MICROPROPAGAREA ŞI FOLOSIREA EI ÎN

AMELIORAREA PLANTELOR

Termenul defineşte înmulţirea în vitro a plantelor şi reprezintă o formă de

multiplicare vegetativă. Acest mod de înmulţire permite obţinerea rapidă a unui

număr impresionant de indivizi identici din punct de vedere genetic.

Micropropagarea se poate face pe căi diferite şi anume: formarea lăstarilor

adventici; lăstărire axilară multiplă şi embriogeneză somatică.

Lăstarii adventici pot fi obţinuţi prin organogeneză directă sau indirectă.

Ultimul tip este asociat însă cu o instabilitate genetică evidentă.

Clasificarea culturilor în vitro în funcţie de tipul de cultură şi scopul urmărit

(după Elena Marcela BADEA şi Daniela Săndulescu, 2000).

Tipul de cultură ScopulCultura de embrioni Scurtarea ciclului de ameliorare

Prevenirea avortării embrionilorDepăşirea incompatibilităţii postzigoticeProducerea haploizilorSursă de explante pentru obţinerea calusurilor

Cultura de meristeme Eliminarea patogenilor (virusuri, bacterii, ciuperci)Clonarea plantelorConservara germoplasmeiStocarea plantelor libere de virusuri

Cultura de apexuri şi noduri Lăstărirea axilară pentru clonare

CrioprezervareaCultura explantelor fără muguri performanţi.

Clonarea prin formarea organelor adventiveIzolarea mutantelorObţinerea poliploizilor.

Cultura de calus/celule în suspensie Clonarea plantelor prin formarea mugurilor sau embrionilorObţinerea variantelor clonateSelecţia mutantelorProducerea metabiliţilor secundariBiotransformarea

Cultura de antere şi microspori Producerea haploizilor şi liniilor homozigoticeProducerea plantelor supermasculeSelecţia mutantelor

Cultura de ovule şi flori excizate Depăşirea incompatibilităţii pre şi postzigoticePrevenirea absciziei florilorRealizarea fecundării în vitro

Cultura de protoplaşti Hibridarea somaticăCrearea cibrizilorTransferul de gene

Lăstărirea axilară multiplă are loc la nivelul vârfului tulpinii şi a

mugurilor laterali. Pentru clonare, propagarea din muguri terminali sau axilari sau

din ‚ţesut maristemic este mai favorabilă deoarece reduce apariţia unor variaţii

genetice.

Explantele obţinute din vârful lăstarilor include adesea 1-2 primordii de

frunze în plus, faţă de cele din regiunile meristemice şi prezintă unele avantaje:

sunt excizate mai repede, fiind mai mari; au rată de supravieţuire mai mare; ciclul

de multiplicare este foarte scurt (câteva săptămâni) şi prin urmare numărul de

plante care poate fi realizat într-un interval de timp este foarte mare.

Problema principală a micromultiplicării plantelor la scară industrială

constă în realizarea unei rate şi a unui ritm cât mai ridicate de clonare, pentru a

asigura un preţ de cost competitiv.

Coeficientul de înmulţire la acest mod de propagare poate fi foarte ridicat.

Minodora PĂTRAŞCU (1981) apreciază că la specia Chrysantheum se pot

obţine într-un an circa 9.000.000 plante pe calea sistemului de micromultiplicare

care utilizează ca explant ţesut tulpinal, în timp ce prin sistemul de înmulţire

vegetativă, (butaşi) se obţine maxim 30.000 plante.

HOLDGATE (citat de Dorina CACHIŢA COSMA, 1987) menţionează că

dintr-o plantă donatoare, în primul an de cultură se obţine cca 100.000 de plante,

iar prin subculturi repetate, în funcţie de specie, numărul de exemplare – copii

fidele – poate creşte an de an.

Foarte important de subliniat este şi faptul că plantele obţinute prin cultură

in vitro, fiind copii conforme cu planta mamă, alcătuiesc o cultură cu o mare

uniformitate, ceea ce este mai greu de realizat prin procedeele tradiţionale.

Propagarea prin culturi de ţesuturi nu poate fi folosită practic pe scară largă

la plantele agricole, care produc sămânţă sau în cazul în care suprafeţe mari

trebuiesc plantele, din cauza costurilor prea mari de transplantare a plantelor

regenerate.

În schimb, există un larg potenţial şi rezultate deosebite la multe alte specii

floricole şi ornamentale care produc sămânţă puţin (Anthurium, Pelargonium,

Begonia, Freesia, Chrysanthenum etc), precum şi la specii horticole (cartof,

căpşun, etc) . Sunt multiplicate in vitro în măsură importantă, numeroase specii de

arbuşti ornamentali, pomi şi arbuşti fructiferi dar şi arbori forestieri. Cea mai

avansată aplicare comercială s-a realizat la orhidee.

Micropopagarea poate fi folosită cu bune rezultate în ameliorarea plantelor,

cu condiţia existenţei unor procedee eficiente de culturi de ţesuturi care să fie

folosite curent pentru specia respectivă şi a păstrării intacte a zestrei genetice, în

descendenţă.

Pe lângă multiplicarea rapidă şi pe scară largă a unor lante identice din

punct de vedere genetic şi care provin dintr-un singur genotip genetic superior,

propagarea clonală mai are şi alte utilizări potenţiale în ameliorarea plantelor şi

anume înmulţirea rapidă a primelor generaţii hidrice, înmulţirea pe scară largă a

genotipurilor heterozigote; înmulţirea genotipurilor autoincompatibile pentru

programele de ameliorare , etc.

Embriogeneza somatică şi sămânţa artificială. Embriogeneza somatică

constituie modalitatea cea mai eficientă de accelerare a micropopagării.

Aptitudinea celulelor vegetale somatice de ase dezvolta în embrioni

somatici este cunoscută de mult timp (STEWARD şi MEARS, 1953), dar numai

după anii 80 embriogeneza somatică a cunoscut interes crescând, eaapărând în

numeroase cazuri ca fiind cea mai eficientă metodă de multiplicare vegetativă.

Mai mult, există menţiuni privind capacitatea unor specii (morcov, lucernă, viţa de

vie, ş.a. ). Capabile de a produce un număr mare de embrioni somatici în mediu

lichid şi care au un comportament analog cu embrionii sexuaţi.

Utilizându-se calus, pe un mediu lichid care este agitat, celulele care

formează conglomerate nediferenţiate se dispersează şi evoluează datorită

mediului nutritiv, formând embrioni într-un timp relativ scurt. Prezentând

primordii cotiledonale şi un mugure central, aceştia nu diferă cu nimic de un

embrion natural conţinut de o sămânţă.

Etapele principalele ale acestui proces pot fi sintetizate astfel: explantele de

pornire sunt prelevate din diferite organe sau ţesuturi, sau constituie din celule

izolate, se formează un calus primar (din explantul unui organ) sau un microcalus

din celule izolate; se realizează subculturi de calus primar sau de microcalus;

calusul poate fi disociat sub formă de suspensii celulare. Suspensiile celulare

repuse pe mediu de cultură solid pot general calus.

În aceste condiţii , resturile celualre în mediu lichid sau solid se organizează

în numeroase masive mici cu structură bipolară (cu un meristem caulinar şi unul

radicular), numiţi embrioizi asexuaţi sau somatici. Embrioizii se dezvoltă ca şi

embrionii zigotici în plante, având capacitatea de a se înrădăcina, asemenea

plantulelor din sămânţă normală.

Cultura embrionilor somatici oferă două perspective de utilizare:

- accelerarea micropopagării;

- producerea de seminţe artificiale.

Accelerarea micropopagării. Embrionii somatici prezintă unele avantaje

pentru multiplicare plantelor. Provenind de obicei dintr-o singură celulă, sunt

capabili să realizeze plante uniforme genetic, pe când cele produse prin

caulogeneză pot prezenta numeroase himere.

Producerea de seminţe artificiale. Într-o perspectivă mai mult sau mai puţin

îndepărtată, apare posibilitatea creării seminţelor artificiale. S-a pornit de la ideea

încapsulării embrionilor somatici într-un mediu nutritiv şi într-o membrană

permeabilă biodegradabilă care va permite seminţei artificiale să germineze în sol

şi să formeze o nouă plantă, copie a plantei de la care a fost prelevat explantul de

origine. Principiul este simplu şi pus la punct sub aspect teoretic.

La cca 100 de specii au fost realizate metode de producere a calusurilor

embriogene, ca şi tehnica obţinerii de embrioni, dar există numeroase aspecte

practice şi economice nerezolvate. Dintre acestea cele mai importante sunt cele

legate de nesincronozarea proceselor de formare a embrionilor somatici dintr-o

cultură; realizarea în mică a inducerii simultaneităţii maturării acestora, precum şi

a izolării fiecărui embrion în vederea semănatului (CHU, 1986). Mediul de

cultură conţine deci embrioni de toate vârstele şi dimensiunile , fapt ce creează

numeroase aspecte negative.

LUZ şi colab. (1985) menţionau că într-un mililitru de mediu de cultură se

găsesc circa 2x106 celule, din care se pot obţine aproximativ 5000 de embrioni

somatici după 14 zile de cultivare a celulelor pe un mediu lipsit de 2,4 D. La scară

industrială apare ca imposibil de reperat toţi embrionii ajunşi la stadiul ideal

pentru includerea în mediu nutritiv adecvat şi într-o membrană, ca ,,sămânţă

artificială”. S-a imaginat un sistem de filtre bine echilibrate pentru trierea

embrionilor prea mici sau prea dezvoltaţi.

De asemenea, evaluând că într-un m3de mediu lichid pot să se găsească

peste 1.000.000 de embrioni, s-a evidenţiat necesitatea realizării unor tipuri de

fermentatoare industriale în care pot fi cultivate celulele. Pentru rezolvarea acestui

aspect s-a recurs la fermentatoare asemănătoare cu cele utilizate în culturile de

microorganisme în scopul producerii substanţelor de origine vegetală (metaboliţi).

STEZER (1985( a imaginat un sistem de bioreactor pentru obţinerea pe

scară mare a embrionilor somatici în suspensii celulare. Se apreciază că în

recipiente de mică capacitate (1-5 l) se pot obţine cu uşurinţă sute de mii de

embrioni. După obţinerea lor, embrionii somatici pot fi menţinuţi cca 20 de

săptămâni până la semănarea acestora. Sub aspectul menţionat, s-au obţinut

rezultate promiţătoare la morcov, ţelină, palmierul de ulei, cafea, curmal, etc.

O altă problemă dificilă o constituie stabilizarea embrionilor în vederea

stocării. Fără acest lucru, embrionii odată formaţi îşi continuă dezvoltarea,

germinează sau pier dacă sunt lipsiţi de elementele nutritive. Actualmente sunt în

studiu diverse procedee de stabilizare. Astfel, GEBBART (1985) a pus la punct un

sistem de încapsulare a embrionilor somatici în polimeri biodegradabili. Împreună

cu embrionii, a încapsulat şi o serie de compuşi pentru a susţine germinaţia şi

creşterea (regulatori de creştere , fertilizanţi, pesticide, amendamente şi de la caz la

caz , anumite tipuri de bacterii fig.1.

Fig. 1. Structura teoretică a unei seminţe artificiale

1.- prelevare de celule; 2- început de cultură prin fragmentare; 3-cultură pe mediu lichid; 4- obţinere de embrioni somatici; 5 - cultură directă de embrioni ; 6-

încapsulare pentru culturi diferite

KILTO şi JANICK (1985) au reuşit să încapsuleze embrionii somatici de

morcov, în polietilenă 5%. La începutul experimentului, procentul de supravieţuire

a embrionilor a fost modest (3%). S-a dovedit ulterior că prezenţa acidului abscisic

în cursul inducţiei embrionare a determinat sporirea evidentă a procesului de

supravieţuire a embrionilor.

SMITH şi MURASHIGE (1984) au făcut experienţe cu embrioni somatici

de dovleac şi au observat necesitatea realizării sincronizării embriogenezei în

suspensiile celulare. Ei au ,,cernut” suspensia prin site, după care au centrifugat

cultura şi au trecut-o pe un mediu cu un anumit conţinut de zaharoză, pentru a

împiedica germinarea precoce a embrionilor. De remarcat că procedeul a favorizat

şi dezvoltarea embrionilor insuficienţi formaţi. În prezent, pentru anumite specii

(lucernă, grâu, orez, morcovi, etc) s-a reuşit să se cunoască cu exactitate procedeul

de inducere într-o cantitate adecvată de mediu, a embrionilor şi stimulării

germinării lor. Introduşi în sol, embrionii astfel condiţionaţi , germinează normal

(DEMARLY şi SIBI, 1989).

RODENBAUGH şi colab (1984) preconizează încorporarea embrionilor

într-o matrice de gel, constituită din alginat de natriu, inserată apoi într-o soluţie de

clorură de calciu, pentru solidificarea matricei.

Toate realizările menţionate constituie, în principal, reuşite de laboratr, dar

ele deschid perspective deosebite agriculturii viitorului.

Sămânţa artificială , pe lângă faptul că este realizabilă într-o perioadă

scurtă de timp (din momentul prelevării explantului şi obţinerea acestuia sunt

necesare 1-2 luni ), poate aduce şi alte avantaje:

- din punct de vedere genetic apare posibilitatea obţinerii de sămânţă la

specii care obişnui nu o produc. Este cazul cartofului dulce, a sfeclei triploide,

bananierului, a unor graminee şi leguminoase furajere şi perene ş.a. Prin acest mod

de multiplicare s-ar putea menţine vigoarea hibridă, fără obligativitatea menţinerii

liniilor parentale. Odată creat un hibrid ar fi suficient să se preleveze explantul ce

va constitui sursa seminţelor necesare culturilor. Această tehnică ar permite

producerea de sămânţă artificială hibridă şi la speciile autogame (cereale păioase,

leguminoase pentru boabe) la care producţia acesteia nu este pusă la punct, pe

scară comercială;

- sub aspect fitosanitar , multiplicarea în vitro şi în fermentatoare, ca şi

includerea embrionilor într-un mediu steril, s-ar traduce în ultimă instanţă în

obţinerea unor seminţe sănătoase. Pentru aceasta, sămânţa încapsulată scoasă din

mediul controlat, trebuie să aibă în învelişul capsular bacterii sau enzime cu

proprietăţi protectoare, ca şi erbicide şi fungicide în doze reduse, cu efect localizat

la nivelul patului germinativ. Pentru eliminarea viruşilor se pot realiza inoculi cu

viruşi mai puţin virulenţi, pentru a combate surse virulente . În acelaşi timp

fermentatoarele ar putea fi utilizate pentru aplicarea termoterapiei şi eliminarea

totală a agentului patogen;

- sub aspect nutriţional şi dinamic, în capsulele protectoare pot fi introduşi

hormoni sau îngrăşăminte – starter, care pot favoriza germinarea printr-o nutriţie

suplimentară, sau pot fi asociate cu bacterii simbiotice (Rhizobium).

Pentru a se putea perfecta crearea seminţei artificiale se urmăreşte cu

precădere găsirea mijloacelor de stopare a dezvoltării embrionilor formaţi şi

îmbunătăţirea fiecărei etape de producere. În acest sens, menţionăm, punerea la

punct a mediilor de cultură pentru fiecare specie, a fermentatoarelor de dimensiuni

uriaşe, a tehnicilor realizării învelişului protector. Studiile întreprinse vor putea

avea repercusiuni pozitive privind multiplicarea celulelor vegetale, tehnicile de

includere în diferite învelişuri protectoare, fabricarea de biomembrane ş.a.

Noua tehnică de producere de sămânţă poate avea o serie de repercusiuni

pozitive sub aspect socio – economic, determinate de schimbarea sistemului

convenţional de producere de sămânţă.

Exemplu:ÎNMULŢIREA PRIN MICROPROPAGARE (IN VITRO) MATERIAL

SĂDITOR VITOCOL

La viţa de vie primele începuturi privind micropropagarea "in vitro" s-au

înregistrat cu aproximativ cinci decenii în urmă (Morel G., 1944). Reţinerile

privind folosirea acestei metode au fost datorate potenţialului de rod mai redus în

primii ani, determinat de fenomenul de " juvenilizare " (Mullins M. G. şi colab.,

1979). Acest dezavantaj poate fi eliminat prin unele tratamente care favorizează

trecerea mai rapidă de la starea fiziologică " juvenilă " la cea adultă (Nazeron R.

şi colab., 1983). Un alt inconvenient al clonării "in vitro" la viţa de vie îl

reprezintă faptul că plantele obţinute nu pot fi folosite la înfiinţarea plantaţiilor

viticole pe terenurile unde se impune utilizarea viţelor altoite.

Micropropagarea (cultura "in vitro"), ca metodă de înmulţire vegetativă, se

bazează pe următoarele principii fiziologice : totipotenţa celulară, independenţa

fiziologică temporară şi aparentă a explantelor, posibilitatea de stimulare a

proliferării ţesuturilor şi de înmulţire a plantelor neoformate.

Totipotenţa celulară este deţinută de fiecare celulă, dar exprimarea se

produce numai la unele tipuri de celule sau grupe de celule. Acestea sunt

restructurate morfogenetic şi pot răspunde anumitor stimuli meniţi să regenereze,

în anumite condiţii specifice, formaţiuni de embrioni cu rădăcină, tulpină şi

coroană, până la plante noi (Murashige S., 1984).

Independenţa temporară şi aparentă exprimă posibilitatea de menţinere în

viaţă a explantelor, inoculate pe mediu de cultură, până la emiterea de

neoformaţiuni.

Posibilitatea de stimulare a proliferării ţesuturilor se materializează prin

inocularea explantelor pe medii de cultură în vederea transformării lor în

formaţiuni tisulare autonome.

Multiplicarea plantelor neoformate are la bază posibilitatea de

înrădăcinare a minibutaşilor pe medii de cultură asemănătoare celor din faza

iniţială, însă cu corectarea conţinutului în substanţe hormonale - prin reducerea

citokininelor în favoarea auxinelor.

Fazele operaţionale

Procesul de micropropagare cuprinde, în ansamblu, mai multe faze (etape)

derulate într-o anumită succesiune, însă fără o accepţiune unitară. Astfel,

Murashige S. (1974) distinge pentru prima dată în practica de micropropagare în

sistem industrial trei etape, şi anume:

- etapa I-a, care cuprinde înfiinţarea culturilor cu plante selecţionate şi o

stare fitosanitară îmbunătăţită, de la care se recoltează material vegetal donator de

explante;

- etapa a II-a, care include iniţierea, multiplicarea şi propagarea "in vitro"

a materialului vegetal;

- etapa a III- a, ce constă în pregătirea şi trecerea plantelor regenerate "in

vitro" pe substrat natural.

Pe baza noilor realizări ştiinţifice sunt acceptate cinci etape (fig.6.4.):

Etapa I. Înfiinţarea culturii de plantă mamă.

Etapa a II-a. Înfiinţarea culturii "in vitro" . Aceasta cuprinde iniţierea şi

creşterea de plante noi pe medii artificiale din fragmente vegetale (culturi de

organe cu capacitate regenerativă şi explante de dimensiuni microscopice, ţesuturi,

celule, protoplaşti).

Materialul vegetal folosit provine de la plante mamă sănătoase obţinute

anterior sau de la plante elită alese pentru înmulţire. În funcţie de tipul de explant

şi faza sezonală se recoltează în perioada de repaus relativ porţiuni de coarde care

nu au mugurii bine exteriorizaţi şi în faza de creştere intensă din perioada de viaţă

activă, lăstari cu frunze şi vârful intact.

Etapa a III-a. Formarea şi multiplicarea plantulelor neoformate.

Recipientele cu medii nutritive, în care s-au inoculat explante, se depun în camera

de creştere cu condiţii de mediu controlat, în rândul cărora temperatura, lumina,

umiditatea şi aerul ocupă un loc important.

Etapa a IV-a. Înrădăcinarea neoplantulelor. Multiplicarea şi

înrădăcinarea se realizează prin subculturi repetate de minibutaşi. Operaţiunea

poate fi favorizată, în prealabil, şi pe calea alungirii lăstarilor prin transferul

culturii iniţiale pe timp limitat pe un mediu adecvat.

Fluxul tehnologic de multiplicare constă în detaşarea, începând de la bază,

a lăstarilor neoformaţi în faza iniţială, urmată de fragmentarea lor sub formă de

minibutaşi de câte un nod cu ochi. Aceştia sunt trecuţi în subcultură pe un mediu

de cultură proaspăt, asemănător celui iniţial, însă, cu corecţia conţinutului în

substanţe hormonale, respectiv de reducere a citokininelor (zeatină sub 0,1 mg/l) şi

de asigurat preponderenţa auxinelor în favoarea înrădăcinării.

Multiplicarea se continuă prin subculturi repetate de până la 10 -12 etape

succesive, cu intervale de 35 - 45 zile pentru fiecare din acestea. În felul acesta se

poate ajunge la o rată posibilă de multiplicare de până la 2 x 10 6 (Nazeran, R.,

1972). Plantele obţinute prin subculturi repetate şi cele individualizate încă din

faza iniţială se înrădăcinează "in vitro".

Etapa a V-a. Transferul în mediul natural, verificarea şi livrarea

materialului. Rolul important în transferul plantelor din mediul controlat aseptic

în cel natural îl are aclimatizarea.. În faza de început, pentru diminuarea stresului

hidric, se acoperă fiecare plantă cu ghivece din material plastic. În vederea

certificării valorii biologice a materialului produs, plantele aclimatizate în mediul

natural se supun unui control citogenetic şi fitosanitar adecvat .

B I B L I O G R A F I E

1. M. Savatti , G.Nedelea, M.Ardelean – Trata de ameliorarea plantelor –

Editura Marineasa – Timişoara 2004.

2. Ardelean M. 1986 – Ameliorarea plantelor horticole şi tehnica

experimentală , Tipo Agronomia – Cluj Napoca

3. G.Nedelea – Ameliorare generală – Editura Agroprint – Timişoara – 2003.