MONITORIZAREA MONITORIZAREA CALITĂȚIICALITĂȚIIMEDIULUIMEDIULUI

Metode bazate pe biosenzori

Conceptul de biosenzor electrod enzimatic (Updike şi Hicks, 1967).Biosenzor Instrument analitic care încorporează o componentă

biologic activă (bioreceptor) integrată sau în contact direct cu un traductor fizico – chimic, care transformă semnalul biologic în semnal electric proporţional cu concentraţia compusului ce prezintă interes analitic.

Principiul de funcţionarePrincipiul de funcţionare

Analit

Bioreceptor

Traductor

Amplificator de semnal

Calculator

Condiţii ce trebuie îndeplinite de un biosenzorCondiţii ce trebuie îndeplinite de un biosenzor

Apecificitate mare pentru substrat Stabil în condiţii normale de păstrare Să permită un număr mare de determinări (peste 100) Procesele implicate la nivelul bioreceptorului şi

traductorului să fie independente de modificări ale unor parametri fizici (ex. pH, temperatură)

Sensibilitate şi precizie ridicată Timp de răspuns scurt corelat cu o calibrare rapidă Suprafaţa să nu fie supusă fenomenului de pasivizare în

timp Uşor de utilizat Să permită analiză continuă Să poată fi integrat în aparate de analiză portabile

Imobilizarea componentei biologic active pe Imobilizarea componentei biologic active pe suprafaţa traductorului suprafaţa traductorului etapă cheie etapă cheie

Metode de imobilizare Adsorbţie fizică pe o suprafaţă solidă/membrană Legarea covalentă intermoleculară pe membrane Înglobare în matrice polimerică Microîncapsulare

Condiţii impuse metodelor Să asigure difuzia liberă a substratului, produşilor de

reacţie prin stratul biosensibil Să conserve activitatea enzimei în procesul de imobilizare Să asigure timp de răspuns scurt Să păstreze afinitatea enzimei pentru substrat şi inhibitori

Biosenzori enzimatici1.Monoenzimatici acetil colina (ATCh) şi butirilcolina

(BuTCh) hidroliză enzimatică produs electroactiv determinat direct prin metode amperometrice

2.Bienzimatci colinesteraza şi colinoxidaza metode amperometrice sau potenţiometrice

3.Trienzimatici acetilcolinesterază, colinoxidază, peroxidază tehnici potenţiometrice

Mecanisme de funcţionare Transformarea catalitică a unui poluant într-un produs

de reacţie care poate fi detectat la suprafaţa

traductorului fizic Indirect, prin detecţia unui poluant care inhibă enzima

Biosenzori microbieniBiocomponenta microorganisme în contact direct cu un

traductor fizic

Caracteristici Transformă substratul în urma mai multor reacţii Funcţionează ca biosenzor cu mai mulţi bioreceptori

capacitate de a recunoaşte mai mulţi analiţi simultan Existenţa unui spectru larg de microorganisme cu

diferite tipuri de metabolism Adaptabilitate la condiţii diferite de lucru Preţ redus datorită procedeului simplu de pregătire Produşii lor pot fi măsuraţi direct şi instantaneu Se pot regenera

ExempleExemple

Bacillus subtilis determinarea consumului biochimic de oxigen (CBO)

Trichosporon cutaneum imobilizate pe electrod de oxigen măsurarea CBO în 15 minute (5 zile cu metode clasice)

Biosenzori respiratori modificarea activităţii respiratorii a celulei în urma acţiunii poluantului scăderea concentraţiei de oxigen

Traductori Clasici celulele microbiene transformă substratul într-un

produs de reacţie detectabile Electrod de dioxid de carbon

Metode imunochimiceSistem imun mijloc de protecţie al organismelor animale

prin care acestea recunosc organismele invadatoare, distingându-le de componentele proprii, le interceptează, după care le distruge.

Vertebrate imunitate limfocite

Mecanisme ale răspunsului imun

Mecanismul celular mediat de limfocitele T

Mecanismul umoral mediat de o mare diversitate de anticorpi sau imunoglobuline

Anticorpi limfocite BAntigen (Ag) substanţă capabilă să genereze un răspuns

imun şi să inducă biosinteza anticorpilorDeterminanţi antigenici (epitopi) acele porţiuni ale

antigenului care se combină cu anticorpii (situs de legare, sau receptor limfocitar)

Anticorpi grup de glicoproteine prezente în ser, sânge ţesuturi şi secreţiile mamiferelor.

În funcţie de separarea în câmp electric pot fi clasificate în albumineα-globulineβ-globulineγ-globuline.

StructurăPatru lanţuri polipeptidice

2 grele şi (440 AA)

2 uşoare (220 AA)

l legate prin punţi disulfat - S – S -

VH VH

VL VL

Fab CL CL

Fc

CH CH

Funcţie

Fab – legarea antigenelor Fc – mediază legarea de ţesutul gazdă a diverselor celule ale sistemului imun

SurseProduşi natural prin imunizare Antigenul purificat injectare sistemul

imun al gazdei recunoaşte antigenul răspuns proliferarea şi diferenţierea celulelor B care produc anticorpi specifici

Interacţiunea antigen – anticorp

Asociere biomoleculară similară cu cea enzimă – substrat

Diferenţa este reversibilăMetode imunologice specificitatea

interacţiei antigen – anticorp Legături non covalente ionice, de

hidrogen, forţe van der Waals

Tehnici1.Reacţia de precipitare în fluide2.Precipitarea în gel (imunodifuzia) linie de

precipitare interacţiunea dintre cele două specii determinări cantitative

Testul Outchterlony (imunodifuzia dublă)Testul Mancini (imunodifuzia simplă radială)3.Imunoelectroforeza4.Imunofluorescenţa5.Reacţia de aglutinare6.Testele RIA şi ELISA