CURS 14 8.01.2014

Acizi nucleiciRevers transcriereMutaiiCaracteristicile structurale ale ARNTranscrierea (Biosinteza ARN)Modificari posttranscriere

Dogma central a biologiei moleculareADN conine informaia genetic sub forma unor secvene de nucleotide

Toat informaia din celula parental este transferat celulelor fiice.

ReverstranscriereaSinteza de ADN pe matri de ARN Revers transcriptaza este prezent n virusurile oncogene care conin ca material genetic ARN

Enzima este o ADN polimeraz ARN dependent, care se activeaz numai la ptrunderea n celula gazda.

Primerul folosit de revers transcriptaz est un ARNt nglobat n particular viral Enzima prezint activitate de revers transcriptaz:activitate ribonucleazic (ribonucleaza H);activitate ADN polimerazic ADN dependent.

Revers transcriptaza nu prezint activitate exonucleazic 3` 5`, putnd face greeli n replicare, ceea ce explic numrul mare de tulpini virale.

HIV este un virus versatil rspunztor de SIDA(virusul conine genele: pol, env i gag)

Revers transcriptaza poate utiliza ca matri orice ARN pe care construiete un ADNc (complementar), aceast posibilitate putnd fi utilizat n obinerea unor gene sintetice.

MUTAII. REPARAREA ADN Notiunea de mutatie a fost elaborata in anul1901 de catre Hugo de Vries care este autorul binecunoscutei teorii mutationiste.

Mutaiile sunt modificri permanente ale secvenei nucleotidice a ADNMutaiile punctiforme= modificri ale unei singure perechi de baze

Mutaiile pot fi produse prin:

Substituia unei baze cu alt baz tranziia A..T G.C

transversia AT CGDeleiaInseria

Cauzele care determin apariia mutaiilor

a.Erori n procesul de replicare care scap celor 2 sisteme: -activitate de corector a ADN polimerazei III.-sistemele specializate de reparare postreplicative

ADN polimeraza I ndeprteaz ARN primer ca urmare a activitii exonucleazice 5` 3` i l nlocuiete cu ADN ca urmare a activitii polimerazice.

b.Factori chimiciAgenii nealchilani:formaldehida (H2C=O): reacioneaz cu gruprile amino;hidroxilamina (NH2-OH) reacioneaz specific cu citozina; acidul azotos (HNO2) determin dezaminarea oxidativ a citozinei, adeninei, guaninei modificnd mperecherea bazelor deoarece o amin se transform n ceton.

Agenii alchilani.etilmetan sulfonatul, adaug o grupare metil la azotul din nucleul purinic labiliznd legtura N-glicozidic prin a crei hidroliz apare un loc depurinat;

c.Analogi structurali ai bazelor azotate pot fi ncorporai n catena de ADN.

5-bromuracilul, se mperecheaz de obicei cu adenina. Forma enolic se leag cu guanina. Tranziia produs este AT cu G..C2-amino purina se mperecheaz de obicei cu timina. Forma sa tautomer normal (amino), se poate lega cu citozina producnd mutaia prin tranziie GC la AT.

d.Factori fizici Radiaiile ultraviolete (200-400 nm) induc formarea dimerilor de timin TT

Radiaiile ionizanteRazele X, radiaiile g, determin deschiderea nucleului purinic, depurinarea i ruperea legturilor fosfo-diesterice.

e.Depurinri-Hidroliza legturilor glicozidice

f.Dezaminri spontane C U G Xantin A Hipoxantin

g.Inserie: Acridin

h.Deleie: pH i temperatur

Repararea ADNPrin:a.excizie-excizia dimerilor de timin-excizia unei secvene ce conine o baz dezaminatb.direct-fotoreactivare-dealchilarea guanineic.prin recombinare.

Repararea prin excizie a.Repararea ADN la procariote prin excizia dimerilor de timin

Repararea ADN n cazul dezaminarii uneia dintre bazele azotate prin dezaminarea citozinei uracil adeninei hipoxantina guaninei xantina

se face analog reparrii prin excizie

DE ce timin n ADN i nu uracil ?Prezenta timinei i nu a uracilului n ADN permite repararea ADN ce conine citozina dezaminat (uracil).

Folosirea timinei n structura ADN i nu a uracilului mrete fidelitatea mesajului genetic.

Repararea direct a ADNprin fotoreactivare ADN fotoliaza, o enzim care se afl n toate organismele i care este activat de radiaiile din domeniul vizibil (l = 400-600 nm). cliveaz legtura covalent timin-timin din dimerii de timin

Absena genetic a fotoliazei duce la creterea riscului de apariie a cancerului de piele.

Caracteristicile structurale ale ARN

Sunt produi de policondensare a ribonucleozidtrisfosfailor

Structura primar: H3PO4 -b-ribozBaze azotate: A,G,U,C

5` GCA 3`

Structura secundarARN este monocatenar cu poriuni bicatenare

Coninutul n A al ARN este diferit de cel n U i cel de G diferit de cel n C

Rolurile diferitelor tipuri de ARN

ARNr -caracteristici structurale

conine zone dublu catenare i monocatenare -este heterogen ca form i mrime. -la procariote, ARNr : 23S, 16S i 5S la eucariote, ARNr : 28S, 18S, 5,8S i 5S

ARNr -este tipul de ARN cel mai stabil metabolic -reprezint ~80% din ARN celular total.

Ribozomii ARNr = componenta catalitic a ribozomilor Ribozomii = complexe ribonucleoproteice ARNr + proteine-proteinele: au roluri catalitice sau sunt implicate n recunoaterea i legarea ARNm i aminoacil~ARNt la ribozomi

Rolul ribozomilorRibozomii constituie sediul biosintezei proteinelor

Ribozomii permit conlucrarea ARNm, ARNt i ARNr, n vederea sintezei proteinelor.

Conin trei situsuri: -situsul aminoacid, care leag ARNt purttor al unui aminoacid;-situsul peptid, care leag ARNt purttor al unui lan polipeptidic;-situsul de eliminare de pe care este eliberat ARNt liber.

ARNt E. Coli conine ~75 tipuri de ARNt Reprezint ~ 15% din masa ARN celular total

Structura ARNt (solubil sau adaptor)

conine ntre 75 i 90 ribonucleotide;

raportul A+G/U+C este apropiat de 1;

prezint o conformaie n foaie de trifoi

ARNt are cel mai mare coninut de baze minore baze azotate modificate structural prin: -metilri- tiolri-hidrogenridup sinteza ARNt (POST-TRANSCRIERE)

Funciile ARNt Leag aminoacizii specifici, activai, prezeni n citosol, la restul adenilic din secvena CCA i i transport, la ribozomi, sub forma complexelor aminoacil~ARNt

Adaptarea aa transportat n dreptul codonului de pe ARNm prin recunoaterea codon-anticodon, pe baza complementaritii bazelor

ARNmStructur -este monocatenar, liniar, de lungime variabil;

-este sintetizat prin transcrierea catenei matri sau template (necodificatoare).

-ARNm conine informaia n limbaj nucleotidic. ADN 5` - G C A T T A T G C - 3` 3` - C G T A A T A C G - 5`

ARN 5` G C A U U A U G C 3`-informaia depozitat n ARNm sub forma tripletelor de nucleotide numite codoni este decodificat la nivelul ribozomilor.

ARNm procariot este poligenic sau policistronic;

ntre gena transcris, ARNm i protein exist o relaie de colinearitate

ARNm eucariot este monogenic; nu este relaie de colinearitate: gen-ARNm-polipeptid

gena pentru sinteza ARNm cuprinde: exoni (expressed regions) i introni (intervening sequences);

ARNm matur care trec n citoplasm este prelucrat prin excizia intronilor;

ARNm eucariot are o via de ordinul orelorARNm bacterian are o via foarte scurt (2-3 minute)

ARN nuclear de mici dimensiuni (small nuclear RNA) Este bogat n uridin (U1, U2, U4, U5, U6).

se afl n nucleu, citosol i mitocondrie

prin asociere cu proteine, genereaz ribonucleoproteine (small nuclear ribonucleoproteins) sau snRNP ( denumite snurps)cu rol n:-excizia intronilor din ARNm transcript primar;-controlul traducerii.

TRANSCRIERE

Biosinteza ARN pe matri ADN

Transcrierea

are loc de cte ori este nevoie n viaa unei celule

nu angajaz tot cromozomul

Transcrierea este asimetriccatena ARN se construiete numai pe una dintre catenele ADN dublu catenar nuclear desemnat drept caten template matri sau necodificatoare

Catena netranscris (codificatoare) a ADN este identic cu ARN nou sintetizat, cu excepia nlocuirii timinei cu uracilul

Catenele ADN vor fi catene template (necodificatoare) pentru unele gene i catene codificatoare pentru alte gene.Catenele template se citesc, invariabil, n direcia 3` 5`.

Elemente necesare transcrierii:

ADN dublu helicoidal. Substrate: ATP, GTP, CTP, UTP

Enzime ARN polimeraze ADN dependente -au activitate polimerazic-necesit caten matri-pot iniia sinteza catenelor poliribonucleotidice -conin Zn i necesit Mg2+ -nu au activitate de corector-sintetizeaz ARN n direcia 5` 3`, antiparalel catenei ADN folosit ca matri

Direcia de sintez

Direcia de cretere a lanurilor ribonucleotidice rmne obligatoriu 5` 3`.

Reacia global catalizat de ARN polimeraz este:

5` GCA 3`

Procariotele Au o singur ARN polimeraz. Holoenzima, este un pentamer constituit din:enzima miez important n elongare;subunitatea adiional s, proprie iniierii transcrierii.In absena subunitii s, ARN polimeraza, se leag nespecific la ADN.

Eucariotele ARN polimeraza mitocondrial

ARN polimerazele nucleare, (cu sensibilitate diferit la a-amanitin -octapeptid biciclic, toxic, existent n ciupercile otrvitoare):

ARN p I, aflat n nucleoli, sintetizeaz ARNr 45S, insensibil la a-amanitin;

ARN p II, aflat n nucleoplasm, sintetizeaz ARNm, i ARN nuclear de dimensiuni mici foarte sensibil la a-amanitin;

ARN p III, aflat n nucleoplasm, sintetizeaz, ARNt, ARNr 5S i ARN nuclear de dimensiuni micisensibil la concentraii mari de a-amanitin

Etape:InitiereElongareTerminare

Unde ncepe transcrierea genei ?Secvente nucleotidiceFactori de transcriere

A.Secvenele promotor (P) secvene specifice de nucleotide, din molecula ADN, responsabile de iniierea transcrierii

punctul de start al transcrierii, este notat cu +1.

Secvenele nucleotidice situate n amonte (upstream), fa de punctul de start al transcrierii, se noteaz cu (-) Secvenele situate n aval (downstream) fa de +1 sunt notate cu (+)

Promotorii procariotelor sunt situai n amonte fa de +1 i sunt notai cu minus Promotorii, pentru cele mai multe gene bacteriene, au dou secvene consens situate pe catena codificatoare: caseta 10 (Pribnow) i caseta 35

La eucariote Acurateea iniierii transcrierii este realizat de: -elementele de activare n cis a genelor (secvene de ADN situate pe acelai cromozom cu gena de reglat)promotorienhancerisilenceriresponsive elements care mediaz rspunsul la diferite semnale printre care hormonii hidrofobi

La eucariote, fiecare ARN polimeraz, utilizeaz promotori diferii

ARNp I utilizeaz promotori identici,ARNp II utilizeaz o diversitate de promotori, cu secvene consens:caseta TATA, asemntoare casetei Pribnow, este responsabil de acurateea iniierii transcrierii;casetele CAAT i GC sunt responsabile de frecvena transcrierii.

B.Factorii de iniiere

La procariote subunitatea s a holoenzimei orienteaz legarea specific a ARNp la ADN

Bacteriile prezint mai multe tipuri de factori s

Etapele iniierii transcrierii :

formarea complexului nchis de iniiere prin legarea ARNp la promotorul specific, n regiunea 35 recunoscut de factorul s;

formarea complexului deschis de iniiereprin denaturarea ADN dublu catenar pe o poriune de ~10 perechi de baze pn la punctul de start al transcrierii

Formarea primei legturi fosfat diesterice ARNp, aflat cu situsul catalitic n dreptul semnalului de iniiere a transcrierii,leag nucleotidul +1, aproape invariabil unul purinic cu nucleotidul +2;

disocierea subunitii s din complexul ARN polimerazADN-ARN dup legarea primelor 10 nucleotide i

asocierea ei cu alt molecul de ARN polimeraz-miez.

La eucariote-elementele de activare n trans :factorii de iniiere a transcrierii = proteine specificeLa procariote factorul sLa eucariote fiecare polimeraz are setul su unic de factori de iniiere a transcrierii (cel puin 6 factori de transcriere acioneaz echivelent cu factorul s de la procariote)

Celulele eucariote au o capacitate de exprimare selectiv a genelor Viteza de sintez a unei proteine n dou celule din acelai organism poate diferi de 109 ori

Elongarea lanului polinucleotidic bucla de transcriere care cuprinde 12-17 perechi de baze ADN-ARN

La procariote,rifampin se leag de ARN polimeraz i i schimb conformaia mpiedicnd iniierea sintezei ARN

La eucariote rifampinul nu se leag de ARN polimeraz i nu este afectat sinteza ARN

Terminarea transcrierii La procariote a.Terminarea transcrierii independent de factorul proteic rho Catena matri ADN conine semnale stop. Structurile n ac de pr a ARN format, favorizeaz terminarea transcrierii.

Terminarea transcrierii rho dependent Factorul rho cu activitate ATP-azic se leag la o secven specific de ARN monocatenar. ARN este desprins de catena matri i de enzim

Transcriptul primar ARNm procariot este mai lung dect gena de transcris.

Inhibitorii transcrierii a.Antibioticul actinomicin D, ca i colorantul acridin, prin intercalarea ntre perechile de baze distorsioneaz molecula ADN mpiedicnd att transcrierea ct i replicarea.

b.a-amanitina (octapeptid biciclic, toxic, existent n ciupercile otrvitoare) este un inhibitor al ARN polimerazelor din celulele animale. c.Antibioticele din familia rifamicin, inhib specific iniierea transcrierii la bacterii. Odat iniiat transcrierea, rifamicina nu are rol inhibitor asupra procesului de elongare.

Rifampin, inhib iniierea transcrierii, la procariote, prin legarea la subunitatea b a ARN polimerazei-holoenzim. Deoarece nu inhib ARN polimerazele eucariotelor, antibioticul rifampin este folosit n tratarea tuberculozei i a altor infecii bacteriene.

La procariote

ARN se nate matur

La eucariote

ARN-polimerazele transcriu ntreaga gen

Transcriptele primare ARN conin exoni i introni

Intronii au dimensiuni cu mult mai mari dect exonii (de peste 100 de ori)

NUMAI 5-10% din genomul eucariot reprezint secvene codificatoare pentru proteine i ARN. Prezena intronilor i exonilor la eucariote este tipic:ARNmARNtARNr

Prelucrri post-transcriere la eucarioteeliminare fragmente polinucleotidice;

adugare fragmente polinucleotidice la capetele 3` i 5`;

modificri covalente ale unor resturi nucleotidice.

Dualitatea funcional a moleculei de ARNARN are rol catalitic i informaional

Moleculele ARN cu rol catalitic = RIBOZIMI Substratele ribozimilor sunt molecule de ARN

Sunt 2 tipuri de Ribozimi:cu activitate autocatalitiEx. introni care i catalizeaz propria excludere (self-splicing)

catalizeaz transformarea unor molecule din care acetia nu fac parteEx. ribonucleaza P care elimin extensia de la captul 5` din ARNt

Excizia intronilor

Excizia intronilor se realizeaz n nucleu, pentru toate tipurile de ARNEnzime specifice:s recunoasc jonciunile intron-exon s elimine intronii s lege exonii

exon intron exon5` __________AGGU------------CAGG __________ 3`

Mutaii la nivelul jonciunilor intron-exon pot genera un ARN inactiv care conine un intron rezidualUn defect de excludere a intronilor, ar putea duce la o sintez sczut a lanurilor de b-globin, fapt constatat n unele b-thalasemii.

Excizia intronilor din ARNrse realizeaz autocatalitic

necesit GTP sau guanozina

odat cu excluderea intronului, se leag cei doi exoni (splicing)

Enzima numit ribozim cu activitate autocatalitic i modific structura n timpul actului catalitic.

Excizia intronilor din ARNmeste realizat de splicozom format din:particule ribonucleoproteice (snurps) (ARN de dimensiuni mici bogai n uracil (U1, U2, U4, U5, U6) asociate cu proteine)ARNm transcript primar, subiect al prelucrrii.

n splicozom aciunea catalitic este realizat de ARN de dimensiuni mici.

Splicozomul dimensiune mare mpiedic ARNm precursor s prsesc nucleul nainte de prelucrarea sa complet la ARNm-matur

desfacerea legturii fosfat diesterice de la unul dintre capetele intronului este realizat de un nucleotid din cadrul intronului

Excizia intronului din ARNt

ARNt eucariot conine introni, n regiunea anticodon (succesiuni de nucleotide (20-40))

Excluderea acestor introni se face de un sistem multienzimatic cu rol de endonucleaz i ligaz

Modificri suplimentare exciziei intronilor n transcriptele primare ARNARNm procariot se nate matur

Modificri ale ARNm eucariot la eucariote ARNm devine funcional numai dup excizia intronilor i modificarea capetelor 5` i 3`:adugarea unui rest de 7-metil guanozin la captul 5`formarea cozii poliadenilice 3`

Formarea captului 5`prin adugarea unui rest de 7-metil guanozin la transcriptul primar.

Funciile captului 5`:protejaz moleculele de aciunea 5` 3` exonucleazelor;favorizeaz traducerea, fiind recunoscut de ctre ribozomi ca semnal de iniiere a sintezei proteinelor.

Modificarea captului 3` al ARNm prin formarea unor cozi poliadenilice de 200-300 nucleotide

Poliadenilarea se produce dup formarea captului 5` dar nainte de excizia intronului.

Poliadenilarea ajut la stabilizarea moleculei ARNm de aciunea exonucleazelor.

ARNm pentru histone i interferon nu sunt poliadenilai.

Modificri ale capetelor ARNttransformarea transcriptul primar multimeric n ARNt precursori monomerici care prezint extensii scurte 3` i 5`

Ribonucleaza P o endonucleaz format din:ARN cu rol catalitic (ribozim) i o protein cu caracter bazic) elimin extensiile din captul 5`

Formarea captului 3` matur al ARNtLa procariotesecvena CCA este relevat de o exonucleaz La eucariotesecvena CCA este adugat ulterior de ctre o nucleotidil-transferaz avnd ca substrate ATP i CTP

Modificarea covalent a unor baze prin reacii catalizate enzimatic: alchilare, tiolare, hidrogenare

Modificri ARNrLa eucarioteDin transcriptele primare 45 se formeaz ARNr matur: 28 S18 S i 5,8 S.

ARNr 5 S rezult dintr-o molecul precursoare diferit

La procariote, dup ndeprtarea ARNt obinut prin transcrierea unor gene ARNt intruse, se formeaz ARNr maturi: 23 S, 16 S, i 5 S prin clivarea ARNr precursor 30 S.