutie 10-3 M in apa ultra pura in primele 12 h dupa preparare.

Au fost masurate, de asemenea, spectrele de absorbtie ale unei solutii cu concentratia de 10-3 M in apa ultra pura, pastrata timp de 51 zile la temperatura de 40C. Evolutia absorbtiei in acest interval de timp se poate observa din Fig.4.6.

Fig.4.6. Evolutia in timp a proprietatilor de absorbtie ale solutiei de BG1188 10-3 M in

apa ultra pura, pastrata la temperatura de 40C timp de 51 de zile.

Examinand detaliul din figura se poate concluziona ca substanta este stabila intr-un interval de timp de pana la 44 de zile (1032 h), daca tinem cont de eroarea de masura calculata prin cumularea celor doua valori: eroarea intrinseca a spectrofotometrului si cea datorata pozitionarii cuvelor in compartimentele echipamentului. La o concentratie de 10-4 M a probei in apa ultra pura tinute la intuneric, la o temperatura de 40C, proba prezinta o stabilitate remarcabila, asa cum se observa din Fig.4.7.

81

Fig.4.7. Evolutia in timp a proprietatilor de absorbtie ale solutiei de BG1188 10-4 M in apa ultra pura, pastrata la temperatura de 40C timp de 119 zile.

Evolutia in timp a solutiei BG1188 10-5 M in apa ultra pura pastrata la frigider (40C) este data in Fig.4.8. si prezinta caracteristici similare cu aceea a solutiei de concentratie 10-4 M. Aspectul spectrului de absorbtie ramane neschimbat, insa maximul de la 314 nm este deplasat la 310 nm.

Fig.4.8. Evolutia in timp a proprietatilor de absorbtie ale solutiei de BG1188 10-5 M in apa ultra pura, pastrata la temperatura de 40C timp de 119 zile.

In ceea ce priveste distributia de intensitate a maximelor de absorbtie, variatiile acesteia, in special in ceea ce priveste maximul de la 310 nm, pot fi grupate (tinand seama de erorile de masura), in trei seturi, pornind de la momentul prepararii solutiei. Primul set include curbele de absorbtie ale solutiei inregistrate pana la 816 h (34 de zile), cel de-al doilea set intre (816 - 1320) h – 55 de zile, iar cel de-al treilea intre (1320 – 2856) h, adica 119 zile. In aceasta ordine, solutia investigata poate fi considerata stabila in primele 34 de zile de la preparare, dupa acest interval de timp intervenind usoare modificari ale proprietatilor de absorbtie.

82

Observand inregistrarile spectrelor de absorbtie ale solutiilor de BG1188 in apa ultra pura in intervalul de concentratii (10-5 – 10-3) M se poate trage concluzia ca acestea prezinta o buna stabilitate in timp. Pe de alta parte, intensitatea spectrelor sufera o usoara descrestere in timp, care poate fi datorata unor fenomene ce intervin la interfata peretilor cuvei cu solutia investigata. Una dintre posibilitati ar fi depunerea (chiar adsorbtia) unor cantitati foarte mici de substanta pe peretii eprubetelor in care au fost pastrate solutiile. O alta explicatie ar putea fi data de procesele interne de organizare moleculara a substantei, prin care sunt generate microcristale sau precipitat. Descresterea globala a semnalului de intensitate poate fi rezultatul scaderii numarului de molecule de substanta din solutie. Considerand, de exemplu, maximul de absorbtie de la 314 nm al solutiei cu concentratia de 10-3 M, cu volumul de 400 µℓ, numarul de molecule din solutie in momentul prepararii este de 2,408854x1017, iar dupa 4 luni (la 2856 h) este de 2,330617x1017, ceea ce indica o scadere de 3% a moleculelor din solutie [4.17]. 4.4. COMPORTAREA BG1188 SUB INFLUENTA RADIATIEI LASER

O solutie de BG1188 in apa ultra pura, cu concentratia de 10-3 M a fost expusa la

radiatie laser care este armonica a treia (355 nm) a unui laser pulsat Nd:YAG, sistemul experimental folosit fiind similar celui descris in Capitolul 3 (Fig.3.4).

In experimentele ce urmeaza a fi descrise, orice modificare a proprietatilor optice ale probelor a fost evidentiata prin masurarea in timp real a spectrelor LIF emise in timpul sesiunilor de iradiere. Inainte si dupa expunere au fost inregistrate spectrele de absorbtie ale probelor cu ajutorul spectrofotometrului Perkin Elmer Lambda 950 UV/VIZ/NIR, descris de asemenea in Capitolul 3 cu scopul detectarii eventualelor modificari induse la nivel molecular de radiatia laser.

Solutia de medicament a fost expusa la radiatia emisa la lungimea de unda de 355 nm pentru intervale de timp intre (1 – 30) min. Caracteristicile fasciculului laser au fost: frecventa 10 Hz, rata de repetitie a pulsurilor 10 pps, durata pulsului la jumatatea intensitatii 5 ns, energia fasciculului 30 mJ. Pentru masurarea spectrului de absorbtie inainte si dupa iradiere s-au folosit celule cu drum optic de 1 mm. Spectrele de absorbtie ale solutiei inainte si dupa iradiere sunt date in Fig.4.9.

Fig.4.9. Spectrele de absorbtie ale solutiei BG1188 10-3 M inainte si dupa iradiere cu

radiatie laser pulsata emisa la 355 nm de laserul Nd:YAG.

83

O analiza a acestor spectre de absorbtie permite observarea a trei puncte isosbestice. Daca se ia in considerare o durata de iradiere de pana la 5 min, cele trei puncte de intersectie isi pastreaza pozitia si anume la lungimile de unda: 250 nm, 286 nm si 354 nm. Acest fapt permite ipoteza existentei a doua specii moleculare avand aceeasi absorbtivitate molara la lungimile de unda corespunzatoare celor trei puncte isosbestice. Incepand de la timpi de iradiere mai mari sau egali cu 10 min situarea in spectru a punctelor isosbestice prezinta diferente cu timpul de iradiere, in sensul deplasarii spre lungimi de unda mai mari a punctului de la 250 nm; astfel, in cazul unei iradieri de 30 min, acesta este localizat la 260 nm. Cel de-al doilea punct isosbestic sufera o deplasare catre lungimi de unda mai mici, de la 286 nm la 281 nm, pentru un timp de iradiere de 30 min, iar cel de-al treilea punct isosbestic „migreaza” spre lungimi de unda mai mari, de la 254 nm la 368 nm. Acest comportament poate fi explicat prin aparitia cel putin a unei a treia specii moleculare absorbante de concentratie diferita, ale carei proprietati de absorbtie difera de celelalte doua.

O comportare care sustine aceste ipoteze se observa si din analiza spectrelor de fluorescenta indusa cu laser (Fig.4.10) din care se poate observa o crestere a semnalului de fluorescenta pentru timpi de iradiere de pana la 5 min, dupa care intensitatea fluorescentei scade pentru timpi de iradiere cuprinsi intre (5 – 30) min.

a) b)

Fig.4.10. Spectrele de fluorescenta ale solutiei de BG1188 10-3 M. 4.5. STUDII DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA ALE FORMATIUNILOR MOLECULARE OBTINUTE IN URMA EXPUNERII LA RADIATIE LASER A SOLUTIILOR DE BG1188 Spectrele 1H RMN au fost inregistrate cu un spectrometru cu transformata Fourier VARIAN MERCURY, a carui prezentare este realizata in Capitolul 3 (Fig.3.5), folosind ca solvent DMSO-d6. Deplasarile chimice (δ) sunt exprimate in ppm relativ la Tetrametilsilan (TMS) si constantele de cuplaj (J) sunt exprimate in Hz.

Spectrul 1H RMN al BG1188 substanta pura, indica prezenta a 10 protoni alifatici in regiunea (2,4 – 4,45) ppm si 4 protoni aromatici in regiunea (7,85 – 8,86) ppm. Se observa prezenta unor semnale slabe la 7,2 ppm, (7,86 – 7,9) ppm, 8,325 ppm si 8,82 ppm (Fig.4.11), care se datoreaza unor impuritati. 1H NMR(DMSO-d6) δ[ppm]:

7,92 (d, 1H, Jo=9,2 Hz, H8), 8,6 (dd, 1H, Jo=8,8 Hz, Jm=2,8 Hz, H7), 8,649 (s, 1H, H2), 8,85 (d, 1H, Jo=2 Hz, H5).

84

La δ=10,190 ppm se observa un maxim larg, care indica prezenta unui proton liber.

Fig.4.11. Spectrul 1H RMN al BG1188 in DMSO-d6.

O solutie BG1188 la concentratia de 3x10-2 M in apa ultra pura in care se observa mici agregate in flotatie a fost uscata pentru a putea fi supusa investigarii prin tehnica RMN. Aceste formatiuni apar in solutie la cateva ore dupa preparare si sunt independente de concentratia substantei sau de conditiile de preparare si pastrare. Spectrul obtinut, redat in Fig.4.12, prezinta mici semnale apartinand unor impuritati, altele decat cele puse in evidenta pentru substanta in stare initiala, in regiunea protonilor alifatici, la 1 ppm si in regiunea protonilor aromatici, la 6,96 ppm, 7,08 ppm si 7,21 ppm.

Fig.4.12. Spectrul 1H RMN in DMSO-d6 al BG1188 3x10-2 M in apa ultra pura continand mici agregate, uscata in prealabil.

O proba de BG1188 10-3 M in apa ultra pura, iradiata timp de 30 min cu un

fascicul laser emis la 355 nm de laserul pulsat Nd:YAG, avand energia de 30 mJ, continand formatiuni in flotatie, a fost uscata in prealabil si apoi masurat spectrul 1H RMN (Fig.4.13).

85

Fig.4.13. Spectrul 1H RMN in DMSO-d6 al BG1188 10-3 M in apa ultra pura continand mici agregate, uscata in prealabil.

Daca facem o comparatie cu spectrul din Fig.4.12 se poate observa o crestere a intensitatii picurilor corespunzatoare impuritatilor observate, dar si aparitia unor alte maxime in regiunea protonilor aromatici la 7,4 ppm, 7,5 ppm, 7,72 ppm, (8 – 8,2) ppm, 8,3 ppm si 8,5 ppm.

In aceasta etapa noile semnale nu pot fi atribuite, fiind necesare investigatii suplimentare in vederea identificarii grupurilor responsabile pentru acestea. Facand o corelatie cu observatiile din cazul interactiei substantei cu radiatia laser, este posibil ca in timpul iradierii substanta initiala sa-si fi redus concentratia pana la degradarea aproape completa. In acelasi timp, concentratia fotoprodusilor a crescut. O alta explicatie posibila ar fi procesul de hidroliza, prin care molecula de BG1188 sa fie rupta in regiunea amid (Fig.4.14.).

Fig.4.14. Fig.4.15. Spectrul 1H RMN al apei ultra pure. Este important de mentionat ca apa ultra pura folosita la prepararea solutiilor nu prezinta impuritati de natura organica, asa cum poate fi observat din Fig.4.15.

86

4.6. STUDII PRIN HPLC-MS ALE FORMATIUNILOR MOLECULARE OBTINUTE IN URMA EXPUNERII LA RADIATIE LASER A SOLUTIILOR DE BG1188

Echipamentul si conditiile folosite in mod practic la obtinerea datelor experimentale sunt prezentate in Capitolul 3 (Fig.3.6).

Cromatograma substantei BG1188 in stare initiala este prezentata in Fig.4.16. Se pot pune in evidenta 2 semnale la timpii de retentie: 2,99 min si 5,04 min.

Fig.4.16. Cromatograma BG1188.

Spectrul de masa (Fig.4.17.a) permite identificarea compusului chimic BG1188 cu [M+H]+= 263,7 m/z la timpul de retentie 2,91 min. Pentru cel de-al doilea timp de retentie, semnalul principal este la [M+H]+= 337,4 m/z (Fig.4.17.b). Este posibil ca acesta sa fie un reziduu de sinteza, care a fost identificat si in spectrul 1H RMN.

a) b)

Fig.4.17. Spectrul de masa al BG1188 la timpul de retentie 2,91 min (a) si la timpul de retentie 5,04 min (b).

Cromatograma solutiei 10-3 M BG1188 in apa ultra pura expusa 30 min la radiatie

laser pulsata cu lungimea de unda 355 nm emisa de laserul Nd:YAG este prezentata in Fig.4.18.

87

a) b)

Fig.4.18. Cromatograma (a) si spectrul de masa (b) al BG1188 10-3 M in apa ultra pura iradiata 30 min cu λ=355 nm emisa de laserul Nd:YAG.

Cromatograma substantei iradiate prezinta mici diferente fata de aceea a substantei neexpuse la radiatie laser, insa cu o separare cromatografica deficienta.

O proba de agregate filtrate dintr-o solutie de BG1188 10-3 M iradiata cu lungimea de unda de 266 nm emisa de laserul pulsat cu Nd:YAG a fost investigata prin tehnica HPLC-MS in scopul obtinerii unor informatii suplimentare in ceea ce priveste compozitia lor. Cromatograma prezinta diferente notabile fata de cazurile discutate pana acum, chiar daca separarea cromatografica nu este atat de buna, asa cum se poate observa din Fig.4.19.

a) b)

Fig.4.19. Cromatograma (a) si spectrul de masa (b) al unei probe de agregate BG1188 10-3 M prelevate din solutia iradiata cu λ=266 nm emisa de laserul

Nd:YAG. O explicatie posibila pentru aparitia acestor formatiuni in solutie ar putea fi

reactia de hidroliza in urma careia molecula de BG1188 sa se desfaca in regiunea amid.

88

4.7. CONCLUZII Studiul comportarii in timp a proprietatilor optice ale derivatului chinazolinic BG1188 demonstreaza o buna stabilitate a solutiilor studiate in intervalul de concentratii 10-5 M – 10-3 M in apa ultra pura. In consecinta, solutia in concentratie 10-3 M este extrem de stabila la o temperatura de 40C in prima luna dupa preparare. In ceea ce priveste concentratiile mai mici, pana la 10-5 M intervalul de timp in care solutiile sunt stabile este chiar mai mare – pana la 4 luni. Nu au fost observate influente ale temperaturii de pastrare pentru prima luna de studiu. In ceea ce priveste comportarea solutiilor derivatului chinazolinic 10-3 M in apa ultra pura expuse la radiatie laser pulsata emisa la 355 nm de laserul Nd:YAG, rezultatele experimentale permit gruparea procesului de fotodegradare in doua etape:

• Pentru un interval de timp de pana la 5 min de expunere se constata degradarea progresiva a compusului, relevata prin scaderea concentratiei BG1188 si cresterea concentratiei fotoprodusului generat de iradierea laser; astfel, in solutie se constata prezenta a doua specii absorbante;

• Incepand de la timpi de iradiere mai mari sau egali cu 10 min, solutia studiata se degradeaza aproape complet, cinetica reactiilor sugereaza aparitia cel putin a unei a treia specii absorbante de concentratie diferita, ale carei proprietati de absorbtie difera de celelalte doua. Spectrul 1H RMN al BG1188 substanta pura indica prezenta a 10 protoni alifatici

in regiunea (2,4 – 4,45) ppm si 4 protoni aromatici in regiunea (7,85 – 8,86) ppm. Se observa prezenta unor alte semnale slabe in regiunea protonilor aromatici, care se datoreaza, probabil unor impuritati. In ceea ce priveste agregatele observate in solutie, ele nu pot fi complet caracterizate in aceasta etapa de studiu, fiind necesare investigatii suplimentare. Se poate presupune ca ele reprezinta rezultatul procesului de hidroliza, efectul radiatiei laser asupra acestora constituind un factor de potentare.

4.8. REFERINTE BIBLIOGRAFICE:

[4.1] Mani Chandrika, P.; Yakaiah, T.; Raghu Ram Rao, A.; Narsaiah, B.; Chakra Reddy,

N.; Sridhar, V.; Venkateshwara Rao, J. Synthesis of novel 4,6-disubstituted quinazoline derivatives, their anti-inflammatory and anti-cancer activity (cytotoxic) against U937 leukemia cell lines. European Journal of Medicinal Chemistry, Vol.43, pag. 846-852, 2008;

[4.2] Vipan, Kumar; Chander, Mohan; Manish, Gupta; Mohinder, P. Mahajan. A catalyst- and solvent-free selective approach to biologically important quinazolines and benzo[g]quinazoline. Tetrahedron, Vol.61, pag. 3533–3538, 2005;

[4.3] Zieliński, W.; Kudelko, A. Acid-base interactions in some isoquinoline and quinazoline amino derivatives. ARKIVOC, pag. 66-82, 2005;

[4.4] Grover, G.; Kini, S.G. Synthesis and evaluation of new quinazolone derivatives of nalidixic acid as potential antibacterial and antifungal agents. European Journal of Medicinal Chemistry, Vol.41, pag. 256–262, 2006;

[4.5] Tiwari, A.K.; Singh, V.K.; Bajpai, A.; Shukla, G.; Singh, S.; Mishra, A.K. Synthesis and biological properties of 4-(3H)-quinazolone derivatives. European Journal of Medicinal Chemistry, Vol.42, pag. 1234-1238, 2007;

[4.6] Chevalier, J.; Mahamoud, A.; Baitiche, M.; Adam, E., Viveiros M.; Smarandache, A.; Militaru, A.; Pascu, M.L.; Amaral, L.; Pagès, J.M. Quinazoline derivatives are efficient chemosensitizers of antibiotic activity in Enterobacter aerogenes, Klebsiella

89

pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa resistant strains, International Journal of Antimicrobial Agents, Vol.36, pag. 164-168, 2010;

[4.7] Rohini, R.; Shanker, K.; Reddy, P.M.; Ho, Y.P.; Ravinder, V. Mono and bis-6-arylbenzimidazo[1,2-c]quinazolines: A new class of antimicrobial agents. European Journal of Medicinal Chemistry, Vol.44, pag. 3330–3339, 2009;

[4.8] Gautheron Chapoulaud, V.; Plé, N.; Turck, A; Quéguiner, G. Synthesis of 4,8-Diarylcinnolines and Quinazolines with Potential Applications in Nonlinear Optics. Diazines. Part 28, Tetrahedron, Vol. 56, Nr.30, Pag. 5499-5507, 2000;

[4.9] Kwok, P.; Chan, Haixin Yang; Allan, S. Hay. Thermal chemistry of poly(aryl ether phthalazine)s and the synthesis of poly(aryl ether quinazoline)s. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, Vol. 34, Nr. 10, pag. 1923–1931, 1996;

[4.10] Bakalova, S.M.; Santos, A.G.; Timcheva, I.; Kanetia, J.; Filipova, I.L.; Dobrikova, G.M.; Dimitrov, V.D. Electronic absorption and emission spectra and computational studies of some 2-aryl, 2-styryl, and 2-(40-aryl)butadienyl quinazolin-4-ones. Journal of Molecular Structure (Theochem) Vol.710, pag. 229–234, 2004;

[4.11] Herget, T.; Freitag, M.; Morbitzer, M.; Kupfer, R.; Stamminger, R.; Marschall, M. Novel Chemical Class of pUL97 Protein Kinase-Specific Inhibitors with Strong Anticytomegaloviral Activity. Antimicrob Agents Chemother. Vol.48, Nr.11, pag. 4154–4162, 2004;

[4.12] Daly, C.J.; Milligan, C.M.; Milligan, G.; Mackenzie, J.F.; McGrath, J.C. Cellular localization and pharmacological characterization of functioning α1-

adrenoreceptors by fluorescent ligand binding and image analysis reveals identical binding properties of clustered and diffuse populations of receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther., Vol.286, pag. 984-990, 1998;

[4.13] Brown, D.J. The Chemistry of Heterocyclic Compounds: Quinazolines, Taylor E. (Ed.), John Wiley & Sons Ed., 1996;

[4.14] Aaron, J. J.; Tines, A.; Gaye, M. D. Effects of solvent on the electronic absorption and fluorescence spectra of quinazolines, and determination of their ground and excited singlet-state dipole moments. Spectrochimica Acta, Vol.4, Nr.3/4, pag. 419-430, 1991;

[4.15] Militaru, A.; Smarandache, A.; Mahamoud, A.; Damian, V.; Ganea, P.; Alibert, S.; Pagès, J.M.; Pascu, M.L. Stability Characterization of Quinazoline Derivative BG1188 by Optical Methods. Advances in Laserology-Selected papers of Laser Florence 2010, AIP Conf. Proc, Vol.1364, pag. 13-23, 2011;

[4.16] http://chemicalland21.com/specialtychem/finechem/QUINAZOLINE.htm; [4.17] Militaru, A.; Smarandache, A.; Mahamoud, A.; Alibert, S.; Pagès, J.M.; Pascu,

M.L. Time Stability Studies of Quinazoline Derivative Designed to Fight Drug Resistance Acquired by Bacteria. Letters in Drug Design & Discovery, Vol.8, 2011;

[4.18] Pascu, R.A.; Trifu, M.; Dumitrescu, M.; Mahamound, A.; Staicu, A.; Dicu, M.; Smarandache, A.; Carstocea, B.; Pascu M.L. In vivo studies of the effects of alkyl substituted Benzo[b]pyridinium compounds exposed to optical radiation I, AIP Conference Proceedings, Vol. 1142, pag. 8-14, 2009;

90

CAPITOLUL 5

STUDIUL PROPRIETATILOR SPECTRALE ALE UNOR SOLUTII DE ANTIBIOTICE

5.1. INTRODUCERE

Intr-un sens larg, antibioticele sunt agenti chemoterapeutici care inhiba sau anuleaza dezvoltarea microorganismelor (fungi, bacterii sau protozoare). Se folosesc si alte denumiri, cum sunt medicamente chemoterapeutice sau antibacteriene, termeni care nu sunt sinonimi. De pilda, medicamentele antibacteriene sunt eficiente si impotriva virusurilor. Expresia „chemoterapeutic” se refera la un compus folosit la tratarea unei boli care distruge celule, microorganisme specifice sau celule canceroase (popular, anti-neoplazic); de asemenea, se poate referi la antibiotice – chemoterapie antibacteriana. In prezent sunt in jur de 250 de entitati chimice diferite inregistrate pentru uz medical (uman sau veterinar) [5.1].

Primele antibiotice au fost de origine naturala (penicilinele produse de fungii Penicillium sau streptomicina, produsa de bacterii Streptomyces), dar astazi ele sunt obtinute prin sinteza chimica sau prin modificari chimic induse asupra compusilor de origine naturala.

Antibioticele pot fi clasificate fie dupa structura lor chimica, fie in functie de mecanismul de actiune. De cele mai multe ori, acestea sunt molecule complexe care pot avea diverse functionalitati. Astfel, in functie de conditiile de pH, acelasi antibiotic poate fi neutru, cationic, anionic sau hibrid (incarcare pozitiva sau negativa in functie de o anumita zona din molecula). Din cauza acestui fapt, este deosebit de util sa se cunoasca proprietatile fizice, chimice, biologice, activitatea, fotoreactivitatea si toxicitatea acestor medicamente in functie de conditiile de preparare, stocare si dispersare.

De exemplu, un studiu al cineticii de degradare al Vancomicinei, unul dintre medicamentele care fac obiectul de studiu al acestui capitol, efectuat pe baza ratei profilului pH-ului, indica faptul ca reactivitatea acestui medicament spre deamidare in intervalul de pH=(6 - 9) este influentata de starea ionica a medicamentului [5.2]. De asemenea, studiul echilibrului protonare-deprotonare a acestei glicopolipeptide a fost caracterizat conform constantelor de protonare, punctului izoelectric si diagramei distributiei speciilor in functie de pH. Astfel, Vancomicina contine doua grupuri bazice si patru acide. Dintre acestea, disocierea grupului carboxil terminal-C are loc separat la pH scazut, in timp ce legarea protonica a celor doua grupuri amino si deprotonarea celor trei grupuri fenolice hidroxil au loc la valori ale pH-ului intre 5 si 13 [5.3].

Eliberarea antibioticelor in mediu se datoreaza in principal utilizarii lor pe scara larga in medicina umana si veterinara. Numeroase studii certifica omniprezenta catorva antibiotice in apele uzate municipale, in concentratii de ordinul sutelor de ng/ℓ, pana la zeci de µg/ℓ [5.4-5.6]. Chiar si la concentratii foarte scazute, antibioticele prezinta efecte ecotoxicologice semnificative in mediile acvatice si terestre. Folosirea excesiva si/sau fara discernamant este considerata a fi una dintre cauzele aparitiei rezistentei la tratament. De aceea este foarte important controlul emisiilor de astfel de substante in mediu printr-o folosire mai responsabila si o monitorizare mai atenta a focarelor de agenti infectiosi rezistenti la medicamente.

91

Antibioticele, ca si alte produse farmaceutice, sunt concepute pentru a stimula un raspuns fiziologic in organismele tinta. In ultimul timp s-a acordat un interes crescand in ceea ce priveste folosirea, efectele adverse si dispunerea in mediu a medicamentelor, in general, asupra ecosistemelor. Cercetarile efectuate dovedesc faptul ca produsele farmaceutice nu sunt in totalitate indepartate in timpul tratarii apelor uzate, astfel ca mici cantitati sunt continuu introduse in mediul natural, fapt ce provoaca adaptarea patogenilor si aparitia unor „super-bacterii” rezistente la tratamente [5.7-5.9]. 5.2. PROPRIETATI FIZICE, CHIMICE SI FARMACOLOGICE ALE DOXORUBICINEI SI VANCOMICINEI

5.2.1. DOXORUBICINA

Doxorubicina (C27H29NO11, (7S,9S)-7-[(2R,4S,5S,6S)-4-amino-5-hidroxi-6-metiloxan – 2- yl]oxi - 6,9,11 – trihidroxi- 9 -(2-hidroxiacetil)-4-metoxi-8,10-dihidro-7H-tetracen-5,12-diona, masa molara 543,52 g/mol) este un antibiotic antraciclinic citostatic izolat din culturi de Streptomyces pencetius var caesius. Structura chimica a Doxorubicinei, data in Fig.5.1, cuprinde un nucleu naftacenchinonic legat printr-o punte glicozidica la nivelul atomului 7 al inelului aromatic de un glucid aminat, daunosamina.

Fig.5.1. Structura chimica a Doxorubicinei.

Legarea Doxorubicinei de acidul nucleic se realizeaza, probabil, prin intercalarea specifica a nucleului antraciclinic intre elementele dublului helix ADN. Inelul antraciclinic este lipofilic, dar capatul saturat al moleculei contine un numar mare de grupari hidroxi legate de glucidul aminat ce confera acestui segment molecular un caracter hidrofilic. Molecula are un caracter amfoter, continand functiuni acide prin gruparile fenol ale inelului aromatic si functiuni bazice prin grupul glucidului aminat. Se poate lega atat de membrana celulara, cat si de proteinele plasmatice.

Desi incomplet elucidat, mecanismul de actiune al Doxorubicinei presupune legarea sa de molecula de ADN si inhibarea sintezei acizilor nucleici [5.10, 5.11]. Studiile efectuate pe culturi celulare au demonstrat penetratia celulara rapida cu legare de cromatina perinucleara, precum si rapida inhibare a activitatii mitotice a sintezei de acid nucleic, a mutagenezei si a aberatiilor cromozomiale. Studii efectuate pe animale au aratat actiunea sa in spectrul tumorilor experimentale, imunosupresie, proprietati carcinogenice la rozatoare, inducerea unor efecte toxice incluzand actiunea cardiotoxica intarziata si progresiva, mielosupresie la toate speciile de animale studiate si atrofie in testele efectuate pe sobolani si caini.

Studiile farmacocinetice au aratat ca injectarea intravenoasa a Doxorubicinei normale sau marcate radioactiv este urmata de clearance plasmatic rapid si o semnificativa legare de tesuturi. Eliminarea urinara a substantei determinata prin

92

metode fluorimetrice arata o eliminare la 5 zile a 4-5% din doza administrata. Calea principala de eliminare este cea biliara, un procent de 40-50% din doza administrata fiind eliminat prin bila si fecale dupa 7 zile de la administrare. In cazul unor tulburari ale functiei hepatice are loc o incetinire a excretiei substantei, ceea ce va duce la o retentie crescuta si la acumularea in plasma si tesuturi. Doxorubicina nu traverseaza bariera hematoencefalica.

In urma producerii si utilizarii Doxorubicinei, aceasta poate fi eliberata in mediu prin intermediul a diferite fluxuri de deseuri.

Daca este eliberata in aer, la o presiune a vaporilor estimata la valoarea de 2,5 x 10-23 mmHg la 250C, Doxorubicina va exista numai in faza de particule in atmosfera. Aceste particule pot fi indepartate din aer pe calea depunerii, fie uscata, fie umeda. Deoarece absoarbe radiatie luminoasa in UV, Doxorubicina este susceptibila de a fi supusa procesului de fotoliza, prin actiunea directa a luminii solare [5.12-5.15].

Daca este eliberat pe sol, medicamentul este considerat imobil, valoarea estimata a coeficientului de repartitie sol/apa, Koc, fiind de 6. Valori estimate de pKa1=7,34, pKa2=8,46 si pKa3=9,46 indica faptul ca acest compus va exista in mediu numai sub forma de cationi, care sunt adsorbiti cu precadere de solurile ce contin carbon organic si argila, caz in care si volatilizarea de pe solul umed este foarte putin probabila [5.13, 5.16-5.19].

In cazul emisiei in apa, este de asteptat ca medicamentul sa fie adsorbit pe particulele in suspensie si pe sedimente. De asemenea, valorile estimate ale pKa indica prezenta sub forma de cationi la valori ale pH cuprinse in intervalul (5 – 9), ceea ce exclude indepartarea pe calea volatilizarii la suprafata apei. O valoare estimata de BCF=0,5 sugereaza ca potentialul de bioconcentrare in organisme acvatice este scazut. Compusul nu prezinta grupuri functionale care sa hidrolizeze in conditii de mediu natural, astfel ca acest proces este exclus. Expunerea la Doxorubicina se poate realiza prin inhalare sau contact direct cu acest compus la locul de munca [5.16-5.22].

Datele din literatura de specialitate sugereaza ca unii compusi activi farmaceutic ce provin din sectoarele medicinei umane si veterinare nu sunt eliminate complet in timpul tratarii deseurilor uzate, fiind astfel eliminate in apele naturale sau depuse pe soluri. De cele mai multe ori procesul tehnologic al acestor uzine de tratare nu este prevazut cu operatii tintite de indepartare a deseurilor de natura farmaceutica, asa incat acestea se pot degrada in compusi noi si mai persistenti decat produsul initial [5.23, 5.24].

5.2.2. VANCOMICINA

Vancomicina (C66H75Cl2N9O24, (1S,2R,18R,19R,22S,25R,28R,40S) – 48 - {[(2S,3R,4S,5S,6R) - 3- {[(2S,4S,5S,6S) - 4- amino - 5- hidroxi - 4,6 – dimetiloxan - 2- yl]oxi} - 4,5 – dihidroxi - 6- (hidroximetil)oxan - 2- yl]oxi} - 22- (carbamoilmetil) - 5,15- dicloro - 2,18,32,35,37 – pentahidroxi– 19- [(2R)- 4- metil- 2- (metilamino)pentanamido]- 20,23,26,42,44 – pentaoxo - 7,13 – dioxa - 21,24,27,41,43 - pentaazaoctaciclo [26.14.2.23,6.214,17.18,12.129,33.010,25.034,39]pentaconta - 3, 5, 8(48), 9, 11, 14, 16, 29(45), 30, 32, 34, 36, 38, 46, 49 – pentadecaena – 40 - acid carboxilic, masa molara 1449,3 g/mol) este un antibiotic glicopeptidic triciclic derivat din Amycolatopsis orientalis, a carei structura chimica este prezentata in Fig.5.2.

Vancomicina a fost izolata pentru prima data in 1953 de catre Edmund Kornfeld, angajat al Eli Lilly, dintr-o proba de sol prelevata din jungla din Borneo. A fost indicata mai intai pentru tratamentul infectiilor cu Staphylococcus aureus rezistent la penicilina. Initial a fost numita „compusul 05865”, dandu-i-se si numele generic de Vancomicina, derivat din „vanquish”. Produsul farmaceutic, Vancomicina hidroclorid, a obtinut

93

aprobarea FDA in 1958 si a fost pus pe piata de Eli Lilly sub denumirea comerciala Vancocin si de catre Nucleus, in India, sub denumirea comerciala Covanc [5.25, 5.26].

Fig.5.2. Structura chimica a Vancomicinei.

Acest medicament nu a devenit niciodata tratament de prima alegere din cateva motive: 1. are o biodisponibilitate orala scazuta, fiind necesara administrarea intravenoasa; 2. au fost dezvoltate peniciline semi-sintetice mult mai active (de exemplu meticilin) impotriva infectiilor stafilococice rezistente; 3. anumite forme impure de Vancomicina (numite „namol de Mississippi”) sunt toxice pentru ureche si rinichi [5.27], ceea ce a plasat acest medicament ca fiind unul de ultima interventie.

Cativa dintre producatorii autorizati sa puna pe piata Vancomicina, sub diferite nume generice, sunt: ViroPharma, Flynn Pharma, Bioniche Pharma, Baxter Healthcare, Sandoz, Akorn Strides si Hospira in SUA si Aspen Pharmacare in Australia.

O forma orala de Vancomicina, pusa pe piata de ViroPharma (SUA) a fost aprobata in 1986 pentru tratamentul Clostridium difficile din colita pseudomembranoasa, dat fiind ca medicamentul nu este absorbit in sange ci ramane in tractul intestinal. In ceea ce priveste farmacocinetica acestui medicament, Vancomicina este administrata intravenos in cazul tratarii infectiilor sistemice. Ea este slab absorbita dupa administrarea orala, chiar daca absorbtia poate fi mai mare in cazul inflamatiilor de la nivelul tractului gastro-intestinal.

Administrarea intravenoasa: la subiectii cu functii renale normale, doze multiple intravenoase de 1 g de Vancomicina (15 mg/kg), perfuzate pe parcursul a 60 min, produc concentratii plasmatice medii de 63 mg/ℓ imediat dupa incheierea perfuziei, concentratii medii plasmatice de 23 mg/ℓ la 2 ore dupa perfuzie si concentratii medii plasmatice de aproximativ 8 mg/ℓ dupa 11 ore. Doze multiple de 500 mg, perfuzate timp de 30 min, produc concentratii plasmatice de 49 mg/ℓ dupa incheierea perfuziei, concentratii plasmatice medii de 19 mg/ℓ la 2 ore dupa perfuzie si concentratii plasmatice medii de 10 mg/ℓ la 6 ore dupa perfuzie. Concentratiile plasmatice de dupa dozele multiple sunt similare celor de dupa doza unica. Timpul mediu de injumatatire al Vacomicinei in plasma este de 4-6 ore. Aproximativ 75% dintr-o doza de Vancomicina este excretata in urina prin filtrare glomerulara in primele 24 de ore. Eliminarea plasmatica medie este de 0,058 ℓ/kg/ora si clearance-ul renal mediu este de aproximativ 0,048 ℓ/kg/ora. Distributia este cuprinsa intre (0,3 - 0,43) ℓ/kg. Aparent, medicamentul nu este metabolizat. Vancomicina este legata in proportie de 55% de proteinele plasmatice, masurate prin ultrafiltrarea nivelelor serice ale Vancomicinei, de

94

(10 – 100) mg/ℓ. Dupa administrarea i.v. de Vancomicina clorhidrat, concentratiile inhibitorii sunt prezente in lichidul pleural, pericardic, ascitic, in tesuturile atriale si lichidul sinovial, precum si in urina si lichidul peritoneal. Vancomicina nu penetreaza in lichidul cerebrospinal decat daca meningele este inflamat. Disfunctiile renale incetinesc excretia de Vancomicina. Timpul mediu de injumatatire la pacientii anefrici este de 7,5 zile. Clearance-urile totale sistemice si renale ale Vancomicinei pot fi reduse la varstnici datorita reducerii naturale a filtrarii glomerulare.

Administrarea orala: in timpul administrarii unor doze multiple de 250 mg, la 8 ore, in 7 doze, concentratia Vancomicinei in fecale la subiectii normali depaseste 100 mg/kg in majoritatea mostrelor analizate. Nu s-au detectat concentratii in sange, iar in urina nu depasesc 0,76%. Date mai multe in ceea ce priveste dozarea solutiei orale sunt prezente in cele ce urmeaza. Administrarea solutiei orale de Vancomicina, 2 g zilnic, timp de 16 zile, in cazul pacientilor anefrici, fara boli inflamatorii ale intestinelor, da nivele serice mai mici de 0,66 mg/ℓ. In cazul unor doze de 2 g zilnic, concentratii de peste 3100 mg/ℓ pot fi regasite in fecale, iar nivele mai mici de 1 mg/ℓ pot fi detectate in serul pacientilor cu functii renale normale, care au insa colita pseudomembranoasa.

Ca proprietate farmacodinamica, actiunea bactericida a Vancomicinei rezulta in primul rand din inhibarea biosintezei peretelui celular. In plus, Vancomicina modifica permeabilitatea membranei celulare si sinteza de ARN. Nu exista dovada unei rezistente incrucisate la Vancomicina si la alte antibiotice. In vitro, Vancomicina este activa impotriva: stafilococilor, inclusiv Staphylococcus aureus si S. epidermidis (inclusiv tulpinile heterogene rezistente la meticilina), streptococilor, inclusiv Streptococcus pyogenes, S. pneumoniae (inclusiv tulpinile rezistente la penicilina), S. agalactiae, grupului viridans, S. bovis si enterococilor (de exemplu: S. faecalis), Clostiridium difficile (de exemplu: tulpinile toxigene implicate in producerea enterocolitei pseudomembranoase) si difteroizilor. Alte organisme susceptibile la Vancomicina in vitro includ Listeria monocytogenes, Lactobacillus spp., Actinomyces spp., Clostridium spp. si Bacillus spp.

Vancomicina nu este activa in vitro impotriva bacililor gram-negativi, micobacteriilor sau fungilor. Combinarea Vacomicinei cu aminoglicozide actioneaza sinergic, in vitro, impotriva multor tulpini de S. aureus, grupului D de streptococi non-enterococici, enterococilor si a Streptococcus spp. (grupul viridans). Vancomicina si Rifampicina actioneaza sinergic impotriva S. epidermidis.

5.3. PROPRIETATI OPTICE ALE MEDICAMENTELOR SELECTATE

Masuratorile experimentale descrise in aceasta sectiune au fost realizate pe solutii de Doxorubicina hidroclorid (Sigma-Aldrich) in apa distilata, intr-un interval de concentratii cuprins intre (10-7 – 10-3) M si Vancomicina hidroclorid (Sigma-Aldrich) in apa distilata la concentratii cuprinse intre (10-4 – 10-3) M.

Spectrele de absorbtie au fost achizitionate cu ajutorul spectrofotometrului Lambda 950 (Perkin Elmer, SUA).

Spectrul de absorbtie al solutiei de Doxorubicina 10-4 M in apa distilata (Fig.5.3.) indica existenta mai multor maxime in UV, la 234 nm, 253 nm si 290 nm cat si in domeniul VIZ, la 479 nm, 500 nm si 535 nm.

95

Fig.5.3. Spectrul de absorbtie al Doxorubicinei.

Pentru determinarea experimentala a gradului de polimerizare al Doxorubicinei (dupa metoda descrisa la Capitolul 3) s-au preparat solutii in apa distilata in intervalul de concentratii (4x10-7 – 4x10-4) M. Au fost inregistrate spectrele de absorbtie in domeniul vizibil pentru toate solutiile (Fig.5.4).

Fig.5.4. Spectrele de absorbtie ale solutiilor de Doxorubicina in apa distilata, in intervalul de concentratii (4x10-7 – 4x10-4) M.

Datele experimentale au condus la concluzia ca incepand cu concentratii de

4x10-5 M in solutie isi fac aparitia agregate moleculare. Din Fig.5.5 se observa ca gradul de polimerizare determinat este 1,84 ceea ce indica prezenta dimerilor.

96

Fig.5.5. Determinarea grafica a gradului de polimerizare a Doxorubicinei.

Spectrul de absorbtie al Vancomicinei expus in Fig.5.6 pune in evidenta o structura specifica de benzi de absorbtie cu un maxim distinct la 280 nm.

Fig.5.6. Spectrul de absorbtie al Vancomicinei.

Spectrul de absorbtie al Vancomicinei la concentratia 4 x 10-3 M este dat la o scara extinsa de lungimi de unda in Fig.5.7; se pare ca exista un maxim important de absorbtie la lungimi de unda mai mici de 225 nm peste care se suprapun liniile de absorbtie ale moleculei de oxigen din aer care se continua in UV– vid.

Fig.5.7. Spectrul de absorbtie deconvolutat al Vancomicinei.

97

Daca se deconvoluteaza spectrele de absorbtie utilizand tehnicile standard de deconvolutie se observa ca spectrul complex masurat isi poate avea originea in cel putin trei benzi de absorbtie distincte, care implica nivelele electronice corespunzatoare ale moleculei de Vancomicina. 5.4. COMPORTAREA SOLUTIILOR DE ANTIBIOTICE SUB INFLUENTA RADIATIEI LASER Solutii de Doxorubicin Ebewe (EBEWE, Pharma Ges., Austria) 10-4 M in apa ultra pura au fost iradiate cu fascicule laser emise de laserul pulsat Nd:YAG, sistemul experimental de iradiere fiind prezentat in Capitolul 3.

Solutia de Doxorubicina 10-4 M in apa ultra pura a fost expusa timp de 30 min, respectiv 60 min la radiatie laser pulsata, fasciculul laser prezentand urmatoarele caracteristici: frecventa, 10 Hz; rata de repetitie a pulsurilor, 10 pps; FTW, 5 ns; λ=266 nm; energie, 10 mJ.

Pentru masurarea spectrului de absorbtie inainte si dupa iradiere s-au folosit celule cu drum optic de 10 mm. Daca pentru un timp de iradiere de 30 min in conditiile date modificarile spectrale ale medicamentului nu sunt semnificative, in cazul unei expuneri de 60 min se observa aparitia unor puncte isosbestice, la 266 nm si 390 nm si deplasarea maximului din VIZ catre lungimi de unda mai mari (Fig.5.8).

La aceasta concentratie in solutie exista formatiuni moleculare (dimeri). Comportarea properietatilor optice ale probei dupa un timp de expunere mai lung permite aprecierea ca in solutie apare cel putin o a treia specie absorbanta de concentratie diferita, ale carei proprietati de absorbtie difera de celelalte doua.

Fig.5.8. Spectrele de absorbtie ale solutiei de Doxorubicina 10-4 M inainte si dupa iradiere cu fascicul laser pulsat Nd:YAG emis la 266 nm.

Solutia de Vancomicina hidroclorid 2 mg/ml (1,35 x 10-3 M) in apa ultra pura a

fost iradiata cu armonica a patra a laserului Nd:YAG, cu emisie reziduala la 532 nm, pana la 2 h. Aranjamentul experimental difera de cel folosit pentru iradierea celorlalte probe de solutii prin lipsa filtrului neutru, astfel ca emisia fasciculului laser are doua componente: radiatia de lungime de unda 266 nm si o radiatie reziduala la 532 nm. Caracteristicile fasciculului laser sunt dupa cum urmeaza: frecventa 10 Hz, durata pulsului 5 ns, energie 20 mJ. Spectrele de absorbtie inainte si dupa fiecare sesiune de iradiere sunt prezentate in Fig.5.9.

98

Fig.5.9. Spectrele de absorbtie ale Vancomicinei hidroclorid 2 mg/ml inainte si dupa iradiere.

La aceasta concentratie, in intervalul spectral (200 – 240) nm semnalul este saturat, existand insa cel putin trei benzi de absorbtie specifice medicamentului, asa cum este aratat in Fig.5.7.

Se observa ca dupa 15 min de iradiere picurile caracteristice Vancomicinei dispar. In acelasi timp, solutia isi modifica aspectul, culoarea devenind galben-pal. Dupa 2 h de iradiere mici bule se formeaza la interfata solutie de medicament-aer si apare un precipitat. Culoarea este galben-inchis.

Disparitia amprentei de absorbtie a Vancomicinei in urma iradierii poate fi explicata prin degradarea totala a solutiei, asa cum se va vedea si in urma analizei 1H RMN a acestei probe.

Spectrele de fluorescenta indusa laser la 35 min, 45 min si 55 min sunt reprezentate in Fig.5.10.

Fig.5.10. Spectrele LIF ale Vancomicinei.

Se observa o descrestere a emisiei cu cresterea timpului de iradiere, ceea ce indica un proces de degradare a compusului.

99

5.5. STUDII DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA SI HPLC-MS ALE FORMATIUNILOR MOLECULARE OBTINUTE IN URMA EXPUNERII LA RADIATIE LASER A SOLUTIILOR DE ANTIBIOTICE Spectrul 1H RMN a fost inregistrat cu un spectrometru cu transformata Fourier VARIAN MERCURY ce lucreaza la o frecventa fixa de 400 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) folosind ca solvent D2O. Spectrul 1H RMN al Vancomicinei in D2O, expus in Fig.5.11 prezinta semnale caracteristice in regiunea protonilor alifatici (0,8 – 5,4) ppm si in zona protonilor aromatici (6,3 – 7,6) ppm. Datorita structurii sale chimice complicate interpretarea acestuia nu este posibila in acest stadiu; sunt necesare experimente ulterioare care sa permita divizarea semnalelor protonice in grupuri sau retele cuplate, in special in zonele suprapunerii multipletilor sau in cazul cuplajelor extensive de ordinul doi.

Fig.5.11. Spectrul 1H RMN al Vancomicinei.

Proba de solutie 2 mg/ml Vancomicina in apa ultra pura continand precipitat a fost prelucrata (uscata si supusa la vacuum timp de 90 min) si investigata prin tehnica de spectroscopie RMN. Spectrul obtinut (Fig.5.12) nu mai prezinta niciuna dintre informatiile caracteristice medicamentului, indicand o degradare totala a acestuia in timpul iradierii.

100

Fig.5.12. Spectrul 1H RMN al Vancomicinei 2 mg/ml expusa timp de 2 h la radiatie laser pulsata emisa la (266+532) nm de laserul Nd:YAG.

Spectrele de masa au fost inregistrate prin intermediul echipamentului descris la

Capitolul 3. Cromatograma Doxorubicinei Ebewe 2 mg/ml in prezentare comerciala farmaceutica este data in Fig.5.13. Se observa o buna separare cromatografica pentru maximul de la 3,32 min, dar si mici semnale aditionale largi la timpi de retentie de 4,5 min, 5,25 min si 7 min datorate probabil aditivilor prezenti in formularea farmaceutica.

Fig.5.13. Cromatograma Doxorubicinei in prezentare comerciala farmaceutica.

Spectrul de masa al Doxorubicinei, prezentat in Fig.5.14 pune in evidenta incarcarea caracteristica acesteia: [M+H]+=544,8 m/z.

101

Fig.5.14. Spectrul de masa al Doxorubicinei.

O solutie de Doxorubicina 10-4 M in apa ultra pura expusa timp de 60 min la radiatie laser emisa la lungimea de unda 266 nm cu energie 10 mJ a fost investigata prin tehnica HPLC-MS in scopul detectarii modificarilor induse de radiatia laser asupra medicamentului. Cromatograma solutiei iradiate (Fig.5.15) prezinta diferente importante fata de cea a solutiei neiradiate.

Fig.5.15. Cromatograma solutiei 10-4 M Doxorubicina in apa ultra pura, iradiata cu armonica a patra a laserului Nd:YAG timp de 60 min.

Spectrul de masa nu pune in evidenta incarcarea specifica medicamentului (Fig.5.16).

102

Fig.5.16. Spectrul de masa al solutiei 10-4 M Doxorubicina in apa ultra pura, iradiata cu 266 nm Nd:YAG timp de 60 min.

O analiza grosiera a datelor cromatografice este data in Tabelul 5.1, unde sunt

prezentate ariile semnalelor la timpii de retentie corespunzatori. Tabelul 5.1

Timp Inaltime Arie Arie% 0,22 1 0,02 0,00 0,37 4 0,33 0,03 0,45 3 0,32 0,03 0,59 3 0,24 0,02 0,87 25 6,23 0,65 1,57 9 2,66 0,28 1,87 6 0,89 0,09 1,99 5 0,47 0,05 2,10 4 0,42 0,04 2,63 4 0,49 0,05 3,22 1279 389,55 40,66 4,68 370 103,66 10,82 5,04 560 193,06 20,15 5,89 54 25,98 2,71 6,64 68 21,66 2,26 7,00 64 20,93 2,18 7,79 3 0,36 0,04 8,12 632 166,65 17,39 8,70 57 24,22 2,53

Cromatograma Vancomicinei HCl nu a putut fi achizitionata din cauza limitelor

echipamentului avut la dispozitie, astfel incat probe de Vancomicina HCl neiradiata si Vancomicina HCl solutie 2mg/ml in apa ultra pura iradiata cu fascicul laser emis la (266+532) nm timp de 2 h, solutie cu precipitat au fost injectate direct in instalatia

103

spectrometrului de masa. Incarcarea proprie Vancomicinei neiradiate poate fi observata in Fig.5.17.a ca fiind [M+H]+=1450,4 m/z.

a) b)

Fig.5.17. Spectrul de masa al Vancomicinei neiradiate (a) si iradiata cu fascicul laser pulsat Nd:YAG emis la 266 nm (b).

Spectrul de masa al probei iradiate de medicament nu scoate in evidenta

incarcarea specifica acestuia (Fig.5.16.b), fapt ce duce la concluzia, alaturi de rezultatele spectrelor de absorbtie masurate in urma sesiunilor de iradiere si dupa analiza spectrului RMN, ca in urma interactiei cu radiatia laser moleculele de medicament au suferit o degradare completa, ireversibila. 5.6. CONCLUZII

Au fost studiate proprietatile optice ale unor solutii de antibiotice (Doxorubicina si Vancomicina) in apa distilata in domenii de concentratie cuprinse in intervalul (10-4 – 10-7) M, care indica benzi de absorbtie specifice situate in regiunea UV pentru Vancomicina, respectiv UV/VIZ in cazul Doxorubicinei. De asemenea, solutii ale celor doua antibiotice in apa ultra pura au fost expuse la radiatie laser pulsata emisa de laserul Nd:YAG la lungimi de unda de 266 nm si energie de 10mJ pentru Doxorubicina (timpi de expunere pana la 60 min) si (266+532) nm si 20 mJ pentru Vancomicina (timpi de expunere pana la 2 h).

Un efect important in comportarea spectrala a Doxorubicinei il au, la concentratii mari (mai mari de 10-4 M) dimerii, care modifica structura spectrelor de absorbtie si influenteaza evolutia medicamentului expus la radiatie laser. Daca pentru un timp de iradiere de 30 min in conditiile date modificarile spectrale ale medicamentului nu sunt semnificative, in cazul unei expuneri de 60 min se observa aparitia unor puncte isosbestice, la 266 nm si 390 nm, si deplasarea maximului din VIZ catre lungimi de unda mai mari. Comportarea proprietatilor optice ale probei dupa un timp de expunere mai lung permite aprecierea ca in solutie apare cel putin o a treia specie absorbanta de concentratie diferita, ale carei proprietati de absorbtie difera de celelalte doua. Aceste modificari sunt evidentiate si prin analiza calitativa a spectrelor HPLC-MS ale solutiilor neiradiate, respectiv ale celor expuse la radiatie optica pulsata emisa de laserul Nd:YAG.

Spectrele de absorbtie masurate ulterior iradierii solutiilor apoase de Vancomicina HCl 2 mg/ml scot in evidenta disparitia amprentei caracteristice medicamentului. De asemenea, procesul de degradare este confirmat si de dinamica

104

spectrelor de fluorescenta indusa cu laser. In acelasi timp, din cauza structurii sale chimice complicate interpretarea spectrului RMN nu este posibila in acest stadiu; sunt necesare experimente ulterioare care sa permita divizarea semnalelor protonice in grupuri sau retele cuplate, in special in zonele suprapunerii multipletilor sau in cazul cuplajelor extensive de ordinul doi.

Spectrul de masa al probei iradiate de Vancomicina nu scoate in evidenta incarcarea specifica a medicamentului, fapt ce duce la concluzia ca in urma interactiei cu radiatia laser moleculele de medicament au suferit o degradare completa, ireversibila.

Coreland datele obtinute prin toate metodele experimentale descrise rezulta ca dupa expunerea la fascicule laser se produc modificari in structura electronica si de vibratie – rotatie a moleculelor de medicamente. Acest fapt sugereaza degradarea medicamentelor studiate, in cazul Vancomicinei chiar o degradare totala, ireversibila.

Rezultatele experimentale incurajeaza continuarea cercetarilor privind fotodegradarea solutiilor de antibiotice prin expunerea lor la radiatie optica emisa de surse coerente in scopul gasirii unor solutii in ceea ce priveste imbunatatirea procesului tehnologic de epurare a apelor uzate.

5.7. REFERINTE BIBLIOGRAFICE [5.1] Kümmerer, K.; Henninger, A. Promoting resistance by the emission of antibiotics

from hospitals and households into effluents. Clin. Microbiol. Infec., Vol. 9, pag. 1203–1214, 2003;

[5.2] Antipas, A.S.; Vander Velde, D.; Stella, V.J. Factors affecting the deamidation of vancomycin in aqueous solutions. International Journal of Pharmaceutics, Vol. 109, Nr.3, pag. 261-269, 1994;

[5.3] Takács-Novák, K.; Noszál, B.; Tókés-Kövesdi, M.; Szász, G. Acid-base properties and proton-speciation of vancomycin. International Journal of Pharmaceutics, Vol. 89, Nr.3, pag. 261-263, 1993;

[5.4] Hirsch, R.; Ternes, T.; Haberer, K.; Kratz, K.L. Occurrence of antibiotics in the aquatic environment. Science of the Total Environment, Vol. 225, Nr.1-2, pag. 109-118, 1999;

[5.5] Kümmerer, K. Significance of antibiotics in the environment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Vol.52, Nr.1, pag. 5-7, 2003;

[5.6] Martinez, J.L.; Fajardo, A.; Garmendia, L.; Hernandez, A.; Linares, J.F.; Martinez-Solano, L.; Sanchez, M.B. A global view of antibiotic resistance. FEMS Microbiology Reviews, Vol. 33, Nr.1, pag. 44-65, 2008;

[5.7] Larsson, D.G.; de Pedro, C.; Paxeus, N. Effluent from drug manufactures contains extremely high levels of pharmaceuticals. J. Hazard. Mater., Vol.148, Nr. 751–755, 2007;

[5.8] Giger, W.; Alder, A.C.; Golet, E.M.; Kohler, H.P.E.; McArdell, C.S.; Molnar, E.; Siegrist, H.; Suter, M.J.F. Occurrence and fate of antibiotics as trace contaminants in wastewaters, sewage sludges, and surface waters. Chimia, Vol.57, pag. 485–491, 2003;

[5.9] Alexy, R.; Kümmerer, K. Antibiotics for human use. In: Organic Pollutants in the Water Cycle, Reemtsma, T.; Jekel, M. (Ed.),. Wiley-VCH, Weinheim, Germania, 2006;

[5.10] Gewirtz, D.A., A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin, Biochem. Pharmacol. Vol.57, pag. 727–741, 1999;

105

[5.11] Yan, Q.; Priebe, W.; Chaires, J.B.; Czernuszewicz, R.S. Interaction of doxorubicin and its derivatives with DNA: elucidation by resonance Raman and surface enhanced resonance Raman spectroscopy, Biospectroscopy, Vol.3, pag. 307–316, 1997;

[5.12] Bidleman, T.F. Atmospheric procesess. Environ Sci Technol., Vol. 22, pag. 361-367, 1988;

[5.13] Lyman, W.J. in Environmental Exposure From Chemicals Vol I, Neely, W.B.; Blau, G.E. (Ed.), CRC Press, Boca Raton, FL, SUA, 1985;

[5.14] Meylan, W.M.; Howard, P.H. Chemosphere, Vol.26, pag. 2293-2299, 1993; [5.15] IARC; Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to

Man. Some naturally occurring subsntaces. Geneva: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, 1972-PRESENT. 10: 45, 1976;

[5.16] Swann, R.L.; Laskowski, D.A.; McCall, P.J. A rapid method for the estimation of the environmental parameters octanol/water partition coefficient, soil sorption constant, water to air ratio and water solubility. Res Rev, Vol. 85, pag. 17-28, 1983;

[5.17] US EPA; Estimation Program Interface (EPI) Suite. Ver. 4.0. Jan, 2009. Disponibil la: http://www.epa.gov/oppt/exposure/pubs/episuitedl.htm;

[5.18] SPARC; pKa/property server. Ver 4.2 Mar, 2008. Disponibil la: http://ibmlc2.chem.uga.edu/sparc/;

[5.19] Doucette, W.J. in Handbook of Property Estimation Methods for Chemicals. Boethling, R.S.; Mackay, D. (Ed.), Lewis Publ., Boca Raton, FL, SUA, 2000;

[5.20] National Library of Medicine, Hazardous Substances Data Bank. Disponibil la http://toxnet.nlm.nih.gov;

[5.21] Franke, C.; Studinger, G.; Berger, G.; Böhling, S.; Bruckmann, U; Cohors-Fresenborg, D.; Jöhncke, U. The assessment of bioaccumulation. Chemosphere, Vol. 29, Nr. 7, pag. 1501-1514, 1994;

[5.22] Meylan, W.M.; Howard, P.H; Boethling, R.S. Improved method for estimating bioconcentration/bioacumulation factor from octanol/water partition coefficient. Environ. Toxicol. Chem., Vol. 18, pag. 664-672, 1999;

[5.23] Heberer, T. Occurrence, fate, and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment: a review of recent research data. Toxicology Letters, Vol. 131, pag 5-17, 2002;

[5.24] Kolpin, D.; Furlong, E.; Meyer, M; Thurman, E.M.; Zaugg, S.; Barber, L.; Buxton, H. Pharmaceuticals, Hormones, and Other Organic Wastewater Contaminants in U.S. Streams, 1999-2000: A National Reconnaissance. Environ Sci Toxicol, Vol. 36, pag. 1202-1211, 2002;

[5.25] Levine, D. Vancomycin: A History. Clin Infect Dis, Vol.42, pag. S5–S12, 2006; [5.26] Moellering, R.C. Jr. Vancomycin: A 50-Year Reassessment. Clin Infect Dis, Vol.42

(Supl. 1), pag. S3–S4, 2006; [5.27] Griffith, R.S. Introduction to vancomycin. Rev Infect Dis, Vol. 3, pag. 2004, 1981.

106

CAPITOLUL 6

STUDIUL PROPRIETATILOR OPTICE ALE AETHOXYSKLEROLULUI 6.1. INTRODUCERE Aproximativ 60% din populatia adulta din Europa si SUA sufera de afectiuni ale sistemului circulator, in particular de boli varicoase ale membrelor inferioare. Se considera ca venectaziile si telangiectaziile (afectiuni ale sistemului venos superficial, care implica venule de diametre mici – pana la 4 mm) se numara printre cele mai comune disfunctii cronice vasculare, cu o incidenta mult crescuta fata de bolile arteriale. In ultimii ani un numar crescut de pacienti se prezinta la medicul specialist cu scopul de a corecta aceste insuficiente, atat in ceea ce priveste simptomatologia, cat si din punct de vedere estetic. Tratamentul venelor varicoase contribuie la reducerea simptomelor si la scaderea ratei de aparitie a insuficientei venoase, crescand gradul de sanatate si nivelul calitatii vietii pacientului. In scopul cresterii eficientei tratamentului si al nivelului de satisfactie, precum si pentru reducerea efectelor adverse grave, a costurilor si a durerilor postoperatorii, in ultimii ani au fost dezvoltate noi tehnici minim invazive, cum sunt scleroterapia cu spuma ghidata cu ultrasunete, terapia laser endovenoasa si ablatia cu radiofrecventa [6.1]. De asemenea, scleroterapia cu spuma combinata cu laser terapia (folosind laseri pulsati Nd:YAG cu emisie la 1064 nm) a demonstrat rezultate clinice foarte promitatoare. Aceasta noua abordare poate fi folosita in tratamentul venelor varicoase originare in plexul lateral subdermal al piciorului inferior sau venelor reticulare prezente in alte locatii, precum si in cazul venelor de calibru mai mare de 4 mm localizate la o adancime fata de derm intre (2 – 4) mm. De asemenea, venele-panza de paianjen, aflate la adancimi intre 1,2 mm si 1,7 mm sub suprafata pielii fie asociate cu, fie independente de venele reticulare din orice locatie sunt susceptibile de a fi tratate folosind cele doua tehnici combinate [6.2-6.4].

Scleroterapia este metoda de indepartare a venelor varicoase prin injectarea unei substante sclerozante in lumenul venei bolnave. Agentul sclerozant produce o iritatie chimica a interiorului venei, care conduce la inflamarea tesutului endotelial al acesteia. In acest mod este generat un tromb secundar local, atasat de peretele venos care, intr-un timp dat, va fi transformat intr-un corp fibros [6.5]. Fiecare clasa si fiecare tip de agent sclerozant din aceeasi clasa produce acelasi efect, fiecare avand diferiti parametri de eficacitate, potenta si complicatii asociate utilizarii [6.6]. In functie de potenta lor, agentii sclerozanti pot fi clasificati in trei categorii, dupa cum urmeaza: agenti sclerozanti majori (alcool, iod, tetradecil sulfat de sodiu - STS), intermediari (salicilat de sodiu, polidocanol - POL) si minori (glicerina cromata). Scleroterapia moderna se realizeaza cu ajutorul detergentilor sclerozanti, din clasa carora face parte si Polidocanolul (POL), substanta activa din medicamentul comercializat dub denumirea Aethoxysklerol (Chemische Fabrik Kreussler & Co., Germania). Odata cu introducerea lor in anii 1920 – 1930, aceste substante cunoscute si ca acizi grasi sau alcooli grasi, au devenit curand si raman inca tipul cel mai popular de agenti sclerozanti folositi in intreaga lume in domeniul tratamentului venelor varicoase. Detergentii sclerozanti, avand raportul risc/beneficiu favorabil, au inlocuit rapid alte tipuri de agenti sclerozanti considerati ineficienti atata vreme cat nu asigurau necroza

107

tesutului vizat sau tromboza acestuia la concentratii vasodistructive. Dupa injectarea intravenoasa, substanta sclerozanta lichida se leaga de proteine si va fi inactivata in momentul diluarii in sange. In cazul folosirii detergentilor sclerozanti sub forma de spuma, aceasta ocupa tot spatiul pe care il are la dispozitie, dislocand sangele din zona respectiva a venei si realizand un contact intim imbunatatit cu peretele endotelial al vasului de sange, pe care il necrozeaza. Observatiile clinice demonstreaza ca scleroterapia cu spuma este preferabila folosirii detergentilor sclerozanti lichizi [6.7]. Acesti agenti sclerozanti pot fi transformati in spuma cu ajutorul unor tehnici specifice. Orbach a fost cel care a descris pentru prima data folosirea spumei in scleroterapie [6.8]. In 1995 noi metode de spumare au fost descrise de catre Cabrera s.a. [6.9] si Monfreux [6.10]. In 1997 Henriet [6.11] a raportat experienta sa in tratarea venelor varicoase de diametre mici cu ajutorul tehnicii Monfreux, in timp ce Cavezzi si Frullini [6.12] in 1999 au raportat experienta lor de-a lungul a 13 luni de tratament prin scleroterapie ghidata Doppler cu spuma de substanta sclerozanta preparata dupa metoda Monfreux. In 1998 Sadoun si Benigni [6.13] si in 1999 Garcia-Mingo [6.14] au sugerat noi cai de producere manuala a spumei. In decembrie 1999, Tessari [6.15] a descris o metoda simpla si sigura de generare a unei spume suficient de compacta si stabila (un mix de medicament si aer) cu ajutorul a doua seringi din plastic si a unui ventil cu trei cai. Ulterior, Frullini [6.16] si Gachet [6.17] au sugerat alte metode de producere a spumei. Abilitatea de a fi agitati si spumati creste potenta detergentilor sclerozanti pana la de patru ori prin asigurarea unui contact mai bun si mai indelungat cu tesutul vizat. De curand, microspuma de POL produsa de Provensis (Anglia) si care se bazeaza pe patentele EP 656203 (Europa) si US 5676962 (SUA) a trecut cu success faza a III-a a proceselor clinice si este in curs de obtinere a aprobarii de punere pe piata de la Food and Drug Administration (SUA) [6.5]. 6.2. PROPRIETATI FIZICE, CHIMICE SI FARMACOLOGICE ALE AETHOXYSKLEROLULUI

Detergentii sclerozanti produc deteriorarea tesutului endotelial venos prin

mecanisme multiple asociate cu scaderea tensiunii superficiale a celulelor endoteliale, interferenta cu lipidele, disruptii ale cimentului intercelular si extractia proteinelor de pe suprafata celulara. Detergentii sunt eficienti mai ales in forma de micele (agregate moleculare), a caror reprezentare este realizata in Fig.6.1 [6.18, 6.19].

Fig.6.1. Schema unei micele.

La concentratii si temperaturi scazute, cele mai multe molecule de detergent sunt dizolvate in solutie, micelele nu sunt formate si toxicitatea asupra endoteliului este considerata minima. Prin cresterea concentratiei de agent sclerozant la temperaturi

108

echivalente cu cele ale tesuturilor vii se produce o crestere predictibila a efectului necrozant. Prin variatia concentratiei detergentului si a duratei de contact cu tesutul tinta, gradul de afectare a acestuia poate fi controlat. Din pacate, din cauza procesului de dilutie cu sangele nu se poate determina cu precizie cantitatea de agent sclerozant in contact intim cu peretele interior al vasului de sange si nici procentul care ramane in fluxul sanguin. Astfel ca rezultatele obtinute nu sunt intotdeauna proportionale cu concentratia de agent sclerozant folosita, existand riscul unor efecte adverse „in aval” asupra vaselor de sange interconexe [6.20].

6.2.1. INTRODUCERE ASUPRA COMPUSULUI

Polidocanol sau Lauromacrogol 400, C14H30O2 (CID 24750, masa molara 230,38 g/mol) este ingredientul activ farmaceutic al medicamentelor disponibile comercial listate in Tabelul 6.1. El este eterul polietilen glicol al alcoolului Lauryl, avand valoarea medie de polimerizare 9 [6.21]. Acest compus chimic se prezinta sub forma unui lichid vascos la temperatura camerei, avand punctul de topire la (15-21)0C. Este miscibil in apa, are pH cuprins intre 6,0 – 8,0 si densitatea 0,97 g/cm3 la temperatura camerei, apropiata de cea a apei.

Imaginea tridimensionala a acestei molecule este data in Fig.6.2., unde atomii de carbon sunt figurati in culoarea gri inchis, atomii de hidrogen sunt gri deschis, iar cei de oxigen sunt rosii.

Fig.6.2. Imaginea tridimensionala a moleculei de POL.

Substanta sub forma de gel a fost sintetizata pentru prima data in 1939 si comercializata ca anestezic topic local sub denumirea SCH-600 (Chemische Fabrik Kreussler & Co. GmbH, Germania). Acest uretan difera de agentii anestezici esteri sau amide, lipsindu-i un inel aromatic. Este utilizat ca anestezic topic in creme si lotiuni pentru iritatii ale pielii, arsuri si intepaturi de insecte, precum si pentru anesteziile epidurale. Abilitatea POL de a necroza vasele de sange fara a aduce prejudicii importante tesuturilor din jur a dus la folosirea lui ca si agent sclerozant in anii 1960. Din 1967 a fost inregistrat in Republica Federala Germania ca Aethoxysklerol si acum este unicul agent sclerozant permis spre utilizare in Germania [6.20]. In zilele noastre Aethoxysklerol este liderul medicamentelor folosite pentru scleroterapie in Europa. Este unicul agent sclerozant aprobat de Ministerul Sanatatii, Muncii si Bunastarii din Japonia [6.22] si, recent (martie 2010) Federatia Medicamentului si a Alimentatiei (SUA) a aprobat injectiile Asclera (POL), de asemenea produse de Kreussler & Co. GmbH, Germania, pentru tratamentul venelor varicoase in SUA [6.23]. In Romania POL nu este aprobat spre utilizare. In Tabelul 6.1 am sintetizat principalele companii farmaceutice, de cercetare-dezvoltare si de distributie care pot pune la dispozitie acest medicament.

109

Tabel 6.1. Companii Numele Produsului

Chemische Fabrik Kreussler & Co., Germania

Aethoxysklerol (Europa), Asclera(USA)

Berlin Pharmaceutical Industry, Germania Aethoxysklerol Cem Farma Ilac, Turcia Aethoxysklerol

Codali, Belgia Aethoxysklerol Felo, Danemara Aethoxysklerol

Globopharm, Elvetia Aethoxysklerol IBI International, Republica Ceha Aethoxysklerol

Institute of Pharmaceutical Research and Technology, Grecia Aethoxysklerol

Inverdia, Suedia Aethoxysklerol Lomapharm Rudolf Lohmann, Germania Aethoxysklerol

Nycomed, Elvetia Aethoxysklerol Repharma, Azerbaijan Aethoxysklerol

Resinag, Elvetia Sclerovein Sigma-Tau, Italia Aethoxysklerol

Tamro Distribution, Suedia Aethoxysklerol POL poate fi pastrat la temperatura camerei (15–250C), fara a fi specificate

conditii speciale de stocare. La concentratii intre 0,5% si 1% si temperaturi intre 150C si 300C (59–860F) substanta este stabila 3 ani. Nu exista recomandari in privinta dispunerii resturilor nefolosite de medicament sau a celui expirat.

Cea mai comuna forma de prezentare farmaceutica este sub forma de fiole de 2 ml solutie injectabila, a carei compozitie este data in Tabelul 6.2. Tabel 6.2. Compozitia solutiei injectabile in concentratie de:

0,5% 2% 3%

Lauromacrogol 400 (activ) 10 mg 40 mg 60 mg Etanol (inactiv) 0,10 ml 0,10 ml 0,10 ml Apa pura (inactiv) 2 ml 2 ml 2 ml Hidrogen fosfat de sodiu (buffer - inactiv) Dihidrogen fosfat de potasiu (buffer - inactiv)

6.2.2. MECANISMUL DE ACTIUNE SCLEROZANTA

Fiind structurat sub forma de micela, Aethoxysclerolul contine un pol hidrofil si unul hidrofob (Fig.6.1) si actioneaza prin modificarea tensiunii superficiale la interfata dintre celulele endoteliale si mediul in care acestea se afla. Polul hidrofob se conecteaza la suprafata celulei, in timp ce polul hidrofil atrage apa in celula, conducand la o hidratare rapida si intensa a acesteia [6.24]. POL isi exercita actiunea sclerozanta cauzand diferite grade de distrugere a celulelor in functie de concentratie [6.25]. Administrarea substantei sclerozante activeaza calciul si oxidul de azot celular, conducand la moartea celulei. Timpul necesar acestui proces este relationat la concentratia de medicament la care este expus tesutul. Acest factor determina liza celulei, dar poate implica, de asemenea, eritrocitele si trombocitele, determinand formarea unor microparticule derivate de trombocite [6.26]. Desi experimental au fost constatate procese de hemoliza in intreaga proba de sange, la

110

concentratii de POL mai mari de 0,45%, liza eritrocitelor, a trombocitelor si formarea microparticulelor derivate de trombocite nu au constituit preocupari semnificative a raportarilor niciunui studiu clinic. Datele farmacocinetice indica faptul ca la 12 ore de la injectarea intravenoasa, aproximativ 90% din POL administrat va fi eliminat din sange. Chiar si in cazul administrarii de doze repetate, la intervale de timp uzuale in scleroterapie, nu au fost semnalate procese de acumulare. Un studiu efectuat in 2007 a raportat urmatoarele valori dupa aplicarea unei singure doze: 64% atasare la proteina, 4 ore timpul de injumatatire prin eliminare, volumul distributiei 24,5 ℓ, epurare totala 11,7 ℓ/h, curatare renala 2,43 ℓ/h si curatare biliara 3,14 ℓ/h [6.6]. In ceea ce priveste Etanolul (substanta inactiva) continut in medicamentul Aethoxysklerol, volumul distributiei este de 0,68 ℓ/kg pentru barbati si 0,55 ℓ/kg pentru femei si este atins foarte repede. Etanolul afecteaza fatul si este acumulat in laptele matern. Este oxidat in ficat formand acid acetic (in proportie de 90 – 96% in cazul barbatilor). Rata de eliminare este independenta de concentratie si este de 0,1 g/kg/h pentru barbati si 0,085 g/kg/h pentru femei. Procente nesemnificative sunt eliminate prin plamani (2 - 3%) si rinichi (1 - 2%) [6.21].

6.2.3. PROCESUL DE SPUMARE

Sunt multe studii care demonstreaza rezultatele mai bune ale scleroterapiei cu spuma fata de cea care foloseste POL in forma lichida [6.5, 6.7, 6.12, 6.14-6.17, 6.24, 6.27-6.29]. Abilitatea de a fi agitati si spumati creste potenta detergentilor de la doua pana la patru ori prin deplasarea sangelui din zona in care este injectata spuma si maximizarea ariei si a timpului de contact cu endoteliul. Acest proces prezinta avantajul utilizarii unor concentratii mai mici de agent sclerozant si deci cu potential alergenic si toxic pentru tesuturi mai scazut, desi pot aparea riscuri in cazul patrunderii bulelor in circulatia sanguina oculara sau cerebrala [6.18]. Deoarece spuma opreste fluxul sanguin intravenos intr-o zona limitata si nu intervine diluarea medicamentului ca in cazul utilizarii acestuia in forma lichida, concentratia agentului sclerozant in contact intim cu peretii vasului de sange este cunoscuta si poate fi controlata. Introducerea spumei duce la o distributie omogena a medicamentului in lumenul vasului de sange, cu exceptia venelor foarte largi, unde efectele gravitationale mentin un contact mai bun intre peretele superior al venei si spuma, care este mai putin densa decat sangele. Spuma trebuie sa fie suficient de stabila astfel incat sa produca efectul terapeutic sclerozant [6.31]. In general, se defineste spuma sclerozanta ca fiind un amestec de medicament sclerozant (cu proprietati tensio-active) in solutie si un gaz (biocompatibil). In afara compozitiei, spumele pot fi diferite ca si coeziune interna, care este relationata la dimensiunea bulelor de gaz. Macrospuma contine bule mai mari de 500 µm, minispuma contine bule cu dimensiuni cuprinse intre 250 – 500 µm si microspuma este realizata din bule cu dimensiuni mai mici de 250 µm [6.29]. Un volum dat de lichid poate fi folosit pentru a produce un volum de spuma de 4 sau 5 ori mai mare decat volumul initial, in functie de metoda de spumare. Acest volum permite utilizarea unei doze totale mai mici de agent sclerozant pentru a produce efectul final dorit. Spuma sclerozanta este caracterizata de urmatoarele variabile: tipul si concentratia agentului sclerozant tensio-activ, tipul gazului, raportul lichid/gaz, conditiile de preparare (temperatura, pH), timpul scurs intre preparare si injectare si dimensiunea bulelor. Omogenitatea spumei este, de altfel, o cerinta importanta in ceea ce priveste dinamica (vascozitatea) si stabilitatea acesteia. Spuma ideala ar trebui sa aiba diametrul si presiunea interna a bulelor uniforme. Timpul de viata al spumei este legat de

111

dimensiunea bulelor, proprietatile tensio-active ale solutiei de medicament si de conditiile in care este produsa si pastrata spuma. Aceasta trebuie sa fie suficient de stabila astfel incat sa se evite separarea sa in partile componente (lichid/gaz) in timpul injectarii, dar suficient de efemera pentru a se distruge dupa un anumit timp in vasul de sange. Gazul folosit pentru spumare trebuie sa fie tolerat fiziologic la doze terapeutice. Astfel, o dimensiune a bulelor care sa indeplineasca aceste cerinte ar trebui sa fie ceva mai mica de 100 µm [6.5]. Exista mai multe metode si mecanisme de mixare cu gaz si agitare a sclerozantilor lichizi in scopul obtinerii unor spume pentru uz clinic. Cu o singura exceptie, POL microspuma pentru uz endovenos (Varisolve®), sclerozantii sub forma de spuma sunt produsi printr-o agitare ciclica mecanica a substantei lichide in prezenta unui gaz. Astfel de spume “home made”, avand diferite densitati si proprietati reologice, implica in general proportii de gaz/lichid incepand de la 1/1 pana la 8/1. In toate cazurile spuma contine 79% azot si 21% oxigen si prezinta o distributie caracteristica a dimensiunilor bulelor [6.32]. Orbach a fost cel care a descris pentru prima data utilizarea spumei in scleroterapia vaselor de sange [6.8], pentru ca incepand din anii 90 sa fie descrise noi metode de transformare a solutiilor de agenti sclerozanti in spuma [6.9-6.15]. Astazi, aceasta este principala metoda de generare a spumei utilizata in scleroterapia vaselor de sange. In tehnica Monfreux, o presiune negativa este generata prin retragerea pistonului unei seringi de sticla, al carei capat este partial acoperit. Afluxul de aer produce bule mari, respectiv o spuma destul de fluida. In tehnica Tessari, amestecul turbulent de aer si lichid slerozant este realizat cu ajutorul a doua seringi din plastic cuplate la un ventil cu trei cai. La concentratii scazute ale detergentului sclerozant se obtine un amestec de bule fine si lichid, in timp ce la concentratii mari de detergent amestecul este o spuma mai degraba vascoasa. In cazul acestei tehnici, raportul agent sclerozant/aer este de 1/3, pana la 1/4. Tehnica celor doua seringi, asemanatoare metodei Tessari, implica folosirea a doua seringi cuplate cu ajutorul unui conector, rezultatul fiind un amestec in proportie de 1/4 (agent sclerozant/aer); spuma obtinuta poate fi caracterizata ca fiind una vascoasa, formata din bule fine [6.33]. In 2008, unii autori au descris o metoda de obtinere standardizata a spumei de POL cu ajutorul kitului EASY-FOAM® (doua seringi de 10 ml din silicon, conectate printr-un ventil cu doua cai, una dintre seringi fiind preumpluta cu 7,4 ml aer steril (Laboratoire Kreussler Pharma, Paris, Franta). Dupa aspirarea a 1,6 mℓ POL in cealalta seringa (1/5,6), miscarile standardizate (ca putere, viteza si numar de miscari) ale pistoanelor seringilor erau realizate cu ajutorul unui mecanism Turbofoam® [6.30, 6.34]. Mai tarziu, BTS International (Anglia) a dezvoltat Varisolve® (microspuma de POL) ca tratament de prima electie pentru afectiuni ale venei mari safena si varicozitatile asociate deasupra si mai jos de genunchi si pentru folosirea impreuna cu ablatia termica endovenoasa. Faza a treia a studiului clinic european a aratat ca 90% dintre pacientii tratati cu aceasta microspuma nu au prezentat reflux in vena mare safena la trei luni de supraveghere si mai putin de 10% au avut recurente la 1 an. In general, pacientii se pot intoarce la viata sociala in aceeasi zi, iar rezultatele pot fi vizibile dupa 6 saptamani. De asemenea, aceasta microspuma a trecut testele fazei III de studiu clinic in SUA. Se preconizeaza ca toate studiile clinice sa fie completate pana la jumatatea anului 2012, urmand ca sa fie aprobata spre utilizare in SUA pana in 2013 [6.35]. Varisolve® este prezentarea farmaceutica a microspumei ce imita spuma produsa si studiata initial de Cabrera [6.28, 6.36, 6.37] intr-o forma standardizata. Ea

112

este generata si distribuita prin intermediul unui mecanism cu canistra presurizata, schitat in Fig.6.3.

Fig.6.3. Mecanismul de generare si distribuire a microspumei Varisolve®.

Sistemul contine agentul lichid si un amestec de gaze format din oxigen si dioxid de carbon si, intr-un foarte mic procent (0,01-0,08%) azot. Trecerea gazului si a lichidului sub presiune prin mecanismul de producere a spumei genereaza o microspuma de 1% POL cu proprietati reologice reproductibile. Dimensiunea bulelor este apreciabil mai mica decat in cazul tehnicilor de generare manuala a spumei, iar absenta azotului faciliteaza absorbtia bulelor de catre organismul uman. Aceste consideratii sunt deosebit de importante in ceea ce priveste profilul de siguranta al tratamentului, dat fiind riscul de embolism ocular si/sau cerebral pe care il implica orice tip de terapie cu spuma sclerozanta [6.22].

6.3. COMPORTAREA LA INTERACTIA CU RADIATIE LASER Cunostinte legate de proprietatile fotofizice si fotochimice ale compusului sunt esentiale in ceea ce priveste atat manipularea, impachetarea si etichetarea medicamentului, cat si in scopul formularii unor predictii relativ la fototoxicitatea produsului. Testele de fotostabilitate pentru produsele farmaceutice trebuie sa furnizeze informatii cu privire la modul de utilizare a medicamentelor, cum ar fi conditiile de expunere la lumina atat in timpul aplicarii tratamentului, dar si in timpul stocarii sau eliminarii acestora ca deseuri (fie metabolizate, fie neutilizate). De asemenea, studii de fotostabilitate efectuate in conditii bine puse la punct asigura calitatea produselor farmaceutice in perioada de valabilitate si garanteaza siguranta si eficienta medicamentelor folosite de catre pacienti. Faptul ca un medicament absoarbe radiatie intr-un anumit domeniu al spectrului electromagnetic poate insemna acumularea unei energii suficiente pentru ruperea unei legaturi in molecula compusului. Astfel, proprietatea de absorbtie este o prima indicatie a faptului ca medicamentul poate fi candidatul unui proces fotochimic, care sa conduca la propria descompunere sau la degradarea altor componente din formularea farmaceutica. Reactia fotochimica trebuie sa urmeze legea de baza a absorbtiei fotochimice stabilita de Grotthus si Draper in 1818, care stipuleaza ca nu poate exista o reactie fotochimica (respectiv fotobiologica) in lipsa unei absorbtii de radiatie electromagnetica. Astfel, spectrul de absorbtie al unui compus reprezinta calea de

113

determinare a lungimii de unda (sau a intervalului spectral) la care/de-a lungul caruia medicamentul poate fi sensibil. Relativ la potentialul unui medicament de a se degrada in urma absorbtiei de radiatie electromagnetica trebuie tinut cont, in principal, de doi factori: - in primul rand, spectrul de absorbtie este descris in mod normal de lungimea de unda la care absorbtia prezinta un maxim si de absorbtivitatea molara la acea lungime de unda. Spectrul de absorbtie al unei molecule de medicament este de regula larg si orice influenta a sursei de iradiere asupra acestuia poate sugera modificari fotochimice ale formatiunilor moleculare; - in al doilea rand, descompunerea poate fi initiata de un alt component al formularii farmaceutice, care prezinta proprietati de absorbtie ce se suprapun cu radiatia incidenta, chiar daca substanta activa terapeutic nu prezinta astfel de caracteristici. In acest caz este vorba despre fotosensibilizare, iar componentul absorbant, respectiv fotosensibilizatorul, poate transfera complet energia absorbita fara a suferi modificari in timpul procesului, desi este mult mai probabil sa intervina procese de degradare ale fotosensibilizatorului.

6.3.1. MATERIALE SI DISPOZITIVE EXPERIMENTALE

Obiectul acestui studiu il constituie solutia de Aethoxysklerol 2% (Chemische Fabrik Kreussler & Co., Germania) in prezentare farmaceutica, ale carei proprietati sunt descrise in sectiunea 6.2. In scopul caracterizarii din punct de vedere optic a acestui medicament au fost realizate masuratori ale spectrului de absorbtie in bulk, folosind celule optice de quart cu drum optic de 10 mm, cu ajutorul spectrofotometrului de absorbtie Perkin Elmer Lambda 950, descris pe larg in Capitolul 3. Pentru acoperirea domeniului spectral IR a fost utilizat spectrofotometrul FTIR Nicolet Magna 550 (ThermoScientific, SUA), care lucreaza in domeniul (4000 - 400) cm-1, cu o rezolutie de 0,125 cm-1. Spectrele pot fi colectate si insumate la o rata de 20 scanari/s. Bancul de lucru este controlat prin intermediul unui software Omnic (Nicolet), cu sistem de analiza incorporat. Sursa este o lampa cu tungsten-halogen. O apertura cu diametru variabil este folosita in scopul atingerii rezolutiei spectrale maxime. Combinatia detector/divizor de fascicul este DTGS/KBr. In al doilea rand, am expus probele de solutie de POL la radiatie laser in scopul detectarii eventualelor modificari induse in moleculele de medicament de fasciculul de lumina coerenta. Sistemul experimental de iradiere folosit este, de asemenea, in amanunt descris in Capitolul 3.

Probele de Aethoxysklerol, in celule spectrofotometrice cu drum optic de 10 mm au fost expuse la fascicul laser pulsat emis la 1064 nm, radiatia laser avand urmatoarele caracteristici: rata de repetitie a pulsurilor 10 pps si energia fasciculului pe proba 1,359 mJ. Timpul de expunere a fost situat in intervalul (2 – 30) min, iar doza de iradiere corespunzatoare a fost intre 60 J/cm2 si 900 J/cm2. Ulterior fiecarei sesiuni de iradiere, spectrele de absorbtie corespunzatoare au fost masurate in domeniul spectral UV/VIZ/NIR cu ajutorul spectrofotometrului Perkin Elmer amintit mai sus. Aetoxysklerolul, fiind o solutie tip detergent, prezinta capacitati de spumare, asa cum am descris in subcapitolul 6.2.3. Am produs probe de spuma folosind metoda Tessari (Fig.6.4) – doua seringi (Luer Slip) conectate la un ventil cu trei cai, una dintre seringi continand Aetoxysklerol si cealalta aer, in proportie de 1:4. Amestecul a fost trecut dintr-o seringa in alta de aproximativ 40 de ori, iar spuma rezultata era stabila timp de 5-6 min.

114

a) b)

Fig.6.4. Metoda de spumare Tessari (a) si consistenta spumei (b). Probe de medicament atat solutie cat si spuma au fost investigate prin

spectroscopie Raman. Sistemul experimental folosit este schitat in Fig.6.5. Radiatia laser utilizata pentru excitarea emisiei Raman este armonica a doua

(532 nm) a laserului Nd:YAG. Preluarea semnalului Raman emis de proba se realizeaza la un unghi de 900 fata de directia de excitare. Detectia si analiza semnalului Raman sunt realizate prin intermediul unui sistem compus dintr-un spectrograf (SpectraPRO 750, Acton Research, Princeton Instruments, SUA) si o camera ICCD (PI-MAX:1024, Princeton Instruments, SUA).

Fig.6.5. Sistemul experimental de spectroscopie Raman.

Fotodetectorul este sub forma unui circuit cu cuplaj de sarcina cu intensificator de imagine (ICCD) cu poarta rapida de masurare a radiatiei optice (deschidere <2 ns) pentru spectroscopie cu rezolutie temporala, format 1024 x 256 pixeli, acoperind domeniul spectral (185 – 900) nm, cu rezolutia limita cuprinsa intre (54 – 64) ℓp/mm.

Spectrograful este compatibil cu detectorul matrice cu intensificator 1024x256, prezinta fante de intrare si iesire laterale, oglinda de iesire motorizata si soft dedicat pentru achizitie si analiza. Distanta focala este de 750 mm, dispersia liniara de 0,4 nm/mm, acuratetea de +/-0,1 nm, iar retelele (holografica UV, 2400 tr/mm; holografica VIZ, 2400 tr/mm; la unghi blaze 1µm, 600tr/mm, domeniu 650 - 1500nm) sunt dispuse intr-o montura triplu carusel.

6.3.2. REZULTATE EXPERIMENTALE

Spectrele de absorbtie ale probelor de Aethoxysklerol 2% sunt prezentate in Fig.6.6. In domeniul spectral UV/VIZ nu se inregistreaza maxime de absorbtie, iar in NIR se observa peakuri de intensitate slaba la 900 nm, 1,19 μm, 1,69 μm si 1,72 μm; acestea sunt rezultatul suprapunerii spectrelor de absorbtie individuale ale substantelor prezente in formularea farmaceutica a medicamentului supus cercetarii.

115

a) b)

Fig.6.6. Spectrele de absorbtie ale probelor de Aethoxysklerol 2% in domeniile spectrale UV-VIZ (a) si NIR (b)

De asemenea, spectrul de absorbtie FTIR, redat in Fig.6.7 este influentat de proprietatile de absorbtie ale apei continute in solutia de Aethoxysklerol.

Fig.6.7. Spectrul de absorbtie FTIR al solutiei de Aethoxysklerol 2%. Alcoolul etilic, de exemplu, unul dintre componentele inactive ale medicamentului, prezinta maxime de absorbtie relativ importante la 900 nm, 1 µm si 1,2 µm, asa cum se poate observa in Fig.6.8.

a) b)

Fig.6.8. Spectrele etanolului: a) transmisia [6.38] si b) absorptia (masurata in laborator) in domeniul NIR.

116

De asemenea, apa prezinta benzi largi de absorbtie in NIR si IR, dupa cum se poate vedea in Fig.6.9. Rezultatele cercetarilor au permis emiterea unei ipoteze conform careia moleculele substantelor active din prezentarile farmaceutice pot fi fotoactivate prin procesul de hidroliza care rezulta din excitarea nivelelor de vibratie ale moleculelor de apa in intervalul spectral 1 – 2 µm in urma absorbtiei radiatiei infrarosii de catre acestea [6.39].

Fig.6.9. Spectrul de absorbtie al apei ultrapure [6.40]. Am expus medicamentul disponibil comercial la radiatie coerenta emisa la 1064 nm de laserul pulsat Nd:YAG pentru intervale de timp cuprinse intre 2 min si 30 min, dupa procedura de iradiere descrisa in subcapitolul 6.3.1. Ulterior iradierii au fost inregistrate spectrele de absorbtie ale solutiilor de medicament, care pot fi vizualizate in Fig.6.10.

Fig.6.10. Spectrele de absorbtie ale Aethoxysklerol 2%

expus la radiatie laser emisa la 1064 nm.

Aceste spectre indica faptul ca pentru lungimi de unda ce depasesc 500 nm, caracteristicile de absorbtie ale solutiilor investigate raman in limitele erorilor de masura caracteristice aparatului (±0,004%). Modificari ce exced domeniul acestor erori se observa in intervalul spectral (250 – 280) nm, dupa cum se poate observa in detaliul

117

din Fig.6.10. O posibila explicatie ar fi aceea ca pot aparea efecte neliniare de absorbtie in moleculele de medicament, cum ar fi absorbtia a 4 fotoni la lungimea de unda de 1064 nm, care sa corespunda unei tranzitii la 266 nm. Ca urmare, moleculele de Aethoxysklerol pot suferi modificari structurale [6.41]. Mecanismele de interactie a radiatiei laser cu solutia de medicament investigata nu sunt pe deplin elucidate, fiind necesare studii suplimentare pentru intelegerea lor.

Este posibil ca moleculele de Aethoxysklerol modificate ca urmare a interactiei cu radiatia luminoasa sa-si schimbe caracteristicile terapeutice precum si modul de comportare in mediu fie ca rezultat al eliminarii metabolice, fie in urma dispunerii deseurilor. Expunerea medicamentului sub forma de spuma la radiatie laser are ca rezultat cresterea drumului optic al fasciculului luminos prin imprastiere pe suprafata bulelor, care conduce la o imbunatatire a absorbtiei totale data fiind proportionalitatea acesteia cu produsul dintre coeficientul de absorbtie, lungimea drumului optic si concentratia moleculelor absorbante. Mecanismul de absorbtie poate fi potentat prin cresterea ratei de impact a fotonilor la coliziunea cu peretii bulelor de gaz. In aceasta circumstanta numarul moleculelor de POL capabile de a suferi fotomodificari structurale pot creste. In aceasta ordine de idei, probe de Aethoxysklerol in solutie si spuma au fost investigate prin tehnica de spectroscopie Raman. Rezultatul experimental expus grafic in Fig.6.11 arata ca semnalele Raman sunt mai intense in cazul probelor de spuma fata de cele ale probelor de solutie.

Fig.6.11. Comparatia spectrelor Raman ale probelor de Aethoxysklerol in solutie si spuma.

Aceasta imbunatatire a caracteristicilor de imprastiere a radiatiei laser este datorata unui drum optic mai lung in probele de spuma de POL. Liniile vibrationale Raman corespunzatoare probelor de spuma sunt mai bine structurate si mai puternice. De asemenea, semnalele Raman ale probelor de spuma au fost inregistrate la diferite momente ale timpului de viata al acesteia. Rezultatele obtinute confirma faptul ca exista o serie de parametri care trebuie luati in considerare pentru studiul interactiei radiatiei laser cu probele de medicament, cum ar fi dimensiunea bulelor de aer, respectiv coeziunea spumei. Asa cum se poate observa in Fig.6.12, cele mai intense semnale de imprastiere au fost obtinute la doua minute dupa prepararea spumei. Dupa

118

cateva minute, spuma se separa iar intensitatea liniilor vibrationale caracteristice scade dramatic.

Fig.6.12. Influenta coeziunii spumei asupra spectrului Raman al probei de spuma de POL.

Banda extinsa din regiunea spectrala (3500 - 3200) cm-1 din spectrul Raman al

solutiei de POL se datoreaza vibratiei de intindere a legaturii OH caracteristica solutiilor apoase, dar si alcoolilor, ambele valabile in cazul solutiei investigate.

In ceea ce priveste spectrul Raman al probei de spuma, semnalele inregistrate pana la 3000 cm-1, in special acelea centrate la 2850 cm-1 si 2935 cm-1 sunt specifice vibratiilor de intindere asimetrice/simetrice ale gruparii metil in lanturi alifatice lungi, situatie caracteristica structurii chimice a substantei active din medicamentul supus studiului.

Profilul caracteristic benzii situate in regiunea spectrala (3600-3200) cm-1 indica existenta grupurilor hidroxil, a caror prezenta, impreuna cu semnalele Raman slabe din intervalul spectral (1650-1450) cm-1 sunt tipice pentru vibratiile de intindere ale OH [6.42].

6.4. DISCUTII SI CONCLUZII

Data fiind utilizarea tot mai frecventa a medicamentelor sclerozante de tip detergent in scleroterapia vaselor de sange, respectiv incidenta crescuta a acestora in societate, este util de cunoscut cat mai multe aspecte in ceea ce priveste soarta unor astfel de potentiali poluanti in ecosistem. Un prim pas in atingerea acestui deziderat este cunoasterea si intelegerea aprofundata a proprietatilor si a modului de comportare a medicamentului sub influenta unor factori perturbatori. In acest sens, proprietatile optice al agentului sclerozant Polidocanol in prezentare farmaceutica sub denumirea de Aethoxysklerol (Chemische Fabrik Kreussler & Co., Germania) au fost studiate. Spectrele de absorbtie ale probelor in solutie au indicat absenta maximelor in domeniile spectrale UV/VIZ si prezenta unor indicii slabe in domeniul NIR al spectrului electromagnetic, la lungimi de unda de 900 nm, 1,19 μm, 1,69 μm si 1,72 μm. Acestea sunt rezultatul suprapunerii proprietatilor optice ale

119

tuturor componentelor prezente in formularea farmaceutica a medicamentului investigat. In vederea cercetarii comportarii Aetoxysklerolului sub influenta radiatiei laser, trebuie avuta in vedere, de asemenea, prezenta tuturor substantelor prezente in medicamentul disponibil comercial. In urma iradierii cu fascicul laser pulsat emis la lungimea de unda de 1064 nm de un laser Nd:YAG pentru diferite intervale de timp s-a pus in evidenta ca la lungimi de unda mai mari de 500 nm caracteristicile de absorbtie ale Aethoxysklerolului raman neschimbate in limita erorilor de masura. De asemenea, in intervalul spectral (250 – 280) nm se observa modificari ale spectrului de absorbtie pentru timpi de iradiere mai mari de 10 min, a caror posibila explicatie ar fi aceea ca pot aparea efecte neliniare de absorbtie in moleculele de medicament, cum ar fi absorbtia a 4 fotoni la lungimea de unda de 1064 nm, care sa corespunda unei tranzitii la 266 nm. Ca urmare, moleculele de Aethoxysklerol pot suferi transformari structurale. In acelasi timp, o alta ipoteza ar fi aceea ca moleculele de substanta activa (POL) pot fi fotoactivate prin procesul de hidroliza care rezulta din excitarea nivelelor de vibratie ale moleculelor de apa prezente in formularea farmaceutica a medicamentului in intervalul spectral (1 – 2) µm in urma absorbtiei radiatiei infrarosii de catre acestea. Mecanismele de interactie a radiatiei laser cu solutia de medicament investigata nu sunt pe deplin elucidate, fiind necesare studii suplimentare pentru intelegerea lor. Masuratorile proprietatilor optice ale Aethoxysklerol prin tehnica de spectroscopie Raman au pus in evidenta ca semnalele Raman ale probelor de spuma sunt mult mai intense decat cele obtinute in cazul probelor de medicament in solutie. Aceasta imbunatatire a caracteristicilor de imprastiere a radiatiei laser se datoreaza unui drum optic mai lung al fasciculului in proba de spuma, liniile vibrationale corespunzatoare acesteia fiind mai bine structurate si mai puternice.

Interpretarea spectrelor Raman in cele doua situatii de prezentare a medicamentului in varianta comerciala, respectiv solutie si spuma, permite efectuarea urmatoarelor aprecieri:

• banda extinsa din regiunea spectrala (3500-3200) cm-1 din spectrul solutiei de POL se datoreaza vibratiei de intindere a legaturii OH caracteristica solutiilor apoase, dar si alcoolilor, ambele valabile in cazul solutiei investigate;

• in ceea ce priveste spectrul probei de spuma, semnalele inregistrate pana la 3000 cm-1, in special acelea centrate la 2850 cm-1 si 2935 cm-1 sunt specifice vibratiilor de intindere asimetrice/simetrice ale gruparii metil in lanturi alifatice lungi, situatie caracteristica structurii chimice a substantei active din medicamentul supus studiului;

• profilul benzii situate in regiunea spectrala (3600-3200) cm-1 impreuna cu semnalele Raman slabe din intervalul spectral (1650-1450) cm-1

caracterizeaza vibratiile de intindere ale OH. De asemenea, rezultatele obtinute in urma masurarii proprietatilor de imprastiere Raman ale probelor de spuma inregistrate la diferite momente ale timpului de viata al acesteia confirma faptul ca exista o serie de parametri care trebuie luati in considerare pentru studiul interactiei radiatiei laser cu probele de medicament, cum ar fi dimensiunea bulelor de aer, respectiv coeziunea spumei. In conditiile experimentale prezentate, cele mai intense semnale de imprastiere au fost obtinute la doua minute dupa prepararea spumei. Dupa cateva minute, spuma se separa iar intensitatea liniilor vibrationale caracteristice scade dramatic.

120

6.5. REFERINTE BIBLIOGRAFICE [6.1] Nijsten, T.; van den Bos, R.R.; Goldman, M.P.; Kockaert, M.A.; Proebstle, M.; Rabe,

E.; Sadick, N.S.; Weiss, R.A.; Neumann, M.H.A. Minimally invasive techniques in the treatment of saphenous varicose veins, J AM ACAD DERMATOL, Vol. 60, pag. 110-119, 2009;

[6.2] Moreno Moraga, J.; Isarria Marcos, M.J.; Royo de la Torre, J.; Gonzalez Urena, A. Photodynamic therapy in the treatment of varicose veins. Disponibil la: http://www.institutomedicolaser.com/archivos/areacientifica/varices_070306.pdf;

[6.3] Trelles, M.; Moreno-Moraga, J.; Alcolea, J.; Smarandache, A., Pascu, M.L. Laser in leg veins: our personal approach of treatment. In: Synopsis of Aesthetic Dermatology & Cosmetic Surgery, Elsaie, M.L. (Ed), Nova Science Publishers Inc, NY, USA, 2012, in press;

[6.4] Smarandache, A.; Moreno Moraga, J.; Staicu, A.; Trelles, M.; Pascu, M.L. Applications of Polidocanol in varicose vein treatment assisted by exposure to Nd:YAG laser radiation. In "Nd YAG Laser", InTech, Open Access publisher, Croatia, 2012, in press;

[6.5] Redondo, P.; Cabrera, J. Microfoam Sclerotherapy. Seminars in Cutaneous Medicine and Surgery, Vol.24, Nr.4, pag. 175-183, 2005;

[6.6] Artemi, P. Pharmacology of Phlebology, ACP Australasian meeting, Abstracts Book, Sydney, Australia, 18-21 Septembrie, 2007;

[6.7] Ouvry, P.; Allaert, F.A.; Desnos, P.; Hamel-Desnos, C. Efficacy of Polidocanol Foam versus Liquid in Sclerotherapy of the Great Saphenous Vein: A Multicentre Randomised Controlled Trial with a 2-year Follow-up. Eur J Vasc Endovasc Surg, Vol. 36, Nr.3, pag. 366-370, 2008;

[6.8] Orbach, E.J. Contribution to the therapy of the varicose complex. J Int Coll Surg, Vol.13, Nr.6, pag. 765–771, 1950;

[6.9] Cabrera, G.J., Cabrera, G.O.J.; Garcia-Olmedo, M.A. Elargissement des limites de la schlerotherapie: nouveaux produits sclerosants. Phlebologie, Vol.50, Nr.2, pag. 181–187, 1997 ;

[6.10] Monfreux, A. Traitement sclerosant des troncs saphenies et leurs collaterales de gros calibre par le methode MUS. Phlebologie, Vol.50, Nr.2, pag. 351–353, 1997;

[6.11] Henriet, J.P. Un an de pratique quotidienne de la sclerotherapie (veines reticulaires et teleangiectasies) par mousse de polidocanol: faisebilite, resultats, complications. Phlebologie, Vol.50, Nr.2, pag. 355–360, 1997;

[6.12] Cavezzi, A.; Frullini, A. The role of sclerosing foam in ultrasound guided sclerotherapy of the saphenous veins and of recurrent varicose veins: our personal experience. Australian & New Zealand journal of phlebology, Vol. 13, pag. 49–50, 1999;

[6.13] Sadoun, S.; Benigni, J.P. The treatment of varicosities and telangiectases with TDS and Lauromacrogol foam. XIII World Congress of Phlebology 1998, Abstracts Book, pag. 327, Sydney, Australia, 6-11 Septembrie, 1998;

[6.14] Garcia-Mingo, J. Esclerosis venosa con espuma: Foam Medical System. Revista Espanola de Medicina y Cirugia Cosmetica, Vol.7, pag.29–31, 1999. Disponibil la: www.cavezzi.it/garciaen.html

[6.15] Tessari, L. Nouvelle technique d’obtention de la sclero-mousse. Phlebologie, Vol.53, Nr.1, pag. 129-133, 2000;

[6.16] Frullini, A. New technique in producing sclerosing foam in a disposable syringe. Dermatologic Surgery, Vol.26, Nr.7, pag. 705–706, 2000;

[6.17] Gachet, G. Une nouvelle methode simple et economique pour confectionner de la mousse pour la sclerose echoguidee. Phlebologie, Vol.54, Nr. 1, pag. 63–65, 2001;

121

[6.18] Hoff, A.J. (Ed.) Handbook of Biological Physics Series, Vol. 1A. Structure and Dynamics of Membranes. From Cells to Vesicles, Lipowsky, R.; Sackmann, E. (Ed. Vol.) Elsevier, Olanda, 1995;

[6.19] Wikipedia. In Micelle, Disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Micelle; [6.20] Duffy, D. M. Sclerosants: A Comparative Review, Dermatol. Surg., Vol. 36, Supl.2,

pag. 1010–1025, 2010; [6.21] PubChem. Polidocanol, In: Compund, Disponibil la:

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/; [6.22] Eckmann, D.M. Polidocanol for Endovenous Microfoam Sclerosant Therapy.

Expert Opin Investig Drugs, Vol.18, Nr.12, pag. 1919–1927, 2009; [6.23] U.S. Department of Health & Human Services, FDA. FDA Approves Asclera to

Treat Small Varicose Veins, In: Press Announcements, (Septembrie 2011). Disponibil la:

http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements; [6.24] Santos, P.; Watkinson, A.C.; Hadgraft, J.; Lane, M.E. Application of

Microemulsions in Dermal and Transdermal Drug Delivery. Skin Pharmacol Physiol, Vol.21, Nr.5, pag. 246-259, 2008;

[6.25] Eckmann, D.M.; Kobayashi, S.; Li, M. Microvascular embolization following polidocanol microfoam sclerosant administration. Dermatol Surg, Vol.31, Nr.6, pag. 636–643, 2005;

[6.26] Parsi, K.; Exner, T.; Connor, D.E.; Herbert, A.; Ma, D.D. ; Joseph, J.E. The lytic effects of detergent sclerosants on erythrocytes, platelets, endothelial cells and microparticles are attenuated by albumin and other plasma components in vitro. Eur J Vasc Endovasc Surg, Vol. 36, Nr.2, pag. 216–223, 2008;

[6.27] Alos, J.; Carreno, P.; Lopez, J.A.; Estadella, B.; Serra-Prat, M.; Marinello, J. Efficacy and safety of sclerotherapy using polidocanol foam: a controlled clinical trial. Eur J Vasc Endovasc Surg, Vol.31, Nr.1, pag. 101–107, 2006;

[6.28] Cabrera, J.; Cabrera, J. Jr.; Garcia-Olmedo, M.A. Treatment of varicose long saphenous veins with sclerosant in microfoam form: long-term outcomes. Phlebology, Vol.15, Nr.1, pag.19–23, 2000;

[6.29] Hsu, T.S.; Weiss, R.A. Foam sclerotherapy: a new era. Arch Dermatol, Vol. 139, Nr.11, pag. 1494-1496, 2003;

[6.30] Rabe, E.; Otto, J.; Schliephake, D.; Pannier, F. Efficacy and Safety of Great Saphenous Vein Sclerotherapy Using Standardised Polidocanol Foam (ESAF): A Randomised Controlled Multicentre Clinical Trial. Eur J Vasc Endovasc Surg, Vol.35, Nr.2, pag. 238-245, 2008;

[6.31] Rao, J.; Goldman, M.P. Stability of foam in sclerotherapy: differences between sodium tetradecyl sulfate and polidocanol and the type of connector used in the double-syringe system technique. Dermatol Surg, Vol.31, Nr.1, pag. 19–22, 2005;

[6.32] Cavezzi, A.; Tessari, L. Foam sclerotherapy techniques: different gases and methods of preparation, catheter versus direct injection. Phlebology, Vol.24, Nr.6, pag. 247-251; 2009;

[6.33] Rabe, E.; Pannier, F. Sclerotherapy of Varicose Veins with Polidocanol Based on the Guidelines of the German Society of Phlebology. Dermatol Surg, Vol.36, Supl.2, pag. 968–975, 2010;

[6.34] Hamel-Desnos, C.; Ouvry; Benigni, J.P.; Boitelle, G.; Schadeck, M.; Desnos P.; Allaert, F.A. Comparison of 1% and 3% Polidocanol Foam in Ultrasound Guided Sclerotherapy of the Great Saphenous Vein: A Randomised, Double-Blind Trial with 2 Year-Follow-up. “The 3/1 Study”, European Journal of Vascular and Endovascular Surgery, Vol. 34, Nr.6, pag. 723-729, 2007;

122

[6.35] BTG International Ltd. Our Pipeline, In: Development, Septembrie 2011. Disponibil la: http://www.btgplc.com/development/our-pipeline;

[6.36] Cabrera, J.; Cabrera, J. Jr; Garcia-Olmedo, M.A.; Redondo, P. Treatment of venous malformations with sclerosant in microfoam form. Arch Dermatol, Vol.139, Nr.11 pag. 1409–1416, 2003;

[6.37] Cabrera, J.; Redondo, P., Beccerra, A.; Garrido, C.; Cabrera, J.Jr.; Garcia-Olmedo, M.A.; Sierra, A.; Lloret, P.; Martinez-Gonzalez, M.A. Ultrasound-guided injection of polidocanol microfoam in the management of venous leg ulcers. Arch Dermatol , Vol.140, pag. 667–673, 2004;

[6.38] Barun, V.V.; Ivanov, A.P. Depth distributions of light action spectra for skin chromophores. Journal of Applied Spectroscopy, Vol.77, Nr.7, pag. 73-79, 2010;

[6.39] Fumarel, R.; Murgoi, G.; Albert, P.; Hurduc, A.; Pascu, M.L. Increase of Cisplatinum therapeutic index through optical irradiation, AIP Conf. Proc. of LASER FLORENCE 2008, Vol.1142, pag.1-7, 2009;

[6.40] Querry, M. R.; Wieliczka, D. M.; Segelstein, D. J. Water: H2O, In: Handbook of Optical Constants of Solids II, Palik E.D. (Ed.), pag.1059–1077, Academic Press 1998, San Diego, CA, USA, 1998;

[6.41] Smarandache, A.; Trelles, M.; Pascu, M.L. Measurement of the modifications of Polidocanol absorption spectra after exposure to NIR laser radiation. J Optoelectronics Advanced Materials, Vol.12, Nr.9, pag. 1942 – 1945, 2010;

[6.42] Smarandache, A. Laser Beams Interaction with Polidocanol Foam: Molecular Background, acceptat spre publicare in Photomedicine and Laser Surgery, Vol.30, Nr.TBD, 2012.

123

CAPITOLUL 7

CONCLUZII GENERALE

Problema prezentei si a potentialelor efecte adverse ale substantelor de natura farmaceutica in mediu a atras atentia autoritatilor si comunitatii stiintifice in ultimii ani. Alaturi de poluantii conventionali, reziduurile farmaceutice au devenit factori contaminanti remarcabili ai mediului terestru si acvatic, iar cunostintele legate de comportarea lor in natura sunt sarace. Multe tone de substante active farmaceutic sunt folosite anual in tratarea diferitelor boli atat in medicina umana, cat si in cea veterinara. Cele mai multe dintre ele sunt eliminate prin excretie fie nemetabolizate, fie ca metaboliti activi. Acest fapt, impreuna cu dispunerea improprie a medicamentelor expirate sau a resturilor menajere a condus la acumularea unor concentratii demne de luat in consideratie pentru anumiti compusi in apele uzate municipale. O eliminare deficienta a acestor compusi in timpul proceselor de tratare permite transportul lor in apele de suprafata, de unde ajung in apele subterane si, respectiv, in apa potabila. Prezenta substantelor farmaceutice in mediu poate cauza consecinte serioase asupra biosistemului. Chiar daca acesti compusi sunt detectati in natura la nivele de concentratii foarte mici, nu se cunoaste inca efectul acumularii acestora in cazul fiintelor vii.

Pe de alta parte, o chestiune majora asupra careia trebuie reflectat este problema rezistentei incrucusate la medicamente, care este raportata din ce in ce mai des cu privire la antibioticele disponibile in acest moment. Pana de curand se presupunea ca existenta in mediu a compusilor activi farmaceutic nu prezinta risc pentru organismele vii. Rezistenta la antibiotice este un fenomen natural biologic. Introducerea in practica medicala a fiecarui astfel de compus era urmata de detectarea in laborator a tulpinilor de microorganisme rezistente, respectiv capabile de a se multiplica in prezenta unor concentratii de medicamente ce depaseau dozele terapeutice. O astfel de rezistenta poate fi o caracteristica asociata intregii specii sau poate aparea prin mutatii sau transfer genetic in alte tulpini.

Exista multe obiective de atins inainte de a realiza un tablou complet al comportarii acestor substante in mediul natural, ca si in ceea ce priveste efectele pe care le comporta prezenta lor asupra ecosistemului, in general. Evaluarea riscului, activitatea farmaceutica, incidenta si persistenta urmelor de medicamente in factorii de mediu, ca si identificarea unor metode mai eficiente de indepartare a resturilor de substante de natura farmaceutica trebuie sa constituie o prioritate. Astfel, sunt necesare acumularea unor cunostinte extinse privind proprietatile fizice si chimice ale acestor substante, precum si comportarea lor in mediu sub influenta mai multor factori. In ceea ce priveste noi metode de eliminare a deseurilor de origine farmaceutica, este foarte util de luat in considerare una dintre proprietatile acestor substante si anume aceea de fotodegradabilitate. Daca o substanta este fotosensibila, asa cum se intampla de cele mai multe ori in cazul medicamentelor, procesul de fotodescompunere poate constitui un element major in cadrul tehicilor de tratare/epurare. Acest studiu vine in intampinarea acestui deziderat, rezultatele experimentale preliminare privind comportarea unor solutii de medicamente in urma expunerii la radiatie optica, in acest caz fascicule laser pulsate, fiind incurajatoare. Astfel, a fost studiat procesul de

124

degradare a solutiilor luate in considerare atat prin analiza proprietatilor acestor substante cu ajutorul unor tehnici si metode optice, cat si folosind metode analitice conexe, care au pus in evidenta in general modificari la nivel molecular, iar in unele cazuri chiar degradarea completa. 7.1 CONTRIBUTII ORIGINALE Aceasta sectiune este dedicata expunerii in mod succint a rezultatelor originale obtinute de autoarea tezei in urma studiilor experimentale prezentate pe larg in cursul lucrarii.

A) Fotodegradarea fenotiazinelor cauzata de expunerea la radiatie optica (naturala, artificiala necoerenta sau radiatie laser) poate fi considerata un element major in ceea ce priveste procesul de eliminare a acestor compusi din mediu.

Studiul experimental al proprietatilor optice si al comportarii Tioridazinei, unul dintre derivatii fenotiazinei, sub influenta radiatiei luminoase permite sintetizarea urmatoarelor concluzii:

• Expunerea solutiilor ce contin Tioridazina la lumina ambianta conduce la modificari spectrale ale probelor investigate, care sugereaza formarea derivatilor sulfoxid;

• Radicalii cationici generati pe cale fotochimica prezinta benzi de absorbtie situate in VIZ/NIR datorate tranzitiilor HOMO → SOMO;

• Formarea radicalilor cationici este insotita de modificari ale spectrului de absorbtie in UV ale medicamentului, ceea ce sugereaza faptul ca procesele de agregare si fotoionizare induc alterari ale structurii medicamentului si, in consecinta, afecteaza tranzitiile S0 → S1 si S0 → Sn;

• Dupa 3h de expunere la radiatie laser pulsata emisa de laserul Nd:YAG la 266 nm se observa o degradare totala, ireversibila a medicamentului, ceea ce permite considerarea acestei metode ca mijloc potential de indepartare a acestor compusi din mediu;

• Expunerea solutiilor de Tioridazina mai concentrate la radiatie laser pulsata emisa la 355 nm conduce la aparitia a noi maxime de absorbtie situate in regiunile VIZ/NIR ale spectrului electromagnetic. Cresterea concentratiei solutiei are ca efect cresterea numarului de mici agregate si, respectiv, cresterea maximelor de absorbtie de la 638 nm si 890 nm. Saturatia intervine, probabil, deoarece numarul moleculelor de Tioridazina care pot fi stabilizate sub forma de radical cationic in agregate mari este semnificativ mai mic decat acela stabilizat in agregate mici [3.42, 3.43, 3.45].

Spectrul 1H RMN al Thr identifica prezenta a 22 de protoni alifatici in intervalul (1,35 – 4,2) ppm si 7 protoni aromatici in intervalul (6,88 – 7,28) ppm.

Spectrul 1H RMN al solutiei de Thr (-) 5x10-2 M in apa ultra pura, expusa in prealabil la radiatie laser emisa de armonica a treia (355 nm) a laserului pulsat Nd:YAG, cu energia medie a fasciculului de 30 mJ indica modificari atat in regiunea protonilor alifatici cat si in cea a protonilor aromatici. Cromatograma Thr (rac) arata o buna separare la un timp de retentie de 3,12 min. Spectrul de masa identifica in mod clar acest compus, avand masa molara 371,8 g/mol. Inregistrarile HPLC-MS ale unei solutii de Thr (rac) 10-3 M in apa ultra-pura expusa la lumina naturala pana la 980 h realizate dupa intervale de timp de 40 h, 70 h, 90 h, 240 h si 980 h permit identificarea a doi compusi, si anume: Thr-2-SO

125

(Mesoridazina), cu incarcarea 387,9 m/z si Thr-2-SO2 cunoscut ca si Sulforidazina, cu incarcarea 404 m/z. Dupa 10 zile de expunere la lumina naturala procentul in care Thr-2-SO2 este prezent in solutie se micsoreaza, astfel ca dominanta este prezenta Mesoridazinei si acest rezultat se perpetueaza pana la finalul studiului (980h).

B) Studiul comportarii in timp a proprietatilor optice ale derivatului chinazolinic BG1188 demonstreaza o buna stabilitate a solutiilor studiate in intervalul de concentratii 10-5 M – 10-3 M in apa ultra pura. Solutia in concentratie de 10-3 M in apa ultra pura este extrem de stabila la o temperatura de 40C in prima luna dupa preparare. In ceea ce priveste concentratiile mai mici, pana la 10-5 M intervalul de timp in care solutiile sunt stabile este chiar mai mare – pana la 4 luni. Nu au fost observate influente ale temperaturii de pastrare pentru prima luna de studiu [4.6, 4.17]. In ceea ce priveste comportarea solutiilor derivatului chinazolinic 10-3 M in apa ultra pura expuse la radiatie laser pulsata emisa la 355 nm de laserul Nd:YAG, rezultatele experimentale permit gruparea procesului de fotodegradare in doua etape:

• Pentru un interval de timp de pana la 5 min de expunere se constata degradarea progresiva a compusului, relevata prin scaderea concentratiei BG1188 si cresterea concentratiei fotoprodusului generat de iradierea laser; astfel, in solutie se constata prezenta a doua specii absorbante;

• Incepand de la timpi de iradiere mai mari sau egali cu 10 min, solutia studiata se degradeaza aproape complet; cinetica reactiilor sugereaza aparitia cel putin a unei a treia specii absorbante de concentratie diferita, ale carei proprietati de absorbtie difera de celelalte doua. Spectrul 1H RMN al BG1188 substanta pura indica prezenta a 10 protoni alifatici

in regiunea (2,4 – 4,45) ppm si 4 protoni aromatici in regiunea (7,85 – 8,86) ppm. Se observa prezenta unor alte semnale slabe in regiunea protonilor aromatici, care se datoreaza, probabil unor impuritati. In ceea ce priveste agregatele observate in solutie, ele nu pot fi complet caracterizate in aceasta etapa de studiu, fiind necesare investigatii suplimentare. Se poate presupune ca ele reprezinta rezultatul procesului de hidroliza, efectul radiatiei laser asupra acestora constituind un factor de potentare.

C) Au fost studiate proprietatile optice ale unor solutii de antibiotice (Doxorubicina si Vancomicina) in apa distilata in domenii de concentratie cuprinse in intervalul (10-4 – 10-7) M, care indica benzi de absorbtie specifice situate in regiunea UV pentru Vancomicina, respectiv UV/VIZ in cazul Doxorubicinei. De asemenea, solutii ale celor doua antibiotice in apa ultra pura au fost expuse la radiatie laser pulsata emisa de laserul Nd:YAG la lungimi de unda de 266 nm si energie de 10mJ pentru Doxorubicina (timpi de expunere pana la 60 min) si (266+532) nm si 20 mJ pentru Vancomicina (timpi de expunere pana la 2 h).

Un efect important in comportarea spectrala a Doxorubicinei il au, la concentratii mari (mai mari de 10-4 M) dimerii, care modifica structura spectrelor de absorbtie si influenteaza evolutia medicamentului expus la radiatie laser. Daca pentru un timp de iradiere de 30 min in conditiile date modificarile spectrale ale medicamentului nu sunt semnificative, in cazul unei expuneri de 60 min se observa aparitia unor puncte isosbestice, la 266 nm si 390 nm, si deplasarea maximului din VIZ catre lungimi de unda mai mari. Comportarea properietatilor optice ale probei dupa un timp de expunere mai lung permite aprecierea ca in solutie apare cel putin o a treia specie absorbanta de concentratie diferita, ale carei proprietati de absorbtie difera de celelalte doua. Aceste modificari sunt evidentiate si prin analiza calitativa a spectrelor HPLC-MS ale solutiilor neiradiate, respectiv ale celor expuse la radiatie optica pulsata emisa de laserul Nd:YAG.

126

Spectrele de absorbtie masurate ulterior iradierii solutiilor apoase de Vancomicina HCl 2 mg/ml scot in evidenta disparitia amprentei caracteristice medicamentului. De asemenea, procesul de degradare este confirmat si de dinamica spectrelor de fluorescenta indusa cu laser. In acelasi timp, din cauza structurii sale chimice complicate interpretarea spectrului RMN nu este posibila in acest stadiu; sunt necesare experimente ulterioare care sa permita divizarea semnalelor protonice in grupuri sau retele cuplate, in special in zonele suprapunerii multipletilor sau in cazul cuplajelor extensive de ordinul doi.

Spectrul de masa al probei iradiate de Vancomicina nu scoate in evidenta incarcarea specifica a medicamentului, fapt ce duce la concluzia ca in urma interactiei cu radiatia laser moleculele de medicament au suferit o degradare completa, ireversibila.

Coreland datele obtinute prin toate metodele experimentale descrise rezulta ca dupa expunerea la fascicule laser se produc modificari in structura electronica si de vibratie – rotatie a moleculelor de medicamente. Acest fapt sugereaza degradarea medicamentelor studiate, in cazul Vancomicinei chiar o degradare totala, ireversibila.

Rezultatele experimentale incurajeaza continuarea cercetarilor privind fotodegradarea solutiilor de antibiotice prin expunerea lor la radiatie optica emisa de surse coerente in scopul gasirii unor solutii in ceea ce priveste imbunatatirea procesului tehnologic de epurare a apelor uzate.

C) Au fost studiate proprietatile optice al agentului sclerozant Polidocanol in prezentare farmaceutica sub denumirea de Aethoxysklerol (Chemische Fabrik Kreussler & Co., Germania). Spectrele de absorbtie ale probelor in solutie au indicat absenta maximelor in domeniile spectrale UV/VIZ si prezenta unor indicii slabe in domeniul NIR al spectrului electromagnetic, la lungimi de unda de 900 nm, 1,19 μm, 1,69 μm si 1,72 μm. Acestea sunt rezultatul suprapunerii proprietatilor optice ale tuturor componentelor prezente in formularea farmaceutica a medicamentului investigat. In vederea cercetarii comportarii Aetoxysklerolului sub influenta radiatiei laser, trebuie avuta in vedere, de asemenea, prezenta tuturor substantelor prezente in medicamentul disponibil comercial. In urma iradierii cu fascicul laser pulsat emis la lungimea de unda de 1064 nm de un laser Nd:YAG pentru diferite intervale de timp s-a pus in evidenta ca [6.3, 6.4, 6.41]:

• la lungimi de unda mai mari de 500 nm caracteristicile de absorbtie ale Aethoxysklerolului raman neschimbate in limita erorilor de masura; • in intervalul spectral (250 – 280) nm se observa modificari ale spectrului de absorbtie pentru timpi de iradiere mai mari de 10 min, a caror posibila explicatie ar fi:

o aparitia efectelor neliniare de absorbtie in moleculele de medicament, cum ar fi absorbtia a 4 fotoni la lungimea de unda de 1064 nm, care sa corespunda unei tranzitii la 266 nm. Ca urmare, moleculele de Aethoxysklerol pot suferi transformari structurale;

o o alta ipoteza ar fi aceea ca moleculele de substanta activa (POL) pot fi fotoactivate prin procesul de hidroliza care rezulta din excitarea nivelelor de vibratie ale moleculelor de apa prezente in formularea farmaceutica a medicamentului in intervalul spectral (1 – 2) µm in urma absorbtiei radiatiei infrarosii de catre acestea.

Mecanismele de interactie a radiatiei laser cu solutia de medicament investigata nu sunt pe deplin elucidate, fiind necesare studii suplimentare pentru intelegerea lor.

127

Masuratorile proprietatilor optice ale POL prin tehnica de spectroscopie Raman au pus in evidenta ca semnalele Raman ale probelor de spuma sunt mult mai intense decat cele obtinute in cazul probelor de medicament in solutie. Aceasta imbunatatire a caracteristicilor de imprastiere a radiatiei laser se datoreaza unui drum optic mai lung al fasciculului in proba de spuma, liniile vibrationale corespunzatoare acesteia fiind mai bine structurate si mai puternice.

Interpretarea spectrelor Raman in cele doua situatii de investigare a medicamentului disponibil comercial, respectiv solutie si spuma, permite efectuarea urmatoarelor aprecieri [6.42]:

• banda extinsa din regiunea spectrala (3500-3200) cm-1 din spectrul solutiei de POL se datoreaza vibratiei de intindere a legaturii OH caracteristica solutiilor apoase, dar si alcoolilor, ambele valabile in cazul solutiei investigate;

• in ceea ce priveste spectrul probei de spuma, semnalele inregistrate pana la 3000 cm-1, in special acelea centrate la 2850 cm-1 si 2935 cm-1 sunt specifice vibratiilor de intindere asimetrice/simetrice ale gruparii metil in lanturi alifatice lungi, situatie caracteristica structurii chimice a substantei active din medicamentul supus studiului;

• profilul benzii situate in regiunea spectrala (3600-3200) cm-1 impreuna cu semnalele Raman slabe din intervalul spectral (1650-1450) cm-1

caracterizeaza vibratiile de intindere ale OH. De asemenea, rezultatele obtinute in urma masurarii proprietatilor de imprastiere Raman ale probelor de spuma inregistrate la diferite momente ale timpului de viata al acesteia confirma faptul ca exista o serie de parametri care trebuie luati in considerare pentru studiul interactiei radiatiei laser cu probele de medicament, cum ar fi dimensiunea bulelor de aer, respectiv coeziunea spumei. In conditiile experimentale prezentate, cele mai intense semnale de imprastiere au fost obtinute la doua minute dupa prepararea spumei. Dupa cateva minute, spuma se separa iar intensitatea liniilor vibrationale caracteristice scade dramatic.