Microinmultire

8/10/2019 Microinmultire

1/135

- 1 -

Lector univ. dr. ADRIAN-GEORGE PETICIL

MICRONMULIREA

PLANTELOR HORTICOLE


2/135

- 2 -

CUPRINS

INTRODUCERE 5

UNITATEA DE NVARENR. 1: ISTORICUL CULTURILOR DE CELULE

I ESUTURI VEGETALE6

1.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 1 61.2 nceputurile culturilor de celule 7

1.3 Avantajele i dezavantajele multiplicrii in vitro 13

1.4 Cercetarea n domeniul culturii de esuturi in vitron ara noastr 16

1.5 Comentarii i rspunsuri la teste 18

1.6Lucrare de verificare nr.1 22

1.7 Bibliografie minimal 22

UNITATEA DE NVARE NR. 2: BAZELE TEORETICE ALE

MICROPROPAGRII I N VITRO23

2.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 2 23

2.2 Biologia dezvoltrii plantelor (cormofite) n cazul culturilor de celule i esuturi in vitro 24


2.4 Lucrare de verificare nr.2 36


UNITATEA DE NVARE NR. 3:LABORATORUL DE CULTURI IN VI TRO 37


3.2 Alctuirea laboratorului de micropropagare 38

3.3 Dotrile laboratorului 45




UNITATEA DE NVARE NR. 4:ASEPSIA N CULTURILE VEGETALE INVITRO

52

4.1 Obiectivele unitii denvare nr. 4 52

4.2 Msuri generale de igien i asepsie 53

4.3 Asepsizarea ncperilor, a instrumentarului i a celorlalte obiecte de laborator 54

4.4 Asepsizarea vaselor de cultur 55

4.5 Asepsizarea mediilor de cultur, apei i a altor substane 55

4.6 Asepsizarea materialului vegetal 56


3/135

- 3 -

4.7 Verificarea asepsizarii 57




UNITATEA DE NVARE NR. 5: MEDIILE DE CULTUR 625.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 5 62

5.2 Generaliti 63

5.3 Compoziia mediului de cultur 64

5.4 Compuii anorganici i organici 65

5.5 Compuii fenolici, compuii antivirali i extractele vegetale 74

5.6 Prepararea mediilor de cultur i pH-ul 75

5.7 Problemele i infeciile care apar n mediile de cultur 785.8 Comentarii i rspunsuri la teste 82

5.9 Lucrare de verificare nr. 5 84


UNITATEA DE NVARE NR. 6: FAZELE PROPAGRII IN VI TRO 85


6.2 Etapa 0 / Pregtirea materialului vegetal n vederea prelevrii explantului 86

6.3Etapa 1/ Iniierea i stabilizarea culturii

90

6.4 Etapa 2/ Multiplicarea 92

6.5 Etapa 3/ nrdcinarea 93

6.6 Etapa 4/ Aclimatizarea 94




UNITATEA DE NVARE NR. 7: METODE DE PROPAGARE I N VITROA

CULTURILOR DE CELULE I ESUTURI VEGETALE 99


7.2 Organogeneza 100

7.3 Culturile de apexuri 101

7.4 Cultura de minibutai 102

7.5 Culturile de meristeme 103

7.6 Culturile de calus 105

7.7 Microaltoirea 106


4/135

- 4 -

7.8 Cultura de embrioni i endosperm 108

7.9 Cultura de embrioni zigotici 110

7.10 Smna sintetic 111

7.11 Cultura de antere, polen, ovare, ovule i esut nucelar 113

7.12 Cultura de protoplati 1137.13 Comentarii i rspunsuri la teste 116



UNITATEA DE NVARE NR. 8: MICROPROPAGAREA IN VITRO A

SPECIILOR HORTICOLE119


8.2 Micropropagarea in vitrola via-de-vie 1208.3 Micropropagarea in vitroa speciilor pomicole 121

8.4 Micropropagarea in vitroa speciilor floricole 124

8.5 Micropropagarea in vitroa cartofului 127

8.6 Micoriza i culturile in vitro 128




9 GLOSAR DE TERMENI 133

10 BIBLIOGRAFIE 135


5/135

- 5 -

INTRODUCERE

Romnia are un mare potenial n ceea ce privete domeniile horticole, de la viticultur la

pomicultur, legumicultur sau floricultur, i n special, n ceea ce privete producerea dematerial sditor. Cum cerinele pieei moderne sunt pentru material sditor de calitate, liber de

virusuri i boli i certificat, micronmulirea - ca disciplin i afacere - este mai mult dect

necesar pentru evoluia pieei de profil.

Ne-am propus n acest manual dedicat studenilor de la Horticultur ID s trecem n revist

principalele instrumente cu care opereaz aceast disciplin, n sperana c, n viitor, una din

direciile de dezvoltare a pieei agricole va cuprindei domeniul micronmulirii, stabilind n acest

fel primele noiuni necesare pentru a opera n domeniul biotehnologiilor. Pe parcursul capitolelor

am trecut n revistdiverse aspecte legate de structura laboratoarelor, de necesarul tehnic aferent

pentru ca mai apoi s listam principalele tehnologii de producie n domeniul micronmulirii,

categoriile de culturi care se pot opera.

La fiecare capitol am ncercat s semnalm problemele deosebite care pot aprea sau

caracterul de importani inedit, micromulirea fiind un bra al biotehnologiei, o tiin aplicat

deosebit de valoroas, care necesit ns cunotine din varii domenii adiacente, de la biochimie,

agrochime, genetic sau biologie, la fiziologie i ameliorare.Pentru a ne ncadra ca ar membr cu drepturi depline n Comunitatea european, nu

avem doar drepturi, avem i obligaii, i una dindre acestea este aceea de a racorda serviciile

oferite la nivelul performanelor europene. Dezvoltarea segmentului de biotehnologii vegetale cu

aplicabilitate n horticultursau agricultur, prin deschiderea de laboratoare de micronmulire,

care s ofere spre comercializare att pe piaa interna ct i pe piaa european produse de

valoare, certificate i care s corespund exigenelor crescnde ale acestui domeniu - de la

productor la consumator, susine importana acestei materii de studiu n cadrul programeitiinifice a Facultii de Horticultur.

Autorul


6/135

- 6 -

UNITATEA DE NVARENR. 1:

ISTORICUL CULTURILOR DE CELULE I ESUTURI VEGETALE

CUPRINS

1.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 1. 61.2 nceputurile culturilor de celule. 7

1.3 Avantajele i dezavantajele multiplicrii in vitro. 13

1.4 Cercetarea n domeniul culturii de esuturi in vitron ara noastr. 16




1.1 Obiectivele Unitii de nvare nr. 1

Prin studierea acestei uniti de nvare vei fi n msur s:

Defineti locul disciplinei n arealul de specialitate.

Identifici principalele etape n dezvoltarea acestei tiine.

Listezi avantajele pe care le prezint aceast tiin i tehnic.

Plasezi cercetarea romneasc n contextul mondial al

dezvoltrii acestei tehnologii, ramur a biotehnologiilor.


7/135

- 7 -

1.2. nceputurile culturilor de celule.

Plantele sunt organismele care prin procesul de fotosintez realizeaz cel mai spectaculos

proces din lumea vie, acela de transformare a energiei solare n energie chimic. Ele joac un rol

hotrtor pentru existena uman, constituind aurul verde, bogia de nenlocuit a Terrei, fiind

surs de hran i energie pentru om i animale. Dac la acest rol se adaug i rolul de purificator alatmosferei prin absorbia bioxidului de carbon i eliberarea oxigenului i rolul de materii prime

pentru unele industrii (alimentar, textil, farmaceutic), gsim justificat interesul omului pentru

perfecionarea continu a procedeelor de nmulire i cultivare a plantelor.

Secolul XX, este considerat pe bun dreptate secolul marilor progrese care au condus la

mbogirea i acumularea informaiilor legate de natur, de descifrare a mecanismelor ereditii, de

descifrare a legitilor din domeniul fenomenelor biologice i a factorilor mutageni, a modului cum

acetia pot fi manipulai pentru inducerea variabilitii pentru crarea de noi forme vegetale,procedee de cultivare i nmulire a plantelor.

S-a consolidat concepia c celula vegetal conine n nucleul su totalitatea informaiei

genetice necesar dezvoltrii unui organism complet. Ea se supune principiului clasic al

totipoteneicelulare. Regenerarea de plante pornind de la o singur celul haploid sau diploid a

stat i st la bazatehnicii nmulirii plantelor in vitro.

Cultura de esuturi vegetale s-a dezvoltat ca urmare a cercetrilor lui Gottlieb Haberlandt

care, intuind capacitatea regenerativ a celulelor plantelor superioare, a ncercat s cultive esuturi

vegetale. El public n anul 1902 lucrarea Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzelle n care este

fundamentat teoretic ideea c orice celul diploid sau haploid conine informaia genetic

ereditar imprimat n genom. La acea vreme, experienele sale nu au fost ncununate de succes

deoarece a folosit explante din celule cu un grad nalt de difereniere morfofuncional (esut

palisadic, stomate etc.) dar i a limitelor la acea dat a cunotinelor de fiziologie vegetal, a

cunotinelor n stabilirea compoziiei substratului de cultur n ce privete natura i concentraia

substanelor macro i microelemente, a proporiei n care trebuie acestea folosite, a

indispensabilitii prezenei n mediu a unor surse de C organic, vitamine i stimulatori de cretere.

Ideea lui Haberlandt a fost respin de botanitii contemporani (E. Kster, 1926), care

susineau c obinerea de plante ntregi prin multiplicare de celule somatice nu este realizabil.

Haberlandt lanseaz totui ipoteza totipotenialitii celulare, concept pe care l gsim

formulat de Schleiden i Schwann (1939) la care i aduseser o contribuie n perioada 19201939

White, 1939 (care a reuit s obin calus din vrfurile rdcinilor de tomate) i R. J. Cautheret,

1934 (care a obinut calusuri folosind explante de salcie, plop, ulm, tutun i morcov pe care le-a


8/135

- 8 -

stimulat cu auxine i le-a repicat n medii sterile), Wirchow n 1858, Bernard, 1878 i anatomistul

vegetal Goebel, citai de White n 1963.

Capacitatea unor celule eucariote de a funciona ca organisme primitive n condiiile

separrii de planta mam susinut de Haberlandt a fost exploatat prin diferite practici de nmulire

vegetativ (butire, marcotaj, altoire).Vchting i Rechinger (1893), citai de White (1963), au iniiat experimente pentru

determinarea limitelor de divizibilitate ale materialului vegetal, fr pierderea capacitii

regenerative.

n 1957, W. D. Stewart elaboreaz prima metodologie de cultivare in vitroa esuturilor

vegetale pe medii nutritive coninnd hormoni de cretere.

Progresele din domeniul biologiei au permis abia n zilele noastre - prin tehnicile

perfecionate i cunotinele despre structura i funcionalitatea celulelor i organitelor celulare generarea de plantule dintr-o singur celul.

Se cunosc citate n literatur (1904) experienele efectuate de Hanning care a obinut

plantule la crucifere pornind de la embrioni extrai din semine imature la Raphanus sativus,

R.landra, R.candatus i Cochlearia danica, experienele dovedind posibilitatea creterii pe medii

artificiale cu adaos de zaharoz a unor fragmente de plante.

Laibach (1925, 1929) demonstreaz utilitatea practic a tehnicii de nmulire in vitropentru

ameliorarea plantelor. El a izolat embrionii din semine neviabile din ncruciarea luiLinum perene

cu Linum austriacum, i-a adus la maturitate i i-a cultivat pe medii nutritive. Aceast metod a

servit mai trziu la realizarea de hibrizi ce ddeau natere la semine sterile, respectiv la embrioni

avortai.

ntre 1904 i 1932 au fost efectuate numeroase ncercri de cultivare pe medii artificiale a

unor explante, dar rezultatele au dovedit c cercetrile n domeniu se aflau n impas (White, 1963).

Muli cercettori s-au aliat n aceast perioad ideii susinut de Kster (1926) potrivit creia

cultivarea esuturilor vegetale este nerezolvabil (Morel, 1948).

Totui, experienele botanitilor au continuat, n jurul anilor 1930, savanii Gautheret n

Frana i concomitent White n Statele Unite efectueaz cercetri n direcia cultivrii in vitro a

explantelor provenite din esut cambial prelevat de la arar, salcie, ulm, plop, (Gautheret, 1931) i

rdcini excizate de la plantele de tomate (White, 1934).

Odat cu descoperirea n 1934 a primului fitohormon (acidul indolil acetic) de ctre

Kgl, Haagen Smit i Erxleben a fost deschis o nouetap n succesul cultivrii in vitro a

explantelor vegetale (Moore, 1979).


9/135

- 9 -

n Frana, Gautheret i Nobecourt (1939), lucrnd independent, obin calus din fragmente

prelevate din rdcinile metamorfozate (tuberizate) de morcov. White (1938), Gautheret i

Nobecourt (1939) realizeaz aproape simultan cultivarea in vitroa calusului, reuind s menin n

via esuturile inoculate i proliferarea acestora, dovedind posibilitatea transferrii i nmulirii

acestor esuturi prin subcultur.Putem considera c prin cercetrile lor, White (1938), Gautheret i Nobecourt au pus bazele

cultivrii in vitro a explantelor vegetale: organe, esuturi i celule. Totodat, ei i-au adus

contribuia i n domeniul alctuirii mediilor de cultur privind compoziia, concentraia n macro i

microelemente eseniale pentru nutriia explantelor, prezena unei surse de C i N organic, a unor

vitamine i auxine.

Culturile de calus i subcultivarea acestora au reuit i datorit descoperirii n 1934 a rolului

fiziologic al auxinei acidul 3 indolilacetic (AIA), care introdus n mediu de cultur favorizeazdeclanarea i susinerea proceselor regenerative.

n 1941, Van Querbeek i colab. demonstreaz efectul stimulator al laptelui de cocos

asupra dezvoltrii embrionilor i a formrii de calus din explante deDatura.

White i Braun, n 1942, apoi Braun singur, n 1945- reuesc cultivarea unor esuturi

tumorale caulinare pe medii aseptice. Meritele n multiplicarea i propagarea in vitroa unor plante

horticole revin lui Morel i Martin (1952, 1955). Ei au obinut material sditor devirozat pornind de

la plante infectate cultivate pe medii aseptice. Astfel, la nivelul materialului sditor au fost eradicate

virozele la cartof, orhidee, garoafe, dalii etc. (Margara, 1982).

Morel i Martin au demonstrat la dalii (1952) i la cartof (1955) c din meristemele

prelevate de la plante mame infectate sepot regenera clone sntoase. Morel (1960) la Cymbidium

stabilete tehnica de micropropagare in vitro care reprezint un prim pas n micropropagarea

industrial. El apreciaz c dintr-un singur explant ntr-un singur an se pot obine 4 milioane de

plante identice din punct de vedere genetic, libere de viroze. Cu aceast metod s-a revoluionat

tehnica nmulirii orhideelor, extins mai trziu la garoafe, crizanteme i alte specii ornamentale, la

pomii fructiferi, n viticultur i silvicultur.

O serie de ali cercettori (Gregory, 1940; Taylor, 1950; Nitsh, 1951; Sparrow i colab.,

1955; Maheshwari i Lal, 1958; Vasil, 1957, 1959 i alii) adopt o direcie deosebit de interesant,

aceea a regenerrii i diferenierii de plantule in vitro folosind componente florale, antere sau

grunciori depolen, fructe ori semine imature (Maroti, 1976).

Tehnica multiplicrii in vitro a explantelor s-a perfecionat n paralel cu rezultatele

cercetrilor din domeniul studiilor compoziiei i consistenei mediilor de cultur. Heller (1951)

experimenteaz creterea esuturilor pe mediu gelificat cu agar sau cu silicagel iar n 1955, Miller


10/135

- 10 -

i colab., izoleaz din sperma de heringi, chinetina. n 1957, Skoog i Miller avanseaz ipoteza

balanei hormonale, a raportului dintre auxin i citochinin, care favorizeaz iniierea de

rdcini i mugurai dintr-o cultur de calus.

Skoog (1956) i Miller (1957) descoper importana chinetinei i aduc elemente noi privind

efectul acestui hormon, precum i aciunea raportului ntre chinetin i auxin asupra proceselor deorganogenez la explantele cultivate in vitro, deoarece manipularea acestei balane influeneaz

reuita direcionrii proceselor de difereniere morfologic la esuturile cultivate prin aceast

metod.

Astfel, sporirea cantitii de auxin determin orientarea proceselor de morfogenez spre

rizogenez n timp ce creterea proporiei de chinetin induce formarea de mugurai i lstrai, iar

la concentraii ridicate fiecare hormon administrat separat determin generare de calus i inhibarea

proceselor de organogenez.Experienele lui Muir (1953) reprezint o premier n sensul c obine suspensii subcelulare

cu celule de Tagetes erectai Nicotiana tabacum iar Nickell cu celule de Phaseolus vulgaris. n

1954Muir i colab.izoleaz ca explant o celul care apoi a fost crescut pe punte de hrtie de filtru.

n 1954, Muir i colab.reuesc izolarea unei unice celule dintr-o suspensie de celule sau din

calus i obin prin diviziuni repetate un conglomerat de celule de tip calus. Doi ani mai trziu,

Nicckel (1956) descrie modul de cretere n cultur continu a unor suspensii celulare de fasole.

n deceniile cinci i ase ale secolului XX nregistrm rezultatele unor cercettori n

domeniu printre care amintim:

n 1944, Skoog iniiaz experimente pentru studierea proceselor de organogenez pe calus

de tutun, studiu care reprezint un progres n domeniul controluluievoluiei inoculilor vegetali in

vitro i un salt calitativ pentru dezvoltarea culturilor de esuturi i celule de plante. Studiile de

organogenez efectuate de Skoog n1944 pe calus de tutun reprezint un progres important n

domeniul controlriievoluiei inoculilor vegetali in vitro.

Caplin i Steward, 1948 i Steward i Caplin, 1951, 1952, realizeaz un pas n dezvoltarea

culturii in vitrola cormofite prin adugarea n mediile de cultur a laptelui din nuc de cocos i a

auxinei de sintez 2,4 diclorfenoxiacetic cu rol stimulator asupra creterii esuturilor de morcov i

de cartof. Aceste experiene relev faptul c unii fitohormoni sau substane fitoefectoare pot aciona

sinergic.

Torrey (1957) realizeaz o cultur de celule vegetale n pictur suspendat, Jones i colab.

(1960) obin o microcultur pe o lam de microscopie. Steward i Shantz (1956) i Reinert (1956)

studiaz creterea unei suspensii celulare dePicea glauca.


11/135

- 11 -

Reinert (1958) i Steward mpreun cu colaboratorii (1958) studiaz problema

embriogenezei ntr-o suspensie provenit din rdcini de morcov. Experiena inoculrii unei celule

i formarea unei suspensii celulare se datoreaz lui Jones i colab. (1960), iar obinerea de clone

dintr-o celul unic revine lui Hildebrandt (1958).

Skoog (1944) i Skoog i Tsui (citai de Gautheret, 1959) demonstreaz pe explantetisulare constnd din mduv de tutun o sporire a creterii masei de calus i formarea de mugurai

n condiiile aplicrii de adenin i ridicrii coninutului de fosfat n mediile de cultur.

n anul 1959 se realizeaz dintr-o singur celul o plantul (Braun). Aceast performan

repetat i prin experienele lui Vasil i Hildebrandt (1965), Chandra i Hildebrandt (1967),

confirm valabilitatea ipotezei emis la nceputul secolului de Hildebrandt, aceea a totipotenialitii

celulei vegetale i anume c dintr-o celul somatic, diploid poate fi regenerat o plantul ce i

poate continua i ncheia ciclul biologic complet la trecerea ei n cadrul natural de via.Progresele cele mai importante n domeniul cultivrii explantelor vegetale pe medii aseptice

s-au nregistrat dup anul 1960,astfel:

Bergman, 1960, relizeaz experimentul de obinere a unei culturi de celule cu circa 90%

celule libere individualizate prin metoda de filtrare a populaiei de celule. ncorporarea celulelor

ntr-o plac de mediu de cultur agarizat a condus la fenomenul c fiecare celul izolat a generat

cte o colonie de celule vizibil cu ochiul liber iar dup separare s-au realizat clone pornind de la o

celul unic.

n anul 1960, Cocking izoleaz pe cale enzimatic protoplati din rdcini, vrful acestora

sub influena unei enzime de origine fungic celulazaduc la formarea dup un timp a unei noi

membrane celulare.

Kohlenbach (1966) izoleaz mecanic celule din mezofil foliar separate din frunzele de

Macleaya cordatape care reuete s le cultive in vitro.

Nagata i Takebe n anul 1970 demonstreaz c proptoplatii izolai din mezofil de frunze

de tutun formeaz n timp mici colonii celulare.Ulterior, Takebe i colab.cultiv protoplati de

tutun dup metoda descris de Bergman (1960) reuind obinerea de calus din culturi de celule

generate din protoplati, prin care se regenereaz plantulele. Randamentul acestor metode la diferite

specii continu s creasc.

S-a nscut astfel ideea realizrii tehnicilor de fuziune a protoplatilor pentru obinerea de

hibrizi somatici ntre speciile la care hibridarea sexuat nu este posibil.

n 1972, Carlson i colab. obin primul hibrid somatic produs prin fuziune de protoplati de

laNicotiana glaucaxNicotiana langsdorffii.


12/135

- 12 -

Paralel cu descoperirile teoretice n domeniul cercetrilor genetice, care fundamenteaz i

pun bazele multiplicrii in vitro se nregistreaz progrese importante n domeniul cercetrilor

aplicative, acela de cultivare a explantelor pe medii aseptice.

Printre cei care au contribuit la dezvoltarea sistemului special de cultivare in vitro a

celulelor amintim pe Steward, Mages i Smith (1958),Tulecke i Nickell (1959, 1960). Ulterior,Byrne i Koch (1962) construiesc instalaii de mare capacitate pentru culturile de celule.

O realizare deosebitconst n punerea la punct a multiplicrii exemplarelor vegetale n ritm

accelerat , lucru greu de imaginat ca fiind realizabil cu trei decenii n urm.

Multiplicarea prin subculturi succesive in vitrorealizat de Murashige, 1977 i 1978 dintr-

un singur meristem de orhidee, care a fcut posibil obinerea a 4 milioane de exemplare, copii

fidele ale plantei donatoare, a demonstrat i eficiena economic a metodei prin care se face

economie de material biologic. Acest fapt a determinat pe practicieni s asimileze procedeeleelaborate n laboratoarele de cercetare i s standardizeze metodele pe profil industrial, crend

adevrate industrii horticole i silvice pentru obinerea prin aceast metod a materialului vegetal

pentru plantat. Clonarea in vitro n ritm intensiv a exemplarelor valoroase a uurat munca

amelioratorilor.

Test de autoevaluare1. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de

spaiul avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la

urmtoarele ntrebri:

a) Ce rol joac plantele n existena uman?

b) Ce proces st la baza tehnicii nmulirii in vitro?

c) Cine a pus bazele cultivrii culturilor in vitroa explantelor vegetale,

celule, esuturi i organe i n ce an?d) n ce an i de ctre cine a fost confirmat teoria totipotenei celulare?

e) Comentai confirmarea importanei economice a micropropagrii.

Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de

nvare.


13/135

- 13 -

1.3. Avantajele i dezavantajele multiplicrii in vitro.

Avantajele multiplicrii in vitro, superioar metodelor de nmulire vegetativ clasic,

constau n rapiditatea (scurtarea timpului), obinereade plante juvenilizate, lipsa bolilor i vigoare

mai mare.

Metoda evit variabilitatea genetic i permite obinerea de material nevirozat n finalconducnd la creterea calitii materialului vegetal.

Este permis prin aceast metod i multiplicarea speciilor care nu au semine viabile sau

care nu se pot nmuli natural pe cale vegetativ.

Culturile de explante vegetale in vitro reprezint modele, instrumente valoroase n

cercetarea modern n domeniul biologiei vegetale. Ele prezint urmtoarele avantaje:

Permit studierea aciunii fitohormonilor, a implicrii permeabilitii, absorbiei,

fotosintezei, respiraiei, metabolismului, n morfogenez, genetic i biochimie.

Sunt domenii de abordare multidisciplinar.

Pun la dispoziie mijloacele stpnirii i dirijrii creterii.

Permit ntr-o perioad scurt de timp crearea de plante adaptate la condiii vitrege de

via (rezistente la aciunea duntoare a unor ageni stresani), plante create n decurs de

cteva luni prin comprimarea evoluiei filogenetice (Gill, 1980).

Din punct de vedere istoric dezvoltarea i evoluia cunotinelor n domeniul tehnicilor de cultivare

in vitroa celulelor i esuturilor vegetale cunoate 5 etape distincte:

Dup parcurgerea acestui subcapitol trebuie s reinei:

Plantele sunt organismele care transform energia solar n

energie chimic i constituie aurul verdeai Terrei.

Principiul de baz al tehnicii nmulirii plantelor in vitroeste

acela al totipotenei celulare, elaborat de Haberland n 1902.

Descoperirea primului fitohormon (IBA) a deschis o nou

etap n succesul culturilor in vitro.

ncepnd cu 1960, a fost demonstrat eficiena economic a

multiplicrii in vitro, uurnd procesele de nmulire i

ameliorare a plantelor.


14/135

- 14 -

1. ntre anii 19391902 perioad cnd s-a lansat teoria unitii structurale fundamentale a

lumii vii (Schleiden i Schwann, 1939) celula a fost acceptat ca unitate structural de

baz a organismelor vii, fiind apoi emis postulatul conceptului de totipotenialitate

(omnipotenialitate) celular a lui Haberlandt, 1902.

2.

n perioada 1902 1920, o perioad de stagnare a cercetrilor n domeniu, deoareceprimele experimente cu culturile de explante nu au condus la rezultate favorabile.

3. Etapa anilor 1920 1939 nregistreaz primelesuccese n domeniul creterii in vitroa

embrionilor, a rdcinilor, a obinerii de calus, esuturi care cultivate apoi pe medii

aseptice i subcultivate periodic prin repicri au condus la obinerea de material vegetal

(White, Gautheret i Nobecourt ).

4. A patra etap ntre 1939 1966 este caracterizat prin studiile efectuate de numeroi

cercettori privind comportamentul diferitelor explante cultivate pe diferite medii decultur, pentru cunoaterea factorilor implicai n procesele de nmulire i difereniere a

celulelor, gradul lor de autonomie funcie de substrat, condiiile de cultur, proveniena

i natura explantului.

n aceast direcie, n 1953 s-a reuit cultivarea meristemelor caulinare, aplicale (Morel

i Martin) i obinerea deplante libere de viroze folosind ca plant donatoare o plant

polivirusat, ocazie cu care s-a emis teoria (Skoog i Miller-1957), referitoare la

controlul hormonal al organogenezei (rolul balanei auxin/citochinin), obinerea de

embrioni somatici, (Steward i Reinert, 1958, 1959), primele culturi de celule (Muir,

Torrey i Jones i colab., 1954 1960), izolarea enzimatic de protoplati (1960) i

obinerea primului hibrid somatic (Carlson, 1972).

5. Perioada ncepnd din 1966 i pn n zilele noastre delimiteaz etapa modern a

culturii de celule i esuturi vegetale, caracterizat prin extinderea larg a utilizrii

explantelor pentru multiplicare. n aceast perioad, cercetrile fundamentale n biologie

cunosc o acumulare de cunotine n domeniile citologiei, citofiziologiei, biologiei

moleculare, geneticii i ameliorrii la nivel ultrastructural i molecular precum i n

biochimie, fiziologie etc.

Paralel cu cercetrile biologice fundamentale apar o serie de subramuri de biotehnologii

vegetale cum ar fi citofitotehnologiile:

nmulirea i clonarea cultivarilor valoroi;

micropropagarea i generarea de material vegetal sntos;


15/135

- 15 -

elaborarea de tehnologii de modificare a genomului unor specii cormofite;

exploatarea capacitii de biosintez a celulelor izolate n condiii de cultur

intensiv;

obinerea de embrioni somatici, producerea de semine artificiale;

clonarea rapid a unor soiuri rezultate din lucrrile de ameliorare.

Test de autoevaluare

2. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de spaiul

avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele

ntrebri:a) Comentai avantajele multiplicrii in vitro.

b) Menionai cele cinci etape distincte din evoluia micropropagrii.

Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de nvare.


Avantajele multiplicrii in vitro constau n scurtarea timpuluipentru obinerea unor plante sntoase, viguroase, lipsite de

virusuri i a unor specii fr semine viabile care nu se pot nmuli

natural pe care vegetativ.

Din 1966 i pn n prezent este delimitat etapa modern a culturii

de celule i esuturi in vitro, cu implicaii economice majore.


16/135

- 16 -

1.4 Cercetarea n domeniul culturii de esuturi in vitron ara noastr.

n ara noastr, din anul 1975 au fost abordate cercetri sistematice privind p roblemele

nmulirii plantelor in vitro fiind amenajate laboratoare de culturi de esuturi la Institutul deCercetri Biologice din Bucureti, Institutul de Cercetri Silvice din Bucureti, n unitile de

cercetare agricol i horticol de la Fundulea, Vidra, Mrcineni, tefneti, n unitile de

nvmnt superior agricol din Cluj-Napoca, Bucureti, Iai, Facultatea de Biologie din Bucureti,

Facultatea de Farmacie din Bucureti i n uniti de producie cum ar fi ntreprinderea de Sere

Codlea (1988).

Ulterior au luat fiin numeroase nuclee de cercetare n domeniul culturilor de explante in

vitro, colective care s-au dezvoltat i laboratoare care s-au dotat pentru a contribui la lrgireacercetrilor i cunotinelor n acest domeniu.

n anul 1984 menionm apariia primei monografii cu acest profil intitulat Culturi de

celule i esuturi vegetale aplicaii n agricultur Ed.Ceres, autori Cachi C.D., Raicu P.Badea

M.E.

n anul 1999 la Iai, la Institutul Agronomic Ion Ionescu de la Brad apare tot n acest

domeniu lucrarea Biotehnologiile viitorului autor Constantin Milic.

n anul 2000 apare la Sibiu lucrarea Biotehnologie vegetal vol.I Bazele teoretice i

practiceautori Dorina Cachi-Cosma i Camelia Sand.

n nvmntul superior agricol, primele cursuri n domeniul culturilor de celule i esuturi

vegetale au luat fiin la Institutul Agronomic N.Blcescu din Bucureti sub form de cursuri

postuniversitare, ntre anii 19851988, fiind editat i un volum intitulat Curs practic de culturi de

esuturi in vitro, cu aplicaii n legumicultur i floricultur autori Cachi C.D. i Petrescu

C.(1985). Din anul 1987 acest curs s-a introdus sub form opional la seciile de biologie i la

facultile de horticultur din ar.

Tehnicile culturilor cu explante in vitro au cptat n ultimile decenii ca urmare a

progreselor teoretice i practice din domeniu, o ampl dezvoltare i extindere n ara noastr

aprnd o serie de bioindustrii profilate pe creterea in vitroa diferitelor explante, care impunea

pregtirea n acest domeniu a unor specialiti biotehnologi. Ca urmare este nfiinat n anul 1995

la Bucureti n cadrul Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar, Facultatea de

Biotehnologie cu ramuri ale biotehnologiei vegetale ce se constitue n discipline fundamentale

independente.

Micarea mondial din domeniul culturilor de explante este foarte activ.


17/135

- 17 -

n anul 1972 a luat fiin International Association for Plant Tissue Culture la care

Romnia a aderat n anul 1975. Din patru n patru ani au loc Congrese Mondiale organizate de

aceast asociaie.

La noi n ar se nfiineaz Asociaia Romn de Culturi de esuturi i Celule Vegetale.

Prima manifestare tiinific din ara noastr cu tematica culturilor de celule i esuturivegetale a fost oraganizat la Cluj Napoca n anul 1981 de Institutul de Cercetri de Biologie.

n 1989 tot la Institutul de Cercetri Biologice din Cluj Napoca s -a organizat al IV-lea

Simpozion Naional de Culturi de Explante.

n noiembrie 2000 se organizeaz la Universitatea Babe Bolyai Facultatea de Biologie

din Cluj Napoca al X-lea Simpozion de Culturi de esuturi i Celule Vegetale care marcheaz 25 de

ani de la iniierea primelor cercetri n domeniul culturilor de celule i esuturi n Romnia.


3. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de spaiul

avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele

ntrebri:

a) Comentai istoricul culturilor in vitron ara noastr.

b) Care sunt motivele dezvoltrii i extinderii n ara noastr a bio industriilor

profilate pe nmulirea in vitro.

Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de nvare.


C n Romnia, dup anul 1975, a nceput amenajarea laboratoarelor de

culturi de esuturi precum i cercetarea sistematic n domeniu.

n domeniul nvmntului superior agricol, primele cursuri de culturi

in vitroau fost inute la Institutul Agronomic Nicoale Blcescu dinBucureti, ncepnd cu anul 1985.


18/135

- 18 -

1.5 Comentarii i rspunsuri la teste

ntrebarea 1

a) Plantele sunt organismele care prin procesul de fotosintez

realizeaz cel mai spectaculos proces din lumea vie, acela detransformare a energiei solare n energie chimic. Ele joac un rol

hotrtor pentru existena uman, constituind aurul verde, bogia

de nenlocuit a Terrei, fiind surs de hran i energie pentru om i

animale. Dac la acest rol se adaug i rolul de purificator al

atmosferei prin absorbia bioxidului de carbon i eliberarea

oxigenului i rolul de materii prime pentru unele industrii

(alimentar, textil, farmaceutic), gsim justificat interesul omuluipentru perfecionarea continu a procedeelor de nmulire i

cultivare a plantelor.

b) S-a consolidat concepia c celula vegetal conine n nucleul su

totalitatea informaiei genetice necesar dezvoltrii unui organism

complet. Ea se supune principiului clasic al totipotenei celulare.

Regenerarea de plante pornind de la o singur celul haploid sau

diploid a stat i st la baza tehnicii nmulirii plantelor in vitro.

c) Putem considera c,prin cercetrile lor, White (1938), Gautheret

i Nobecourt au pus bazele cultivrii in vitroa explantelor vegetale:

organe, esuturi i celule. Totodat, ei i-au adus contribuia i n

domeniul alctuirii mediilor de cultur privind compoziia,

concentraia n macro i microelemente eseniale pentru nutriia

explantelor, prezena unei surse de C i N organic, a unor vitamine

i auxine.

d) n anul 1959 se realizeaz dintr-o singur celul o plantul

(Braun). Aceast performan repetat i prin experienele lui Vasil

i Hildebrandt (1965), Chandra i Hildebrandt (1967), confirm

valabilitatea ipotezei emis la nceputul secolului de Hildebrandt,

aceea a totipotenialitii celulei vegetale i anume, cdintr-o celul

somatic, diploid poate fi regenerat o plantulce i poate


19/135

- 19 -

continua i ncheia ciclul biologic complet la trecerea ei n cadrul

natural de via.

e) Multiplicarea prin subculturi succesive in vitro realizat de

Murashige, 1977 i 1978 dintr-un singur meristem de orhidee, care

a fcut posibil obinerea a 4 milioane de exemplare, copii fidele

ale plantei donatoare, a demonstrat i eficiena economic a

metodei prin care se face economie de material biologic. Acest fapt

a determinat pe practicieni s asimileze procedeele elaborate n

laboratoarele de cercetare i s standardizeze metodele pe profil

industrial, crend adevrate industrii horticole i silvice pentru

obinerea prin aceast metod a materialului vegetal pentru plantat.

Clonarea in vitron ritm intensiv a exemplarelor valoroase a uurat

munca amelioratorilor.

ntrebarea 2

a. Avantajele multiplicrii in vitroconstau n rapiditatea (scurtarea

timpului) obinerii de plante juvenilizate, lipsa bolilor i vigoare

mai mare. Metoda evit variabilitatea genetic i permite obinerea

de material nevirozat n final conducnd la creterea calitii

materialului vegetal. Ea permite i multiplicarea speciilor care nu

au semine viabile sau care nu se pot nmuli natural pe cale

vegetativ. Dintre avantaje: permite studierea aciunii

fitohormonilor, a implicrii permeabilitii, absorbiei,

fotosintezei, respiraiei, metabolismului, n morfogenez, genetic

i biochimie; pune la dispoziie mijloacele stpnirii i dirijrii

creterii; permite ntr-o perioad scurt de timp crearea de plante

adaptate la condiii vitrege de via (rezistente la aciuneaduntoare a unor ageni stresani), plante create n decurs de

cteva luni prin comprimarea evoluiei filogenetice (Gill, 1980).

ntre anii 1939 1902 perioad cnd s-a lansat teoria unitii

structurale fundamentale a lumii vii (Schleiden i Schwann,

1939) celula a fost acceptat ca unitate structural de baz a

organismelor vii, fiind apoi emis postulatul conceptului de

totipotenialitate (omnipotenialitate) celular a lui Haberlandt,1902. n perioada 19021920, o perioad de stagnare


20/135

- 20 -

a cercetrilor n domeniu, deoarece primele experimente cu

culturile de explante nu au condus la rezultate favorabile. Etapa

anilor 1920 1939 nregistreaz primele succese n domeniul

creterii in vitroa embrionilor, a rdcinilor, a obinerii de calus,esuturi care cultivate apoi pe medii aseptice i subcultivate

periodic prin repicri au condus la obinerea de material vegetal

(White, Gautheret i Nobecourt). A patra etap ntre 1939

1966 este caracterizat prin studiile efectuate de numeroi

cercettori privind comportamentul diferitelor explante cultivate

pe diferite medii de cultur, pentru cunoaterea i a factorilor

implicai n procesele de nmulire i difereniere a celulelor,gradul lor de autonomie funcie de substrat, condiiile de cultur,

proveniena i natura explantului. n aceast direcie, n 1953 s-a

reuit cultivarea meristemelor caulinare, apicale (Morel i

Martin), obinerea de embrioni somatici, Steward i Reinert,

1958, 1959), primele culturi de celule (Muir, Torrey i Jones

colab., 1954 1960), izolarea enzimatic de protoplati (1960)

i obinerea primului hibrid somatic (Carlson, 1972). Perioada

ncepnd din 1966 i pn n zilele noastre delimiteaz etapa

modern a culturii de celule i esuturi vegetale, caracterizat

prin extinderea larg a utilizrii explantelor pentru multiplicare.

n aceast perioad, cercetrile fundamentale n biologie cunosc

o acumulare de cunotine n domeniile citologiei,

citofiziologiei, biologiei moleculare, geneticii i ameliorrii la

nivel ultrastructural i molecular precum i n biochimie,

fiziologie etc.

ntrebarea 3

a. n ara noastr, din anul 1975 au fost abordate cercetri

sistematice privind problemele nmulirii plantelor in vitrofiind

amenajate laboratoare de culturi de esuturi la Institutul de

Cercetri Biologice din Bucureti, Institutul de Cercetri Silvice

din Bucureti, n unitile de cercetare agricol i horticol de la

Fundulea, Vidra, Mrcineni, tefneti, n unitile de


21/135

- 21 -

nvmnt superior agricol din Cluj-Napoca, Bucureti, Iai,

Facultatea de Biologie din Bucureti, Facultatea de Farmacie din

Bucureti i n uniti de producie cum ar fi ntreprinderea de Sere

Codlea (1988).b. Tehnicile culturilor cu explante in vitro au cptat n ultimile

decenii o ampl dezvoltare i extindere n ara noastr, ca urmare a

progreselor teoretice i practice din domeniu, aprnd o serie de

bioindustrii profilate pe creterea in vitro a diferitelor explante, care

impunea i pregtirea n acest domeniu a unor specialiti biotehnologi.


22/135

- 22 -

1.6 Lucrare de verificare nr. 1

1.7 Bibliografie minimal

1. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia Universitar

Atheneum, Bucureti, 1993

2. D. Hoza, 1997, Biotehnologie pomicol.

3. Rou, 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist.

4. F. Stnic, 1999, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,

Editura Grand;

INSTRUCIUNI

Lucrarea de verificare solicitatimplic activiti care necesit cunoaterea

Unitii de nvare nr. 1.

Rspunsurile la ntrebri vor fi transmise tutorelui pentru comentarii,

corectare i evaluare. Pe prima pagin a lucrrii se vor scrie urmtoarele:

Titulatura acestui curs (MICRONMULIREA PLANTELOR

HORTICOLE), numrul lucrrii de verificare, numele i prenumele

studentei (studentului). Fiecare rspuns va trebui s fie clar exprimat i s

nu depeasc o jumtate de pagin. Punctajul aferent este menionat

pentru fiecare ntrebare.

ntrebrile la care trebuie s rspundei sunt urmtoarele:

1. Ce rol joac plantele n existena uman? 1 p

2. Ceproces st la baza tehnicii nmulirii in vitro?1 p

3. Cine a pus bazele cultivrii culturilor in vitro a explantelor vegetale,

celule, esuturi i organe i n ce an?1p

4. n ce an i de ctre cine a fost confirmat teoria totipotenei celulare?1

p

5. Comentai confirmarea importanei economice a micropropagrii.-1p

6.Comentai avantajele multiplicrii in vitro. - 1p

7. Menionai cele cinci etape distincte din evoluia micropropagrii.- 1p

8. Comentai istoricul culturilor in vitron ara noastr.- 1p

9. Care sunt motivele dezvoltrii i extinderii n ara noastr a bio

industriilor profilate pe nmulirea in vitro.-1p

*Un punct se acorda din oficiu.


23/135

- 23 -

UNITATEA DE NVARENR. 2:

BAZELE TEORETICE ALE MICROPROPAGRII I N VITRO

CUPRINS

2.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 2 232.2 Biologia dezvoltrii plantelor (cormofite) n cazul culturilor de celule i esuturi in vitro 24




2.1 Obiectivele Unitii de nvare nr. 2


Cunoti particularitile i specificul biologic al celulelor din

perspectiva micropropagrii.

Defineti categoriile de celule implicate n micropropagare,

meristemele.

nelegi diferenierea celular. Principalele procese care au labaz diferenierea celular.


24/135

- 24 -

2.2. Biologia dezvoltrii plantelor (cormofite) n cazul culturilor de celule i esuturi in

vitro

Creterea plantelor reprezint un proces complex morfologic, fiziologic i biochimic prin

care are loc sporirea numrului de celule prin acumularea de mas vegetativ, cnd au loc

modificri cantitative ireversibile iar n final plantele ating dimensiunile caracteristice fiecreispecii.

Paralel cu procesul de cretere cantitativ, are loc i procesul de dezvoltare, de evoluie

individual a plantelor care parcurg o serie de etape calitative ce ncep cu germinarea i se ncheie

cu nflorirea i fructificarea. Dezvoltarea parcurs conduce la realizarea ciclului ontogenetic care

cuprinde modificri morfologice, anatomice i fiziologice ce se produc ntr-o succesiune riguroas

determinat de factorii ereditari care la rndul lor sunt influenai de factorii de mediu.

Cunoaterea aspectelor legate de biologia dezvoltrii plantelor superioare este deosebit deimportant pentru nelegerea proceselor ce au loc n tehnica multiplicrii in vitro.

Procesele biologice ce au loc n timpul nmulirii, creterii i dezvoltrii plantelor parcurg

etape de acumulri prin sintez a unor compui endocelulari, compui care joac dou roluri i

anume: rol plastic(de constituie n cazul proteinelor i celulozelor) dar i rol de material genetic

(cazul ADN i ARN).

Meristemele sunt esuturi care ndeplinesc funcia de multiplicare celular, ele se divid

continuu pe tot parcursul vieii. Ele sunt celule tinere pe tot parcursul procesului de multiplicare.

La plantele adulte construirea arhitecturii corpului lor se realizeaz prin cteva tipuri de

meristeme categorisite dup criterii ca: localizare, caracteristici i origine, fiecare cu anumite

semnificaii din punct de vedere ontogenetic i anume:

meristeme histogenecare genereaz esuturi;

meristeme organogene care genereaz organe i anume:

radiculare apicale; caulinare apicale; foliare

meristeme embriogenecare dau natere la embrioni

La plantele superioare, organogeneza este indefinit, dar att timp ct planta sau pri din

aceasta sunt vii, procesul de multiplicare celular i formarea de masive histogene din meristeme

este continuu. ( meritos = divizibil n l. grec).

La cormofite, dup formarea oului sau zigotului, prima diviziune nseamn o polarizare care

va da natere la embrionul bipolar, una din celulele meristematice genereaz polul caulinar iar cea

de a doua polul radicular. Acest fenomen este valabil i n cazul formrii embrionilor somatici care

au origine n cte o celul somatic.


25/135

- 25 -

Dup germinaie din embrioni (zigotici sau somatici) se formeaz plantule la care n zona

hipocotil i n cotiledoane activitatea meristematic intr ndeclin i n continuare pe msur ce

plantula crete se transform n plantela care esuturile meristematice (embrionare sau formatoare)

se gsesc n vrfurile extreme ale rdcinilor i tulpinilor principale (care constituie axa plantei) sau

secundare.Dup localizarea meristemelorele pot fi:

meristeme embrionare(localizate n embrion);

meristeme apicale(localizate n vrfurile de cretere tulpini sau rdcini);

meristeme intercalarece pot fi:

discontinui(deasupra nodurilor unor tulpini);

continui laterale: cambiu (strat libero-lemnos) i felogen (strat

generator subero-felodermic).Dup caracterulcelulelor meristematice:

meristeme primordiale(promeristeme) din care fac parte celulele embrionilor i

cele mai tinere masive meristematice care formeaz vrfurile vegetative sau

domurile meristematice.

meristeme primare (semimeristeme) derivate din meristemele primordiale.

Dup originea celulelor meristematice clasificare funcie de evoluia teoriilor emise de unii

cercettori:

- dup Hanstein (18681870) meristemul radicular ar fi:

dermatogen(genereaz rizoderm);

periblem(genereaz scoar);

plerom(formeaz cilindrul central.

- dup Haberland (1900) meristemele sunt:

protoderm (din care apar esuturile protectoare rizoderma i epiderma);

procambiu(din care se formeaz esuturile conductoare i cele mecanice);

meristem fundamental(din care apar parenchimurile corticale i medulare.

- dup Schmidt (1924) meristemul apical al tulpinilor este format din:

tunica (ptura extern de celule care formeaz esutul protector i o parte din

scoar);

corpusul (ptura care genereaz celule ce dau natere la o parte din scoar,

cilindrul central i mduv).


26/135

- 26 -

- dup Plantefol (1947 1948) care a emis teoria inelului iniial, meristemul

apical al tulpinii este constituit din:

meristem de ateptare care corespunde zonei apicale axiale i joac rol n

formarea primordiilor florale i a inflorescenelor;

inelul iniial (zona periferic) care are forma unui inel central nconjurat de

celule care periodic vor genera frunzele i scoara tulpinii;

meristemul medularce ocup poziia central i este aezat sub meristemul de

ateptare, celulele derivate din acest meristem vor da natere parenchimului

medular.

n ara noastr, Jitaru i Toma (1980) prezint o sintez a clasificrii acestor categorii de

meristeme pe care o prezentm mai jos.

-

esuturi meristematice primordialepromeristeme care pot fi: fr celule, cu

o celul iniial, cu mai multe celule iniiale

- esuturi meristematice primare semimeristeme care pot fi: apicale,

intercalare, laterale

- esuturi meristematice secundarecare pot fi: cambiul , felogenul

- esuturi meristematice meristemoide (meristemoizi) care pot fi grupate la

nivelul esutului protector i au zone lipsite de celule cu activitate meristematic

numite cmpuri de inhibiie sau zone de blocaj.

La nivelul explantelor cultivate in vitro, grupuri cu celule cu caracter meristematic pot

proveni din celule cu caracter embrionar, preexistente n explante ce pot deveni primordii

radiculare, caulinare sau foliare. Aceste centre meristematice pot evolua anormal n meristeme

radiculare sau caulinare sau prin regresie n calus. Aceti meristemoizi prezeni la nivelul

explantelor, n cazul tehnicii in vitro pot avea efect benefic n procesele regenerative i demorfogenez.

n cazul multiplicrii in vitroare loc neogeneza de zone sau centre meristematice din celule

dedifereniate care sunt considerate meristeme speciale ntruct acestea nu exist n structurile

organelor ci generarea lor este determinat de excizare, de condiiile speciale de cultur, i de

prezena regulatorilor de cretere n substratul de cultur.

Autonomia explantelor sau celulelor meristematice n condiiile cultivrii in vitro,

imposibilitatea dirijrii proceselor de morfogenez ntr-o anumit direcie dorit sunt dificile

ntruct natura esuturilor i celulelor din structura explantelor poate exercita influene de durat pe


27/135

- 27 -

parcursul mai multor subculturi, explantul fiind independent de planta mam, dar are totui

informaia genetic motenit de la aceasta.

Diferenierea celular

Celulele tinere difereniate dup divizarea continu sufer transformri structurale i ospecializare morfologic i fiziologic cptnd caracteristici noi, proprii celulelor adulte mari.

Progresiv, modificrile secundare ce survin ngreuneaz schimburile dintre aceste celule cu cele

nvecinate cu toate c majoritatea celulelor difereniate din corpul plantelor rmn vii, cu o intens

activitate metabolic dar i pierd capacitatea de a se divide.

Integritatea sistemului, continuitatea celulelor unui esut, comunicarea dintre celulele i

esuturile unor organe din organismul viu se menin datorit unor substane elaborate de ctre

celule, substane care pot migra la distane mari i pot asigura relaia organismului unitar cuperceperea factorilor de mediu.

Controlul asupra diferenierii i funcionrii altor celule de ctre un grup de celule poart

denumirea de proces de inducie.Celulele asemntoare ca structur i funciune care determin n

esutul respectiv specificitatea fiziologic, faciliteaz prin interrelaiile dintre esuturi buna

funcionare aorganelor i activitatea ntregii plante.

Procesul de dedifereniere este invers procesului de difereniere celular. El rar se petrece

natural, spontan. Dediferenierea este provocat de aciunea unor ocuri externe asupra celulelor

difereniate deci dediferenierea se produce ca reacie la aciunea traumatic exogen.

n cazul multiplicrii in vitron condiiile detarii explantelor dediferenierea se produce n

sens regenerativ datorit aciunii fitohormonilor. Prin dedifereniere celulele se transform n celule

meristematice apte a se divide.

Capacitatea celulelor de a se dediferenia este inegal rspndit n corpul plantei i depinde

de ct de avansat este procesul de difereniere n morfostructura celular.

n condiiile cultivrii explantelor in vitrocapacitatea regenerativ a celulelor este exploatat

la maximum. Sigur c aptitudinile regenerative ale inoculilor depind de proveniena explantului,

condiiile de cultur i de manifestarea integral a ntregii informaii genetice existent n genomul

inoculului. Succesul operaiei de regenerare de plante din diferite tipuri de explante depinde de

reuita metodelor de transformare a celulelor nemeristematice n celule meristematice obinute prin

dedifereniere.

n condiiile de cultur in vitro dediferenierea i revenirea celulelor la starea de celul

meristematic este condiie pentru instalarea i progresarea proceselor regenerative i realizarea

neoformrii unui nou organism vegetal.


28/135

- 28 -

Fazele dediferenierii sunt pe scurt urmtoarele:

1. Prima faz caracterizat prin:

amorsarea proceselor de dedifereniere

producerea dediferenierii celulelor, dobndirea caracteristicilor citologice ale

unui esut meristematic secundar cu celule aplatizate ce seamn ca aspect istructur cu cambiul

2. A doua faz a dediferenierii const n:

dediferenierea celulelor pn la stadiu de meristem primar

generarea de promeristeme sau meristemoizi din care pot aprea centre

organogene sau embriogene

3. A treia faz de dedifereniere se caracterizeaz prin:

formarea din celulele dedifereniate a calusului neorganizat, omogen structural lanivelul cruia se pot forma meristemoizi sau centri embriogeni

Putem considera c dediferenierea celulelor detaate de planta mam sau de unele organe,

anuleaz interdependena explantelor de organismul donor, celulele eliberate de aceast stare pot

s-i exprime n aceste condiii totipotena deinut n genom.

Deci, in vitro celulele se pot dediferenia mai rapid i mai uor ele fiind scoase de sub

interrelaiile i incidena factorilor endogeni care asigur echilibrul fiziologic al unui organism viu.

Morfogeneza: organogeneza i embriogeneza

Morfogeneza este diferenierea histologic complex a celulelor care n final duce la

formarea de organe proces numit organogenez, sau generare de embrioni proces numit

embriogenez.

Organogeneza este procesul de refacere a organelor prin activitatea meristemelor dup tipul

fitohormonilor folosii, genernd organe sau calus.

Embriogeneza este procesul n care, pornind de la zigot, celul somatic sau gamei (andro

i ginogenez) se genereaz un embrion.

Morfogeneza are la baz citodiferenierea ca exprimare a competenei celulare indus de

determinismul genetic.

n condiiile explantrii i inoculrii in vitro, capacitatea de citodifereniere a celulelor

depinde de capacitatea celulelor de a-i modifica starea lor de competen sub influena unor factori

interni i externi.


29/135

- 29 -

Dintre factorii interni amintim fitohormonii i natura esuturilor explantelor n ceea ce

privete susinerea i viteza de avansare a proceselor de morfogenez (organogenez sau

embriogenez)

Rolul mediului de cultur ce se ncadreaz n grupa factorilor externin care amintim sursa

de energie, temperatura, lumina i regimul fotoperiodic pot exercita o influen decisiv asupraproceselor regenerative i de morfogenez.

Organogeneza

Prin organogenez se neleg procesele de formare cretere i difereniere celular i tisular

a organelor.

n tehnica de multiplicare in vitro este vorba de apariia rdcinielor (rizogeneza), a

mugurailor i tulpinielor (caulogeneza) i a frunzulielor (filogeneza).n rizogenezsau formarea rdcinilor, pe lng factorii endogenin principal cel genetic-

un rol important l au fitohormonii, mai exact auxinele (endogene sau exogene) sau unele substane

cu aciune benefic asupra rizogenezei, substane formate n tinerele frunzulie ca rezultat al

activitii fotosintetice.

Aerarea (oxigenarea) zonei n care se produce rizogeneza, temperatura, pH-ul, rezervele

energetice endogene stimuleaz dar chiar condiioneaz rizogeneza alturi de factorul genetic (gen,

specie, soi) care au rol determinant n capacitatea rizogen a unor explante.

Caulogeneza, procesul de formare a tulpinilor, se afl deasemeni sub controlul genetic i

fitohormonal i evolueaz n funcie de condiiile de mediu i unii factori endogeni n mai mic

msur dect n cazul rizogenezei.

Caulogeneza este stimulat de un anumit raport ntre auxine i citochinine, raport care este

n favoarea citochininelor.

n cazul culturilor in vitro apariia centrilor meristematici, a mugurailor i apoi a

tulpinielor, este favorizat de prezena n mediul de cultur achinetinei, a benziladeninei.

Polaritatea fragmentelor: este proprietatea de care trebue s se in seama atunci cnd

fragmentele vegetative se introduc n substratul rizogen sau mediul de cultur i anume apexurile

sau meristemele apicale sau axilare utilizate pentru nmulire.

Embriogeneza

Procesul de formare a embrionului sau embriogeneza a cptat o nou dimensiune dup

descoperirea embriogenezei somatice n suspensia de celule, n anul 1958 de ctre Steward i

Reinert. Embrionul ca entitate morfoanatomic distinct este un stadiu intermediar de trecere de la


30/135

- 30 -

gametofit la sporofit n ciclul biologic al unui organism, la spermatofite, n cazul embriogenezei in

vitro, neogeneza unui embrion din celule somatice poart denumirea de embriogenez

nonzigotic sau embriogeneza somatic, diferit ca origine de embriogeneza zigotic.

Zigotul, (embrion derivat din ou sau zigot) este rezultatul fecundrii gametului femel

(oosfera) de ctre gametul mascul (spermatia).Cnd formarea embrionului se produce n lipsa fecundrii, fenomenul se numete apomixie.

n acest caz embrionul ia natere din elemente ale nuceleisau sacului embrionarsau chiar celule

ale integumentelor ovulului.

n cazul apomixiei, producerea embrionului se poate face prin:

partogenez cnd are loc la nivelul oosferei nefecundate i este: haploid

(generativ) sau diploid (somatic);

apogamie cnd geneza embrionului are loc dintr-o celul a sacului embrionar; aposporiecnd formarea embrionului are loc dint-o celul vegetativ a nucelei

sau a integumentului;

poliembrionie formarea mai multor embrioni din acelaovul prin apogamie

ct i prin aposporie. Acest tip de embrioni se numesc embrioni adventivi iar

embriogeneza se mai numete embriogenez asexuat.

n cazul multiplicrii in vitrola nivelul explantelor, calusul celulelor n cultur n suspensii,

fenomenul de embriogenez se declaneaz printr-o serie de multiplicri celulare dintr-o celul

unic prin diviziuni succesive, se formez un embrion nezigotic asemntor cu embrionul zigotic

din punct de vedere al mrimii, structurii i comportamentului specific fiecrei specii, embrion

denumit embrion somaticfenomenul cptnd denumirea de embriogenez somatic.

Manifestarea totipotenialitii celulei vegetale n acest caz, al embriogenezei somatice, are

loc prin:

androgenez (neoformarea unui embrion, apoi a unei plante haploide dintr-un

microspor sau gruncior de polen); i

ginogenez (neoformarea unui embrion din oosfera nefecundat, embrion care

este haploid i va da natere unei plante haploide).

n inducerea genezei de embrioni din celule somatice n tehnica de multiplicare in vitro

laptele din nuc de cocos introdus n mediul de cultur, care este bogat n citochinine joac un rol

pozitiv hotrtor.

Ca i n cazul organogenezei, i n embriogeneza somatic exist embriogenez somatic

direct cnd embrionii somatici iau natere din celulele explantelor care s-au folosit la iniierea


31/135

- 31 -

culturii i embriogenez somatic indirectcnd embrionii se formeaz din celule de calus ori din

suspensii celulare care provin din calus sau protoplati.

Embriogeneza somatic are avantajul c embrionul zigotic, somatic diploid sau haploid

deine ntr-un tot echilibrat structurat morfofuncional att rdcinia, tulpinia ct i muguraul care

asigur viitoarei plante un excelent debut n via, odat cu germinaia.Prin embriogenez somatic, ntr-un timp scurt i cu mare vitez, se pot obine un numr

mare de copii ale unui organism vegetal elit.

Plantele rezultate din embrioni somatici, identice din punct de vedere genetic cu donatorul

de explante, sunt libere de ageni patogeni, au cretere uniform, sunt robuste, au o mare

productivitate iar produsele lor sunt superioare din punct de vedere calitativ.

Embrionii somatici pot fi stocai pe o perioad lung de timp ca material biologic n bnci

de gene. Din embrionii somatici, prin multiplicarea in vitro, se pot obine produi secundari demetabolism ce pot constitui surs de extracte cu efecte fitofarmaceutice.

Pe calea embriogenezei somatice, studiile de mutagenez pot permite selecia rapid de noi

mutani de la care se pot obine noi soiuri valoroase ce pot fi multiplicate uor i introduse n

cultur.

Embriogeneza in vitropermite producerea unui numr mare de haploizi i triploizi ntr-un

interval scurt de timp i cu randament economic ridicat.


32/135

- 32 -


2. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de

spaiul avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la

urmtoarele ntrebri:

a) Comentai i analizai asemnrile i deosebirile dintre procesul de

cretere i dezvoltare a plantelor.

b) Definii i clasificai meristemele.

c) Definii procesele de difereniere i de dedifereniere celular.

d) Care sunt fazele dediferenierii?

e) Definii organogeneza i embriogeneza i menionai de cte feluri

sunt acestea.

Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de

nvare.

Dup parcurgerea acestui subcapitol trebuie s reinei: Creterea plantelor reprezint un proces complex morfologic,

fiziologic i biochimic prin care are loc sporirea numrului de

celule prin acumularea de mas vegetativ, cnd au loc modificri

cantitative ireversibile iar n final plantele ating dimensiunile

caracteristice fiecrei specii.

Meristemele sunt esuturi care ndeplinesc funcia de multiplicare

celular, se divid tot timpul, constituind celule tinere n procesul de

multiplicare.

Clasificarea meristemelor se face dup localizare, caracteristici,

origine i funcie. Celulele tinere diferentiate, dup faza de divizare continu, sufer

transformri structurale i o specializare morfologic i fiziologic,

cu caracteristici noi, proprii celulelor adulte, mari.

Morfogeneza este diferenierea histologic complex a celulelor

care, n final, duce la formare de organe, proces denumit

organogenez sau generare de embrioni, proces numit

embriogenez.


33/135


34/135

- 34 -

Dup Plantefol (1947 1948) care a emis teoria inelului iniial, meristemul

apical al tulpinii este constituit din: meristem de ateptare care corespunde

zonei apicale axiale i joac rol n formarea primordiilor florale i a

inflorescenelor; inelul iniial (zona periferic) care are forma unui inel

central nconjurat de celule care periodic vor genera frunzele i scoaratulpinii; meristemul medular ce ocup poziia central i este aezat sub

meristemul de ateptare, celulele derivate din acest meristem vor da natere

parenchimului medular. n ara noastr, Jitaru i Toma (1980) prezint o

sintez a clasificrii acestor categorii de meristeme: esuturi meristematice

primordiale fr celule, cu o celul iniial, cu mai multe celule iniiale.

esuturi meristematice primare semimeristeme: apicale, intercalare,

laterale. esuturi meristematice secundare pot fi: cambiul, felogenul.esuturi meristematice meristemoide (meristemoizi) care pot fi grupate la

nivelul esutului protector i au zone lipsite de celule cu activitate

meristematic numite cmpuri de inhibiie sau zone de blocaj.

c) Controlul asupra diferenierii i funcionrii altor celule de ctre un grup

de celule poart denumirea de proces de inducie. Celulele asemntoare ca

structur i funciune care determin n esutul respectiv specificitatea

fiziologic, faciliteaz prin interrelaiile dintre esuturi buna funcionare aorganelor i activitatea intregii plante. Procesul de dedifereniere este invers

procesului de difereniere celular. El rar se petrece natural, spontan.

Dediferenierea este provocat de aciunea unor ocuri externe asupra

celulelor difereniate deci dediferenierea se produce ca reacie la aciunea

traumatic exogen. n cazul multiplicrii in vitro n condiiile detarii

explantelor dediferenierea se produce n sens regenerativ datorit aciunii

fitohormonilor. Prin dedifereniere celulele se transform n celule

meristematice apte a se divide. Capacitatea celulelor de a se dediferenia este

inegal rspndit n corpul plantei i depindede ct de avansat este procesul

de difereniere n morfostructura celular.


35/135

- 35 -

d) Fazele dediferenierii sunt urmtoarele: prima faz caracterizat prin:

amorsarea proceselor de dedifereniere; producerea dediferenierii

celulelor, dobndirea caracteristicilor citologice ale unui esut

meristematic secundar cu celule aplatizate ce seamn ca aspect i

structur cu cambiul. A doua faz a dediferenierii const n:

dediferenierea celulelor pn la stadiu de meristem primar; generarea de

promeristeme sau meristemoizi din care pot aprea centre organogene

sau embriogene. A treia faz de dedifereniere se caracterizeaz prin:

formarea din celulele dedifereniate a calusului neorganizat, omogen

structural la nivelul cruia se pot forma meristemoizi sau centri

embriogeni.e) Prin organogenez se neleg procesele de formare cretere i

difereniere celular i tisular a organelor. n tehnica de multiplicare in

vitroeste vorba de apariia rdcinielor (rizogeneza), a mugurailori

tulpinielor (caulogeneza) i a frunzulielor (filogeneza). Embriogeneza

somatic are avantajul c embrionul zigotic, somatic diploid sau haploid

dein ntr-un tot echilibrat structurat morfofuncional att rdcinia,

tulpinia ct i muguraul care asigur viitoarei plante un excelent debutn via, odat cu germinaia.


36/135

- 36 -

2.4 Lucrare de verificare nr. 2

2.5 Bibliografie minimal

1. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia Universitar

Atheneum, Bucureti, 1993

2. D. Hoza, 1997, Biotehnologie pomicol.

3. A.Rou, 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist.

4. F. Stnic, 1999, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,

Editura Grand;

INSTRUCIUNI

Lucrarea de verificare solicitat, implic activiti care necesit

cunoaterea Unitii de nvare nr. 2.

Rspunsurile la ntrebri vor fi transmise tutorelui pentru comentarii,

corectare i evaluare. Pe prima pagin a lucrrii se vor scrie

urmtoarele:

Titulatura acestui curs (MICRONMULIREA PLANTELOR

HORTICOLE), numrul lucrrii de verificare, numele i prenumele

studentei (studentului).

Fiecare rspuns va trebui s fie clar exprimat i s nu depeasc o

jumtate de pagin. Punctajul aferent este menionat pentru fiecare

ntrebare.

ntrebrile la care trebuie s rspundei sunt urmtoarele:

1) Comentai i analizai asemnrile i deosebirile dintre procesul de

cretere i dezvoltare a plantelor.-1p

2) Definii i clasificai meristemele.-3p

3) Definii procesele de difereniere i de dedifereniere celular.-2p4) Care sunt fazele dediferenierii?-2p

5) Definii organogeneza i embriogeneza i menionai de cte feluri

sunt acestea1p

* Un punct se acord din oficiu.


37/135

- 37 -

UNITATEA DE NVARE NR. 3:

LABORATORUL DE CULTURI IN VI TRO

CUPRINS

3.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 3 373.2 Alctuirea laboratorului 38

3.3 Dotrile laboratorului 45




3.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 3


Cunoti alctuirea laboratorului de micronmulire.

Cunoti principalele dotri tehnice necesare procesuluitehnologic care se desfoar n cadrul micronmulirii.

Deprinzi primele noiuni despre procedurile de lucru.

Ai o viziune de ansamblu a ce presupune dezvoltarea unui

laborator de micronmulire, didactic/cercetare sau industrial.


38/135

- 38 -

3.2 Alctuirea laboratorului.

Laboratoul de culturi in vitroeste mprit n dou spaii strict delimitate care asigurfiecare

n parte fluxul tehnologic continuu dac este nevoie. Spaiile laboratoului de micronmulire sunt

ncperi amenajate facil pentru ntreinere i evacuare, cu pardoseal din gresie sau mozaic, cu

pereii acoperii cu faian sau vopsea de ulei pentru a seputea ntreine uor i a fi facil pentruprocesele de asepsie. Orice defeciune care s-ar produce n cadrul laboratorului, de mai lung

durat, poate provoca perturbaii grave n desfurarea lucrrilor, stagnnd fluxul operaiunilor i

ducnd la pierderi majore de material vegetal.

Un aspect important care trebuie subliniat este acela al asigurrii unei curenii perfecte n

toate compartimentele laboratorului, praful i murdria constituind surse constante de germeni,

respectiv de infecii.

Respectnd condiiile de asepsie, evitm infectarea mediului de cultur cu microorganisme,n caz contrar, acestea se vor nmuli (mediile fiind deosebit de bogate n nutrieni i vitamine), flora

dezvoltat n recipientul de cultur devenind concurent pentru esuturile i celulele inoculate.

Infeciile microbiene i fungice avanseaz n scurt timp (2-5 zile de la inoculare) iar mediul de

cultur i modific proprietile, se altereaz, n el fiind eliminate toxine, pH-ul se modific i,

treptat, dezvoltarea explantelor este ncetinit i ulterior stopat definitiv.

n consecin, unul din aspectele majore pe care trebuie s le avem n vedere atunci cnd

dorim s iniiem culturi in vitro l constituie asigurarea unei asepsii perfecte, att a materialului

biologic ct i a recipientelor i a mediilor de cultur.

Laboratoarele de micronmulire pot fi laboratoare pentru cercetri cu profil biologic,

fiziologic, ameliorare, laboratoare de micronmulire care deservescinterese didactice, laboratoare

de micronmulire pentru afaceri la scar redus i ultima categorie, laboratoare de micronmulire

pentru afaceri la scar industrial.

Cerinele pentru realizarea acestor spaii sunt multiple i in att de sigurana procesului de

produciei ct i de securizarea operaiunilor. Deobicei, laboratoarele sunt mprite n dou zone:

zona steril i zona nesteril.

Zona nesteril este spaiul destinat activitilor care se desfoar n condiii

nesterile i este reprezentat de spltor, laboratorul de preparare a mediilor de

cultur, spaiile de incubare, camera frigorific, ncperea cu autoclave etc.

Zona steril, ncpere aseptic, steril, care conine mai multe hote de lucru cu flux

laminar orizontal de aer steril ce sunt folosite pentru urmtoarele procedee de lucru:

dezinfectarea materialului vegetal, prelevare i inoculare explante in vitroi repicare

sau subcultivare.


39/135

- 39 -

Dimensionarea zonelor i ncperilor se va face innd cont de volumul de activitate pe care

laboratorul urmeaz s l aib, de amploarea personalului care va deservi laboratorul, mobilierul i

aparatura folosit. n funcie de specificul activitii, inclusiv mobilierul sau aparatura vor fi

diferite, ca n cazul culturilor de meristeme versus obinerea de material pentru aclimatizat i

plantat.Cnd se urmrete obinerea de material de plantat devirozat, nu trebuie scpat din vedere

necesitatea amenajrii de ncperi pentru aplicarea termoterapiei, precum i a unui laborator

profilat pe testarea i certificarea calitii i a strii de sntate a plantelor generate in vitro.

Materialul de plantat rezultat, transferat din in vitro n mediul septic, dup aclimatizarea lui n

camera de cretere, urmeaz s fie plantat n ser (o construcie special n cazul n care se

urmrete pstrarea culturii n condiii de protejare fa de ageni fitopatogeni, sau o construcie

obinuit).Faptul ca unele din activitile din laboratorul de micronmulire sunt sezoniere,

desfurndu-se n funcie de fenofazele speciilor lucrate, va trebui ca planul de afaceri sgenereze

o diversificarea a activitilor, astfel nct investiia s se justifice i activitatea s fie n flux

continuu.

Ambele zone trebuie s rspund condiiilor standard de amenajare a laboratoarelor de lucru

tiinifice i s primeasc avizele de funcionare de la forurile specializate. Se vor asigura instalaii

de ap, lumin, canalizare, nclzire, gaze, toate n condiii perfecte de funcionare.

Alcatuirea zonei nesterile

Spltorul

Acesta poate fi amenajat ntr-o ncpere (de cca. 16 mp) cu canalizare n pardoseal, ciment

mozaicat sau gresie pe jos, cu panta uoar - n condiii de scurgere prinpardoseal.

Splarea sticlriei se va face n bazine de capacitate corespunztoare, funcie de volumul

inoculrilor zilnice. Dup evacuarea culturilor, mediile cu agar se colecteaz n glei i se arunc la

gunoi (agarul nfund instalaiile de canalizare); recipientele golite de mediu cu agar (precum i cele

etaneizate prin aplicare de folie de polietilen la cald), prealabil splrii, vor fi nmuiate n ap.

n consecin, n spltor- n funcie de volumul de sticlrie manipulat zilnic - trebuie s

avem n vedere amenajarea unor bazine pentru: nmuierea sticlriei, pentru splarea propriu -zis a

acesteia i, eventual, un al treilea bazin pentru limpezirea sticlriei splate.

Deasupra chiuvetei se va instala un distilator (de 510 litri) cu ap distilat (prezentnd

scurgere bazal, unde se va racorda un tub de cauciuc, cu clem) prin intermediul cruia vom avea,


40/135

- 40 -

n imediata apropiere a acesteia, o surs de ap distilat,

necesar pentru limpezirea final a sticlriei.

Chiuveta va fi prevzut cu robinete de ap cald

i rece i cu un sistem de iluminare care s asigure o

lumin corespunztoare ca intensitate, pentru creareacondiiilor optime de verificare a gradului de curire a

obiectelor splate. n ncpere se vor monta rastele pentru

uscarea sticlriei. Pe pereii rmai liberi se pot amplasa

dulapuri, n scopul depozitrii sticlriei, a unor materiale

i a reactivilor care nu necesit condiii speciale de

pstrare.

n spltor se va proceda i la curareamaterialelor vegetale, de tipul rdcinilor, rizomilor,

bulbilor, tuberculilor etc.

n cazul n care nu avem posibilitatea s asigurm

ap cald la robinet, n apropierea chiuvetei se va instala

un boiler. n vecintatea chiuvetei trebuie s existe cutii

pentru gunoi (preferabil cu capac) i un suport pentru

perii (periile vor fi de diferite forme i mrimi), necesare

Distilator pentru splarea sticlriei. Pentru scurgerea sticlriei, se va

avea n vedere i amenajarea unor suporturi avnd perforaiisau grtare.

Laboratorul pentru pregtirea mediilor de cultur

Este ncperea destinat preparrii mediilor de cultur, care trebuie sa fie spaioas (s

permit accesul concomitent a 3-4 persoane) i s fie corespunztor iluminat. Laboratorul va

deine instalaii de: canalizare, de ap curent (rece i cald), gaze, electricitate, pomp pentru vid.

Pardoseala va fi acoperit cu materiale uor lavabile. Dac spaiul o permite, vor fi aezate me se

att la perete ct i n centrul ncperii. Mesele de lucru vor fi faianate sau vor fi acoperite cu

material plastic ori cu folie melaminat, pentru a putea fi ntreinute uor i pentru a rezista la

reactivi.

Pe perei i sub mese se vor monta dulpioare, n scopul depozitrii n ele a sticlriei i a

substanelor. n laborator trebuie s fie instalate chiuvete cu ap rece i cald iar, n vecintatea lor,

se vor amplasa recipiente cu ap distilat i bidistilat.


41/135

- 41 -

n dreptul meselor se vor afla instalaii de gaz(aproximativ 3-4 guri de gaz repartizate pe

perei diferii), prize pentru curent de 220 V, precum i instalaie de vid (pentru operaiunile de

filtrare).

n laborator vor fi amplasate diferite aparate i anume: etuve, (din care, cel puin o etuv - decapacitate mare va funciona n regim de 160180C i o alta de tip bacteriologic, necesar pentru

Cntar electronic Plit cu agitator magnetic Cuptormicrounde

incubare, la ntuneric, a inoculilor i care

va funciona la 24-38 C) ; 1-3 agitatoare

magnetice (dac se poate cu plit

electric) care vor fi necesare pentru

operaiunile de dizolvare a substanelor,

pH metru portabil Autoclav

mai ales atunci cnd avem n vedere prepararea soluiilor stoc; n

laborator snt indispendabile i 1-2 bain marrie, de mare

capacitate, pentru prepararea mediilor cu agar (se pot face i

improvizaii, folosind, ca nlocuitori, vase de buctrie, n care se

introduce un material textil, pentru a proteja recipientele n timpul

fierberii apei), mai ales cnd nu dorim s folosim autoclavulpentrusolubilizarea agarului. De mare utilitate n laborator este un pH-

metru; n laborator este indispensabil i prezena unui frigider, de

mare capacitate, cu congelator, pentru pstrarea soluiilor stoc, a

unor substane i mediile de cultur pn la folosire, dup

sterilizare. Materialul vegetal, pn n momentul prelevrii

explantelor, poate fi pstratn camera frigorific.


42/135

- 42 -

ntr-o camer nvecinat laboratorului se vor instala balane electronice care s permit

cntrirea pn la subuniti de gram (100 10 mg), microscop optic i un stereomicroscop,

destinate examinrii materialului biologic, pre sau post inoculare.

n laborator trebuie s existe un sortiment variat i n cantiti ndestultoare de sticlrie.

Sterilizareancperea care se preconizeaz a fi utilizat n scopul sterilizrii, respectiv n care va

funciona autoclavul, poate avea dimensiune variabil, n funcie de numrul autoclavelor i de tipul

i mrimea acestora. Pentru a nu se produce o strangulare a fluxului operaiunilor de inoculareeste

de dorit s dispunem de dou autoclave funcionale, de mare capacitate, pentru a permite

sterilizarea concomitent a ct mai multe flacoane cu mediu.

Autoclavarea recipientelor cu medii de cultur se face la temperatura de 121C i 1,1

atmosfere, pe o durat de timp care variaz n funcie de ncrctur. Flacoanele cu medii sedepoziteaz n casolete metalice (de tip medical) sau n couri din srm, ori n tvi metalice apoi se

introduc n autoclav, cu perforaiile neobturate; celelalte tipuri de suporturi cu flacoane vor fi

nvelite n hrtie de mpachetat, perforatdin loc n loc pentru a se permite accesul aburului din

autoclav, n interiorul ambalajelor. Dup autoclavare, la transportare, casoletele vor avea

perforaiile obturate. Etuv

ncperea n care se monteaz autoclaveletrebuie s

aib pardoseal din ciment, cu scurgere. Mediile, odat

sterilizate, pot fi pstrate o perioad de timp (preferabil la

ntuneric), n camer frigorific, pentru a evita degradarea

vitaminelor i a hormonilor i pentru a prentmpina

deshidratarea mediilor, prin evaporarea apei.

Apa distilat este indispensabil n laborator, att

pentru prepararea apei bidistilate ct i pentru splarea

materialului biologic sau la cltirea final a sticlriei. Bidistilatoarele, n general, sunt din sticl

special, lipsit de ioni de natriu. Bidistilatoarele de mare capacitate snt electrice.

Camera de cretere

Camera de cretere sau de incubare a culturilor este destinat pstrrii n condiii optime a

inoculilor, n vederea asigurrii bunei dezvoltri a acestora. Ea trebuie s ntruneasc condiii

maxime de septicizare, s nu fie igrasie, s nu fie demisol sau subsol, dei literatura veche

recomand, din contr, acest tip de amplasament pentru evitarea fluctuaiilor mari de temperatur.

Recent, nu se mai recomand amplasarea camerelor de cretere sub nivelul solului, deoarece


43/135

- 43 -

pot aparea probleme legate de umiditate,

microorganismele specifice zonelor calde i

umede, fraerisire.

Amenajarea etajelor n camerele de

cretere trebuie fcut de aa manier ncts se foloseasc la maximum spaiul

disponibil, permindu-se totodat accesul

cu uurin la recipientele cu inoculi. n

cazul n care ncperea nu poate fi

climatizat, se recomand ca distana dintre

polie s fie ceva mai mare, de cea 4050

cm. S-a constatat c rafturile de 1 m lime,cu nlimea de 2 m i de lungime variabil,

snt cele mai practice.

Flacoanele de cultur cu inoculi

trebuie expuse la lumin, pe etajere

metalice, iluminate n regim prestabilit,

Camera de cretere

reglabil, preferabil automatizat, folosindu-se tuburi fluorescente amplasate deasupra culturilor, la o

distan de 30-40 cm. n cazul utilizrii polielor din sticl la care dedesubt, n imediata

apropiere a recipientelor se gsesc instalate tuburile de iluminare (corespunztoare raftului de jos)

aezarea flacoanelor s fie fcut pe un strat izolator, de exemplu din polistiren expandat, pentru

a nu se suprancinge, situaie n care mediul de cultur gelificat cu agar se va deshidrata i va crpa.

Regimul de temperatur al camerelor de cretere se recomand a fi la 25-27C (2C fa de

temperatura dorit) iar umiditatea de 50%, dar nu sub 50%. Fluctuaiile de temperatur, chiar i

numai cele provocate ca urmare a stingerii tuburilor fluorescente n perioada de ntuneric, produc

modificri ale volumului aerului din recipientele de cultur (prin creterea sau scderea presiunii

interioare) cu formarea unor cureni care vehiculeaz n recipiente spori i germeni, provocnd

infectarea secundar a mediilor de cultur, chiar dup o lung perioad de timp de la inoculare.

Tuburile fluorescente vor fi montate astfel nct s se evite orice posibilitate de incendiu i

s se asigure o iluminare uniform a suprafeelor. Fotoperioada optim, adecvat unei creteri

corespunztoare a celor mai multor tipuri de explante, este aceea de 16 ore lumin/8 ore ntuneric.

Recomandrile privind intensitatea optim a luminii, la suprafaa mediilor cu inoculi, variaz de la

caz la caz; de regul, se indic ca iluminarea s corespund la cea 22,6 Kluci.


44/135

- 44 -

Transferarea din in vitro n mediul septic se face

trecnd plantele printr-o etap de ac1imatizare. O prim

acomodare a plantelor la viaa n mediul septic se face n

condiiile camerei de cretere. Plantulele eliberate de mediu

vor fi splate n ap (meninut la temperatura camerei),apoi vor fi introduse cu rdcinile ntr-un substrat inert

(perlit, nisip, vermiculit) simplu, sau n amestec cu turb,

argil, mrani etc. cu asigurarea umiditii ridicate.

Regimul de iluminare i cel termic vor rmne, la nceput, n

limitele obinuiten care au fost cultivate plantulele in vitro, pentru ca apoi treptat, timp de cca. 3-4

sptmni, s se aduc plantulele la regimul obinuit de cultur. Uneori, literatura recomand

trecerea plantulelor pentru o prim perioad de aclimatizare n incinte cu cea i abia dup cca.2-3 sptmni s intre n procesul standard de aclimatizare.

Alctuirea zonei sterile

Camera steril

Este ncperea n care se execut

sterilizarea, prelevarea i inocularea

explantelor. Pereii ncperii aseptice vor fi

vopsii n ulei sau vor fi placai cu faian,

pardoseala va fi din ciment pentru a fi uor

lavabil, dar nu va avea canalizare n

podea. Camera steril este bine s fie

amenajat n apropierea laboratorului de preparare a mediilor. Hot cu flux laminar de aer steril

n camera steril vor fi montate nie sau boxe (hote) cu flux laminar orizontal continuu, de aer

steril. Acestea au forme i dimensiuni variate iar asepsia aerului este asigurat prin filtre speciale

care reinparticulele mai mari de 0,2 mm. Hotele vor fi orientate pe peretele opus uii i ferestrelor,

pentru a evita formarea curenilor de aer.

Manevrele efectuate n condiiile hotei cu flux de aer steril cer deprinderea operatorului, cu

un mod special de executare a micrilor, nefiind permis s se interpun mna, penseta sau alte

obiecte (chiar dac snt sterile), ntre curentul de aer steril i recipientul deschis; n caz contrar,


45/135

- 45 -

adeseori, procentul de infecii poate

fi mai ridicat dect n condiiile

executrii acelorai operaiuni, n

niele aseptice, improvizate.

De regul, nia sau hota trebuiencrcat naintea nceperii

lucrului numai cu obiecte

sterilizate, iar operatorul se va spla

cu alcool pe mini, de fiecare dat

cnd prsete i revine n

perimetrul baleiat, scldat" de

fluxul laminar, orizontal, de aer steril. n condiiile efecturii unor inoculri obinuite, hota va fipus n funciune cu cca. 20 de minute nainte de nceperea operaiunilor. Hota steril va fi

prevzut cu instalaie de gaze (ori cu lmpi de spirt) i, dac este posibil, i cu instalaie de

vacuum; n spaiul propriu-zis de lucru vor fi aezate i suporturi pentru instrumente sterile i,

firete, att n ni ct i n camer, vor fi montate instalaii obinuite de iluminat i tuburi pentru

emanaie de raze ultraviolete necesare sterilizrii.

3.3. Dotrile laboratorului

Sticlria

n general, ntr-un laborator de culturi de esuturi se utilizeaz toate tipurile de recipiente

din sticl, de uz comunn laboratoarele de chimie-biologie. n laboratoare sunt necesare i pipete,

cilindrii gradai, plnii, baloane cotate (de diferite capaciti), sticle i borcane pentru reactivi (de

variate tipuri i mrimi) precum i vasele Erlenmeyer i Berzelius, dedimensiuni diverse, capsule

Petri, casolete, baghete, tuburi din sticl, sticlele de ceas, nuci filtrante, filtre Millipor, seringi,

exicatoare etc.

Ca recipiente de cultur pot fi folosite i baloanele cu fund plat ori variate vase din sticl

incolor, de forme i mrimi diferite.Pe lng recipiente din sticl, se folosesc frecventi flacoane

sau capsule Petri, din material plastic, livrate sterilizate, ambalate fiind n pungi din polietilen.

Acest tip de recipiente nu se sterilizeaz, mediul sterilizat i cald, se toarn n recipientele sterile, n

condiii de perfect asepsie (n hota steril). n condiii de producie se folosesc dispozitive

automate de injectare (la cald) a unor cantiti fixe de mediu comparabil cu procedeele similare din

fabricile de medicamente.


46/135

- 46 -

Flacoanele cu medii de cultur, n vederea

sterilizrii, vor fi obturate cu dopuri de vat hidrofil,

nfurate cu tifon; periodic dup utilizri repetate

dopurile de vat vor fi autoclavate i apoi uscate n etuv.

Dup folosire ndelungat, dopurile de vat trebuie nlocuite,cu al

Microinmultire

Documents

Transcript of Microinmultire