Introducere n ciuda unei istorii de peste un veac colanologia (tiina ce studiaz acizii biliari i derivaii acestora) continu s se dezvolte datorit multiplelor aplicaii n biologie i medicin. Acizii biliari conjugai constituie cei mai importani ageni tensioactivi din organism. Ei solubilizeaz componentele insolubile ale bilei (fosfolipide, colesterolul), ajut la digestia i absorbia monogliceridelor, acizilor grai, vitamine liposolubile, controleaz anumite procese intracelulare cum ar fi sinteza colesterolului. Sunt cunoscui peste 150 de compui organici pe baz de acid colanic, menionai n Elsevier Encyclopedia of Organic Chemistry i peste 440 de acizi biliari monocarboxilici cu grupele hidroxil nesubstituite i cu grupele carboxil substituite. Cei mai muli sunt produi de sintez i nu compui naturali. n acest referat sunt prezentai derivaii acizilor biliari (AB) naturali. Vom prezenta modaliti de obinere a unor derivai cu molecul mic i macromoleculari, reacii chimice ale unora dintre ei precum i anumite utilizri ale acestor compui.

I. 1. Structurile chimice i rolul acizilor biliari n organism AB fac parte din clasa steroidelor ce cuprinde produi naturali izoprenoizi cu schelet perhidrociclopentanofenantrenic. Cele patru inele se noteaz cu literele A-D. Condensarea ntre inelele B i C respectiv C i D este trans. Condensarea ntre inelele A i B poate fi trans [seria colestanului (5) numit i serie alo] sau cis [seria coprostanului (5) numit i serie normal] (figura 1).

a

b

Figura 1. Formulele structurale ale colestanului (a) i coprostanului (b)

Acidul colanic (acidul 5 -cholan-24-oic)(figura 2.1) constituie scheletul de baz pentru toi acizii biliari din organism. Acid colic (CA) (acidul 3 ,7 ,12 -trihidroxi-5 -colan-24-oic) (figura 2.2) i acid chenodeoxicolic (CDCA)(acidul 3 ,7 -dihidroxi-5 -colan-24-oic) (figura 2.3) sunt sintetizai n ficat din colesterol prin mai multe trepte de reacii catalizate enzimatic (capitolul). Sunt stocai n vezica biliar sub form de sruri de Na ale acizilor biliari conjugai [glicocolat (75%)(figura 2.5) i taurocolat (25%) (figura 2.6). Conjugarea are rolul de a mri solubilitatea n ap a srurilor acizilor biliari n condiii fiziologice. n momentul ingerrii de alimente, AB coninui n bil (n procent de 67%) sunt eliminai din vezica biliar prin canalele biliare n intestinul subire. Aici formeaz micele mixte cu substane insolubile n ap (lipide, acizi grai, colesterol, medicamente, vitamine liposolubile, etc) ajutnd la solubilizarea i adsorbia lor prin lumenul intestinal.

2

Figura 2. Structura celor mai importani AB simpli i conjugai.

Cea mai mare parte a srurilor acizilor biliari sunt reabsorbii din ileumul terminal (95%) i prin circulaia sistemic (vena port) ajung din nou la ficat. Aici srurile acizilor biliari sunt absorbite de ctre hepatocite pentru a fi recirculate. Doar 5% din cantitatea total de sruri ale AB se pierde prin excreie deci la fiecare ciclu ficatul va sintetiza din nou doar cantitatea pierdut. Aceasta circulaie a srurilor acizilor biliari menine constant nivelul acizilor biliari n organism i poart numele de circulaia enterohepatic (CEH) (figura 3). Se nregistreaz circa 6-15 cicluri ale CEH /zi n organismul uman fiind transportate zilnic circa 10-40 g de sruri ale acizilor biliari conjugai.

Figura 3. Circulaia enterohepatic.

n organismul uman, 90% din srurile ale acizilor biliari conjugai sunt: CA, CDCA, DCA (raport masic de 2/2/1). UDCA i LCA se gsesc n procent de 10%.

3

I.2. Biosinteza acizilor biliari primari, secundari i teriari AB sunt sintetizai din colesterol prin mai multe etape de reacie catalizate enzimatic (schema 1) ce au loc att la nucleul steroidic ct i la catena lateral a acestuia. n prima etap colesterolul este oxidat la 7-hidroxicolesterol de ctre colesterol 7-hidroxilaz. 7-hidroxicolesterolul este apoi convertit la colest-7-hidroxi-4-3-on (intermediarul cheie al sintezei) prin aciunea unei izomeraze i a unei reductaze. Acest derivat oxonesaturat este punctul de plecare n sinteza acizilor colic and chenodeoxicolic. Hidroxilarea la C12 duce la formarea scheletului acidului colic. Acest oxoderivat este apoi redus stereoselectiv pentru a permite obinerea scheletului acidului biliar 5. A doua etap cheie este hidroxilarea la C27 cu formarea acidului C27 (n mitocondrii), proces mediat de hidroxilaza P-450. Urmeaz apoi o scindare oxidativ a catenei laterale ce permite obinerea din acidul C27 a acidului C24. n final AB sunt transformai n derivaii lor conjugai prin amidare cu glicin i taurin, reacie catalizat de aciltransferaz.

Schema 1. Sinteza acizilor biliari primari din colesterol

4

O parte a acizilor biliari primari sunt transformai n colon de ctre o bacterie intestinal (IB) (7-dehidroxilaz) n AB secundari: acidul deoxicolic (DCA)(acidul 3 ,12 -dihidroxi-5 -colan-24-oic), acid litocolic (LCA)(acidul 3 -hidroxi-5 colan-24-oic) i acidul 7-oxo-litocolic (7-oxo-LCA) (schema 2). n final anumite reductaze i oxidaze din cadrul bacteriilor intestinale (IB) mpreun cu anumite enzime hepatice (L) duc la formarea acidului ursodeoxicolic (UDCA)(schema 2) din 7-oxo-LCA. n paralel n ficat are loc formarea acidului litocolic sunt acizi biliari teriari. sulfatului acidului litocolic (schema 2) din LCA sub influena enzimelor hepatice (L). Acizii UDCA i sulfatul

Schema 2. Sinteza AB secundari i teriari din AB primari.

I.3. Micele simple (a) i mixte (b) ale acizilor biliari i derivailor acestora AB prezint amfifilie facial deoarece scheletul rigid steroidic conine grupe polare hidroxil pe faa concav () i grupe hidrofobe metil pe faa convex (). Aceast caracteristic unic a AB determin autoagregarea/agregarea lor n soluii apoase ntr-un

5

mod diferit de agenii tensioactivi clasici. Datorit condensrii nucleelor A i B n poziia cis molecula acidului colic (AC) este curbat (figura 4).

Figura 4. Amfifilia facial a CA

I.3. A.1. Autoagregarea moleculelor AB Autoagregarea moleculelor AB se datoreaz ntr-o prim etap interaciunilor hidrofobe ce se stabilesc ntre feele (micele primare) (figura 5a) urmate n a doua etap de formarea de legturi de hidrogen (micele secundare) (figura 5b). Small este primul care a ncercat modelarea micelelor primare i secundare ale acizilor biliari (figura 5) [1].

a

b

Figura 5. Modelul Small pentru formarea de micele primare (a) i secundare ale acizilor biliari (b).

Concentraiile critice de micelizare (cmc) pentru micelele simple ale srurilor AB dihidroxilici au valori sub 5 mM (datorit hidrofobicitii ridicate) n timp ce cmc-ul pentru AB trihidroxilici au valori cuprinse ntre 10-15 mM (datorit hidrofobicitii sczute). Numrul de agregare (Nagg) pentru micelele primare variaz ntre 2-10 iar pentru cele secundare este cuprins ntre 10-100. Prin adugarea de sare mic-molecular n sistem

6

sunt ecranate interaciunile electrostatice ntre ionii de acelai semn ceea ce duce la creterea valorii Nagg. Valoarea Nagg poate fi mrit i prin scderea pH-ului soluiei. Determinarea numrului de agregare al micelelor pentru AB s-a fcut prin ultracentrifugare i difuzia luminii cvasi-elastic (QLS) [2]. Studiile QLS indic o raz hidrodinamic pentru micelele primare de 10-16 iar pentru cele secundare de aproximativ 100 . Forma micelelor primare este globular iar pentru micelele secundare este de baghet [1]. Micelele srurilor acizilor biliari sunt polidisperse 20 % pentru micelele primare respectiv 50 % pentru micelele secundare [3]. Studiile realizate de Chakrabarty D. i colab. relev prezena de molecule de ap puternic legate de suprafaa micelar a srurilor a AB [4].

I.3. A.2. Autoasocierea derivailor de AB mic-moleculari Proprietatea de autoagregare pentru un ester al CA cu toate cele trei grupe hidroxil transformare n sruri de amoniu [5] a fost studiat cu ajutorul crio-TEM. Imaginile crioTEM (figura 6) indic agregate sferice, mici (ntre 3-5 nm). Dimensiunea micelelor variaz n funcie de lungimea grupelor alchil din gruparea esteric a derivatului de CA. Realizarea unei histograme a densitii agregatelor indic o distribuie gaussian a micelelor. Ocazional, apar i agregate mai mari (15-50 nm), sferice. Se presupune existena de micele secundare formate prin agregarea celor primare similar comportamentului n soluie al CA care de fapt constituie catena de baz a agentului tensioactiv.

Figura 6. Imaginile crio-TEM pentru o soluie apoas 1 g% de n12m7 (stnga) i n16m3 (dreapta) [5].

7

Msurtorile de difuzie a luminii confirm rezultatele oferite de crio-TEM.

I.3. A.3. Autoasocierea polimerilor cu grupe pendante de AB Polimerii cu grad de substituie (GS) mic, solubili n ap, se pot autoasocia n soluii apoase. A fost investigat fenomenul de autoasociere pentru chitosan [6] i dextran (Dex ) [7] cu resturi de CA i DCA. Concentraia critic de agregare (cca) a Dex modificat cu CA sau DCA [7] este de un ordin de mrime mai mare comparativ cu cea a chitosanului modificat cu DCA [6]. Valoarea cca depinde de GS a polizaharidei cu resturile de AB. Agregatele sunt mai compacte n cazul chitosanului modificat cu DCA comparativ cu agregatele Dex modificat cu CA sau DCA. Diferena poate fi atribuit flexibilitii mai mari a catenei Dex dar se poate datora i diferenei dintre condiiile experimentale (diferii fluoroflori). Msurtorile de fluorescen corelate cu cele ale difuziei statice i dinamice a luminii indic formarea de agregate pe ntreg domeniu de concentraii dar dimensiunea i forma agregatelor depind de concentraia polimerului. Pentru concentraii ale polimerului mai mici de valoarea cca i anume la o anumit concentraie critic (ci) moleculele polimerice izolate ncep s se asocieze prin interaciuni hidrofobe. Se formeaz agregate largi (diametru ~150-200 nm) constituite din 10-20 catene polimerice conectate prin interaciuni intermoleculare (figura 7) .

Figura 7. Histograma diametrelor hidrodinamice obinute din studii de difuzie dinamice a luminii pentru (a) Dex-CA (GS=4.0%) la 0.025 g% (alb) i 0.5 g% (gri); (b) Dex-DCA (GS=3.6%) la 0.025 g% (alb) i 0.25 g% (gri).

8

Agregatele sunt dispersate i umflate cu ap, care este un bun solvent pentru ele (al doilea coeficient virial este pozitiv). Polaritatea mediului n interiorul agregatelor este mai mic dect cea a apei. Pentru concentraii ale polimerului mai mari de valoarea cca crete compactitatea microdomeniilor hidrofobe (figura 8). Astfel peste o anumit valoare a concentraiei (concentraie critic de tranziie notat ct) are loc o tranziie a catenelor polimerice de la o form extins la o form compact. Tranziia este nsoit de schimbarea calitii solventului (al doilea coeficient virial devine negativ) i de ruperea parial a asociaiilor intermoleculare. Se formeaz agregate cu un diametru mic (20 nm), compacte (formate din 2-3 catene polimerice) cu un numr ridicat de legturi intra i inter-moleculare i o vscozitate local ridicat.

Figura 8. Histograma diametrelor hidrodinamice obinute din studii de difuzie dinamice a luminii pentru (a) Dex-CA (GS=4.0%) la 0.1 g% ; (b) Dex-DCA (GS=3.6%) la 0.1g%

Tranziia de la agregate mari la cele mici odat cu creterea concentraiei n soluie a polizaharidei se poate explica prin: Nagg al micelelor AB, masa molecular i GS mici pentru polimerii modificai [7]. Conjugatele heparin-DCA (conjugate HD) [8] precum i cele rezultate prin legarea covalent a DCA la glicolchitosan (conjugate GCD) [9] au capacitatea de a se autoasocia n soluii apoase Fenomenul de autoagregare a conjugatelor HD n soluie apoas a fost investigat cu ajutorul 1H-RMN, difuzia luminii dinamic, potenialul zeta, TEM, spectroscopie de fluorescen iar pentru conjugatele GCD au fost folosite difuzia luminii dinamic, TEM, spectroscopie de fluorescen.

9

Autoasamblarea conjugatelor HD/GCD este produs de o simpl expunere la ultrasunete a soluiei apoase a acestora respectiv a unei soluii de tampon fosfat (PBS). Diametrul agregatelor este reproductibil i nu variaz odat odat cu timpul de expunere la ultrasunete (1-30 min). Creterea GS al conjugatelor HD/GCD scade diametrul agregatelor de la 200 la 120 nm respectiv de la 450nm la 245nm. Interaciunile dintre agregate sunt neglijabile deoarece creterea concentraiei conjugatelor nu modific dimensiunile autoagregatelor. Factorii de polidispersitate sunt mici (0.005-0.043) deci distribuia dimensiunilor nanoparticulelor este ngust [10]. Determinrile potenialului zeta indic o ncrcare negativ a suprafeelor conjugatelor HD (-56 mV) deci la suprafaa autoagregatelor se afl molecule de heparin. ncrcarea negativ a suprafeelor autoagregatelor determin o mare stabilitate a acestora n soluie apoas. Msurtorile TEM indic o form sferic pentru conjugatele HD/GCD iar dimensiunile acestora coincid cu cele determinate prin studiile de difuzie a luminii dinamic (figura 9)

Figura 9. Forma sferic a conjugatelor HD/GCD din msurtorile TEM pentru un raport molar H/DCA-NH2=0.049 (stnga) respectiv DCA/GC=0.058 (dreapta).

Cu ajutorul studiilor de fluorescen (piren-Py-prob fluoroflor) a fost determinat valorea cca (concentraia critic de agregare) precum i constanta de partiie Kv a moleculelor de Py ntre autoagregate i ap. Valorile cca se obin din punctele de inflexiune ale curbei variaiei intensitii de excitaie a Py n funcie de concentraia conjugatelor HD/GCD. Valorile cca variaz pentru agregatele HD/GCD ntre 0.02-0.003 mg/ml respectiv 0.038-0.26mg/ml pentru conjugatele GCD. Valorile relativ mari ale cca ale conjugatelor GCD se datoreaz maselor moleculare mari precum i rigiditii mai mari a catenei polimerice. Valorile cca scad cu creterea GS a conjugatelor cu grupele hidrofobe (DCA)(figura 10). 10

Figura 10. Raportul intensitilor de excitaie ale Py (I333/I328) n funcie de cconjugate HD pentru diferite GS ale conjugatelor HD6 (O), HD8 (), HD10 ().

Valorile Kv cresc cu creterea GS al conjugatelor HD/GCD iar valorile acestora indic o hidrofobicitate redus pentru miezul autoagregatelor HD/GCD. Cauza o constituie flexibilitatea limitat a catenelor de DCA precum i mpiedicrilor sterice datorate heparinei respectiv glicolchitosanului.. Studiile de inhibare a fluorescenei (inhibitorul utilizat este clorura de cetilpiridiniumCPC) permite aflarea Nagg al DCA per microdomeniu hidrofob pentru ambele tipuri de nanoparticule. Astfel Nagg pentru conjugatele HD/GCD variaz ntre 32-88 respectiv 12118. Numrul de catene ale heparinei/glicolchitosanului din fiecare microdomeniu hidrofob variaz ntre 5-9 respectiv 2.3-3.9. Ambele tipuri de nanoparticule conin n interiorul lor mai multe miezuri hidrofobe cu o structur asemntoare biopolimerilor modificai hidrofob cu acizi grai i AB [11-13]. Nanoparticulele de GCD pot fi utilizate drept ageni de eliberare a unor substane hidrofobe (medicamente) deoarece miezul hidrofob al conjugatelor permite solubilizarea acestora. n aceast idee s-a studiat stabilitatea autoagregatelor n condiii fiziologice (pH=7.4 i trie ionic = 0.15). Stabilitatea conjugatelor depinde de GS al acestora (figura 11) i crete cu creterea acestuia. Astfel pentru autoagregatele GCD cu un raport molar DCA/GC = 0.23 (GCD30) stabilitatea nanoparticulelor se menine timp de 10 zile n timp ce pentru celelate conjugate GCD 6, 12, 22 (rapoarte molare DCA/GC = 0.015, 0.058, 0.115) stabilitatea este mai mic.

11

Figura 11. Schimbrile n diametru ale nanoparticulelor GCD (1 mg/mL) n timp la 36 C n soluie PBS: (O) GCD6, () GCD12, () GCD22, () GCD30.

Conjugatele insulinei (Ins) cu esteri ai DCA (sucinimidodeoxicolat respectiv sucinimidobisdeoxicolat-L-lisin)(conjugate notate Ins-DCA respectiv Ins-bisDCA) [14] au proprietatea de a se autoagrega n soluii apoase. Cu ajutorul studiilor de difuzie a luminii dinamice putem afla dimetrul autoagregatelor (figura 12). Acesta variaz ntre 130-240 nm pentru Ins-DCA i Ins-bisDCA n timp ce pentru insulina nativ dimensiunea este neglijabil. Fenomenul de autoagregare este reversibil i scade la diluie. Dimensiunea autoagregatelor crete odat cu creterea numrului de resturi ale DCA. Autoagregarea reduce activitatea biologic a insulinei. La diluie agregatele disociaz i activitatea biologic reapare.

Figura 12. Profilul distribuiei dimensiunilor pentru insulin i conjugatele acesteia determinate prin studii de difuzie a luminii dinamice insulin (), Ins-DCA (O), Ins-bisDCA ().

In-Sook Kim i colab. au dovedit cu ajutorul studiilor de fluorescen autoasocierea n ap a nanoparticulelor polimerice constituite din diamino-polietilenglicolul (ATPEG)

12

avnd drept grupe terminale CA i acidul lactobionic (LA) legate de PEG prin intermediul grupelor aminice [15]. Creterea intensitii emisiei de fluorescen cu creterea concentraiei de LAATDEG-CA indic formarea de autoasociate polimerice (figura 13).

Figura 13. Spectrele emisiei de fluorescen n funcie de lungimea de und pentru diferite concentraii ale LA-ATDEG-CA.

Din punctul de inflexiune al curbelor intensitii de fluorescen n funcie de concentraia polimerului (Py prob fluoroflor extrinsec) se determin valoarea cmc pentru nanoparticule (0.05g/l) (figura 14).

Figura 14.Raportul intensitilor de excitaie ale Py n funcie de logaritmul concentraiei de nanoparticule polimerice

Imaginile TEM indic formarea de nanoparticule sferice cu dimetrul variind ntre 1030 nm (figura 15).

13

Figura 15. Imagini TEM pentru conjugatele polimerice LA-ATDEG-CA.

Chulhee Kim i colab. au caracterizat un polimer amfifil avnd polietilenoxidul (PEO) drept parte hidrofil i DCA drept parte hidrofob (PEO-DCA) [16]. Spectrele 1H-RMN conin pickuri largi corespunztoare protonilor DCA ceea ce indic micarea limitat a unitilor DCA din copolimer datorit formrii de autoasociate PEODCA avnd un miez hidrofob (unitile DCA) i un nveli hidrofil (unitile PEO). Folosind Py drept prob fluoroflor s-au putut afla valorile cmc (din punctul de inflexiune al curbelor raportului intensitilor de emisie ale Py n funcie de concentraia polimerului) pentru cei doi copolimeri (PEO1000-DCA respectiv PEO5000-DCA). La 250C valorile cmc sunt 43/36 mg/l pentru PEO1000-DCA/ PEO5000-DCA (figura 16). Valorile cmc cresc cu creterea temperaturii datorit creterii solubilitii unitilor de DCA din polimer .

Figura 16.Raportului intensitilor spectrului de excitaie ale Py n funcie de logaritmul concentraiei copolimerului.

Studiile de difuzie a luminii dinamice indic diametre ale particulelor polimerice PEO1000-DCA/PEO5000-DCA de 120/180 nm. Micelele individuale se asociaz formnd agregate mari cu mai multe miezuri hidrofobe. Procesul de asociere al micelelor este favorizat de lungimea mic a unitilor PEO ce constituie partea hidrofil a micelelor [17]. Factorul de polidispersitate este relativ mic (0.07-0.12) ceea ce indic o 14

distribuie ngust a agregatelor. Imaginile TEM arat o form sferic pentru agregate (figura 17).

Figura 17. Imaginile TEM pentru agregatele DCA1000-PEO.

Din constanta de echilibru Kv de partiiea probei fluoroflore (Py) ntre cele dou faze (micele i ap) rezult o hidrofobicitate mai mare a miezului micelelor pentru PEO5000-DCA comparativ cu PEO1000-DCA. Valoarea Kv scade cu creterea temperaturii datorit scderii hidrofobicitii segmentelor DCA. I.3. B. Micelele mixte ale AB Micelele srurilor AB solubilizeaz substane practic insolubile n ap (colesterol, lecitina, monogliceridele, etc) prin formarea cu acestea de micele mixte. Astfel, aceste substane pot fi adsorbite prin lumenul intestinal n form solubilizat. Capacitile de solubilizare sunt mai mari pentru srurile AB hidrofobi comparativ cu cei mai hidrofili. Solubilitatea soluiei apoase a colesterolului (1nM) crete de o milion de ori n prezena micelelor srurilor de AB [18]. Prin adugarea de lecitin n sistemul apos colesterol-sruri ale AB solubilitatea colesterolului crete i mai mult (figura 18).

Figura 18. Aranjamentul molecular al micelelor mixte sruri ale ABlecitincolesterol n seciune longitudinal (a) i transversal (b).

I.4. Structura cristalin a acizi biliari i derivailor acestora

15

Fiecare molecul de AB are o arhitectur spaial chiral (figura 19).

Figura 19. Chiralitatea moleculei de CA.

Structurile AB i derivaii acestora sunt chirale datorit asimetriei pe trei direcii diferite (figura 20a). n urma procesului de asociere se formeaz (n stare solid) cristale de incluziune caracteristice. Moleculele cu chiralitate nalt cum sunt cele ale acizilor biliari se asociaz pentru a forma ansambluri sub form de benzi helicoidale orientate spaial (figura 20b). Acestea la rndul lor se pot asocia n diferite feluri pentru a forma ansambluri de benzi helicoidale (figura 20c). Acestea prin legturi de hidrogen permit formarea de structuri arhitecturale dublu strat tridimensionale (figura 20d)[19].

a

b

c

d

Figura 20. Reprezentarea schematic a structurii cristalelor de incluziune ale acizilor biliari i derivailor acestora (a) molecula chiral a CA, (b) o band chiral helicoidal, (c) un asamblu bidimensional de benzi helicoidale, (d) un asamblu tridimensional de benzi helicoidale.

Prin asocierea moleculelor de AB, n interiorul cristalelor, apar multe canale ce permit includerea de diveri compui chimici (figura 21) [20].

16

Figura 21. mpachetarea a dou molecule de NaCA n stare solid.

II. Derivai ai acizilor biliari cu molecul mic II.1. Derivai ai acizilor biliari cu grupe esterice O serie de esteri alchilici ai CA (figura 22) [5] avnd grupe alchil de 8, 10, 12 atomi de C au fost sintetizate lucrndu-se n prezena acidul p-toluensulfonic (PTSA) drept catalizator. Amestecul de reacie este supus agitrii timp de 12h la 800C.

Figura 22. Structurile generale ale esteri alchilici ai CA.

Studiile TEM, realizate n octan indic o structur fibroas a gelurilor. Fibrele au un diametru de 10-12 nm i doar ocazional se asociaz n fascicule (figura 23).

Figura 23. Imagine TEM pentru o soluie 10 mM n octan pentru esterul cu n=10.

Studiile DSC indic tranziii pre-topire datorit parialei topiri a reelei gelului. Interacia dintre fibre se pierde nainte ca acestea s se dezintegreze. p.t poate fi aflat din termograma DSC a gelului (figura 24) i corespunde pickului de tranziie cel mai abrupt.

17

Figura 24. Termograma DSC pentru o soluie 15 mM al esterului cu n=10, n octan, cu o rat de nclzire de 0.3 C/min.

Un nou derivat al CA [5] este realizat prin ataarea a trei grupe ionice trimetilamoniocarboxilat la cele trei grupe hidroxil ale nucleului steroidic prin intermediul unui spaiator mic. Iniial are loc esterificarea grupei carboxil a CA cu o grup alchil lung astfel nct n final se obine un agent tensioactiv triplet (are trei grupri hidrofile). Sinteza are loc n trei etape (schema 3), prima etap constnd n esterificarea grupei carboxil cu alcoolul corespunztor n C6H6 prin agitare timp de 24 h la 900 C (a). Catalizatorul utilizat este PTSA. n a doua etap spaiatori mici sunt ataate la cele trei grupe hidroxil folosindu-se clorura acid a acidului carboxilic corespunztor -bromurat. S-a lucrat ntr-un amestec de C6H6 i piridin utilizndu-se drept catalizator DMAP. Reacia are loc la t.c. prin agitare timp de 45 min (b). n a treia etap atomii de brom sunt substituii de ctre trimetilamin pentru a forma grupe de tip trimetilamoniu. Reacia are loc n etanol la 1000C prin agitare timp de 24h (c).

Schema 3. Sinteza n trei etape a agentului tensioactiv triplet bazat pe CA.

18

Pentru a se verifica structura i puritatea compuilor obinui se utilizeaz msurtori IR, RMN i spectrometrie de mas. Compuii finali sunt solizi, de culoare alb i foarte higroscopici. Zhu X. X. i colab. au sintetizat noi derivai pe baz de CA cu multiple grupe metacrilat prin reacii de acilare (figura 25) [21]. Reaciile de acilare s-au fcut la grupele hidroxil ale nucleului stroidic iar drept ageni de acilare s-au utilizat: metacriloil (MAC) i anhidrida metacrilic. CA (produsul 1) nu reacioneaz cu agenii de acilare ca atare ci n forma sa esteric. Gruparea carboxil a CA a fost esterificat fie cu metanol (n mediu acid, la reflux)(esterul este notat CAME)(produsul 2) fie cu etilenglicol (EG)(n mediu acid la 800C) (esterul este notat CAEG) (produsul 3). Au fost preferate formele esterice deoarece solubilitatea acidului colic ca atare este sczut. CAME este acilat cu clorura de metacriloil (A) iar CAEG este acilat cu anhidrida metacrilic (B). Rapoartele molare dintre cei doi reactani sunt diferite 1/1.5, 1/5, 1/7.5 (produii 4, 5, 6) n cazul (A) respectiv 1/1.5, 1/2, 1/4, 1/8 (produii 7, 8, 9, 10) pentru cazul (B). Separat CAME este aminat cu dietilenamin iar aminamida (produsul 11) rezultat reacioneaz cu MAC (raport molar 11/MAC=1/8). clorura de

19

Figura 25. Sinteza, structurile chimice i condiiile de reacie pentru obinerea derivailor metacrilici ai CA. (a) MeOH/H+, re-flux; (b) MAC/Et3N/CHCl3, MAC/CAME = 1.5:1; (c) MAC/Et3N/CHCl3, MAC/CAME = 5:1; (d) MAC/Et3N/CHCl3, MAC/CAME = 7.5:1; (e) EG/H+; (f) anhidrid metacrilic /DMAP/Et3N/THF, anhidrid metacrilic /CAEG = 1.5:1; (g )MAC/Et3N/DCM, MAC/CAEG = 2:1; (h) MAC/Et3N/THF, MAC/CAEG = 4:1; (i) MAC/Et3N/CHCl3, MAC/CAEG = 8:1; (j) etilendiamin, (k) MAC/Et3N/CHCl3 (MAC/11 = 8 :1).

20

Reactivitatea cea mai mare dintre cele trei grupe hidroxil o prezint ntotdeauna , indiferent de condiiile de reacie, gruparea hidroxil de la C3 datorit poziiei sale ecuatoriale. n funcie de condiiile de reacie, reactivitatea ntre grupele hidroxil ale C 12 i C7 variaz. C12-OH fiind n vecintatea gruprii 21-CH3 este mai mpiedicat steric i ar trebui s aib o reactivitate mai mic comparativ cu C7 -OH. Sattar i Blickenstaff, pentru acilri cu anhidrid acetic, indic urmtoarea ordine a reactivitii hidroxililor steroidici: C3-OH > C12-OH > C7-OH [22,23]. Sellergren i al. indic pentru acilri cu acidul metacrilic (4-DMAP-catalizatorul i DCC-agent de cuplare) o ordine invers a reactivitii pentru hidroxilii steroidici C7-OH > C12-OH [24]. Reactivitatea grupelor hidroxil ale nucleului steroidic n reaciile de acilare (figura 23) scade n ordinea: C3-OH > C12-OH > C7-OH. Derivaii acrilici ai CA se obin prin reacii similare cu cei metacrilici. II.2. Derivai ai acizilor biliari cu grupe ureice Compui bazai pe CA [5] avnd grupe ureice (figura 26) au fost sintetizai din clorhidratul 24-aminocolat-3, 7, 12-triol n mediu bazic (KOH) cu alchilizocianatul corespunztor n CH2Cl2 prin agitare timp de 24h la temperatura camerei (t.c.).

Figura 26. Structurile generale ale compuilor bazai pe CA cu grupe ureice.

II.3. Derivai ai acizilor biliari cu grupe amidice Blagbrough I. S. i colab. au sintetizat conjugate ale unor AB (CDCA, UDCA i DCA) cu amine naturale liniare (spermina) n ncercarea de a produce policationi (pH fiziologic) care s determine condensarea ADN-ului prin legarea de grupele fosfat anionice ale acestuia [25]. Spermina este o tetraamin natural liniar ce se gsete n majoritatea celulelor vii avnd un rol important n meninerea structurii 3D a ADN-ului prin condensarea acestuia n urma interaciilor poliamin-ADN (interacii reversibile la pH=7.4) [26,27]. n prima etap de reacie o grupare aminic primar a sperminei este protejat folosind etiltrifluoroacetatul-TFA (MeOH, 00C) urmat de reacia celorlate grupe aminice rmase

21

cu di-terbutildicarbonat [(Boc)2O] iar n final are loc deprotejarea grupei aminice (NH3, pH=11) cu obinerea N1,N2,N3-tri-Boc-sperminei:

Schema 4. Obinerea N1,N2,N3-tri-Boc-sperminei

n a doua etap are loc reacia dintre AB i spermidina tersubstituit (DCC, 1-hidroxibenzotriazol-HOBt)(figura 26):

Schema 5. Reacia dintre AB i spermidina tersubstituit

n ultima etap de reacie are loc deprotejarea grupelor aminice (CH 2Cl2, TFA) cu obinerea produsului final (figura 27):

Figura 27. Structura general a conjugatelor AB cu spermina

Deepak B. Salunke i colab. au sintetizat alcoolamide chirale ale AB (schema 3) [28].

22

Schema 6. Sinteza alcoolamidelor chirale ale AB

Condiiile de reacie i reactanii folosii sunt: a) N- hidroxisuccinimida, DCC, THF-CH3CN, 250C, 18 h; b) (1R, 2R)-1-fenil-2-amino-1, 3-propandiol, DMF, 250C, 1.5 h sau (1R, 2R)-1-para-nitrofenil-2-amino-1, 3-propandiol, DMF, 250C, 1.5 h ; c) (1S, 2S)-1-fenil-2-amino-1, 3-propandiol, DMF, 250C, 1.5 h sau (1S, 2S)-1-para-nitrofenil-2-amino-1, 3-propandiol, DMF, 250C, 1.5 h. Hendra Willemen [5] a realizat sinteze de esteri ai N-colilalchilaminoacizilor (figura 28) prin cuplarea acidului colic cu esteri ai -aminoacizilor n DMF utiliznd drept agent de cuplare cianura de dietilfosforil (DEPC) dup o metod de lucru descris n literatur [29]. Studiile de 1H-RMN, cromatografia n strat subire (CSS) i analiza elemental confirm structurile i puritatea structurilor (tabelul 1).

Figura 28. Structura general a esterilor N-colil alchilaminoacizilor

23

Tabelul 1. Structurile esterilor N-colil alchilaminoacizilor.

Studiile de SEM realizate n benzen pentru gelul cu R1=benzil i R2=Me indic existena de fibre cu diametrul de 50 nm i o lungime de civa m (figura 29). Ocazional, unele din fibre se gsesc sub form de fascicule paralele ntre ele. Structuri de form elicoidal nu au fost semnalate.

Figura 29. Imagine SEM pentru o soluie 25 mM gel (R1=benzil i R2=Me) n benzen.

Termogramele obinute prin DSC (figura 30) indic existena a una sau dou tranziii pre-topire ceea ce indic o parial topire a reelei organogelatorilor cu R1=benzil i R2=Me respectiv cu R1=p-metoxibenzil i R2=Me dup nclzire. Ansamblul de fibre este distrus n urma nclzirii nainte de completa dezintegrare a fibrelor individuale.

Figura 30. Curbele de nclzire pentru soluii 25 mM n benzen ale gelurile compuilor (R1=benzil i R2=Me) (sus) respectiv (R1=p-metoxibenzil i R2=Me) (jos)(rata de nclzire este 0.5 C/min).

24

S-au sintetizat [5] esteri ai N-chenodeoxicolil, N-deoxicolil, N-litocolil alchilaminoacizilor (figura 31) dup o metod de lucru descris n literatur [29].

Figura 31. Structurile esterilor N-chenodeoxicolil, N-deoxicolil, N-litocolil alchilaminoacizilor.

Au fost sintetizate [5] diferite alchilcolamide (produii a1-a6) (figura 32) dup o metod de lucru descris n literatur [29]. Compuii b1-b3 au fost sintetizai prin cuplarea CA cu clorhidratul aminei corespunztoare.

a1-a6

b1-b3

Figura 32. Structurile derivailor alchil ai colamidelor.

Studiile TEM (figura 33) indic o structur fibroas a gelurilor, fibrele nefiind asociate ntre ele i avnd diametre mici (5-6 nm). Unitile steroidice sunt localizate n centrul fibrelor i conectate prin legturi de hidrogen iar grupele alchil sunt orientate spre solvent.

Figura 33. Imagini obinute prin TEM pentru o soluie 25 mM a3 n benzen.

25

II.4. Derivai ai acizilor biliari cu grupe aminice John F. Barry i colab. au sintetizat 3-aliloxicarbonilamino, 12terbutoxicarbonilaminocolat de metil [30]. Compusul obinut, avnd la C3 i C12 grupe reactive protejate (de tip amino), poate fi utilizat mai departe n chimia combinatorial pentru sinteza de game largi de polipeptide. Se pleac de la esterului 12-oxim-metilic al CA, n schema 4 sunt prezentate att succesiunea reaciilor ct i reactanii folosii:

i, H2N-OH.HCl, NaOAc, MeOH, reflux, 6 h; ii, H2, PtO2 (~1 mol%), AcOH, 7 zile; iii, Zn, AcOH, 3 h; iv, (Boc)20, THF, aq. KOH; v, Ph3P, DEAD, MeSO3H, THF-toluen (2:7), 40 C; vi, NaN3, THF-DMPU (1:3), 45 C, 24 h; vii, H2, Pd/C, EtOAc-MeOH (1:2), 2 h; viii, alil cloroformiat, i-Pr2NEt, CH2Cl2, NaHCO3 aq. Schema 7. Succesiunea de reacii precum i reactanii folosii pentru sinteza 3-aliloxicarbonilamino, 12-terbutoxicarbonilamino colat de metil.

II.5. Analogi al cosalanului Arunachalam Kannan i colab. au sintetizat un analog al cosalanului (activitate antiHIV) folosind CA [31]. Structura cosalanului conine dou resturi de acid salicilic clorurate legate printr-un spaiator alchenic de un nucleu steroidic (figura 34).

Figura 34. Structura cosalanului.

26

Analogul cosalanului conine n locul gruprii steroidice acidul colic. Succesiunea i condiiile de reacie folosite pentru obinerea analogului de cosalan plecnd de la CA sunt prezentate n schema 8.

Schema 8 . (a) Ac2O, Py, DMAP, CH2Cl2; (b) (i) Et3N, ClCOOEt, (ii) NaBH4, H2O; (c) reactiv Dess-Martin, CH2Cl2; (d) TiCl4.2 THF, Zn, benzofenon; (e) KOH, MeOH, , 24h; (f) BBr3. (CH3)2S, ClCH2CH2Cl, 700C, 40h.

Reacia de hidroliz a legturilor eterice (f) se realizeaz la temperatur n prezena unui acid Lewis ntr-un timp ndelungat cu randamente mici de aceea s-a ncercat o alt cale de reacie n care grupele fenolice s nu mai fie protejate prin eterificare cu grupri metal ci prin esterificare cu grupe acetil (schema 9).

27

Schema 9. (a) aq. CH2O, H2SO4, MeOH, H2O, ; (b) TMSCHN2, MeOH, benzen; (c) Ac2O, Py, DMAP, CH2Cl2; (d)CrO3, Ac2O; (e) TiCl4. 2THF, Zn, produsul reaciei c din schema 5, THF, ; (f) KOH, MeOH, , 24h;

II.6. Umbrele moleculare bazate pe AB n anii 90 apare un nou concept chimic, acela de umbrel molecular. Umbrelele moleculare sunt acei compui chimici constituii dintr-un schelet de baz pe care sunt ataai chimic doi sau mai muli produi (pereii umbrelei) iar central se afl un compus chimic (agentul central) care n funcie de caracterul su i al mediului nconjurtor (hidrofil/hidrofob) poate fi ecranat sau nu de exterior. Dac agentul central are caracter hidrofob/hidrofil, imersia umbrelei n ap/solveni organici nepolari determin o ecranare pentru agentul central (figura 35). Vor fi favorizate interaciile hidrofobe/hidrofile intramoleculare iar pereii exteriori ai umbrelei vor fi solvatai. Dac agentul central are un caracter hidrofob/hidrofil imersia acestuia ntr-un solvent hidrocarbonat/ap va determina o expunere total la mediu nconjurtor (figura 35). Pot apare fenomene de solvatare a agentului central precum i diverse interacii intra i intermoleculare ale acestuia. Exist i o configuraie intermediar pentru agentul central, atunci cnd acesta este situat perpendicular pe planul pereilor umbrelei (figura 35).

28

Pentru a juca rol de perete al umbrelei un compus chimic trebuie s aib caracter amfifil. AB, posednd o amfifilie facial, ndeplinesc aceast condiie.

Figura 35. Configuraiile agentului central n funcie de natura sa i a mediului nconjurtor

Printre primele umbrele moleculare sintetizate sunt cele ce au drept schelet de baz spermidina, CA constituie pereii umbrelei iar agentul central este un derivat a unei substane fluoroflore (dansilglicina)(dansil=5-dimetilamino-1-naftalensulfonil). Au fost sintetizate dou umbrele moleculare cu doi respectiv un singur perete steroidic [32]. Reacia a doi moli de ester N-hidroxisuccinimidei CA cu spermidina (etapa I) i apoi cu dansilglicina (DCC-agent de cuplare)(etapa a II-a) permite sinteza unei umbrele cu doi perei de CA (schema 10).

Schema 10. Succesiunea de reacii pentru obinerea umbrelei cu doi perei de CA

Din esterul N-hidroxisuccinimidei CA cu monodansilcadaverina (DCC) se sintetizeaz o umbrel cu un singur perete steroidic (schema 11).

29

Schema 11. Structura umbrelei cu un singur perete molecular

Pentru a avea o umbrel funcional este nevoie de cel puin doi perei ai acesteia, altfel agentul central nu poate fi ecranat ntr-un mediu nefavorabil.

II.7. Structuri de tip sandwich bazate pe AB CA i DCA au o structur rigid cu grupele C3-OH i C12-OH paralele i la distane mici (6-6.5 A0). De cele dou grupe hidroxil se pot ataa chimic compui aromatici (ex piren) rezultnd structuri ce pot ncorpora la rndul lor, drept oaspei, ali compui organici prin interaciuni de tip - (figura 36) [33]. Rezult structuri stabile de tip sandwich. Prin funcionalizarea potrivit i a grupei C7-OH (CA) gradul de reinere al compuilor aromatici n interior este mrit.

Figura 36. Structura compuilor de tip clete.

Pentru a sintetiza un astfel de compus esterul metilic al AB este tratat cu clorura acid a acidului piren-1-carboxilic dup o reacie Oppenauer (CaH2, toluen, reflux) (schema 12). n funcie de raportul molar ester de AB/clorura acid se pot ataa una sau dou grupe pirenil n structur.

30

Schema 12. Succesiunea de reacii pentru obinerea diesterului dipirenilic

Compuii aromatici oaspete ce au fost ncorporai n structurile cu grupe pirenil pe schelet de acid 7-ceto-DCA sunt derivai ai benzenului, naftalinei sau 9-ceto-fluorenului 31

(figura 37)

Figura 37. Formulele structurale pentru moleculele oaspete

Analiza cu raze X a structurii cristaline pentru compuii cu grupe pirenil indic o structuri supramoleculare cu nucleele aromatice ale Py orientate paralel (figura 38).

Figura 38. Structura cristalin a compuilor cu grupe pirenil rezultat din analiza de raze X (sunt numerotai atomii de C).

Compuii de mai sus pot fi ataai de o suprafa polimeric (figura 39). Astfel, acidul 7- ceto-deoxicolic avnd grupe pirenil ataate la hidroxilii de pe C3 i C12 sub forma srii de Cs (Cs2CO3, THF) poate reaciona cu clorometil- polistirenul reticulat (DMF, 90 0C, 24h).

Figura 39. Compusul de tip clete ataat pe suprafaa polimeric.

32

II.8. Conjugate ale complecilor Gd (III)-compui poliaminocarboxilici cu AB Pier Lucio Anelli i colab. au sintetizat compleci ai Gd (III) cu liganzi poliaminopolicarboxilici care sunt ataai covalent de AB (CA, GCA i TCA) [34]. S-au sintetizat trei generaii de conjugate. Complexul cu Gd (III) poate fi legat covalent de gruparea C24-COOH a nucleului steroidic (prima generaie de conjugate), de C3 a nucleului steroidic (a doua generaie de conjugate) respectiv de atomul de N din poziia a lisinei funcionalizat (a treia generaie de conjugate). Prima generaie de conjugate (figura 40) cuprinde compleci ai Gd (III) fie cu acidul dietilentriaminopentaacetic (DTPA)( figura 40a) fie cu monoamide ale DTPA (figura 40b). Acetia sunt legai printr-o legtur amidic de C24 al CA.

a

b

Figura 40. Formulele structurale ale primei generaii de conjugate

Generaia a doua de conjugate este constituit compleci Gd (III)-monoamide ale DTPA legate de C3 al nucleului steroidic al AB (CA, GCA, TCA) (figura 41).

33

Figura 41. Formulele structurale pentru a doua generaie de conjugate

A treia generaie de conjugate este constituit din CA legat prin gruparea carboxil C24 a nucleului steroidic de compleci ai Gd (III) cu lisin funcionalizat cu DTPA (figura 42). Lisina este ataat de gruparea carboxilic a CA prin atomul de N din poziia .

Figura 42. Formulele structurale pentru a treia generaie de conjugate

34

III. Dimeri ai AB legai prin puni III.1. Dimeri ai AB legai prin puni amidice ntre nucleele A-A. Kohmoto i colab. au sintetizat un dimer al CA rezultat n urma reaciei de condensare dintre dianhidrida acidului naftalen-1,4,5,8-tetracarboxilic cu derivai ai 3 aminocolanoatului [35]. Analiza conformaional a dimerului realizat cu ajutorul studiilor de 1H-RMN la temperaturi variabile indic existena a dou conformaii stabile (la 213 K) datorit flexibilitii catenei dimerului (figura 43).

Figura 43. Cele dou conformaii ale produsului de condensare dintre CA i dianhidrida acidului naftalen-1,4,5,8-tetracarboxilic

Aceste dimeri ai CA pot gzdui diverse molecule organice [2,6bis(hidroximetil)naftalen]. Molecula oaspete se leag paralel cu gruparea diimidic a dimerului, legturile de H dintre grupele hidroxil ale celor doi compui permind formarea complexului de tip sandwich (figura 44).

Figura 44.Complexul de tip sandwich bazat pe dimeri ai CA cu derivatul de naftalin.

35

III.2. Dimeri ai AB legai prin puni esterice i eterice ntre nucleele A-A. X.X. Zhu i colab. au sintetizat 3 i 3 dimeri ai AB legnd grupele C3-OH al nucleului steroidic cu spaiatori prin intermediul legturilor esterice i eterice [36]. 3-dimeri ai LCA i CA au fost sintetizai prin intermediul legturilor esterice dintre 3C-OH i acizi dicarboxilici cu diferite lungimi (acidul sebacic i acidul suberic)(schema 13). Sinteza are loc n trei etape. n prima etap se obine esterul metilic al AB (MeOH, HCl); n a doua etap are loc cuplarea a dou molecule de AB prin intermediul legturilor esterice (clorura de sebacil /clorura de suberil, DCM, Et3N); n a treia etap are loc hidroliza regioselectiv n condiii blnde a esterului dimetilic al dimerului (LiOH, THF).

Schema 13. Succesiunea de reacii pentru obinerea 3-dimerilor LCA i CA.

A fost sintetizat un 3-dimer al LCA prin legarea grupelor 3C-OH ale LCA cu dietilenglicol (DEG) prin intermediul legturilor eterice. 36

Sunt cinci etape ale sintezei (schema 14). n prima etap LCA este esterificat cu MeOH (HCl). n a doua etap gruparea 3C-OH este eterificat cu clorur de p-tosil (Py). n a treia etap are loc substituia grupei tosil cu DEG (THF, ). Mecanismul reaciei este de tip SN2 de aceea are loc o izomerizare la 3C obinndu-se izomerul 3. n a patra etap are loc obinerea dimerului AB (clorura de mezil, Py, ) iar n ultima etap are loc hidroliza grupelor esterice de la 24-COOH (NaOH, THF, ).

Schema 14. Succesiunea de reacii pentru obinerea 3-dimerului LCA.

III.3. Dimeri ai AB legai prin puni diaminice/triaminice ntre nucleele D-D. Salunke D. i colab. au sintetizat dimeri ai CA i DCA legai prin puni etilendiaminice respectiv etilentriamin (schema 15) [37]. 37

Schema 15 . Condiiile i reactanii necesari pentru sinteza dimerilor CA i DCA a) etilendiamin, DMF, 250C, 1.5 h; b) dietilentriamin, DMF, 250C, 1.5 h.

Burrows i Sauter au sintetizat dimeri ai CA n care unitile steroidice sunt unite prin puni m-fenilen diaminice substituite la atomul de N (schema rigid ntre grupele intramoleculare. 13)[38]. Compusul rezultat are o conformaie hidroxil existnd legturi de hidrogen

Schema 16. Succesiunea de reacii pentru sinteza dimerului CA coninnd puni mfenilen diaminice.

38

III.4. Dimeri ai AB legai prin puni amidice ntre nucleele D-D. Au fost sintetizai dimeri ai CA n care unitile de AB sunt unite prin intermediul grupelor amidice printr-un spaiator liniar sau ciclic [5]. Sinteza s-a realizat n DMF utiliznd drept agent de cuplare cianura de dietilfosforil (DEPC) dup o metod de lucru descris n literatur [29] (figura 45).

Figura 45. Formulele structurale ale dimerilor AB legai prin puni amidice ntre nucleele D-D.

III.5. Dimeri ai AB legai prin puni esterice ntre nucleele D-A. Li i Dias au sintetizat un -dimer al unui derivat al LCA (schema 17)[39].

39

Schema 17 . Succesiunea reaciior de obinere a dimerului de LCA.

IV. Compui macromoleculari coninnd AB IV.A. Compui macromoleculari ai AB rezultai din reacia de polimerizare/policondensare IV.A. 1. Polimerizarea monomerilor coninnd AB Zhu X. X. i colab. au sintetizat noi copolimeri termosensibili pe baz de esteri ai CA [40]. ncorporarea de compui naturali precum CA mbuntete biocompatibilitatea acestor copolimeri. Polimerii inteligeni termosensibili sunt acei polimeri care prezint tranziie de faz n soluii apoase cu creterea temperaturii. ntre gruprile hidrofile ale polimerului i moleculele de ap se formeaz legturile de hidrogen, iar apa de hidratare mpiedic interaciunea gruprilor hidrofobe. Cnd temperatura crete, legturile de hidrogen se rup, grupele hidrofobe nu mai sunt ecranate i pot interaciona intra- i inter-molecular determinnd separarea de faz i precipitarea polimerului din soluie. Soluia devine

40

ceoas, transmitana scade pe msura opacizrii soluiei. Temperatura minim la care se realizeaz separarea de faz pentru polimerii termosensibili se numete LCST (lower critical solution temperature) (temperatur critic minim de solubilizare). Copolimerii termosensibili conin N-izopropilacrilamid (NIPAM) i esteri (pe baz de CA) ai acidului metacrilic i se obin prin polimerizare radicalic liber. ntre restul de acid metacrilic i acidul biliar se afl interpui spaiatori cum ar fi etilenglicol (EG) sau oligo(etilenglicoli). Acetia au rolul de a scdea temperatura critic (Tg ) a copolimerului (figura 46).

Figura 46. Formula structural pentru polimerii termosensibili pe baz de CA

Se obin copolimeri cu 1-5 mol % de CA. Dei fracia este mic, ea este suficient pentru a influena semnificativ proprietile termosensibile ale copolimerului. LCST variaz n funcie de balana hidrofobie/hidrofilie i cu ct crete lungimea spaiatorului solubilitatea copolimerului este mbuntit deoarece este necesar o cantitate mai mare de energie pentru a produce agregarea i precipitarea copolimerului. Rezultatul este creterea LCST-ului. Creterea proporiei de CA induce scderea valorii LCST . Zhu X. X i colab. au sintetizat o serie de copolimeri termosensibili, solubili n ap bazai pe NIPAM i derivai cu CA ai acrilamidei (notat ACA) respectiv metacrilamid (notat MACA) prin copolimerizare radicalic liber) (figura 47)[41].

41

Figura 47. Formulele structurale ale copolimerilor termosensibili

Legtura dintre CA i (met)acrilamid se face prin intermediul 1,2-etilendiaminei drept spaiator. Succesiunea reaciilor de obinere a ACA/MACA este prezentat n schema 18.

Schema 18. Succesiunea reaciilor de obinere a ACA/MACA.

Proporia de CA este de aproximativ 1-7 moli %. Valoarea LCST-ului se poate schimba n funcie de compoziia chimic a copolimerului. ncorporarea de comonomeri hidrofobi duce la o scdere a LCST-ului Zhu X. X i colab. au sintetizat copolimeri ai N-alchilacrilamidelor cu derivai (met)acrilamidici ai CA utiliznd studii de analiz termic, spectroscopie UV-VIZ (titrri turbidimetrice), calorimetrice [42]. Au fost sintetizate dou serii de copolimeri, una incluznd derivaii acrilamidici ai CA iar a a doua derivaii metacrilamidici ai CA (figura 48). Copolimerizarea monomerilor este radicalic iar catalizatorul utilizat este AIBN.

42

Figura 48. Structurile chimice ale copolimerilor de N-alchilacrilamid cu derivai (met)acrilamidici ai CA

Studiile de analiz termic indic c pentru ambele serii de copolimeri valoarea T g crete cu creterea coninutului n resturi de CA datorit rigiditii nucleului steroidic. Cu ct crete coninutul n resturi de CA cu att crete i valoarea temperaturii necesare descompunerii termice a copolimerilor ceea ce indic o stabilitate termic ridicat a copolimerilor. Valoarea LCST crete cu scderea coninutului n resturi hidrofobe de CA din copolimeri. La t0CLCST absorbana este mare pentru toate lungimile de und lucru ce indic prezena de particule att mari ct i mici. IV.A. 2. Policondensarea AB Primele studii de policondensare AB au fost realizate de Ahlheim i Hallensleben [ 43] pe CA DCA i LCA la temperaturi nalte. Este utilizat drept catalizator acidul ptoluenaminosulfonic (PTSA). Spectrele IR i RMN indic obinerea de policondensate (ramificate) doar pentru AB cu cel puin dou grupe hidroxil n structur (DCA i CA) (figura 49). Mase moleculare ale produilor sunt mici iar solubilitate acestora este redus n solveni organici.

43

Figura 49. Formula structural pentru policondensatele cu DCA.

Oligocondensarea liniar regioselectiv a CA (1) n poziia 3 a nucleului steroidic a fost realizat n THF n prezena unei lipaze (Candida Antartica) drept catalizator [ 44]. Produsul final izolat are structura unui oligoester (figura 50), lucru indicat de tehnici RMN.

Figura 50. Formula structural a oligoesterului CA obinut n prezena lipazei

n condiii similare de lucru, se adaug n sistem pe lng CA, lipaz i acidul 11metacriloilaminoundecanoic (figura 51). n prezena AIBN drept catalizator are loc policondensarea esterului format la C3-OH al nucleului steroidic, tehnicile RMN indicnd formarea poliesterului pe baz de CA.

44

Figura 51. Formula structural pentru poli( CA-co-acid 11-metacriloilaminoundecanoic).

Policondensare liniar a trei acizi biliari (CA, DCA, LCA) a fost realizat la t.c. utiliznd drept agent de cuplare DCC iar drept catalizator un amestec 4dimetilaminopiridin (4-DMAP) i acid p-toluensulfonic (PTSA) n raport molar 1/1 [45]. Condiiile de lucru alese permit policondensarea selectiv a monomerilor de AB la C 3OH cu gruparea carboxil terminal evitndu-se reticularea produilor finali. Studiile GPC i spectroscopia de mas confirm policondensarea AB, indicnd valorile maselor moleculare ale policondensatelor. Acidul polilitocolic i acidul polideoxicolic au mase moleculare relativ mari (20-60 kD) dar acidul policolic are o mas molecular mic (2.3 kD). S-au realizat studii de analiz termic precum i difracie de raze X. Aceste studii relev o bun stabilitate termic (pn la 3800C) respectiv o parial cristalinitate (1530%, depinznd de tipul de AB utilizat). Datorit prezenei nucleului steroidic hidrofob n structur solubilitatea poliacizilor biliari este redus n marea majoritate a solvenilor organici. X. X. Zhu i colab. sintetizeaz homo i polianhidride bazate pe dimeri ai LCA. Aceti dimeri sunt legai ntre ei la C3-OH prin intermediul resturilor de acid sebacic (schema 19) [46].

45

Schema 19 . Structura chimic a polianhidridelor bazate pe dimeri ai LCA.

Polianhidridele au masa molecular de aproximativ 18kD iar valorile T g scad de la 850C la 130C pentru copolimerul cu 90% acid sebacic. Studiile de degradare hidrolitic realizate n soluie tampon (pH=7.4) indic un ordin de reacie egal cu zero pentru procesul de erodare a matricei polimerice. Pentru a produce degradarea hidrolitic a polianhidridelor se utilizeaz drept comonomeri resturi de acid sebacic. n funcie de procentul de acid sebacic din structura policondensatelor putem regla gradul de degradare termic. Cu ct crete procentul de comonomer hidrofil (acidul sebacic) cu att crete gradul de degradare hidrolitic. Studiile de degradare hidrolitic, n sistem tampon la 370C, au fost realizate pentru a determina capacitatea de biodegradare a polianhidridelor n vederea utilizrii lor ca sisteme de eliberare controlat a medicamentelor.

IV.B. Polimeri rezultai prin ataarea AB pe catena polimeric Putem ataa chimic resturi de AB prin intermediul grupei carboxil C24-COOH utiliznd polimeri cu grupe hidroxil sau amince. Modificarea grupelor OH ale

46

polimerului se realizeaz cu ajutorul agenilor de cuplare cardiimidei sau utiliznd esteri activai ai AB.

(carbodiimid sau

carbonildiimidazol). Cuplarea AB la grupele NH2 ale polimerului se face cu ajutorul Muli polimeri sunt hidrofili iar prin introducerea de resturi de AB pe catena polimer rezult polimeri amfifili. Acetia datorit interaciunilor hidrofobe dintre resturile de AB se pot autoasocia. n funcie de poziia grupelor reactive de pe catena polimer putem obine polimeri cu grupe pendante de AB sau polimeri ce au resturile de AB ataate la capetele catenei polimerice.

IV.B.1. Polimeri cu grupe pendante de AB Moleculele de AB au fost ataate covalent pe suporturi polimerice cum ar fi: polizaharide (Dex [47,48], heparin [8], glicolchitosan [9], etc). GS a polimerului este relativ mic dac se dorete ca polimerii s fie solubili n ap (515 moli %) i depinde de aplicaiile urmrite pentru polimerii amfifili. Marieta Nichif i colab. au ataat resturi de AB pe catena dextranului (Dex) n dou variante de lucru diferite [47,48]. Catena AB este legat de cea a Dex fie prin intermediul C3-OH [47] fie prin intermediul grupei C24-COOH [48]. n primul caz grupele pendante ale CA au grupele carboxil libere ceea ce confer Dex modificat caracter amfifilic i polielectrolitic. Esterificarea Dex cu AB prin intermediul grupei carboxilice (polimeri amfifili neutri) (schema 20) [48] se face: 1. direct, n prezena DCC drept agent de cuplare i 4-DMAP drept catalizator (pentru CA i DCA); 2. indirect, (pentru CA) prin reacia AB cu clorhidratul esterului metilic al glicinei/acidului 6-aminocapronic, urmat de reacia grupei COOH a spaiatorului cu Dex avnd acelai catalizator i respectiv agent de cuplare ca n varianta 1.

47

CH3 CH3 OH

H3C C O OH

HCl.H2N CH2 COOCH3 ni: EEDQ/TEA/EtOAc 80 C, 20 h ii: K2CO3/H2O/EtOH 85-90 C, 30 min

R1 OH

1 a, b

DCC/DMAP

P-OH

Fa/DMF/DCM 24 h, r.t.

CH3

H3C C O NH CH2 n COOH

OH CH3 CH3 OH H3C C O R1 OH R2 O P P-OHDCC/DMAP Fa/DMF/DCM 24 h, r.t.

1 c, d

I a -d

R1

Ia Ib Ic Id

OH H OH OH

R2 _ _ HN CH2 HN CH2 CO n CO n

n _ _ 1 5 P OH = HO CH2 O OH O OH p

Schema 20. Succesiunea de reacii pentru esterificarea Dex cu CA.

Eficacitatea cea mai mare (raportul dintre numrul de moli de AB legai/ numrul de moli AB n reacie) s-a obinut pentru un amestec de solveni Fa/DMF/DCM =10/9/1 (v/v/v) [49]. Explicaia o constituie stabilitatea mare n acest amestec de solveni a produsului final al sintezei [50]. Se obin GS = 0.5-20 moli % ale Dex cu grupe de CA. Legarea CA pe catena Dex [47] prin intermediul grupei C3-OH se face n patru etape prin intermediul 3-succinoiloxi acidului colic avnd gruparea C24-COOH protejat cu grupe tricloracetice (DCC/4-DMAP n MF/DMF/DCM). n final, gruparea carboxilic este deprotejat (Zn/AcOH) (schema 21).

48

Schema 21. Succesiunea reaciilor pentru obinerea Dex cu grupe pendante de CA.

Capacitatea de autoagregare a Dex cu grupe pendante de CA este evideniat cu ajutorul studiilor de fluorescen [47]. Proba fluoroflor extrinsec utilizat este N-fenil1-naftalinamina (NPN). Se formeaz microdomenii hidrofobe de-a lungul catenei Dex iar proba fluoroflor este distribuit preferenial n miezul agregatelor hidrofobe. Din punctul de inflexiune al curbei intensitii relative a fluorescenei n funcie de concentraia polimerului se afl valoarea concentraiei critice de agregare (cca)(figura 52). Valorile cca scad cu creterea GS al catenei Dex i nu sunt semnificativ influenate de forma ionic a grupelor pendante carboxil sau de tria ionic a mediului.

49

Figura 52.Variaia intensitii fluorescenei la maximul spectrului de emisie al NPN respectiv variaia poziiei acestui maxim n funcie de concentraia polimerului

Studiile de vscozitate (figura 53) [47] indic un comportament de ne-polielectrolit deoarece sp/c scade la concentraii mici de polimer. Valorile vscozitii sunt ntotdeauna mai mici comparativ cu cele ale Dex nemodificat i depind mult de valoarea GS al polizaharidei deci conformaia Dex modificat cu resturi de CA este una mai compact comparativ cu cea a Dex nativ. Compactitatea apare ca urmare a interaciunilor hidrofobe dintre grupele pendante hidrofobe. Prezena unui numr ridicat de grupe carboxil pe grupele pendante ar trebui s determine expansiunea catenelor polimerice ca urmare a respingerilor electrostatice care apar. Deoarece comportamentul n soluie al polizaharidei modificate este de ne-polielectrolit demonstreaz faptul c atraciile hidrofobe sunt mai puternice dect respingerile de natur electrostatic.

Figura 53.Variaia vscozitii reduse n funcie de concentraia polimerului.

n cazul polimerilor amfifili neutri profilurile vscozitii reduse sunt liniare (figura 54) [48] pentru mase moleculare mici.

50

0.8 0.7 0.6 viscozitatea redusa(dl/g) 0.50

Ia (200)

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

02.1

3.6 0 2.8 5.5

Ia (30)

1

2 3 concentratia polimerului (g/dL)

4

Figura 54. Variaia vscozitii reduse n funcie de concentraia polimerului la diverse GS (valoarea este nscris pe curbe n moli%)

ale Dex (Dex 30) pe ntreg domeniu de concentraii al polimerului dar sunt deviate de la liniaritate pentru mase moleculare mari ale Dex (Dex 200) la concentraii > 1.5 g/dL ale polimerului. Aceste rezultate indic predominana interaciunilor hidrofobe intramoleculare la mase mici ale Dex i apariia interaciunilor hidrofobe intermoleculare la mase mari ale Dex. Studiile de tensiune superficial n soluii apoase [48] indic o scdere a tensiunii superficiale, similar cu a NaCA, la creterea concentraiei polimerului (figura 55).80Surface tension (mN/m)

70 60 50 40 30 20 10 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7Solute concentration (g %) Sodium cholate Ia (30), DS = 2 mol %

Figura 55.Variaia tensiunii superficiale cu concentraia solutului

51

Scderea valorii tensiunii superficiale crete cu creterea GS al polimerului (figura 56).75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 0 1 2 3 4 5 6 7Degree of substitution (mol %)

Comportamentul pentru soluiile apoase de Dex modificat cu grupe de CA este de agent tensioactiv, soluiile apoase fiind stabile n timp. Kyeongsoon Park i colab. au sintetizat conjugate amfifile ale heparinei cu DCA (conjugate HD), heparina constituind segmentul hidrofilic iar DCA segmentul hidrofobic. Conjugatele au diferite grade de substituie (GS) cu resturile de AB, prezint dimensiuni de ordinul nm-lor i sunt ncrcate negativ la exterior [8]. DCA este tratat cu dietilendiamin (N-hidroxisuccinimid (NHS)/DCC) rezultnd Ndeoxicoliletilendiamina (DCA-NH2). DCA-NH2 este apoi cuplat cu heparina n prezena 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimid (EDAC) (schema 22). n funcie de raportul molar DCA-NH2/heparin se obin conjugate cu diferite GS.

Surface tension (mN/m)

Figura 56 .Variaia tensiunii superficiale cu GS al polimerului

52

Schema 22. Structura conjugatelor heparin DCA

Spectrele FT-IR i 1H-RMN indic legarea DCA-NH2 pe molecula heparinei prin legturi amidice. GS al conjugatelor HD a fost determinat prin titrarea grupelor carboxilice rmase libere. Cu ct crete numrul de moli de DCA-NH2 din raportul molar al reactanilor cu att crete GS al heparinei. Este cunoscut faptul c grupele carboxilice ale heparinei joac un rol important n determinarea activitaii anticoagulante a heparinei. Legarea pe heparin a DCA-NH2 scade activitatea anticoagulant a heparinei proporional cu GS (pn la 37% ). Kwangmeyung Kim i colab. au sintetizat autoagregatele formate prin ataarea covalent a DCA la glicolchitosan (GC) (conjugate GCD) (figura 57) i au studiat caracteristicile fizico-chimice precum i stabilitatea nanoparticulelor formate [9].

53

Figura 57. Structura conjugatelor GCD.

DCA a fost ataat prin legturi amidice de catena GC n prezena clorhidratului de 1etil-3- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimid (EDC) i N-hidroxisuccinimidei (NHS). Se obin variate conjugate GCD cu diferite GS (6-30) n funcie de numrul de moli de DCA din raportul molar iniial al reactanilor. Studiile FT-IR indic prezena de grupe amidice n structur iar cele de 1H-RMN [51], prin existena pickurilor caracteristice DCA, ilustreaz legarea covalent a DCA la catena GC. Conjugatele GCD dizolvate ntr-o soluie tampon fosfat (PBS)(pH = 7.4 i tria ionic = 0.15) supuse timp de 3h la ultrasunete formeaz prin autoasociere agregate de dimensiuni nanometrice.

IV.B.2. Polimeri cu una sau dou grupe terminale constituite din AB In-Sook Kim i colab. au sintetizat i caracterizat nanoparticule polimerice constituite acidul lactobionic (LA), polietilenglicol cu grupe aminice terminale (ATPEG) i CA notate LA-ATPEG-CA [15]. Nanoparticulele sunt sintetizate n dou etape. n prima etap LA este cuplat cu ATPEG n DMSO utilizndu-se drept agent de cuplate DCC (schema 23).

54

Schema 23. Succesiunea de reacie pentru obinerea LA-ATPEG.

n a doua etap CA reacioneaz cu LA-ATPEG n DMSO n prezena DCC drept agent de cuplare (schema 24).

Schema 24. Succesiunea de reacie pentru obinerea LA-ATPEG-CA.

55

Cu ajutorul spectrelor FT-IR i RMN s-a dovedit obinerea nanoparticuleleor LAATPEG-CA. Chulhee Kim i colab. au sintetizat i caracterizat copolimerul amfifil PEO-DCA [16]. DCA, n forma sa activat (ester cu N-hidroxisuccinimid) (DCA-NHS), reacioneaz cu -metoxi--aminopoli(etilenoxid) cu dou mase moleculare diferite (1000 respectiv 5000) rezultnd PEO1000-DCA respectiv PEO5000-DCA (schema 25).

Schema 25. Succesiunea de reacie pentru obinerea PEO1000-DCA i PEO5000-DCA.

Spectrele FT-IR i RMN demonstreaz obinerea conjugatelor PEO-DCA.

IV.C. Macrocicluri speciale ale AB AB au capacitatea de a forma macrocicluri legate sau nu prin spaiatori denumite ciclofani respectiv ciclocolai. IV.C.1. Ciclocolai Ciclocolaii sunt poliesteri macrociclici (macrolactone) avnd n structur ntre 2-6 cicluri steroidice formate prin ciclizarea cap (24COOH)-coad (C3-OH sau C7-OH) a AB. Obinerea lor are loc din derivai monomerici sau dimeri liniari ai AB prin macrolactonizarea Yamaguchi n prezena clorurii de 2,6-diclorobenzoil (DCBC) i a 4N,N-dimetilaminopiridinei (4-DMAP) drept ageni de cuplare (schema 26) [52-55]

56

Schema 26. Macrolactonizarea Yamaguchi a derivailor de AB.

Gao i Dias au studiat macrolactonizarea LCA folosind diciclohexilcarbodiimida (DCC) n locul DCBC [56]. Datorit absenei benzoilrii competitive a 3 -OH se obine un ciclotrimer cu un randament mult mai bun comparativ cu cel obinut folosind reacia Yamaguchi [57,58]. Brady i Sanders au dezvoltat o metod rapid i eficient pentru sinteza ciclocolailor pornind de la monomerii corespunztori care prin reacii de transesterificare n condiii de echilibru n toluen i folosind drept catalizator un eter coroan [complexul de K al metoxid-diciclohexil-18-coroan-6]. Transesterificarea este controlat termodinamic i poate fi considerat ca un proces de macrolactonizare vie datorit echilibrului ce exist ntre produi. Intermediarul este un compus liniar (schema 27) [59,60]. Este posibil s influenm ponderea diferiilor oligomeri ciclici obinui prin adugarea de iodur a unui metal alcalin (Li, Na, K, Cs) la soluia de monomer nainte de adugarea n sistem a catalizatorului. Ionii cu raz ionic mic/mare favorizeaz formarea de inele macrociclice mari/mici [60].

57

Schema 27. Procesul de macrolactonizare vie

Continundu-i studiile Bonar-Law i Sanders au sintetizat ciclocolai ce nclobeaz metaloporfirina (Zn+2) (schema 28). Ciclocolatul conine patru uniti de AB. Fiecare din grupele hidroxil de la C3 al nucleelor steroidice din ciclocolat este esterificat cu acidul 3formilfenoxi acetic i prin reacia cu patru moli de pirol (BF 3.Et2O/DDQ) formeaz ciclul porfirinic nglobat n ciclocolat. Prin tratarea acestui compus cu acetat de zinc (NH3) se formeaz Zn-porfirina ciclocolatului [61].

58

Schema 28. Succesiunea reaciilor de obinere a ciclocolailor cu Zn+2-porfirin

59

IV.C.2. Ciclofani Ciclofanii sunt macrocicluri bazate pe AB coninnd 2-4 uniti de AB unite prin intermediul unor spaiatori. Davis i colab. au sintetizat ciclofani pe baz de ciclocolamide [62,63]. Flexibilitatea i solubilitatea n solveni organici moderat reduc proprietile acestora de legare. De aceea a fost sintetizat o nou generaie de ciclofani avnd grupe alchilice la exterior ceea ce le mrete solubilitatea n solveni organici i le reduce libertatea conformaional [63] (figura 58).

Figura 58. Formula structural a ciclofanului constituit din ciclocolamide cu grupe alchilice la exterior

Albert i Feigel au sintetizat ciclopeptide avnd nuclee steroidice formate prin legarea a dou molecule de acid 3 -aminolitocolic/acid 3 -acetoxilitocolic prin intermediul a doi monomeri [64] /dimeri de fenilalanin [65](figura 59). Aceti compui au structur cristalin existnd legturi de hidrogen intramoleculare ntre nucleele steroidice i resturile peptidice.

Figura 59. Formulele structurale ale ciclopepetidelor cu nuclee steroidice

Pandey i Singh au realizat un ciclofan avnd n structur dou resturi de CA unite printr-o punte de etilendiamin respectiv o grupare tereftalat [66] (schema 29).

60

Schema 29. Succesiunea de reacii pentru sinteza de ciclofani cu spaiatori tereftalat

Patru cioclofani pe baz de LCA cu grupe etan-1, 2-diol [ 67] sau piperazin [68] au fost sintetizai de grupul de lucru condus de Kolehmainen utiliznd ciclizarea Yamaguchi.. Acidul tereftalic sau acizi p-dicarboxilici ai Py constituie grupele terminale ale macrociclurilor (schema 30). Spectrele de13

C-RMN indic o structur tetrameric pentru compusul cu grupe

etandiolice i o structur dimeric pentru ciclofanul cu grupe piperizinice iar drept grupe terminale acidul tereftalic.

61

Schema 30. Succesiunea reaciilor de obinere a ciclofanilor cu LCA i 1,2-etandiol/piperazin

V. Dendrimeri pe baza de AB Dendrimerii sunt materiale polimerice de dimensiuni de ordinul nm cu structuri bine definite i multiple grupri organice terminale ce pot fi n continuare funcionalizate [69].

62

Uday Maitra i colab. au sintetizat pentru prima oar n 2001 dendroni pe baz de AB [70]. Dendronii rezultai pot fi n continuare funcionalizai pentru a forma n final macromolecule cu dimensiuni mari (dendrimeri de diverse generaii). Dintre cele dou metode clasice (convergent i divergent) utilizate n sinteza de dendrimerilor a fost utilizat metoda convergent a lui Frchet [71]. Din seria AB au fost selectai CA i DCA. Protecia celor doi AB s-a fcut cu grupe acetat (la grupele hidroxilice) respectiv cu grupe 1-naftilmetil (la gruparea carboxilic) (figura 60).

X=Z=OAc, Y=R=H (acid 3 , 12 -diacetat deoxicolic); X=Z=OH, Y= H, R=1-CH2Np (acid 1-metilnaftildeoxicolic); X=Z=Y=OAc, R=H (acid 3 , 7 ,12 -triacetatcolic); X=Z= Y=OH, R=1-CH2Np (acid 1-metilnaftilcolic). Figura 60. Structura derivailor de CA i DCA utilizai n sinteza dendronilor.

Din reacii sucesive ntre derivaii neprotejai respectiv protejai ai CA/DCA se ajunge n dou etape de reacie la obinerea unui dendron decameric pentru CA (figura 61) respectiv a unui dendron heptameric pentru DCA (figura 62). Toi intermediarii sintezelor sunt hidrogenolizai (Pd/C, H2, dioxan) pentru a permite obinerea unui grad mare de ramificare al dendronilor.

Figura 61. Structura decamerilor pe baz de CA (R=1-CH2Np/ R=H).

63

R=1-CH2Np; R=H. Figura 62. Structura heptamerilor pe baz de DCA (R=1-CH2Np/ R=H).

Dac sinteza dendronilor se face pe scheletul DCA cu CA avnd grupe protejate se ajunge, n dou etape de reacie, la un nonamer (figura 63). Intermediarul din aceast sintez a fost i el supus hidrogenolizei (Pd/C, H2, dioxan) pentru a permite un grad mai mare de ramificare al dendronului..

Figura 63 .Structura nonamerilor cu R=1-CH2Np i R=H.

Produii au fost caracterizai prin studii IR, 1H RMN, UV, MALDI-TOF. Structurile coninnd grupe naftilmetil (marker UV) au fost utilizate n analiza cantitativ a spectrelor UV obinndu-se informaii asupra maselor moleculare ale compuilor. Cu ajutorul 1H-RMN au fost studiate pickurile pentru hidrogenii din grupele

64

metilen ale grupelor naftilmetil iar absena semnalelor n regiunea 3-4 ppm sugereaz absena -H ataai la grupele OH neesterificate. Determinrile rotaiilor molare specifice indic absena de conformeri chirali pentru dendronii cu mase mici n timp ce pentru cei cu mase moleculare mari apar structuri secundare. Modelarea pentru decamerul pe baz de CA (R=H) indic formarea de structuri globulare, compacte cu diametre de 2.6-5.2 nm (figura 64).

Figura 64. Structura globular a decamerului pe baz de CA (R=H).

Uday Maitra i colab. au sintetizat un dendrimer de generaia I bazat pe resturi de CA [72]. Alturi de acesta au mai fost sintetizai dendroni bazai pe CA i LCA pentru un studiu comparativ cu structura dendrimerului. Structura compuilor folosii n sintez este dat mai jos (figura 65)

Figura 65. Structura compuilor folosii n sinteza dendrimerului

Sinteza pleac de la reacia dintre acidul colic cloroacetilat la toate grupele hidroxil cu colatul de benzil rezultnd un tetramer cu nou grupe cloroacetat (figura 66).

65

Figura 66. Structura tetramerului (R=benzil)

Tetramerul este supus hidrogenolizei (Pd/C, H2, dioxan) i cuplat cu antracen-9carbinol. Din reacia compusului hidrogenat al tetramerului cu un exces de sare de K a naproxenului n DMSO rezult dendrimeri de generaia I (figura 67).

Figura 67. Structura dendrimerilor de generaia I (R= benzil) /(R= 9-antracenilmetil)

Derivaii de LCA (figura 68b) pot i fi ei funcionalizai (cu sarea de K a naproxenului) alturi de cei ai CA (figura 68a).

66

R=benzil R=9-antracenmetil a b

R=benzil R=9-antracenmetil

Figura 68. Structurile derivailor de CA respectiv LCA funcionalizai cu sarea de K a naproxenului

Din modelare reiese c structura dendrimerului de generaia I este globular (figura 69).

Figura 69. Modelarea produsului 13 (Naproxen-albastru i antracen-verde).

VI. Utilizri VI.1. Derivai ai AB drept ageni de gelifiere (organogelatori) Gelificarea este caracteristic compuilor cu solubilitate mic care au dificulti de cristalizare i apare ca urmare a capacitii unor molecule de a forma n mod spontan agregate tridimensionale care includ n interiorul acestora molecule de solvent. Starea de gel poate fi privit ca o stare metastabil ntre soluie i cristalizare.

67

Cele mai multe organogeluri se formeaz n urma nclzirii i a rcirii ulterioare a unei soluii de organogelator ntr-un solvent adecvat. Sunt suficiente cantiti mici de agent de gelifiere, astfel nct concentraii de mici de 1 g % permit producerea gelifierii. Gelul este constituit dintr-o reea tridimensional format din fibre (figura 70). Structura acestei reele influeneaz proprietile macroscopice a organogelatorilor.

Figura 70 Reprezentarea schematic a reelelor din organogeluri: interacii tranzitorii (stnga) i nodurile microcristaline (dreapta) n poziiile unde fibrele se ntlnesc.

Gelifierea apare ca urmare a interaciunilor dintre fibrele reelei care pot fi: hidrofobe, legturi de hidrogen, legturi van der Waals [73,74]. Diveri derivai ai CA cum ar fi: esteri de N-colil alchilaminoacizilor, alchilcolamidele i esterii alchilici ai CA pot fi utilizai drept organogelatori datorit proprietilor acestora de gelifiere n diveri solveni aromatici [5]. Gelurile nou obinute sunt transparente, termoreversibile i stabile. Testele fcute n tuburi nchise coninnd solventul i esterul (1.5 g %) relev formarea de geluri prin nclzire i apoi rcire. Lipsa apei din sistem este o condiie pentru obinerea de geluri, adugarea doar a unor picturi de ap sau metanol peste gel determin pierderea proprietii de gel i n unele cazuri precipitarea compusului pe baz de CA. Gelurile au o stabilitate foarte mare, putnd fi depozitate timp de mai multe luni la temperatura camerei. O mic diferen n structura esterilor determin schimbarea proprietilor de gelificare. Legturile de hidrogen sunt cele care determin gelifierea compuilor sus-menionai. VI.2. Derivai ai CA cu proprieti antimicrobiene Doi derivai ai CA (n8m3 i n10m3) [5] prezint proprieti antimicrobiene. Aceti compui constituie inhibitori n creterea unor bacterii (Escherichia coli i Enterococcus faecalis).

68

Aceste proprieti apar ca urmare a existenei a celor trei atomi de N ncrcai pozitiv i a grupei hidrofobe din gruparea esteric [75,76]. ncrcarea pozitiv a atomilor de N permite asocierea acestor molecule cu membrana ncrcat negativ a bacteriilor iar catena alchil lung (cel puin 8 atomi de C) din gruparea esteric faciliteaz deplasarea moleculelor organice prin membrana bacterial. Concentraia minim de inhibare (MIC) are o valoare situat sub valoarea cmc a celor doi ageni tensioactivi naturali ceea ce indic implicarea de molecule individuale i nu a micelelor n mecanismul de inhibiie. Activitatea antimicrobian a compusului n10m3 este aproximativ egal cu cea a cloramfenicolului. Creterea catenei grupei alchil din gruparea esteric a compuilor bazai pe CA (n12m3 i n16m3) nu mai permite transportul acestora prin membrana bacterial datorit puternicilor interaciuni de natur hidrofob dintre compusul organic i membrana bateriei.

VI.3. Derivai ai CA cu activitate anti-HIV Arunachalam Kannan i colab. au sintetizat un derivat al CA (analog al cosalanului) cu activitate anti-HIV folosind CA [31]. Cosalanul este un inhibitor al replicrii HIV-1 i HIV-2 [77,78] i este foarte stabil d.p.d.v. metabolic. n schimb prezint o foarte slab bioactivitate pe cale oral ( AB dihidroxilici> AB monohidroxilici) [79,80,] s-a folosi CA n locul nucleului steroidic din cosalan. Activitatea antiviral a cosalanului se datoreaz inseriei fragmentului steroidic prin membranele celulare i virale, gruparea disalicilmetanului rmnnd la exterior (figura 71).

69

Figura 71. Inseria cosalanului i analogilor acestuia prin membranele celulare i virale

Analizele activitii anti HIV indic o activitate mai slab pentru analogul cosalanului comparativ cu originalul. Cauza este lipofilicitatea crescut a nucleului steroidic din CA comparativ cu cea din produsul original. VI.4. AB utilizai n procesul de recunoatere molecular Moleculele de AB pot fi utilizate n procesul de recunoatere molecular datorit rigiditii scheletului steroidic precum i a amfifiliei lor faciale. AB, cu cel puin dou grupe hidroxil n structur, poate constitui scheletul de baz n sinteza de receptori sintetici. Faa a nucleului steroidic (hidrofil) CA, cu cele trei grupe hidroxil orientate perpendicular fa de planul steroidic, permite formarea de legturi de hidrogen cu molecule oaspete. Printre moleculele oaspete se numer i monozaharidele [81]. Anumite bis(colamide) datorit formei lor geometrice pot lega n cavitatea acestora monozaharide. Bis(colamidele) conin dou uniti de CA legate prin m-respectiv pxilenildiamine (notate mCAH respectiv pCAH) (figura 72).

Figura 72 . Formulele structurale ale m respectiv p-CAH.

70

Formele spaiale ale bis(colamidelor) difer, pCAH/mCAH prezentnd suprafee n form de disc/L. Forma de disc pentru suprafeele bis(colamidelor) permite, prin forma i dimensiunea sa (lime 8-12 A0), ncorporarea de monozaharide iar suprafeele n form de L permit legarea de oaspei doar cu ajutorul unui singur bra de CA. S-au sintetizat macrocicluri pe structura pCAH respectiv mCAH. Folosind o grupare de tip etilenic pentru a nchide pCAH se obine o form de toroid circular cu o lime de 8.8 A0. Pentru mCAH s-au sintetizat dou macrocicluri (mCAH1 i mCAH2). mCAH1 a fost nchis cu ajutorul grupei CH2-CH2-O-CH=CH-O-CH2-CH2- (izomerul cis) (forma macrocicului este de canapea) iar mCAH2 cu ajutorul grupei metilen (forma macrociclului este de toroid oval). Drept monozaharid oaspete s-a folosit inozitolul (cis-1,2,3,5-trans-4,6ciclohexanhexol. Acesta prezint grupe hidroxil n poziia ecuatorial la fiecare atom de C (figura 73).

Figura 73.Formula structural a ionozitolului.

Inozitolul este ancorat bine n macrociclul pCAH prin cinci legturi de hidrogen. ntrega cavitate a macrociclului pCAH este umplut cu molecula inozitolului, forma de toroid a macrocicului fiind cea optim pentru complexarea monozaharidei (figura 74).

Figura 74. Macrociclul pCAH cu inozitolul drept molecul oaspete

n cazul mCAH1 forma de canapea a macrociclului permite legarea monozaharidei prin patru legturi de hidrogen, un rol important n procesul de ancorare a inozitolului avnd prezena unor spaiatori cu grupe de tipul etoxi ce pot genera legturi de hidrogen

71

suplimentare (figura 75). Stabilitate structurii este mult mai mic comparativ cu cea anterioar n care monozaharida umple ntrega cavitate a macrociclului.

Figura 75. Macrociclul mCAH1 cu monozaharida ancorat de acesta.

Pentru macrociclul mCAH2, inozitolul este legat, prin legturi de hidrogen, simetric umplnd ntrega cavitate a macrociclului (figura 76).

Figura 76. Inozitolul plasat central n structura macrociclul mCAH2.

Amprentarea molecular este o tehnic relativ nou care const n obinerea de polimeri n prezena unor compui chimici (amprente) care le vor imprima polimerilor noi sintetizai forma, dimensiunile precum i locurile de legare ale substanei amprent. Chad C. Huval i colab au sintetizat polimeri din clorura de poli(alilamoniu) reticulat cu epiclorhidrin (ECH) n prezena NaCA (amprent) (figura 77) [82]. Particulele polimerice dup uscare i mcinare au fost filtrate pentru a avea dimensiunile dorite (P2>P1). Izotermele de legare realizate pentru studiile in vitro arat aceeai capacitate de legare precizat anterior (figura 78).

Figura 78. Izotermele de legare pentru polimerii imprimai P1 (a), P2 (b), P3 (c).

Cercetrile realizate pe hamsteri, prin msurarea cantitii de CA excretat din organismele vii, indic aceeai ordine de legare a CA de ctre polimerii imprimai (figura 79)

73

Figura 79. Cantitatea de CA excretat din organism dup tratamentul cu sechestranii de acizi biliari: (a) grupa de control fr ingestia de polimeri imprimai; (b) polimerii P1; (c) polimerii P2; (d) polimerii P3.

Capacitatea crescut de a lega AB o au polimerii de tipul P 3 datorit formei, dimensiunilor i siturilor complementare cu cele ale CA. Moleculele de CA recunosc molecular polimerii imprimai n prezena lor ceea ce permite, prin interaciuni electrostatice, nglobarea cu uurin a moleculelor de AB n cavitile polimerice. n plus, polimerii imprimai i dubleaz volumul n urma umflrii lor n soluie ceea ce permite accesul unor molecule cu mici variaii structurale avnd forme i dimensiuni similare cu cele ale cavitile polimerilor. VI.5. AB - ageni de transfecie AB constituie o nou clas de ageni de transfecie diferit de cea clasic bazat pe un amestec de lipide cationice-lipide neutre. Primul agent de transfecie utilizat (1987) este Lipofection, un amestec echimolecular constituit dintr-o lipid cationic (clorur de (N-[1,2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,Ntrimetilamoniu (DOTMA)(figura 80) i o lipid fusogenic [dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE)] (figura 80).

Figura 80. Formulele structurale ale DOTMA i DOPE.

74

Rolul lipidei cationice (DOTMA) este acela de a interaciona (electrostatic) cu sarcinile negative ale grupelor fosfat din structura ADN-ul ceea ce duce la neutralizarea sarcinilor acestuia, producnd colapsarea acidului nucleic. Complexul DOTMA-ADN avnd sarcini pozitive poate interaciona cu membranele biologice care sunt ncrcate negativ. Complecii cu ADN ptrund n celule fie direct prin membrana citoplasmatic fie indirect prin endocitoz. Rolul DOPE este acela de a facilita ptrunderea ADN prin membrana celular (agent fusogen). Poliamine ale AB sau derivaii acestora pot substitui, datorit amfifiliei lor faciale, lipida cationic (DOTMA), transfeciei) (figura 81)[83]. facilitnd fuziunea membranar (procesul critic al

Figura 81. Formula structural general pentru agenii de transfecie bazai pe AB.

Poliaminele acizii biliari/derivaii lor, alturi de DOPE, au o activitate sinergetic rezultnd o rat mare de transfecie. Sinteza poliaminelor AB const n activarea grupei carboxilice de la C24 (prin esterificare) urmat de reacia cu poliamina (schema 31). Poliaminele folosite sunt: spermina, tetraetilenpentamina, pentaetilenhexamina i 1, 2-dodecildiamina. Dintre AB sau utilizat: CA, DCA, CDCA, LCA, acidul colic 7 i/sau 12-glicozilat.

75

Schema 31. Succesiunea reaciilor de obinere a agenilor de transfecie pe baz de AB.

Stabilitatea complexului ADN-poliamin biliar este necesar pentru obinerea unor rate ridicate de transfecie. Trebuie ndeplinite anumite condiii pentru a stabiliza complexul cu ADN: 1. AB sau derivaii acestora s aib caracter hidrofil (ct mai multe grupe hidroxil pe scheletul steroidic); 2. poliamina, legat covalent de AB, s aib ct mai multe sarcini pozitive (ct mai multe grupe aminice). Prezena de ct mai multe grupe aminice, ce pot fi protonate, stimuleaz procesul de endocitoz prin tamponarea mediului i previn fusiunea cu lisosomii. Este necesar ntotdeauna prezena DOPE alturi de poliamidele acizilor biliari sau derivailor acestora pentru a mri permeabilitatea celular. S-au fcut studii pe celule de tip COS-7, Hep G-2 care indic o cretere de 4-7 ori a eficienei procesului de transfecie pentru poliamidele AB sau derivailor acestora

76

comparativ cu Lipofection. Este mbuntit expresia genelor, acest lucru putnd fi folosit n terapia multor boli.

VI.6. Tratarea diferitelor afeciuni cu ajutorul derivailor AB VI.6.1. Conjugate ale AB cu medicamente Conjugate ale AB cu diverse medicamente pot fi utilizate drept pro-medicamente ce pot fi administrate pe cale oral subiecilor bolnavi. Aceste conjugate au avantajul c sunt recunoscute molecular de ctre sistemele de transport ale AB (NTCP-sodium taurocholate cotransporting polypeptide i OATPorganic anion transport protein) fiind transportate de acestea, prin mecanisme active sau pasive, putnd ajunge la nivelul hepatocitelor, ileocitelor sau celulelor tubulare din rinichi. Aici are loc eliberarea medicamentului prin scindarea legturii dintre medicament i AB. Pentru a fi recunoscute molecular de ctre NTCP i OATP, pro-medicamentele trebuie s ndeplineasc simultan trei condiii: 1. inelele A i B din nucleul steroidic trebuie s fie n poziia cis, 2. catena lateral a AB legat de C17 a nucleului steriodic trebuie s poarte o sarcin negativ, 3. trebuie s existe cel puin o grup hidroxil axial n una din poziiile 3, 7 sau 12. Legtura dintre medicament i una din grupele funcionale ale AB se face printr-un spaiator avnd diferite grupe funcionale, lungimi, polariti (figura 82).

77

Figura 82. Structura pro-medicamentelor bazate pe AB.

S-au realizat conjugate ale AB cu clorambucil [84,85]. Clorambucilul este un agent citostatic utilizat n tratamentul diferitelor tipuri de cancer (leucemie, sindromul Hodgkin) iar excreia sa i a metaboliilor si se face pe cale renal. Clorambucilul a fost ales drept model pentru a vedea dac se poate schimba calea de eliminare din organism din cea renal n cea hepatic. Pro-medicamentul conine clorambucilul legat, prin intermediul unui spaiator scurt, de grupa OH de la C3 a nucleului steroidic printr-o legtur amidic (figura 83).

Figura 83. Formulele structurale ale clorambucilului i a conjugatelor acestuia cu CA.

78

Clorambucilul are un efect slab asupra transportorilor de AB dar conjugatele acestuia cu AB inhib puternic aciunea transportorilor de AB att la nivelul hepatocitelor ct i la nivelul ileocitelor. Aciunea conjugatelor cu AB crete n ordinea: ester metilic