morfopat

157

Apoptoza. Implicatii in patologia maligna

DANIELA NICOLETA PETRUSCA*, OLIVIA MIHAELA POPA**, L. MESTER***

*Centrul de Imunologie, Institutul de Virusologie Stefan S. Nicolau, Bucuresti**Institutul de Genetica al Universitatii din Bucuresti, Aleea Portocalelor Nr. 1-3, Sector 6,Bucuresti***Universitatea din Bucuresti, Facultatea de Biologie

1.IntroducereMoartea celulara fiziologica este esentiala pentru dezvoltarea si functionarea normala

a organismelor multicelulare. Celulele non-necesare, deteriorate si potential nocive trebuieinlaturate din microclimatul celular sanatos pentru asigurarea homeostaziei structurale sifunctionale a tesutului. Exemple ale mortii celulare fiziologice au fost observate la aproapetoate tipurile celulare pe parcursul dezvoltarii si maturarii. Pe parcursul dezvoltariiembrionare modelarea celulara specifica si organogeneza sunt asigurate de un programspatiotemporal definit genetic de proliferare si moarte celulara. In tesuturile adulte, moarteacelulara fiziologica apare de asemenea proeminent in interiorul tesuturilor ciclic stimulate saudependente hormonal, cum sunt endometrul, prostata si glanda mamara, dar si in turnoverulstady-state al multor alte tesuturi. Moartea selectiva a celulelor este fundamentala pentrudezvoltarea, reglarea si functionarea sistemului imun, incluzand eliminarea timocitelor auto-reactive, selectia negativa a limfocitelor T si B si distrugerea celulelor realizata de limfociteleT citotoxice. Celulele ce au suferit deteriorari genetice ireparabile sunt de asemenea detectatede procese endogene, probabil limitandu-se astfel diseminarea leziunilor genetice potentialnocive. Limfocitele ce invadeaza tesuturi privilegiate din punct de vedere imunologic suntrapid eliminate, astfel protejandu-se regiunile sensibile de o deteriorare produsa printr-unraspuns inflamator (1). Conceptul unificator al tuturor acestor circumstante diverse este acelaca procesul de moarte celulara este mediat de un set comun de evenimente si se desfasoara pecai biochimice similare conducand la o dispunere stereotipa a modificarilor structurale.Aceasta moarte celulara este numita apoptoza.

Apoptoza este un proces innascut, conservat din punct de vedere evolutiv, prin carecelulele sistematic isi inactiveaza, isi dezasambleza si isi degradeaza propriile componentestructurale si functionale pentru desavarsirea propriului lor deces. Acest proces poate fi activatintracelular printr-un program de dezvoltare definit genetic sau extracelular prin intermediulproteinelor endogene, citokinelor si hormonilor ca si de componente xenobiotice, radiatii,stresul oxidativ si hipoxia. Abilitatea unei celule de a intra in apoptoza ca raspuns la unsemnal de moarte depinde de statusul sau proliferativ, pozitia ciclului celular si de expresiacontrolata a genelor care promoveaza, inhiba si afecteaza programul de moarte. Reglareastricta a acestor parametri modulatori ai mortii trebuie mentinuta pentru asigurarea contextuluifiziologic propice aparitiei apoptozei. Disfunctiile ce apar in oricare dintre punctele caii de


158

moarte programata, pot duce la un proces apoptotic eronat determinand astfel la exprimareaunor conditii fiziopatologice.

Importanta apoptozei deriva din natura sa activa si din potentialul sau de a controlasistemele biologice.

Moartea celulara a fost considerata la inceput un proces haotic. Totusi, asa cum ocelula isi poate echilibra metabolismul, penduland intre anabolic si catabolic, tot astfel unorganism multicelular trebuie sa echilibreze ratele de proliferare celulara si de moarte celularapentru mentinerea homeostaziei. De asemenea, un organism trebuie sa indeparteze celulelesenescente, deteriorate sau anormale care ar putea sa interfere cu buna functionare a unuiorgan sau s-ar putea transforma malign. Ca urmare, alterarile survenite in domeniul reglariimortii celulare ar putea contribui la patogeneza bolilor degenerative si neoplazice. Desimoartea celulara fiziologica se cunoaste de decenii, interesul pentru aceasta problema a fostreactualizat in 1972, cand Kerr, Wyllie si Currie au descris in detaliu modificarileultrastructurale caracteristice celulelor muribunde si au propus termenul de apoptoza pentrudescrierea acestui proces (2). Ei au evidentiat faptul ca moartea celulara fiziologica nu este unproces randomic, ci are trasaturi morfologice distincte. De obicei apoptoza afecteaza celuleindividuale si, odata initiata, se propaga rapid.

Ingestia celulelor apoptotice de catre macrofage nu induce eliberarea enzimelorproteolitice sau a oxigenului singlet care e toxic. Fragmentarea celulelor are loc fara scurgereacontinutului celular in spatiul extracelular, iar indepartarea celulelor apoptotice nu provoacaun raspuns inflamator. Absenta inflamatiei reprezinta o trasatura cruciala permitandu-se astfelmoartea celulei fara deteriorarea celulelor adiacente.

2. Apoptoza versus necrozaMoartea celulara poate fi accidentala sau programata intr-un organism multicelular.

Dovezile sprijina ipoteza existentei unui program de sinucidere inerent in celulelevertebratelor care este activat atunci cand moartea celulei este dorita pentru binele restuluicomunitatii celulare.

In tesuturile vertebratelor s-au descris doua modele de moarte celulara cu morfologiedistincta: apoptoza si necroza (3, 4), insa mecanismele lor la nivel molecular nu sunt incacomplet intelese.

NECROZA poate fi descrisa ca si colapsul metabolic celular si apare cand celula nu-simai poate mentine homeostazia ionica. Pe masura ce nivelurile de ATP se epuizeaza sigradientul ionic transmembranar se disipa, celulele se umfla si organitele intracelulare sedilata. Initial se observa inmuguriri reversibile ale membranei, modificari timpurii inconformatia si functia mitocondriilor si celula devine rapid incapabila de a mentinehomeostazia. Depasind un prag, procesul devinde ireversibil. Membrana celulara poate devenisitusul major al alterarilor pierzandu-si astfel capacitatea de reglare a presiunii osmotice,celula se umfla si crapa. Deteriorarile membranelor interne permit eliberarea enzimelorlizozomale, continutul celulei este imprastiat in spatiul tisular inconjurator si provoaca unraspuns inflamator nespecific.

Necroza este indusa tipic de modificari extreme in mediul inconjurator al celulei, cedetermina leziuni severe si bruste, provocate de exemplu de ischemie, hipertermie mentinutasau traume fizice sau chimice. Se presupune ca necroza nu este influentata genetic (5),(figura 1).

DANIELA NICOLETA PETRUSCA, OLIVIA MIHAELA POPA, L. MESTER

159

Figura 1. Ilustrarea secventei de modificari ultrastructurale care au loc in apoptoza (2-6) si necroza (7si 8). (1)Celula normala. Apoptoza timpurie (2) se caracterizeaza prin compactarea si marginalizarea cromatinei,condensarea citoplasmei si plierea membranelor, nucleara si plasmatica (3). In ultima etapa, nucleul sefragmenteaza si protuberantele formate pe suprafata celulei se separa pentru a forma corpii apoptotici, care (4),sunt fagocitati de celulele vecine si (5 si 6) degradate in lizozomi (7). Necroza este asociata cu grupareaneregulata a cromatinei, umflarea organitelor si distrugerea focala a membranelor (8). Apoi membranele sedezintegreaza dar, in general, celula isi mentine intreaga conformatie pana la indepartarea ei de catre fagocitelemononucleare.

APOPTOZA este o forma de moarte celulara in care procesul este mult mai subtil.Este adesea echivalata cu moartea celulara programata, dar este bine sa mentinem cele douaconcepte distincte - cel morfologic si cel escatologic. Apoptoza se refera la o serie demodificari morfologice pe parcursul procesului de moarte celulara, modificari diferite de celeobservate in necroza, fiind asociata cu procesul normal de reglare a tesuturilor (fig. 1). Lavertebrate, moartea celulara este acceptata ca un proces obisnuit si chiar accentuat previzibil,dar programarea ei nu se face in sensul acceptat la nevertebrate, ca o moarte a celulelorindividuale, care in anumite cazuri poate fi apreciata, cu mare acuratete, ca fiind programata(6, 7). In ultima vreme suntem fortati sa acceptam observatia, aparent paradoxala, ca moarteacelulara este atat programata cat si stohastica. De exemplu, pe parcursul dezvoltariipopulatiilor de celule B, aproximativ 95 % din celule vor muri dintr-unul dintr-o varietate demotive (rearanjament genic imperfect sau absenta stimularii) dar este imposibil de prevazutdinainte care dintre ele se va produce.


160

Apoptoza apare in celule individuale dispersate, nu in grupuri de celule invecinate, asacum se intampla in necroza.

Se pare ca apoptoza prezinta cea mai comuna morfologie atunci cand moartea celularaeste determinata fiziologic. Referindu-ne la mamifere, exemplele includ moartea celulelor cuperioada de injumatatire scurta (neutrofile); eliminarea celulelor T autoreactive; involutiacelulelor lipsite de factorii de crestere necesari; moartea morfologica a celulelor pe parcursulevolutiei embrionare si postembrionare timpurii; si omorarea celulelor care servesc drepttinte celulelor T, celulelor natural ucigase (NK), sau mecanisme citotoxice mediate celulardependente de anticorpi.

Motivul pentru care celulele trebuie sa moara este diferit de la un tip celular la altul lafel si mecanismul de declansare. Deseori semnalul de sinucidere provine din mediulinconjurator, ca in expunerea la sau retragerea dintr-un mediu cu hormoni sau factori decrestere. Acest aspect este incitant din punct de vedere conceptual, atata vreme cat se traduceprin faptul ca soarta unei celule este dependenta de activitatea alteia; chiar daca moartea esteprogramata, locusul programului este in afara celulei care trebuie sa moara. In alte cazuri, deexemplu turnoverul neutrofilelor, se pare ca celula are un ceas intern autonom care ar controlaprogramul de moarte a celulei (adevaratul program de moarte celulara autonom a fostidentificat la nematode si genele ce controleaza acest proces au fost elucidate (8). Caile deactivare a apoptozei vor fi diferite in diferite celule, dar mecanismul de moarte in sine va fimereu acelasi, ceea ce inseamna ca exista o cale finala comuna. Este foarte important ca instudiul apoptozei sa incercam sa facem distinctia dintre procesele care sunt specifice celuleide cele care sunt specifice mortii. Se pare ca exista multe mecanisme declansatoare ale cailorde sinucidere, chiar si intr-un singur tip de celula. Nu toate acestea vor fi recunoscute imediatca fiind programate. De exemplu, pentru a activa calea apoptotica, timocitele pot fisemnalizate de catre glucocorticoizi sau de o cross-linkare a receptorului pentru antigen, inacest caz, ambii stimuli fiind considerati fiziologici. Dar, timocitele vor suferi un procesapoptotic identic dupa expunerea la o doza mica de radiatii ionizante sau la o otrava.Deoarece nici unul dintre acesti agenti nu este fiziologic, in acest caz moartea celulelor nupoate fi strict definita ca fiind programata. Totusi definitia poate fi largita in sensul ca inanumite celule, cand sunt deteriorate nespecific, se poate activa fiziologic o moarteprogramata. Aceasta presupune ca deteriorarea sa nu fie foarte severa pentru ca programul sapoata fi exprimat: daca timocitele sunt mentinute la 43C vor muri prin necroza, dar daca serevine, suficient de rapid, la o temperatura de 37C, vor muri prin apoptoza. S-a sugerat ca, arfi prea periculos pentru limfocite sa incerce repararea unor astfel de tipuri de leziuni, atatavreme cat o reparare imperfecta ar putea duce la instalarea autoimunitatii sau a leucemiei inastfel de cazuri celulele activandu-si mecanismul apoptotic.

3. Fazele procesului apoptoticControlul general al numarului de celule ce se efectueaza prin intermediul ciclului

celular este compus dintr-un sistem multicompartimentat in interiorul caruia celula are celputin 3 optiuni posibile (fig.2).

Celula poate fi:1) metabolic activa dar nu desfasoara nici procesul de proliferare si nici cel de

apoptoza (celula aflata in faza G0);2) in curs de desfasurare a procesului de proliferare (G0G1SG2mitoza)3) pe punctul de a desfasura procesul de moarte celulara fie pe calea programata

(G0D1FD2fragmentare celulara apoptotica), fie pe calea neprogramata(necroza) (figura 2).


161

Figura 2. Schema desfasurarii ciclului celular care arata optiunile unei celule aflate in faza G0. D1 definesteperioada pe parcursul careia se activeaza noi gene a caror expresie proteica este ceruta pentru inducereafragmentarii ADN (faza F). D2 defineste perioada insasi celula se fragmenteaza in corpi apoptotici.

Celulele pot fi induse sa intre pe calea mortii celulare programate din orice faza aciclului celular de proliferare (G1, S sau G2). Semnalele locale sau sistemice ale factorilor decrestere ce regleaza progresia in interiorul ciclului celular sunt specifice tipului celular si suntindependent determinate ca parte a fenotipului de diferentiere a celulei in cauza. Astfel,acelasi factor de crestere (ex: factorul transformant de crestere 1) poate avea efecteagoniste sau antagoniste in cadrul ciclului celular al diferitelor tipuri de celule (ex: inductor alproliferarii celulare in celulele mezemhimale sau inductor al arestului in G0 sau progresia prinfazele apoptozei pentru celulele epiteliale).

Procesul apoptotic poate fi impartit in trei etape distincte:- angajarea, in care celula care a primit un stimul apoptotic letal devine ireversibil

angajata pe calea mortii;- executarea, pe parcursul careia apar majoritatea modificarilor structurale;- clearance-ul, in cadrul caruia resturile celulare sunt indepartate prin fagocitoza.Modificarile structurale ce apar pe parcursul fazei executorii au fost descrise pentru

prima data de Kerr si colaboratorii (2), iar acum sunt din ce in ce mai bine intelese din punctde vedere al mecanismului.

4. Morfologia apoptozeiPe parcursul fazei de executie, apar modificari morfologice si biochimice coordonate

in interiorul nucleului, citoplasmei, organitelor si membranei plasmatice. Modificarilemorfologice care se observa cel mai usor sunt cele care apar in interiorul nucleului. Cromatinacondenseaza si formeaza agregate de-a lungul periferiei nucleare relevand un modelconformational semilunar. Caracterizarea morfologica a cromatinei demonstreaza o degradareordonata a ADN-ului de catre o nucleaza endogena dependenta de cation (9), intai infragmente mari de 30-50 kilobaze (10) pana la fragmente nucleozomale de 180-200 perechide baze (11). Totusi, clivarea cromatinei la fragmente nucleozomale nu are loc in toatetipurile celulare si poate fi inhibata fara a bloca celelalte modificari ale apoptozei (12,13).


162

Odata cu condensarea cromatinei este alterata ultrastructura nucleara. Lamina nucleara sireteaua de filamente intermediare care mentine integritatea anvelopei nucleare si distributiaporilor nucleari sunt clivate proteolitic (14-16). Astfel, distrugerea structurii retelei nucleare arputea permite alaturarea porilor nucleari (17) si faramitarea nucleului in fragmente ce contincromatina, care, majoritatea mentin vestigii ale membranei nucleare. Celelalte organitecitoplasmatice raman intacte din punct de vedere structural cu toate ca difunctiilemitocondriale sunt asociate cu apoptoza (18) (figura 3).

Modificarile nucleare sunt precedate de reducerea potentialului transmembranarmitocondrial, necuplarea transportului de electroni de la sinteza ATP-ului si crestereagenerarii de specii reactive de oxigen. In citoplasma apare cross-linkarea de proteine prinactiunea transglutaminazelor (19), filamentele citoscheletale se agrega in formatiuni paralelesi reticulul endoplasmic se dilata si fuzioneaza cu membrana plasmatica creand cratere informa de sac la nivelul fuziunii. Se poate specula faptul ca celula sufera o alterare profunda acitoscheletului. Cu toate ca, pana in momentul de fata, aceasta problema nu a fost studiata indetaliu, exista exemple in care distrugerea citoscheletului duce la angajarea celulei pe caleaapoptotica, in timp ce, stabilizarea citoscheletului inhiba apoptoza. In apoptoza, membranacelulara se umfla si se cuteaza intr-o masura mult mai mare decat in necroza, fenomenul a fostnumit zeioza. Integritatea structurala a membranei este ulterior compromisa prin pierdereaasimetriei fosfolipidice, a microvililor si a jonctiunilor intercelulare. Celula se sfericizeaza, seindeparteaza de vecinii sai si se contracta dramatic si expulzeaza protuberante care se separain corpi apoptotici inveliti in membrana. In interiorul tesuturilor, celulele apoptotice sicorpii apoptotici sunt recunoscuti si fagocitati rapid de catre celulele vecine sau macrofage.

Figura 3. Stadiile apoptozei intr-un limfocit. Aceste stadii sunt observate mai bine in culturi izolateatata vreme cat in vivo ar interveni fagocitoza: (a) Celula normala are o citoplasma dispersata si cromatinanucleara heterogena. Volumul celulei e de aproximativ 90 fL. (b) Celula a pierdut o parte din volum si organitelecitoplasmatice sunt strans impachetate, se observa ingramadiri ale cromatinei. In acest stadiu sunt prezentemodificarile membranare care duc la fagocitoza. (c) Celula etaleaza zeioza. (d) Colapsul cromatinei cu aranjareaei in forma de semiluna de-a lungul anvelopei nucleare. Volumul celular este acum de 70 fL. (e) Nucleul areacum aspectul unei gauri negre. (f) Nucleul se fragmenteaza in sfere, iar membrana se cuteaza vormand vezicule.(g) Fragmentele celulare continute in corpii apoptotici care, pentru o vreme, continua sa excluda colorantul vital.

Recunoasterea celulelor apoptotice de catre fagocite poate implica interactii alelectinelor macrofagelor endogene cu resturi zaharidice N-acetil specifice exprimate pe


163

suprafata celulelor apoptotice, interactiile specific mediate de receptori cu fosfatidilserina dinstratul exterior al membranei plasmatice si interactiile trombospondina/receptori de suprafatacelulara, ce contin resturi incomplet caracterizate, de pe suprafata celulelor apoptotice (20).Exista evidente ce sugereaza ca mecanismul de recunoastere poate fi diferit in functie depopulatia de fagocite. Semnificativ pentru strategia centrala a acestui tip de moarte celularaeste clerance-ul rapid si eficient al resturilor apoptotice de catre fagocitele vecine, amatoaresau profesioniste, deoarece previne raspunsul inflamator care, altminteri, ar urma caleadistrugerii celulare si deversarea proteinelor intracelulare si a acizilor nucleici in spatiulextracelular.

Odata ce faza de executie a apoptozei este activata, intregul proces demareaza rapid sieste complet terminat in cateva ore (21). Durata acestei faze este relativ invariabil in raport cutipul celular si stimulul apoptotic sugerand ca stadiul final al apoptozei trece printr-o calecomuna. Totusi, stadiul de angajare, timpul de la receptarea stimulului apoptotic pana lainitierea fazei ireversibile de executie este extrem de variabil si depinde de tipul celular, destimulul apoptotic, de situarea in cadrul ciclului celular si de expresia diversilor factorimodulatori ai mortii. Multi factori care influenteaza angajarea sau susceptibilitatea celulara laapoptoza sunt implicati direct in receptia si transmiterea semnalului apoptotic. Acesti factorireglatori sunt frecvent selectati pentru a bloca procesul pe parcursul transformarii neoplazicesau dezvoltarii rezistentei la medicamente si sunt subiectul modificarii virale.

Perioada de fragmentare a ADN (figura 2, faza F) poate fi utilizata pentru dividereain serii temporale a evenimentelor implicate in apoptoza mai mult decat perioada sintezei deADN (figura 2, faza S) ce este utilizata pentru impartirea ciclului celular proliferativ (22). Peparcursul fazei D1 apoptotice, celula sufera o reprogramare genetica, proces pe parcursulcaruia gene care erau normal exprimate acum sunt supresate si invers (23-26). Acestemodificari epigenetice au ca rezultat fragmentarea dublu catenara a ADN pe parcursul fazei F.Pe parcursul acestei faze F morfologia nucleara se schimba (marginalizarea nucleara acromatinei urmata de condensarea nucleara si eventual de fragmentarea nucleului insusi), cutoate ca membranele plasmatica si lizozomala sunt inca intacte si mitocondria inca functionala.Pe parcursul urmatoarei faze, portiunea D2, apare inmugurirea membranei si eventualfragmentarea celulara in clustere de corpi apoptotici inveliti in membrana.

5. Biochimia apoptozeiCelulele care sufera apoptoza, se contracta considerabil, iar electrono-micrografiile

evidentiaza o citoplasma extrem de condensata cu organite ce par a fi normale. Cea maiplauzibila explicatie ar fi aceea ca celula a pierdut apa si, cum nu se evidentiaza o umflareimediata, probabil a pierdut ioni izoosmotic. De asemenea, nu au fost descrise leziunispecifice ale organitelor citoplasmatice, sau ele nu au fost cautate intr-un mod adecvat. A fostobservata umflarea cisternelor reticului endoplasmic.

Biochimic, in celula are loc reducerea sintezei de ARN si proteine urmata dedegradarea lor, dar sincronizarea acestor evenimente in raport cu modificarile morfologice nueste inca bine caracterizata. Totusi, initial s-a crezut ca tranzitia de la normal la contractareaapoptotica se realizeaza atat de rapid incat nu poate fi observata o stare intermediara,citometria in flux poate ajuta la caracterizarea modificarii si in combinatie cu sortarea celularapoate inlesni o patrundere mai profunda in ordinea evenimentelor.

Desi apoptoza este un proces opus necrozei, reprezentand calea fiziologica de moartecelulara, poate fi de asemenea provocata de stimuli patologici. In general, orice stimul ceproduce necroza prin distrugere celulara directa poate induce apoptoza, in cazul in care celulainitial supravietuieste. In acest sens, apoptoza reprezinta un raspuns celular coordonat la


164

stimuli vatamatori care nu sunt imediat letali. Nu se poate vorbi de o serie invariabila deevenimente metabolice ce au loc in cursul apoptozei. Totusi, timpuriu, in apoptoza, in multetipuri celulare apare o crestere sustinuta a nivelului de calciu ionizat citosolic. Calciul, poateactiva latent enzime care contribuie la modificarile structurale din cursul apoptozei. Acesteenzime includ o endonucleaza nucleara calciu dependenta care cliveaza invariabil ADN si otransglutaminaza care crosslinkeaza proteine citosolice. Proteazele calciu dependente(calpaina) degradeaza citoscheletul (figura 4) (27-29).

In general, procesul apoptotic are nevoie de energie sub forma de ATP, reclamasinteza activa a ARN si proteina depinde de tipul celular si stimulul apoptotic. In limfocitelemature, agentii care inhiba ARN-ul sau sinteza proteica in general duc la blocarea apoptozei;din contra, in neutrofilele imature si in unele linii celulare leucemice, aceeasi compusiamplifica apoptoza. Una din explicatiile acestei contradictii este ca majoritatea celulelorcontin proteine reglatoare care pot inhiba sau promova moartea celulara fiziologica. Intr-untip particular celular, comparand ratele catabolice ale inhibitorilor si promotorilor se poatedetermina daca sistarea sintezei de ARN si proteice previne sau induce apoptoza.

Figura 4. Evenimente metabolice ce au loc in apoptoza.

In celulele destinate sa sufere apoptoza creste mRNA pentru -tubulina inainte deaparitia modificarilor morfologice si a clivajului DNA. Intr-o etapa ulterioara, apar si incitoplasma cantitati crescute de -tubulina. Probabil ca, genele pentru -tubulina suntdegradate impreuna cu restul DNA-ului nuclear indata ce endonucleaza devine activa (30).Agentii care interfera cu polimerizarea actinei, cum ar fi citocalasina B, s-a aratat ca previninmugurirea celulara ce duce la formarea corpilor apoptotici fara a bloca fragmentareanucleului sau clivajul DNA (31).


165

5.1. Activitatea endonucleazica, structura cromatinei si degradarea ADN in apoptoza

Nucleul este locul producerii majoritatii modificarilor dramatice ce au loc in apoptoza.Modificarile sunt studiate mai bine cu ajutorul microscopiei electronice de transmisie(figura 5), dar au fost deja vizualizate in celule vii in urma utilizarii colorantilor fluorescenticum sunt acridin oranjul sau Hoechst 33342. Modelul modificarilor difera de la un tip celularla altul dar, in general, nucleul se contracta si cromatina devine foarte densa, se fragmenteazasi, in final se leaga strans de anvelopa nucleara.

Aceasta modificare este adesea acompaniata de fragmentarea ADN in subunitatiregulate ce formeaza o scara ca rezultat al ruperii dublu catenare, aparent randomice lanivelul regiunilor linker dintre miezurile nucleozomale. In fiecare celula exista peste unmilion de astfel de rupturi ceea ce releva o situatie imposibil de reparat si ca urmare are locsistarea transcriptiei (32).

In ultimii ani a existat o controversa cu privire la dimensiunile fragmentelor deADN, produse pe parcursul apoptozei, responsabile de angajamentul ireversibil pe caleamortii celulare.

Figura 5. Modificarile structurale ale celulei pe parcursul apoptozei. Imaginea superioara reprezinta o celulanormala. Imaginea inferioara reprezinta o celula in cursul procesului de apoptoza; sagetile indica fragmente decromatina condensata.


166

Exista o serie de rapoarte ce precizeaza ca atunci cand celula intra in apoptoza ADN-ul genomic este degradat in fragmente mici nucleozomale (repetari de cate 200 pb). Totusi auexistat rapoarte ce sustineau ca celulele pot intra in apoptoza pe criterii morfologice faraproducerea scarii de ADN nucleozomal (33-36, 37).

O serie de investigatii au sugerat ca proteinele responsabile de fragmentarea letala aADN in apoptoza sunt endonucleaze de tip DNaza I care, pentru activare, depind de calciu(Ca2+) (11, 38). De asemenea, intr-o serie de tipuri celulare, in care a fost indusa apoptoza subdiferite forme, s-a demonstrat elevarea sustinuta a nivelului de ioni liberi de calciu intracelular(Cai) (39-43) care s-a sugerat ca ar fi necesari pentru activarea endonucleazelor deaproximativ 23 kD (44, 45). Celulele raspund la o crestere a Cai prin pomparea calciului ininteriorul unei organite intracelulare sau in afara celulei prin membrana citoplasmatica. Astfelde transport de Ca2+ este catalizat de schimbul membranar de Na2+ - Ca2+ si de proteinele ATP-aze Ca2+. Deoarece ATP-aze Ca2+cere un proton pentru transportul vectorial al Ca2+ in afaracelulei un astfel de transport ar putea acidifia celula daca nu ar fi imediat tamponat sautransportat in afara celulei (46).

In modelul propus de Filipski in 1990 (figura 6) este privit ca fiind ordonat in buclede cromatina bine stabilizate de cate 50 Kb, aceste bucle sunt infasurate in structurihexamerice numite rozete si continand aproximativ 300 Kb de ADN. Rozetele formeazasubunitatea de baza a cromatidei rasucite.

Au fost studiate activitatile endonucleolitice asociate cu fragmentarea ADN cu masamoleculara mare cu ajutorul tehnicii PFGE (pulsed field gradient gel electrophoresis). S-aobservat, in toate tipurile de celule studiate, o activitate dependenta de Mg2+ capabila deproducerea fragmentelor de la 50 Kb la 300 Kb, iar ionii de Ca au fost necesari pentrufragmentarea ulterioara la oligonucleozomi (47-49). Aceaste experimente au sugerat ca arputea fi necesare doua enzime separate pentru fragmentarea completa a ADN pe parcursulapoptozei. Totusi, utilizand chelatori ai Ca2+ intracelular (50) s-a observat ca pentrudegradarea ADN de masa moleculara mare sunt de asemenea necesare cantitati nanomolarede calciu, complicand astfel explicatia fenomenului de clivare. De asemenea s-a observat cafragmentarea internucleozomala de ADN poate fi blocata de catre zinc, cunoscut inhibitor alendonucleazelor Ca2+ si Mg2+ dependente (51, 52).

In continuare s-a demonstrat faptul ca fragmentarea internucleozomala a ADN inapoptoza nu este randomica (53). Fragmentarea apare preferential in elementele repetate aleADN care au un rol in organizarea structurala a cromatinei.

Figura 6.Modelul Filipski et al. (1990) ce prezinta structura cromatinei. Sagetile corespund situsurilor declivare ale cromatinei.


167

De asemenea, se pare ca nucleozomii sunt eliberati de preferinta din regiuneadomeniilor rozeta si/sau bucla ce contin elemente repetitive ale ADN pe parcursul fazeisecundare de degradare. S-a aratat ca sensibilitatea generala a cromatinei la nucleaze nu estealterata pe parcursul apoptozei (54). Aceasta indica faptul ca in conditiile unui nivel ridicat deCa2+ fragmentarea de ADN are loc in interiorul buclelor de ADN la un numar strict de locisi nu e dependent de gradul de pliere al fibrei de 30-nm care determina accesibilitateagenerala a regiunilor linker (55). Luand in considerare toate aceste date se poate spune cafragmentarea endogena a ADN pe parcursul apoptozei se produce in 3 etape (fig. 6). Primaetapa incepe cu activarea unei endonucleaze legata constitutiv de o clasa de SAR (regiuni deatasare a matricei si citoscheletului) bogate in legaturi A-T, care ataseaza domenii mari alecromozomului la matricea nucleara. Concentratia nucleara endogena de Mg2+ este suficientapentru activitatea ei. Nu este nici o cerinta de Ca2+ atat timp cat ADN este monocatenar. S-auevidentiat astfel o serie de fragmente monocatenare de ADN pe parcursul procesului deapoptoza. A doua etapa implica propagarea acestei degradari la alte clase de SAR. Aceastapropagare are o dependenta de Ca2+ sugerand ca situsurile si-au imbogatit compozitia in C-Gsi toata cromatina este redusa la fragmente de ~ 300 kb. In etapa a treia se cliveaza ADNinternucleozomal la regiunile linker din interiorul buclelor si genereaza scara ADN.Aceasta clivare este relativ independenta de secventa (in termeni legati de situsurile ce leaganucleaza) dar necesita Ca2+ pentru cinetica. De asemenea, aceasta etapa necesita proteoliza(56). Factorii aditionali implicati in aceasta etapa ar putea realiza extensia finala afragmentarii ADN ce difera mult de la un tip celular la altul. Toate aceste etape de degradaresunt catalizate de o enzima sau doua pool-uri de enzime cu proprietati DNaza-I like.

ADN-ul mitocondrial nu sufera fragmentare (57). Se presupune ca aceasta clivare aADN-ului nuclear, intr-o etapa timpurie a procesului, poate avea un rol protector prin evitareatransferului de material genetic potential activ celulelor vecine dupa fagocitarea corpilorapoptotici (58). Exista si tipuri celulare in care apoptoza tipica, care include modificarilenucleare, este observata microscopic ca fiind lipsita de clivajul nucleozomilor ADN. Totusi,in putinele sisteme in care a fost studiata, au fost observate anumite forme de deteriorare aADN (ruptura monocatenara extinsa, rare fragmentari dublu-catenare), necesare modificarilormorfologice profunde. Nu exista un consens privind rolul pe care il joaca fragmentarea ADNce are loc inaintea mortii celulare. Desi transcriptia este oprita, ea insasi nu este atat de rapidletala precum este apoptoza, ceea ce inseamna ca sunt implicate si alte procese. S-a constatatfaptul ca acidul aurin tricarboxilic, care inhiba nucleaza, este un ihibitor al tuturor aspectelorlegate de apoptoza; dar este incorect sa concluzionam ca, prin urmare, distrugera ADN estepasul critic in procesul apoptozei, atata vreme cat aurinul inhiba multe alte reactii metabolicecelulare.

5.2. Modificarile membranei plasmatice

Fagocitarea rapida a corpilor apoptotici de catre celulele adiacente, cat timpmembranele lor celulare sunt intacte (pentru prevenirea inflamatiei si lezarii tesuturilor in carese formeaza, in special cand procesul apare in conditii fiziologice) implica operarea unuimecanism de recunoastere foarte specific si exista dovezi care sustin existenta mai multorastfel de mecanisme (59).

In mod normal, fosfolipidele membranei plasmatice sunt distribuite asimetric. Lipidelece contin colina, cum ar fi fosfatidilcolina (FC) si sfingomielina sunt concentrate pe fataexterna a membranei plasmatice in timp ce aminofosfolipidele cum sunt fosfatidiletanolamina(FEA) si fosfatidilserina (FS) abunda pe fata interna a membranei plasmatice. Dintre toatefosfatidilserina (FS) este restrictata in majoritatea celulelor exclusiv la fata interna amembranei (60). Pierderea asimetriei fosfolipidice si expunerea FS a fost prima oara


168

demonstrata pentru limfocite (61) dar aceasta descoperire a fost confirmata intr-o serie detipuri celulare (62).

Externalizarea FS este rapida sugerand mai degraba un transport facilitat decat odifuzie pasiva a lipidelor prin bistrat. Aceasta activitate se presupune ca este mediata de oproteina enzimatica activata de calciu, ATP independenta si nespecifica din punct de vedere alfosfolipidelor transportate (63).

Din punct de vedere biologic, expunerea FS la suprafata e considerata a fi un ligandpentru inlaturarea rapida a celulelor ce-l exprima. O alta consecinta biologica este legata defaptul ca FS serveste drept cofactor pentru cascada de coagulare (64) domeniu in care dateleincep sa se contureze sugerand ca FS poate avea o serie de efecte anti-inflamatoare sauimunosupresive.

6. Recunoasterea si inlaturarea celulelor apoptoticeEvenimentul final, comun pentru majoritatea celulelor apoptotice este reprezentat de

recunoasterea si indepartarea lor de catre fagocite. Celulele apoptotice sunt indepartateinaintea lizei lor, acest eveniment sugerand ca ele exprima modificari specifice pe suprafatace semnalizeaza fagocitelor legarea si inglobarea lor. Aceste fagocite pot fi profesioniste(macrofagele) sau amatoare (fibroblaste, celule epiteliale si celule musculare netede dinperetii vaselor de sange). Pana acum au fost descrisi mai multi receptori pe macrofage si altecelule ce leaga celulele apoptotice si mediaza inglobarea lor. Acestia sunt reprezentati dereceptori lectin-like (65), receptorul pentru vitronectine v3 (66), CD36, receptorul derecunoastere al fosfatidilserinei (67), inca necaracterizat, CD14 (68) si receptori scavanger(69). De curand, s-a demonstrat ca transportorul ABC1, de asemenea implicat in inglobareacelulelor mamaliene apoptotice, mediaza transportul anionic fiind omolog genei ced-7asociata cu fagocitoza corpilor apoptotici in C. elegans. Mecanismul prin care acesti receptorimediaza fagocitoza celulelor apoptotice nu este cunoscut, iar liganzii acestor receptori nu suntinca bine caracterizati. Cu toate acestea comun multor celule ramane expunereafosfatidilserinei pe fata externa a membranei plasmatice, acest fosfolipid parand a firecunoscut intr-o maniera stereospecifica de catre subseturi de macrofage, de catre celulemelanoma, de celule musculare netede din peretii vaselor de sange si de celule Sertoli. In modnormal, fosfolipidele de membrana sunt distribuite asimetric.

Macrofagele sunt fagocite profesioniste ce indeparteaza celulele si corpii apoptotici,dar la acest proces pot participa si alte tipuri celulare, ca de exemplu celule epiteliale situmorale ce pot ingloba celule apoptotice vecine. In timpul inglobarii celulelor apoptotice,macrofagele nu elibereaza agenti de tipul eicosanoizilor si citokinelor (70). Lipsa acestuiraspuns pare a fi determinata de mecanismul prin care celulele apoptotice sunt ingerate, datfiind ca celulele apoptotice, opsonizate pentru a putea fi preluate de receptorii Fc aimacrofagelor, induc, de exemplu, eliberarea de tromboxan. Totusi, daca celulele apoptoticenu sunt preluate de catre macrofage, ele se umfla si se dezintegreaza eliberandu-si continutul.Daca ar avea loc un astfel de eveniment pe parcursul clearance-ului neutrofilelor din situsurileinflamate, eliberarea continutului granulelor citoplasmatice ar avea consecinte nefaste. Maimult decat atat, evadarea nedorita a materialului nuclear din leucocitele moarte, poate fi deasemenea periculoasa, nucleozomii eliberati din limfocitele apoptotice neingerate pot stimulasinteza de ADN si imunoglobuline in limfocitele viabile (71). Prin urmare, este posibil cadezintegrarea limfocitelor apoptotice (presupus neingerate) sa constituie o sursa de ADNnucleozomal circulant, observat de altfel la anumiti pacientii cu lupus sistemic eritematos,contribuind la stimularea policlonala a celulelor B tipica pentru aceasta afectiune autoimuna si


169

tintind autoanticorpi catre paturile vasculare, cum ar fi glomerulii renali, in care componentelenucleozomale circulante s-ar putea lega (72).

Exista mai multe mecanisme posibile de recunoastere a celulelor apoptotice de catrefagocite si de asemenea, mai multe statusuri tinta etalate de celulele apoptotice.

Lectinele fagocitelorUn mecanism obisnuit de interactie intercelulara il reprezinta legarea carbohidratilor

de la suprafata celulara a unei celule de lectinele altei celule, mecanism ce poate fi inhibatspecific de catre zaharuri simple recunoscute de lectine.

Unele din consecintele apoptozei sunt reprezentate de modificarile specifice alecarbohidratilor de pe suprafata membranei celulare. Se presupune ca pierderea, printr-unmecanism inca necunoscut, a unui reziduu terminal de acid sialic din lanturile lateraleglicoproteice ar putea sa expuna N-acetilglucozamina, N-acetilgalactozamina si galactoza,mascate in conditii normale, restituind aceste reziduuri accesibilitatii interactiunii cupresupusele lectine macrofagice (73) (figura 7).

Figura 7. Trei mecanisme prin intermediul carora fagocitele ar putea recunoaste celulele ce intra in apoptoza.

Receptori trombospondinici ai fagocitelorMacrofagele umane derivate din monocite (HMDM) pot recunoaste neutrofile si

limfocite umane apoptotice prin intermediul receptorilor pentru vitronectina (VnR) v3 sireceptorii scavenger din clasa B (CD36) (74). Acesti receptori se leaga de trombospondina ceserveste drept punte intre macrofage si celulele apoptotice. Se pare ca aceasta recunoastere


170

este independenta de expunerea fosfatidilserinei le suprafata membranei celulei apoptotice sipare a fi legata de fenotipul macrofagului si nu de tipul celulei apoptotice.

Receptorii pentru fosfatidilserinaEste clar ca macrofagele pot recunoaste fosfatidilserina intr-o maniera dependenta de

doza si de stereospecificitate, fapt ce sugereaza existenta receptorului pentru FS. Au fostdescrisi o serie de receptori cu rol in medierea recunoasterii FS si anume CD68, CD14,anexinele, receptorii scavenger, beta2 glicoproteina I si gas-6. Exista si date care sugereazarecunosterea FS de pe celulele apoptotice de catre fagocite amatoare. Nu se stie totusi dacaacesti receptori sunt specifici pentru FS. Cel mai probabil este ca mai multi receptori pot legaFS, dar ramane inca sub semnul intrebarii daca ei pot recunoaste FS pe suprafata celulara.

Foarte multi ani semnificatia fagocitarii celulelor intacte nedorite a fost subestimata.Pana nu demult, inglobarea celulelor apototice a fost considerata ca o inlaturare protectiva acelulelor nedorite (75). Recent clearance-ului celulelor apoptotice i-a fost atribuit o nouasemnificatie. In functie de context, inlaturarea celulelor apoptotice de catre fagocite poatesupresa inflamatia, poate modula deletia directionata a celulelor gazda sau a parazitilorinvadanti de catre macrofage si poate regla raspunsul imun (figura 8).

Figura 8. Clearance-ul fagocitic al celulelor apoptotice.

7. Genetica apoptozeiIn pofida numeroaselor progrese ce s-au realizat in cercetarea stiintifica este foarte

dificila identificarea moleculelor responsabile de apoptoza cu ajutorul demersurilorbiochimice si moleculare in sistemele mamaliene. Din fericire, nematodul Caenorhabditiselegans reprezinta un model particular de studiu al reglarii genetice a apoptozei extrem de util(76). Pe parcursul dezvoltarii embrionare si larvare a nematodului sunt eliminate 131 din 1090celule in cadrul unui program foarte bine caracterizat, invariant din punct de vedere spatio-temporal. Astfel, s-a identificat un numar mare de mutatii ce afecteaza stadii specifice aleprocesului apoptotic si genele corespunzatoare care au fost ordonate intr-o schema genetica


171

(figura 9). Aceste gene sunt implicate in decizia de a intra pe calea mortii, in executia acesteicai, in inglobarea celulelor muribunde si in degradarea resturilor celulare din cadrul inglobarii.Doua dintre aceste gene, ced-3 si ced-4 sunt necesare pentru toate formele de apoptoza dincadrul dezvoltarii si se considera a codifica efectorii finali ai cai apoptotice. O alta genareglatoare cheie, ced-9, este necesara pentru supresia apoptozei in celulele programate sasupravietuiasca (77). Aceasta gene codifica o proteina omologa cu familia Bcl-2 din sistemuluman. Mai mult decat atat, expresia lui Bcl-2 poate inhiba apoptoza in nematode si poatechiar substitui partial pierderea functiei lui Ced-9, ceea ce indica faptul ca cel putin catevacomponente ale caii apoptotice sunt conservate in evolutie. Mutatiile survenite in 6 geneafecteaza inglobarea corpilor apoptotici de catre celulele vecine non-profesionale. Proteineleintracelulare Ced-2, Ced-5 si Ced-10 semnalizeaza intr-o maniera comparabila cu omologiilor mamalieni Crkll, DOCK 180 si Rac mediind reorganizarea si extensia citoscheletuluicelulei inglobatoare. Ced-7, omoloaga cu ABC-1 activeaza atat in celula muribunda cat si incea inglobatoare, posibil in transportul transmembranar de lipide. Ced-1 este analogreceptorilor scavenger din sistemul mamalian; Ced-7 si Ced-1 promoveaza, probabil,inglobarea interactionand cu proteina adaptoare de semnalizare Ced-6 (78).

Figura 9. Schema genetica a apoptozei in C. elegans. Au fost izolate mutatiile din 14 gene diferite ce afecteazaapoptoza in diferitele ei etape. Mutatiile ce influenteaza decizia de a murii afecteaza doar un numar mic de gene.Genele implicate in etapele ulterioare sunt comune tuturor celulelor somatice din organism angajate pe caleamortii. Activitatea lui ced-3 si ced-4 promoveaza moartea celulara, iar ced-9 previne acest proces.

8. Semnificatia apoptozei in cancer si in terapia canceruluiImplicatiile apoptozei in patologie

Dereglarea procesului apoptotic, ce are ca rezultat o moarte celulara excesiva,insuficienta sau prematura, constituie fundamentul initierii si progresiei multor maladii umane.Se presupune ca o exacerbare a apoptozei celulelor neuronale ar putea contribui la progresia siseveritatea mai multor dereglari neurodegenerative ce includ maladia Alzheimer, sclerozalaterala amiotrofica, atrofia musculara spinala, maladia Parkinson, maladiile neuromotorii sichiar atacul cerebral. Apoptoza excesiva la nivelul celulelor T circulante este corelata cusindromul imunodeficientei severe si SIDA, in vreme ce manifestarea insuficienta a acestuiproces constituie mecanismul de declansare al anumitor boli autoimune si limfoproliferative.Inhibarea procesului apoptotic prin pierderea mutatiilor functionale in genele activatoare alemortii sau castigarea unor mutatii functionale in genele supresoare de moarte este incriminata


172

in transformarea neoplazica. Virusurile si-au dezvoltat mecanisme care manipuleaza caleaapoptotica pentru a-si asigura perpetuarea propriei supravietuiri, inhiband apoptoza celulelorinfectate pentru a permite replicarea virala si activand apoptoza mecanismelor celulare deaparare ale gazdei. Tinand cont de aceste realitati, manipularea cailor apoptotice prininterventie farmacologica sau genetica promite noi oportunitati terapeutice pentru o serie demaladii.

Circumstantele aparitiei apoptozei se impart in doua mari categori. Apoptoza apare intesuturile normale, unde raspunde de deletia celulelor si este de asemenea observata incontexte patologice specifice. Cel putin intr-o parte din situatiile din categoria a doua, poate fisustinut teoretic faptul ca vine in sprijinul unei semnificatii biologice. Supravietuirea celulelorin curs de distrugere ar putea fi nociva gazdei. In contrast, necroza este totdeauna patologicafiind consecinta lezarii majore a celulei si nu ii poate fi atribuita nici o functie homeostatica(9).

Celulele raspund la leziune, daca pot, prin apoptoza. Daca un medicament induceapoptoza intr-un limfocit, de obicei ne furnizeaza mai multe date despre celula decat despremedicament, deci astfel de experimente trebuie interpretate cu precautie. Implicatiile acestuiproces in terapie sunt evidente: un medicament care inhiba apoptoza poate fi folosit inprevenirea pierderii celulei acordand timp altor forme de terapie sa inlature infectia. In cancer,dimpotriva, va avea valoare terapeutica o cale de stimulare a apoptozei in celulele maligne.Modul de obtinere al acestui efect cu specificitate adecvata reprezinta o provocare la fel ca incazul agentilor chemoterapeutici uzuali. Desigur, celulele T citotoxice, una din cele maistralucite inventii ale naturii, stiu cum sa ucida specific.

O alta potentiala terapie e reprezentata de anticorpii declansatori ai apoptozei, darfoarte importante sunt si imunotoxinele ce ascund liganzi ce induc apoptoza.

Concomitent cu explorarea potentialului terapeutic al apoptozei este necesaradescoperirea mecanismelor si moleculelor implicate.

Evolutiei i-au trebuit milioane de ani pentru dezvoltarea unui sistem desavarsit,capabil sa elimine celulele nedorite; noua ne revine dificila sarcina de a descoperi cum sainducem organismului comutarea procesului pe on sau off, la comanda.

Legaturile intercelulare caracteristice formelor superioare de viata nu ar fi posibile faraun mecanism de indepartare individuala a celulelor care nu mai sunt necesare sau care nu maifunctioneaza normal. Reglarea defectiva a mortii celulare programate ar putea juca un rol inetiologia cancerului, SIDA, bolilor autoimune si bolilor degenerative ale sistemului nervoscentral. Manipularea farmacologica a apoptozei ofera noi posibilitati de profilaxie si tratamentacestor maladii.

Transformarea malignaDeoarece o celula trebuie sa sufere o serie de modificari moleculare pentru a atinge

fenotipul malign si datorita faptului ca aceste schimbari sunt deseori induse de agenti sautratamente care, in timp, altereaza celula, orice activeaza supravietuirea celulelor deterioratesau initiate promoveaza carcinogeneza.

In majoritatea cazurilor, celulele canceroase sunt diferite de celulele normale din punctde vedere morfologic. Variatiile legate de marimea si forma celulelor si a nucleilor lorcorespund pleomorfismului celulelor tumorale. Nucleul este deseori marit, cu densitati inegale(hiper- sau hipocromatism), o membrana nucleara neregulata, angulara, nucleoli proeminenti,singulari sau multipli. Exista o crestere a raportului nucleo-citoplasmatic. Se observa si celulebizare, cu nuclei polilobati sau multipli si celule gigantice. Aceste modificari reprezintasemnele citologice ale malignitatii. Exista si exceptii, in anumite varietati de cancer, celuleletumorale au un aspect morfologic foarte apropiat de celulele normale; ca urmare diagnosticul


173

de malignitate este dificil de hotarat si in astfel de situati se apeleaza la alte criterii, inparticular arhitecturale.

Majoritatea cancerelor se caracterizeaza printr-un numar mare de celule in diviziune.Aceste mitoze sunt uneori anormale, mitoze tri- sau multipolare. Indicele mitotic, definit prinnumarul de mitoze pe unitatea de camp microscopic, are o valoare data contribuind laevaluarea prognostica a tumorilor. In realitate, cancerele nu poseda un indice mitotic ridicat,ca cel care se poate observa in patologia nontumorala. Totusi, in anumite tipuri de cancer,diagnosticul de malignitate se bazeaza pe indicele mitotic (79).

Apoptoza si cancerulOncologii au fost traditional preocupati in principal de proliferarea celulara, cu toate

acestea in ultimul timp atentia lor se indreapta, cu un interes din ce in ce mai mare, sprestudiul apoptozei (2, 11, 80).

Observatia legata de aparitia apoptozei in tumori nu este recenta. Cu peste 20 de ani inurma s-a sugerat ca apoptoza este responsabila de o mare parte din pierderile celulare ce aparin tumori, observatii obtinute in studiile cinetice, si nu mai este o noutate extinderea ei siactivarea in tumori ca urmare a aplicarii bine cunoscutelor metode terapeutice: iradierea,chemoterapia citotoxica, ablatie hormonala (81,82). Totusi, in ultimii ani, extindereacunostintelor despre controlul apoptozei la nivel molecular a dus la largirea semnificatiei eipotential oncologice depasind simpla alimentare a unei explicatii mecaniciste pentru deletiacelulelor tumorale. In particular, descoperirea faptului ca apoptoza poate fi reglata de produsiiunor anumite proto-oncogene si de gena supresor tumoral p53, a deschis noi drumuriviitoarelor cercetari.

Atunci cand modificarile de la nivelul ADN cauzeaza acumularea anormala de celulese produce transformarea maligna. Ratele comparative, ale mortii celulare si ale diviziuniicelulare, determina viteza de crestere a cancerului. Anumite celule canceroase se divid multmai incet decat celulele normale, dar, cancerul continua sa se extinda datorita prelungiriitimpului de viata al celulei.

Multi carcinogeni provoaca rupturi ADN sau interfera cu enzimele necesare pentrureplicarea corecta a ADN. Celula poate raspunde la acest tip de alterare in mai multe feluri:poate intarzia diviziunea celulara pana la rerpararea leziunii, poate suferii apoptoza sau poateprogresa fara intrerupere in ciclul de crestere celulara.

Apoptoza este o metoda eficienta de prevenire a transformarii maligne deoarece eaindeparteaza celulele care poseda alterari genetice. Apoptoza anormala poate promovadezvoltarea cancerului, atat prin permiterea acumularii de celule in diviziune, cat si prinblocarea indepartarii variantelor genetice cu potential malign ridicat. Inca nu se cunoscfactorii care determina celula sa urmeze una din cele trei cai: intrarea in apoptoza dupaleziune, repararea deteriorarii sau continuarea ciclului celular. Paradoxal, anumite gene carestimuleaza diviziunea celulara, cum este c-myc, participa la deciderea caii de urmat (81).Concentratiile de ARN si proteina pentru c-myc cresc timpuriu in apoptoza sisupraexprimarea acestor oncogene induce apoptoza in fibroblaste (82).

Oncogena bcl-2 ar putea fi supresorul general al mortii celulare pentru genele careregleaza direct apoptoza (83). Toate celulele hematopoetice si limfoide, multe celule epitelialesi neuronii contin gena bcl-2, intalnita in special in membrana mitocondriala, nucleu si reticulendoplasmic. Limfoamele foliculare de celule B poseda o concentratie crescuta de proteinaBcl-2, datorita translocatiei [t(14:18)] care plaseaza gena bcl-2 sub controlul unui promotorputernic, cel al genei ce codifica pentru lantul greu al imunoglobulinei. Proteinele virusuluiEpstein-Barr cresc nivelul expresiei genei bcl-2 in celulele limfomului Burkitt (84).

Comparativ cu limfocitele B normale, acelea care exprima bcl-2 supravietuiesc maimult in cultura dupa privarea de factori de crestere si sunt rezistente atat la radiatii ionizante


174

cat si la glucocorticoizi. De asemenea, concentratiile crescute de Bcl-2 protejeaza celulele deapoptoza indusa de catre c-myc (85). Soarecii transgenici, care au fost inginerizati pentru asupraproduce proteina Bcl-2, in limfocitele B, deseori dezvolta limfoame imunoblastice cucelule mari si difuze. La jumatate din aceste tumori cu grad avansat de dezvoltare se remarcatranslocatia genei c-myc (86).

Produsul proteic al genei supresoare tumorale p53 poate intarzia progresia cicluluicelular inaintea initierii sintezei replicative de ADN. Multe cancere umane poseda mutatii saudeletii la nivelul genei p53 (87). Proteinele codificate de virusurile oncogene pot de asemenealega si inactiva proteina p53. Proasta functionare a p53 poate promova dezvoltarea canceruluiprin permiterea duplicarii DNA in celulele cu mutatii secundare, inainte de o repararecompleta. Totusi, p53 este doar un inhibitor al diviziunii celulare, in alte situatii se comportaca o apoptogena directa (o gena ce cauzeaza apoptoza). Superproducerea proteinei p53normale, in linia celulara leucemica mieloida, induce rapid moartea celulara prin apoptoza (88)(figura 10).

Figura 10. Relatia dintre proliferarea celulara si apoptoza.

In multe tipuri celulare, proliferarea necesita cel putin doi stimuli externi, uneorinumiti semnale de competenta si progresie. Semnalele de competenta declanseazaevenimentele metabolice comune atat replicarii cat si apoptozei; semnalul de progresie abatecelula spre replicare, altminteri survine apoptoza.


175

Apoptoza poate fi considerata o cale alternativa care distruge celulele incapabile sastrabata punctul de vama inainte de replicarea ADN si se petrece in celulele competenteactivate, cand un semnal de progresie este absent sau anormal sau cand o celula nu-si repara oleziune intr-o perioada critica.

Majoritatea medicamentelor anticancerigene: inhibitori ai topoizomerazei, agentialchilanti, antimetaboliti si hormoni antagonisti, produc apoptoza in celulele sensibile (89). Inurma acestor observatii este subanteles faptul ca eficienta lor nu depinde totdeauna doar deinteractia cu o tinta biochimic specifica; un efect asupra evenimentelor metabolice conducandla apoptoza poate, de asemenea, influenta raspunsul la chemoterapie. S-a descoperit faptul ca,in diferite cancere umane, concentratia endonucleazelor calciu dependente, care degradeazaADN pe parcursul apoptozei, variaza enorm. Tendinta unei celule cancerigene de a suferiapoptoza poate fi importanta in special pentru terapia tumorilor maligne cu o rata scazuta decrestere, care sunt de obicei rezistente la agenti citostatici.

Aparitia spontana a apoptozei in tumoriApoptoza poate fi gasita in toate tumorile virtuale, netratate. Desi s-au efectuat putine

studii cantitative precise (90), evaluarile histologice indica faptul ca extinderea apoptozei inanumite tumori umane se apropie de ceea ce s-a observat in tesuturile cu involutie rapidaevidentiind semnificatia sa cinetica, uneori considerabila.

Factorii responsabili pentru aparitia spontana a apoptozei in tumori sunt, indubitabil,diversi. Apoptoza, deseori este proeminenta mai ales la locusul de confluenta cu necroza,unde se presupune ca ischemia moderata este implicata in initierea ei, aceasta este o cauzacunoscuta a activarii apoptozei in tesuturile non-neoplazice (91, 92).

S-a aratat ca, TNF (factorul de necroza tumoral) induce apoptoza in liniile de celuletumorale in vitro, astfel, o serie de fenomene apoptotice observate in vivo in tumori ar putea fiatribuite eliberarii acestei citokine de catre macrofagele infiltrante. In alte cazuri, apoptozapoate fi rezultatul atacului tumorii de catre limfocitele T citotoxice. Totusi, un nivel ridicat alapoptozei este observat si in locusurile preneoplazice si in nodulii ce se dezvolta in ficat dupaadministrarea de carcinogeni chimici (93), este improbabil ca factorii mentionati ar putea fioperativi in aceste circumstante. Este posibil ca prezumtivele mecanisme reglatoare alepopulatiilor celulare, descrise mai sus, actioneaza intr-o etapa timpurie a procesului decarcinogeneza, cu o apoptoza crescuta ce echilibreaza temporar cresterea proliferarii celulare.In sfarsit, nivelurile crescute de apoptoza in tumori pot fi rezultatul unui proces intrinsec alacestor celule. Ratele de apoptoza gasite in tumori similare difera fiind rezultatul expresieidiferitelor oncogene.

Bibliografie1. T.S. Griffith, T. Brunner, S.M. Fletcher, D.R. Green, and T.A. Ferguson, Science 270,

1189-1192 (1995).2. J.F.R. Keer, A. H. Wyllie, and A. R. Currie, Br. J. Cancer 26, 239-257 (1972).3. A. H. Wyllie, Cell death in Biology and Pathology, 9-34 (1981)4. C. Dive and J.A. Hickman, Br. J. Cancer 64, 192-196 (1991)5. C. Dive, C.D. Gregory, D.J. Phipps, D.L. Evans, A.E. Milner and A. H. Wyllie, Bioch.

Biophy. Acta 1133, 275-282 (1992)6. H.M. Ellis, and H.R.Horvitz, Cell 44, 817-829 (1986)7. R.S. Malyapa, and S. Sawada, Radiat. Res.,125 , 134-140 (1991)8. J.Y. Yuan, and H.R. Horvitz, Dev. Biol. 138, 33-41 (1990)9. A. H. Wyllie, J.F.R. Keer, and A. R. Currie, Int. Rev. Cytol. 68, 251-305 (1980).


176

10. F. Oberhammer, J. W. Wilson, C. Dive, I. D. Morris, J. A. Hickman, A. E. Wakeling, P. R.Walker, and M. Sikorska, EMBO J. 12, 3679-36-84 (1993).

11. A. H. Wyllie, Nature 284, 555-556 (1980).12. M. D. Jacobson, J. F. Burne, and M. C. Raff, EMBO J. 13, 1899-1910 (1994).13. K. Schulze-Osthoff, H. Walczak, W. Droge, and P. H. Kramer, J. Cell Biol. 127, 14-20

(1994).14. S. H. Kaufmann, Cancer Res.49, 5870-5878 (1989).15. D. S. Ucker, J. Mayer, and P. S. Obermiller, J. Immunol.149, 1583-1592 (1992).16. Y. A. Lazebnik, S. Cole, C. A. Cooke, W. G. Nelson, and W. C. Earnshaw, J. Cell Biol.

123, 7-22 (1993).17. S. Raipert, B.M. Raipert, J.A. Hickman and T.D. Allen, Cell Death Differ., 3, 131-139

(1996)18. G. Kroemer, P. Petit, Z. Naofal, J.-L. Vayssiere and B. Mignotte, FASEB J., 9, 1277-1287

(1995)19. L. Fesus, V. Thomazy and A. Falus, FASEB J., 224, 104-108 (1987)20. J. Savill, Biochem. Soc. Trans. 224, 1065-106921. W. Burch, S. Pafe, B. Putz, G. Barthel, and R. Schulte-Hermann, Carcinogenesis 11, 847-

853 (1990)22. R. Berges, and J.T. Jsaacs, Clin. Chem. 39, 2-8 (1993)23. J.T. Jsaacs, P.I. Lundmo, R. Berges, P. Martikainen, N. Kyprianos, and H.F. English, J.

Androl., 13, 457-464 (1992)24. D.K. Armstrong, J.T. Jsaacs, Y.L. Ottaviano, and N.E. Davidson, Cancer Res., 52, 3418-

3424 (1992)25. R.J. Smeyne, M. Vendrell, M.Hayward, S.J. Baker, G.G. Miao, K. Schilling, L.M.

Robertson, T. Curran, and J.I. Morgan, Nature, 363, 166-169 (1993)26. G.E. Deng, and E.R. Podack, Proc. Natl. Acad. Sci U S A, 90, 2189-2193 (1993)27. S. Orrenius, D.J. McConkey, G. Bellomo, and P. Nicotera, Trends Pharmacol. Sci., 10,

281-285 (1989)28. M.J. Arends, R.G. Morris, and A.H. Wyllie, Am .J Pathol., 136, 593-608 (1990)29. C.R. Knight, R.C. Recs, and M. Griffin, Biochim. Biophis. Acta, 1096, 312-18 (1991)30. S.M. Pittman, M. Geyp, S.J. Tynan, C.M. Gramacho, D.H. Strickland, and M.J. Fraser,

Tubulin in apoptotic cells, Harwood Academic Publishers, 315-323 (1993)31. T.G. Cotter, S.V. Lennon, J.M. Glynn, and D.R. Green, Cancer Res., 52, 997-1005 (1992)32. F. Oberhammer, J.W. Wilson, C. Dive, I.D. Morris, J.A. Hickman, and A.E. Wakeling,

EMBO J, 12, 3679-3684 (1993)33. F. Obsehammer, W. Burch, W. Parzefall, P. Brett, E. Erben, M. Stadler, and R. Schulte-

Hermann, Cancer Res., 51, 2478-2485 (1991)34. D.S. Ucker, P.S. Obermiller, W. Eckhart, J.R. Apgar, N.A. Berge and J. Meyers, Mol. Cell.

Biol., 12, 3060-3069 (1992)35. D. Barbieri, L. Troiano, E. Grassilli, C. Agnesi, E.A. Cristofalo, D. Monti, M. Capri, A.

Cossariza and C. Franceschi, Biochem. Biophy. Res. Commun., 187, 1256-1261 (1992)36. L.D. Tomei, J.P. Shapiro and F.O. Cope, Proc. Natl. Acad. Sci U S A, 90, 853-857 (1993)37. D.G. Brown, X-M. Sun and G.M. Cohen, J. Biol. Chem., 268, 3037-3039 (1993)38. J.J. Cohen and R.C. Duke, J. Immunol., 132, 38-42 (1984)39. P. Nicotera, P. Hartzell, G. Davis and S. Orrenius, FEBS Lett., 209, 139-140 (1986)40. M. Poenie, R.Y. Tsien and A-M Schmitt-Verhulsm, EMBO J., 6, 2233-2238 (1987)41. N.L. Allbritton, C.R. Verret, R.C. Wooley and H.N. Eisen, J. Exp. Med., 167, 514-519

(1988)42. D.J. McConkey, P. Hartzell, Nicotera and S. Orrenius, FEBS Lett., 3, 1843-1949 (1989)


177

43. M.Perotti, F. Toddei, F. Mirabelli, M. Vairetti, G. Bellomo, D.J. McConkey and S.Orrenius, FEBS Lett., 269, 331-334 (1990)

44. R.A. Schwartzman and J.A. Cidlowski, Endocrinology, 133, 591-599 (1993)45. M.C. Peitsch, B. Polzar, H. Stephan, T. Crompton, H.R. MacDonald, H.G. Mannerz and J.

Tschopp, EMBO J., 12, 371-377 (1993)46. J.T. Issacs, Curr. Opin. Biol., 6, 82-89 (1994)47. J. Filipski, J. Leblanc, T. Youdale, M. Sikorska and P.R. Walker, EMBO J., 9, 1319-1327

(1990)48. P.R. Walker, V.M. Weaver, B. Lach, J. Leblanc and M. Sikorska, Biochem.Cell.Biol., 213,

100-106 (1994)49. X.M. Sun and G.M. Cohen, J.Biol.Chem., 269, 14857-14860 (1994)50. B. Zhivotovsky, B. Cedervall, S. Jiang, P. Nicotera and S. Orrenius,

Biochem.Biophys.Res.Commun., 202, 120-127 (1994)51. C. Giannakis, I.J. Forbes and P.D. Zalewski, Biochem.Biophys.Res.Commun., 181, 915-

920 (1991)52. P.D. Zalewski, I.J. Forbes and W.H. Betts, Biochem. J., 296, 403-408 (1993)53. M. Loukkamaki, K. Servomaa and T. Rytomaa, Int. J. Radiat. Biol., 63, 207-213 (1993)54. M.J. Arends, R.G. Morris and A.H. Wyllie, Am. J. Pathol., 136, 593-608 (1990)55. P.R. Walker and M. Sikorska, Biochemistry, 25, 3839-3845 (1986)56. W.M. Weaver, B. Lach, P.R. Walker and M. Sikorska, Biochem. Cell Biol., 71, 488-500

(1994)57. M. Murgia, P. Pizzo, D. Sandona, P. Zanovello, R. Rizzuto and F. Di Virgilio, J. Biol.

Chem., 267, 10939-41 (1992)58. M.J. Arends,R.G. Morris and A.H. Wyllie, Am J Pathol., 136, 593-608 (1990)59. J. Savill, V. Fadok, P. Henson and C. Haslett, Immunol Today, 14, 131-136 (1993)60. V.A. Fadok, D.L. Bratton, S.C. Frasch, M.L. Warner and P.M. Henson, Cell Death Differ.,

5, 551-562 (1998)61. V.A. Fadok, D.R. VoelkerP.A. Campbell, J.J. Cohen, D.L. Bratton and P.M. Henson, J.

Immunol., 148, 2207-2216 (1992)62. A. Shiratsuchi, M. Umeda, Y. Ohba and Y. Nakanishi, J. Biol. Chem., 272, 2354-2358

(1997)63. B. Verhoven, R.A. Schlegel and P. Williamson, J. Exp. Med., 182, 1597-1601 (1995)64. R.F.A. Zwaal and A.J. Schroit, Blood, 89, 1121-1132 (1997)65. L. Falasca, A. Bergamini, A. Serafino, C. Balabaud and L. Dini, Exp. Cell Res., 224, 152-

162 (1997)66. J. Hughes, Y. Liu, J. VanDamme and J. Savill, J. Immunol., 158, 4389-4397 (1997)67. D. Pradhan, S. Krahling, P. Williamson and R.A. Schlegel, Mol. Cell Biol., 8, 767-778

(1997)68. A. Devitt, C. Raykundalia, O.D. Moffatt, J.D. Capra, D.L. Simmons and C.D. Gregory,

Nature, (1998)69. K. Murao, V. Terpstra, S.R. Green, N. Kondratenko, D. Steinberg and O. Quehenberger, J.

Biol. Chem., 272, 17551-17557 (1997)70. S.J. Weiss, New Engl. J. Med., 320, 365-375 (1989)71. D.A. Bell and B. Morrison, Clin. Immunol. Immunopth., 60, 13-26 (1991)72. S.R. Batsford, APMIS, 99, 1-9 (1991)73. R.G. Moris, A.D. Hargreaves, E. Duvall and A.H. Wyllie, Am. J. Path. , 115, 426-436

(1984)74. J.S. Savill, N. Hogg, Y. Ren and C. Haslett, J. Clin. Invest., 90, 1513-1522 (1992)75. R.E. Ellis, J. Yuan and R.H. Horvitz, Annu. Rev. Cell Biol., 7, 663 (1991)76. H. Steller, Science, 267, 1445-1449 (1995)


178

77. J. Savill and V. Fadok, Nature, 407, 784-788 (2000)78. N. Platt, R.P. da Silva and S. Gordon, Trends Cell Biol., 8, 365-372 (1998)79. J.Audouin, M.A. de Maublanc and T. Maolina, Cancerologie Aujourdhui, 4 (2), 51-69

(1995)80. P. Goldstein, D.M. Ojcius and J.D. Young, Immunol Rev., 121, 29-65 (1991)81. M. Oren M, Cancer Metastasis Rev., 11, 141-148 (1990)82. G.I. Evan, A.H. Wyllie and C.S. Gilbert, Cell, 69, 119-128 (1992)83. S.J. Korsmeyer, Surveys, 15, 105-118 (1992)84. J. Finke, R. Firtzen and P. Temess, Blood, 80, 459-469 (1992)85. R.P. Bissonette, F. Echeverri, A. Mahboubi and D.R. Green DR, Nature, 359, 552-554

(1992)86. T.J. McDonnel and S.J. Korsmeyer, Nature, 349, 254-256 (1991)87. A.J. Levine, J. Momand and C.A. Finlay, Nature, 351, 453-456 (1991)88. E. Yionish-Rouach, D. Resnitsky, J. Lotem, L. Sacha, A. Kimchi and M. Oren, Nature,

353, 345-347 (1991)89. J.A. Hickman, Cancer Metastasis Rev., 11, 121-139 (1992)90. C.E. Sarraf and I.D. Bowen, Cell Tissue Kinet., 21, 45-49 (1988)91. J.F.R. Kerr, J Pathol., 105, 13-20 (1971)92. G.C. Gobe, R.A. Axelsen and J.W. Searle, Lab Invest., 63, 770-779 (1990)93. A. Columbano, G.M. Ledda-Columbano, P.M. Rao, S. Rajalakshmi and D. Sarma, Am. J.

Pathol., 116, 441-446 (1984)

Bibliografie

morfopat

Documents

Transcript of morfopat