NANOFIRE POLIMERICE ELECTROCONDUCTIVE CE FACILITEAZĂ ADEZIUNEA
-
Upload
oana-cristina-duta -
Category
Documents
-
view
28 -
download
1
Transcript of NANOFIRE POLIMERICE ELECTROCONDUCTIVE CE FACILITEAZĂ ADEZIUNEA
UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREȘTI FACULTATEA DE CHIMIE APLICATĂ ȘI ȘTIINȚA MATERIALELOR
NANOFIRE POLIMERICE
ELECTROCONDUCTIVE CE FACILITEAZĂ
ADEZIUNEA, PROLIFERAREA SI
DIFERENTIEREA LINIEI DE CELULE STEM
NEURONALE IN VITRO
BUCUREȘTI2012
I. Introducere
Terapiile bazate pe ingineria țesutului celulelor stem pot aduce beneficii importante
pacienților care trăiesc cu boli neurologice și dereglări ce implică o perturbare funcțională
și/sau o schimbare patologică în măduva spinării. De exemplu boli ca poliomielita, pojarul
sau herpesul pot provoca mielită, o inflamație a măduvei spinării. Mielopatia vasculară este
un alt tip de tulburare a măduvei spinării și, adesea, rezultă din malformații vasculare ale
măduvei spinării. Când tulburările măduvei spinării sunt cauzate de o traumă, ea este
menționată ca o rană a măduvei spinării (SCI). Majoritatea indivizilor ce au tulburări la
nivelul măduvei spinării prezintă acest tip de răni cauzate de o traumă. Cauzele acestor traum
includ accidentele de mașină, actele de violență, căzăturile și practicarea sporturilor. În anul
2009 numărul de persoane cu astfel de tulburări a fost estimat a fi între 231000-311000. Mai
mult, 52% din aceste persoane sunt paralizate, adică funcția senzorială a extremităților
inferioare este afectată și își pot folosi numai extremitățile superioare. Restul de 48% sunt
tetraplegici, funcția senzorială a întregului corp este afectată, nu-și pot utiliza membrele și
trunchiul. Din păcate, nu există nici o modalitate dovedită clinic pentru a inversa procesul de
deterioare a măduvei spinării. Tratamentul actual se axează pe prevenirea agravării rănilor și
pentru ca cei afectați să poată avea o viață activă. Cercetătorii continuă să lucreze pe
tratamente inovatoare, cum ar fi injecțiile directe cu celule stem și terapie cu celule stem
asociate cu ingineria tisulară care poate promova regenerarea celulelor nervoase sau
îmbunătățirea funcției nervilor ce rămân în urma SCI.
Nanotehnologia oferă căi interesante de a explora terapiile bazate pe ingineria tisulară
a celulelor stem pentru a promova regenerarea celulelor nervoase sau pentru a îmbunătății
funcția nervilor rămași după SCI. Matricea țesuturilor fabricate cu o nanotopografie unică au
prezentat răspunsuri favorabile la celulele neuronale, atât in vitro cât și in vivo. Mai multe
studii in vitro au raportat o funcționalitate îmbunătățită a celulelor neuronale pe matrici de
nanofibre de polimer, matrici nanoporoase și matrici de nanofire. În plus, există dovezi
semnificative că celulele stem neuronale (NSC) promovează creșterea axonală extensivă când
sunt implantate cu matrice de nanofibre în locul rănii măduvei spinării și poate reduce de
asemenea și deficitele funcționale în cazul unei răni a nervului sciatic într-un model in vivo.
Astfel, se poate concluziona cu ușurință că nanotopografia pe suprafața unei matrici joacă un
rol pozitiv în interacțiile celule neuronale – suprafață. Cu toate acestea, majoritatea matricilor
nu au proprietăți fiziologice relevante ale suprafeței. În cazul celulelor mamare este cunoscută
aderența preferențială și diferențială pe suprafețe încărcate electric. De aceea, în timp ce
2
nanotopografia s-a dovedit că îmbunătățește răspunsul celular, este necesar să se
funcționalizeze matricea și să se creeze o suprafață încărcată electric pentru creșterea și
menținerea celulelor stem neuronale. Polipirolul, polimer electroconductiv, a atras un interes
substanțial pentru aplicații în ingineria tisulară neuronală datorită biocompatibilității sale,
ușurinței sintezei și proprietăților electrice. A fost utilizat frecvent în biosenzori și baterii
poliemere datorită acestor motive. Studiile au arătat că polipirolul are abilitatea de a promova
creșterea celulelor endoteliale, neuronilor primari și chiar cea a celulelor stem mezenchimale.
Nevoia unui polimer electroconductiv pentru aplicațiile de inginerie tisulară neuronală
decurge din faptul că suprafețele neîncărcate sunt mai puțin optime pentru promovarea
comportamentelor celulare fenotipe normale. În plus, capacitatea de a transmite un curent
electric celulelor prin intermediul suprafeței matricei poate avea unele avantaje. Cercetările
actuale au arătat că stimularea electrică fiziologic relevantă poate îmbunătății regenerarea
nervilor și ajută la refacerea celulelor stem neuronale în locul unei răni. Prin urmare, este
avantajoasă proiectarea unor matrici care nu numai că au o nanotopografie unică a suprafeței,
ci au, de asemenea și abilitatea de a oferi nivele fiziologice de stimulare electrică pentru a
modula și îmbunătății răspunsul lor celular.
În cadrul acestui stadiu, s-a dezvoltat o tehnică nanotemplate fără solvent pentru
fabricarea de suprafețe de tip nanofire de policaprolactonă (PCL) ca matrice pentru creșterea
și diferențierea celulelor stem neuronale. Suprafețele acestea de tip nanofire au fost apoi
acoperite cu polipirol (PPy) pentru a asigura o suprafață electroconductivă pentru interacțiile
celulă – suprafață. PCL a fost utilizată pentru fabricarea suprafețelor de tip nanofire datorită
biocompatibilității și biodegradabilității sale controlate. Nanofirele de PCL acoperite cu Ppy
au fost caracterizate utilizând spectroscopia fotoelectrică de raze X (XPS) și microscopie
electronică de scanare (SEM). În plus, stabilitatea nanofirelor de PCL acoperite cu Ppy în
condiții fiziologice a fost evaluată utilizând SEM și XPS. Celulele stem neuronale murinice
au fost folosite ca celule model pentru a studia viabilitatea, adeziunea, proliferarea și
diferențierea pe suprafețele de tip nanofire de PCL acoperite cu PPy. Această linie de celule a
derivat din stratul extern germinal a cerebelului unui șoarece nou-nascut. Cu toate acestea,
linia de celule C17.2 este un bun model de celule stem neuronale deoarece după izolare, ele
incă au abilitatea de a diferenția în neuroni și celule gliale. S-a demonstrat de asemenea că
linia de celule prezintă niveluri semnificative de mai mulți factori neurotrofici, inclusiv
factorul de creștere a nervilor, factorul neurotrofic derivat din creier și factorul neurotrofic
derivat din linia de celule gliale.
3
II. Metode experimentale
1. Fabricarea suprafețelor de nanofire de PCL
Suprafețele de nanofire
de PCL au fost fabricate conform unui protocol dezvltat anterior în
laborator și sunt ilustrate în Fig.1. Pe scurt, suprafețele de nanofire au fost
fabricate printr-o sinteză template din PCL utilizând membrane
nanoporoase de oxid de aluminiu cu o dimensiune a porilor de 20 nm.
Discuri de polimer (10mm diametru și aproximativ 2mm grosime) au fost
puse pe suprafața membranei (Fig.1A) și nanofirele au fost extrudate prin
membrane într-un cuptor la 115ºC timp de 3 minute (Fig.1B și 1C).
Membranele de oxid de aluminiu au fost dizolvate într-o soluție de NaOH
1M pentru 75 minute pentru îndepărtarea membranei, eliberând astfel
nanofirele extrudate (Fig.1D). Suprafețelor nanofirelor au fost apoi înmuiate
în apă și apoi clătite în apa DI, uscate și depozitate într-un exicator până la
utilizarea ulterioară.
Fig.1 Schema fabricării PCL-NW
2. Acoperirea suprafețelor nanofirelor de PCL cu Ppy
Suprafețele de nanofire au fost acoperite cu Ppy utilizând o tehnică de polimerizare.
Suprafețele de nanofire au fost ultrasonate într-o soluție de 14 mM pirol și 14 mM
sodiu para-toluen sulfonat pentru 30 de secunde pentru a satura suprafețele cu pirol.
Această procedură a fost urmată de o agitare blândă și incubarea suprafețelor de NW
timp de o ora la 4ºC. După îndepărtarea excesului de soluție de reacție, suprafețele de nanofire
de PCL acoperite cu PPy (Ppy-NW) au fost ultrasonate timp de 1 minut în apă DI urmată de
uscarea în cuptor sub vid.
4
3. Caracterizarea suprafețelor PPy-NW
Suprafețele de nanofire, atât cele acoperite cât și cele neacoperite, au fost caracterizate
utilizând SEM, XPS și măsurători ale rezistivității suprafeței. Stabilitatea acopririi în mediu
fiziologic a fost de asemenea caracterizată utilizând SEM și XPS.
Nanoarhitectura suprafeței înainte și după acoperirea cu PPy a fost evaluată utilizând
imaginile SEM.
Polimerizarea PPy din pirol pe suprafețele de PCL-NW implică încorporarea de
clorine și sodiu para-toluen sulfonat.
4. Cultura de celule stem neuronale
Celulele stem neuronale murinice, dezvoltate de grupul Dr. Evan Snyder, au fost
utilizate în studiul prezentat. Această linie de celule diferențiază în toate liniile neuronale.
Mediul utilizat pentru creșterea celulelor C17.2 a fost Invitrogenul suplimentat cu 10% ser
fetal bovin, 5% ser cabalin, 1% L-glutamină și 1% penicilină/streptomicină. Mediul a fost
schimbat la fiecare 2-3 zile, iar subcultura a fost făcută într-un raport de 1:10. Celulele au fost
menținute într-un incubator la 37ºC și 5% CO2. Nanofirele și suprafețele de PPy-NW au fost
sterilizate în 24 de godeuri prin incubarea lor cu 70% etanol pentru 30 min, urmată de
expunerea la lumină ultravioletă timp de 30 de minute într-un cabinet de biosecuritate. Înainte
de semănarea celulelor, toate substraturile au fost spălate de 3 ori cu PBS steril. Celulele
C17.2 au fost semănate la o densitate de 10000 de celule.
5. Adeziunea și proliferarea celulelor C17.2 pe suprafețele PCL-NW
Adeziunea și proliferarea celulelor au fost investigate după 1, 2 și 7 zile de cultură.
Suprafețele au fost îndepărtate din mediul de cultură, clătite cu PBS și incubate timp de 45min
la 37ºC.
5
III. Rezultate și discuții
Fig.2 Imagini SEM reprezentative pentru NW și PPy-NW
6
Imaginile SEM reprezenative arată că suprafețele de nanofire au o arhitectură
uniformă cu întreruperi ocazionale în uniformitate datorate prezenței aleatoare a
microcanalelor formate ca urmare a efectelor de încărcare de suprafață. Imaginile SEM arată
că nanofirele individuale ale suprafeței au un diametru de aproximativ 100-150 nm. Motivul
discrepanței dimensiunii dintre porii membranei și diametrul NW poate fi explicat prin
extinderea termodinamică a polimerului în timpul răcirii. În timpul extruziunii, PCL topită
umple nanoporii membranei (Fig.1B și 1C). În timp ce polimerul se topesște, exercită
presiune pe pereții nanoporilor. La dizolvarea membranei, polimerul răcit expandează ușor,
rezultând NW care sunt mai mari în diametru decât nanoporii. Totuși, prin utilizarea unei
membrane cu dimensiunea porilor diferită, suprafețele cu NW cu diametru diferit pot fi
fabricate.
Suprafețele de NW au fost acoperite cu PPy prin polimerizare. Necesitatea unui
polimer electroconductiv pentru aplicații de inginerie tisulară neuronală rezultă din faptul că
suprafețele neacoperite sunt mai puțin optime pentru comportamentul fenotipic neuronal. În
plus, capacitatea de a transmite un curent electric la celule prin suprafața matricei poate avea
unele avantaje în viitoarele aplicații ale ingineriei tisulare. Fig.2 (PPy-NW) prezintă imagini
SEM reprezentative ale suprafețelor PPy-NW. Aceste imagini arată că suprafețele menționate
au o arhitectură similară cu cea a suprafețelor NW la măriri mici. NW pe suprafețele acoperite
cu PPy își mențin orientarea, și mai important, NW individuale mențin un diametru
consecvent. Mai mult, imaginile SEM la măriri ridicate evidențiază faptul că NW individuale
ale suprafețelor PPy-NW au un diametru puțin mai mare în comparație cu cele ale
suprafețelor NW.
Suprafețele NW și PPy-NW au fost caracterizate utilizând XPS pentru a compara
compoziția chimică a fiecărei suprafețe și pentru a determina dacă polimerizarea a avut loc cu
succes pe suprafețele NW sau nu.
Studiile au arătat o adeziune îmbunătățită a celulelor pe suprafețe cu rezistivitate
scăzută in vitro. În plus, studiile au arătat o funcționalitate îmbunătățită a neuronilor când sunt
expuși la câmpuri electrice in vivo. Astfel, suprafețele de PPy-NW fabricate au un dublu
avantaj: o nanotopografie unică și scăderea rezistivității electrice a suprafeței, care pot fi
atribuite îmbunătățirii răspunsului celulelor stem neuronale.
7
8
Fig.3 Imagini ale celulelor stem neuronale realizate cu ajutorul microscopiei fluorescente
Adeziunea și proliferarea celulelor stem neuronale a fost evaluată după 1, 2 și 7 zile
de cultură. Rezultatele indică că suprafețele de PPy-NW au susținut o adeziune a celulelor
semnificativ mai mare comparativ cu suprafețele de NW după prima zi de cultură (Fig.3, ziua
1) . Celulele par de asemenea a avea o morfologie a împrăștierii pe suprafețele de PPy-NW,
indicând o migrație îmbunătățită. După 2 zile de cultură, celulele de pe supraftețele de PPy-
NW au prolifert și par a fi în contact cu celulele din apropiere (Fig.3, ziua 2). În timp ce,
celulele se înmulțesc pe suprafețele de NW, pare a fi un contact scăzut sau nici un contact sau
agregare. După 7 zile de cultură, există un număr semnificativ mai mare de celule viabile pe
suprafețele de PPy-NW în comparație cu suprafețele de NW (Fig.3, ziua 7). Celulele par a
forma o rețea neuronală pe suprafețele de PPy-NW.
Rezultatele indică faptul că nanotopografia suprafeței îmbunătățește adeziunea
celulelor și înmulțirea lor. Din rezultate reiese că asigurând nanotopografia cu o suprafață
electroconductivă a îmbunătățit semnificativ adeziunea și înmulțirea celulelor.
Fig.4 Imagini SEM ale celulelor stem neuronale pe suprafețe de NW și PPy-NW după 1, 2 și 7 zile de cultură
9
Din imaginile de microscopie fluorescentă rezultă că, celulele de pe suprafețele de PPy-NW prezintă o morfologie mai răspândită în comparație cu cele de pe suprafețele de NW după o zi de cultură (Fig.4, ziua 1). După 2 zile de cultură, celulele de pe suprafețele de PPy-NW prezintă un grad semnificativ mai mare de răspândire și par a fi în contact cu alte celule (Fig.4, ziua 2). După 7 zile de cultură, celulele au format ceea ce pare a fi o “rețea neuronală”(Fig.6, ziua 7).
IV. Concluzii
În cadrul acestui studiu s-a dezvoltat o tehnologie simplă pentru a fabrica suprafețe de
PCL-NW. Aceste suprafețe au fost apoi acoperite cu un film de PPy pentru a furniza o tehnică
fiziologic relevantă pentru creșterea și întreținerea celulelor stem neuronale. Rezultatele
prezentate confirmă că acoperirea cu PPy reduce rezistivitatea electrică a PCL-NW la un nivel
funcțional unde stimularea electrică poate fi aplicată pentru a controla creșterea neuronilor. În
plus, rezultatele indică faptul că scăderea rezistivității electrice a suprafeței crește
funcționalitatea celulelor stem neuronale C17.2 în termeni de adeziune, proliferare și
diferențiere. Astfel, prin controlul nanotopografiei suprafeței și oferind o suprafață încărcată
fiziologic relevant, funcționalitatea celulelor neuronale poate fi modificată pentru potențiale
aplicații în ingineria tisulară neuronală.
V. Bibliografie
1. Samuel Bechara, Lucas Wadman, Ketul C. Popat, “Electroconductive polymeric nanowire
templates facilities in vitro C17.2 neural stem cell line adhesion, proliferation and
differentiation”, Acta Bimaterialia 7, 2011.
2. Chunyan Zhao, Aaron Tan, Giorgia Pastoriu, Han Kiat HO, “Nanomaterial scaffolds for
stem cell proliferation and differentiation in tissue engineering”, 2012.
10