INTRODUCERE

Acidul folic şi derivaţii săi prezintă un larg interes în biologie şi medicină datorită

funcţiilor coenzimatice îndeplinite în organism într-o serie de reacţii de importanţă

vitală.

Acidul folic participă la formarea timinei şi a bazelor purinice din ADN, deci

deţine un rol fundamental în creşterea şi reproducerea celulară.

Folat-coenzimele sunt derivaţi ai acidului tetrahidrofolic, acestea reprezentând

forme biologic active ale acidului folic. De aici derivă importanţa specială a reducerii

acidului folic şi mai ales aceea a transformării acidului dihidrofolic în acid

tetrahidrofolic, proces ce se desfăşoară în organism sub acţiunea enzimei

dihidrofolatreductază.

Această enzimă “cheie” a metabolismului folaţilor a constituit obiectul unor

numeroase studii biochimice şi histoenzimologice.

Ea reprezintă cu cea mai mare probabilitate, receptorul molecular al analogilor

acidului folic, explicând marea eficacitate a unora dintre aceste substanţe ca agenţi

citotoxici şi în consecinţă, aplicabilitatea lor în terapia cancerului.

Dat fiind rolul derivaţilor acidului folic în biosinteza acizilor nucleici şi a

proteinelor, de un interes deosebit a beneficiat în această lucrare studiul implicaţiior

acidului folic în diferite situaţii fiziologice (sarcină, copil în creştere) sau patologice

(neoplasme, în particular leucemii, anemie megaloblastică, boli cronice exfoliative ale

pielii). De asemenea, în lucrarea de faţă s-a urmărit o reactualizare privind noile date

apărute în literatura de specialitate în legătură cu această temă: noutăţi referitoare la

mecanismul absorbţiei, transportului şi utilizării folaţilor, la carenţa de folaţi şi

malformaţiile congenitale, la mecanismul de acţiune al medicamentelor antiinflamatoare

nesteroidiene (AINS).

2

De-a lungul ultimilor ani s-au făcut multe studii în ceea ce priveşte incidenţa

malnutriţiei la bătrâni (în special la pacienţii vârstnici spitalizaţi pe perioade mai mari,

cât şi la persoane care se hrănesc cu conserve).

Câteva studii au indicat o incidenţă crescută a malnutriţiei la persoanele trecute de

65 de ani. Malnutriţia a fost evaluată atât prin parametrii antropometrici cât şi biochimici

(incluzând nivelul seric de acid folic). De asemenea a fost observată o incidenţă crescută

a anemiei la aceşti pacienţi, anemie datorată unui deficit de folaţi.

Mai mult, în ultimii ani hiperhomocisteinemia a fost propusă ca factor independent

de risc pentru boala arterială coronariană. De vreme ce deficitul de acid folic este o

cauză importantă de hiperhomocisteinemie în populaţia generală, scăderea

hiperhomocisteinemiei printr-un tratament simplu şi eficace cu acid folic poate scădea

incidenţa bolii arteriale coronariene.

Ţinând cont de informaţiile menţionate anterior am ales să studiez în partea

experimentală variaţia concentraţiei de acid folic din omogenate tisulare, în funcţie de

vârstă şi organ (ca factori independenţi).

Determinările le-am făcut pe şobolani împărţiţi în trei grupe de vârstă: tineri, adulţi

şi vârstnici şi concentraţiile de acid folic au fost măsurate din omogenatele tisulare din

ficat, creier, rinichi, splină.

Problema variaţiei acidului folic cu vârsta este de importanţă nu atât individuală,

cât socială, indicând oportunitatea unei suplimentări sistematice puţin costisitoare şi

lipsită de riscuri (cel puţin la cei ce prezintă manifestări clinice).

Abordarea acestei teme se impunea cu atât mai mult cu cât la noi în ţară există

puţine studii referitoare la acest subiect, iar în articolele de specialitate din întreaga lume

este menţionată tot mai frecvent.

3

1. ACIDUL FOLIC ŞI DERIVAŢII SĂI

1.1. Scurt istoric

Primele observaţii cu privire la existenţa unui nou factor alimentar, cu acţiune

vitaminică, s-au semnalat în perioada anilor 1931-1932, când s-a constatat că leucopenia

şi granulocitopenia maimuţelor poate fi vindecată cu ajutorul unui extract obţinut din

drojdia de bere.

În 1931, L.Wills şi B.S.Lond extrag din drojdia de bere un factor antianemic activ

pe maimuţă, numit vitamina M (M=monky). Tot în 1931, L.Wills, aflat în India, remarcă

efectul favorabil al unui extract din ficat şi drojdii asupra anemiei macrocitare tropicale,

concluzionând că această afecţiune trebuie să fie cauzată de lipsa unui factor nutritiv, a

unei deficienţe alimentare.

În 1938, P.Day, W.C.Langeston, W.Y.Darby constată că extractul din drojdia de

bere este activ şi asupra puilor de găină, stimulând creşterea acestora. A fost numit

factor de creştere pentru pui sau “Factor U”. A.G.Hogan şi E.M.Parrott reuşesc să

descopere în extractele din ficat un factor antianemic pentru puii de găină, căruia îi dau

numele de “Vitamina Bc”(c=chick, pui de găină).

În perioada 1939-1940, E.E.Snell şi W.H.Peterson obţin din ficat un factor de

creştere pentru Lactobacillus casei, izolat prin adsorbţie pe cărbune activ (norit) şi eluare

cu alcool amoniacal şi îl denumesc “factor L.Casei”sau “norit-eluat-factor”.

În 1941, H.K.Mitchell, E.E.Snell, R.J.Williams reuşesc să izoleze din frunzele de

spanac acidul folic (folium=frunză), care stimulează creşterea la Streptococcus lactis şi

manifestă proprietăţi vitaminice la animale.

Ulterior s-a constatat că factorii nutritivi obtinuţi de diferiţi cercetători din drojdie,

ficat, spanac, microorganisme, fac parte din aceeaşi grupă şi s-a propus denumirea lor

generică de acizi folici.

4

Termenul de folaţi este utilizat să desemneze toţi membrii familiei acizilor folici şi

a derivaţilor acestora, inclusiv compuşii în care acidul folic este legat de unul sau mai

multe resturi de molecule de acid L-glutamic.

Stabilirea structurii chimice a acidului folic a fost efectuată de E.L.Wittle,

B.L.O’Dell, J.E.Vandenbelt, J.J.Pfiffner, în 1945, confirmată în acelaşi an prin sinteza

de R.B.Angir şi colab., care menţionează că în componenţa acidului folic intră şi unii

pigmenţi pteridinici izolaţi anterior din aripile fluturilor precum şi acidul p-amino-

benzoic.

În 1962, C.Herbert consumă mai multe luni o dietă deficitară în folaţi şi stabileşte

simptomele care apar în starea carenţială. Totodată stabileşte necesităţile de folaţi pentru

oamenii adulţi.

Ulterior au fost identificaţi, în 1973, de către W.S.Osborne-White şi R.M.Smith

numeroşi factori nutritivi înrudiţi (aproximativ 28) din ficatul de oaie şi şobolan, dintre

care o importanţă deosebită o prezintă acizii folinici în reacţiile de transformilare.

În 1991, G.Wald stabileşte efectul favorabil al acidului folic în tratarea unor

afecţiuni neuropsihice. În 1992, Butterworth raportează că dozele mari de acid folic

ajunse în sânge reduc riscul apariţiei cancerului cervical la femeile infectate cu

“papilloma virusul” uman.

În 1993 Serviciul de Sănătate Publică din S.U.A. hotărăşte ca toate femeile să

consume zilnic 0,4 miligrame de folaţi pentru a reduce riscul apariţiei unor malformaţii

şi afecţiuni cancerigene.

1.2. Grupul acizilor folici

Grupul generic al “acizilor folici” este constituit dintr-un complex de vitamine B,

care din punct de vedere chimic sunt corelate cu acidul pteroilglutamic, au acţiune

5

hematopoetică şi leucopoetică, dar se deosebesc între ele prin acţiunea specifică pe care

o au asupra diferitelor microorganisme şi specii de animale.

Aparţin acestui grup: acidul folic, acidul folinic, acidul tetrahidrofolic, acidul

dihidrofolic, vitamina Bc-conjugată, vitaminele M, U, R etc.

Acidul folinic se mai numeşte şi “citrovorum factor” deoarece este indispensabil

culturilor de Leuconostoc citrovorum. Vitamina M este un factor nutritiv care vindecă

anemia nutriţională la maimuţă, de unde îi derivă şi numele. Vitamina Bc-conjugată

vindecă anemia macrocitară a puilor de găină şi este esenţială pentru creşterea

microorganismelor Lactobacillus casei L. şi Streptococcus faecalis R.

Dintre alţi factori nutriţionali corelaţi cu grupa acidului folic menţionaţi de diferiţi

cercetători fac parte factorul U, factorul R, factorul S, vitaminele B10 si B11 etc., factori

necesari creşterii unor microorganisme sau vindecării unor forme diferite de anemie la

animale. Toţi aceşti factori se pot obţine prin extracte apoase din drojdii, frunze de

spanac, ficat etc., prin adsorbţie pe cărbune activ (norit) şi apoi eluate de pe adsorbant cu

diferiţi compuşi. Prin metode fizice şi chimice compuşii din complex pot fi separaţi,

identificaţi şi dozaţi. Acizii folici au un rol însemnat în formarea globulelor roşii şi albe

din sânge, în prevenirea şi tratarea anemiilor, sunt factori de creştere pentru numeroase

organisme; deasemenea au un rol fundamental şi în activarea şi transportul unităţilor C1

active (-CH3, -CH2OH, -C=O, HCOO-, -CH=NH etc.), în biosinteza bazelor azotate, a

acizilor nucleici şi a proteinelor, în metabolismul unor aminoacizi etc.

1.3. Structura acidului folic

Acidul folic se numeşte astfel deoarece a fost izolat prima dată din frunzele

plantelor (folium-frunza). Se mai numeşte şi acid pteroilglutamic, denumire ce provine

din structura sa chimică. Este identic cu vitaminele Bc, B4, M, U, R, Lactobacillus factor,

precum şi cu cea de Norit eluat factor, pentru că la izolarea sa din produsele naturale se

foloseşte adsorbţia pe cărbune Norit (cărbune activ) şi eluare cu soluţii amoniacale.

6

Acidul folic are o structură complexă, având molecula compusă din trei fragmente:

-un inel pteridinic pe care se găseşte grefată o grupare amino în pozitia 2 şi o

grupare hidroxil în pozitia 4 (2-amino-4-hidroxipteridina);

-un radical al acidului para-amino-benzoic (PABA);

-un rest peptidic rezultat din una sau mai multe (până la 7) molecule de acid

glutamic.

Primele două componente constituie acidul pteroic. Prin adăugarea la acesta a celui

de-al treilea component (un rest de acid glutamic), se obţine acidul pteroil-mono-

glutamic (Pte-Glu), derivat la care ne referim atunci când folosim denumirea de acid

folic.

Structura moleculara a acidului folic

Structura chimică a acidului folic s-a stabilit iniţial prin identificarea compuşilor ce

rezultă din degradarea sa hidrolitică, în mediul alcalin aerob. În aceste condiţii din acidul

folic s-a obţinut o fracţiune cu funcţie aminică aromatică primară, din care prin hidroliza

ulterioară se eliberează acidul paraaminobenzoic şi acidul glutamic.

A doua fracţiune avea structură pteridinică, era fluorescentă şi prezenta caracter

acid.

Utilizarea difracţiei cu raze X a facilitat stabilirea structurii cristaline a moleculei

de acid folic dihidratat; acesta are o conformaţie extinsă cu nucleu pteridinic în poziţia

7

ceto. Oxigenul de la carbonul 4 şi atomul de azot 10 sunt de aceeaşi parte a moleculei,

legându-se de restul moleculei prin legături de hidrogen.

aranjarea intramoleculara a nucleului pteridinic

1.4. Caracterizarea compuşilor din categoria folaţilor

Folaţii reprezintă o mare familie de molecule naturale formate prin modificări a

moleculei de acid folic, structura de bază a grupului.

Derivaţii naturali ai acidului folic diferă între ei prin:

-starea de oxidare a ciclului pteridinic;

-natura substituienţilor de la carbonul din pozitiile N5 si N10;

-numărul resturilor de acid glutamic din moleculă.

Pteridinele au fost identificate în pigmenţii aripilor fluturilor, pe baza

fluorescenţei intense în U.V. (Hopkins, 1889-1893) şi ulterior au fost izolate o serie de

pteridine (xantopterina, leucopterina, izoxantopterina). Ele sunt prezente şi la

microorganisme şi la animale şi au fost supuse unor ample cercetări care au dus la

8

stabilirea structurii (H.Wieland, 1925), la sinteza şi la elucidarea rolului lor biologic, de

exemplu: cofactori şi hidrolaze ca precursori ai vitaminei B12; în biosinteza şi/sau ca

elemente structurale a acizilor folici şi folinici.

Pteridina are o structură biciclică fiind formată dintr-un nucleu pirimidinic (A) şi

unul piramizinic (B).

Pteridina contribuie la formarea pterinei (2-amino-4-hidroxi-6-metil-pteridina).

Pterina împreună cu acidul para-amino-benzoic formează acidul pteroic (Pte).

Prin ataşarea la acidul pteroic a unui rest de acid glutamic (Glu) se obţine acidul

pteroilmonoglutamic (Pte-Glu), respectiv acidul folic.

Prin adăugarea unor noi resturi de acid glutamic la acidul folic prin legături γ, se

pot obţine diopterina (Pte-Glu2), teropterina (Pte-Glu3), vitamina Bc conjugată (Pte-

Glu7).

Structura pteridinei si a pterinei

9

Structura unor compusi pteroidici si folici

10

Structura unor compusi pteroidici si folici

11

Structura xantopterinei si a biopterinei

Acidul pteroic nu prezintă activitate de creştere asupra L.casei şi nici antianemică.

Acidul N10-formil-pteroic (Rhizopterina-izolat din Risopus nigrigans) are

activitate limitată de creştere asupra microorganismelor, dar, prezintă proprietăţi

antianemice. A fost obţinut din diferite produse biologice. Are substituit un radical

formil la N10 al acidului folic. Este de zece ori mai activ decât acidul folic asupra

creşterii microorganismelor L.casei şi Str.faecalis R.

Diopterina se găseşte sub formă de acid pteroil-L-glutamil-α-glutamic şi sub

formă de acid pteroil-γ-glutamil-glutamic. Primul acid este eficace în tratarea anemiei

macrocitare la om şi atenuează la canceroşi simptomele dureroase.

Teropterina sau acidul pteroilglutamic se mai numeşte şi factor de creştere. Este

utilizat în tratamentul tumorilor maligne.

Rizopterina este un factor de creştere pentru Streptococcus faecalis R (SLR), dar

nu are acţiune asupra Lactobacillus casei şi nici asupra anemiei puilor de găină. Este un

derivat al acidului pteroic. S-a obţinut prin sinteză din acid pteroic şi acid folic. S-a

izolat din lichidul de fermentare de la Rhizopus nigricans.

Vitamina Bc conjugată sau acidul pteroilhexaglutamic are 7 resturi de acid

glutamic substituite la acidul pteroic. Reprezintă forma predominantă sub care se găseşte

acidul folic în ţesuturi. Vitamina Bc conjugată nu are o acţiune directă asupra anemiei

macrocitare la om şi nici nu stimulează creşterea la L.casei şi Streptococcus lactis R.

Prezintă acţiune curativă în anemia puilor de găină. Sub acţiunea unei enzime hepatice

12

numită vitamina-Bc – conjugaza, vitamina Bc conjugată eliberează acidul pteroil

glutamic activ.

Vitamina Bc conjugată este forma cea mai răspândită sub care se găseşte acidul

folic în alimentele naturale. Ea este eficientă în tratarea anemiei macrocitare şi la

maimuţă. Enzima vitamin – Bc conjugaza are acţiune carboxipeptidazică a fost iniţial

izolată din ficat, iar ulterior şi din rinichi de porc, pancreas (pui de găină), de la gâşte şi

din materiale vegetale (cartofi, migdale). Microorganismele nu conţin această enzimă şi

de aceea nu pot utiliza vitamina Bc conjugată.

1.5. Derivaţii metabolic activi

Acidul folic este inactiv ca atare în cadrul metabolismului celular, formele

metabolic active fiind constituite din compuşii rezultaţi din:

A. Reducerea acidului folic în poziţiile 5, 6, 7, 8 rezultând acid

dihidrofolic şi acid tetrahidrofolic.

Carbonul asimetric din poziţia 6 conferă moleculei FH4 stereospecificitate pentru

diferite funcţii metabolice şi mai ales permite trecerea în formele dihidro, în schimb, se

pare că gruparea NH2 din poziţia 2 a nucleului pteridinic deţine rolul fundamental în

coordonarea moleculei de folat cu funcţie de coenzimă.

Reducerea acidului folic în acid tetrahidrofolic se realizează în două etape

succesive; întâi se obţine acidul dihidrofolic (FH2) şi apoi acidul tetrahidrofolic (FH4),

sub acţiunea enzimei dihidrofolatreductaza.

13

Reducerea acidului folic sub actiunea dihidrofolatreductazei

Acidul dihidrofolic se poate prepara prin reducerea catalitică cu oxid de platină sau

paladiu în mediu alcalin sau prin reducerea cu hidrosulfit de sodiu la pH=6, în prezenţa

acidului ascorbic. Sunt posibili trei izomeri ai acidului dihidrofolic:

5, 6 H2 Pt. Glu. ;

7, 8 H2 Pt. Glu. ;

5, 8 H2 Pt. Glu. ;

dintre care numai acidul 7, 8 dihidrofolic (acid dihidrofolic “standard”) s-a izolat şi

este stabil.

14

Acidul dihidrofolic este uşor degradat prin expunerea la aer sau sub acţiunea

bazelor. Degradarea sa este favorizată de EDTA în timp ce acidul ascorbic şi tiolic îl

protejează.

Spectrul de absorbţie al acidului dihidrofolic la pH neutru prezintă două maxime

la lungimea de undă de 282 nm, precum şi la 310 nm. Spre deosebire de acidul folic care

nu este fluorescent, derivaţii săi în forma redusă posedă spectre de absorbţie

carecteristice în UV.

Acidul tetrahidrofolic (FH4) este acidul folic redus în poziţiile 5, 6, 7, 8. Poate fi

stabilizat în mediul acid (de exemplu în acid ascorbic 0,2-0,5% sau cu compuşi ce conţin

grupări tiolice cum ar fi mercaptoetanolul în soluţie 0,2-1 M).

Oxidarea cu aer produce o amină diazotabilă (acid para aminobenzoilglutamic).

Spectrul de absorbţie al acidului tetrahidrofolic prezintă două maxime, la lungimea de

undă de 298 nm, iar în absenţa agenţilor reducători maximul de absorbţie variază între

limitele 270-298 nm.

Spectrul de absorbţie al derivaţilor acidului folic la diferite pH-uri

Compusul Maximul de absorbţie la diferite pH-uri (în

nm)

Acid Neutru Bazic

Folat 292 280 257

Dihidrofolat 282 282, 310 283

Tetrahidrofolat 272 270, 298 -

N5 – formil FH4 - - 282

15

N5, N10 – metenil

FH4

348 x x

N10 – formimino

FH4

xx 258 255

N5, N10 – metilen

FH4

292 293 297

N5 – metil FH4 - 290 -

- Valoarea nu este cunoscută;

x compusul se transformă în N10 – formil FH4 în soluţie neutră sau bazică;

xx compusul se transformă în N5, N10 – metenil FH4 în soluţie acidă.

B. Substituirea de grupări monocarbonate în poziţiile N5 sau N5, N10 sau

N10. Mai jos sunt reprezentate structurile celor mai importanţi derivaţi ai acidului

folic, metabolic activi: N5 – metil FH4: N5 formil – FH4; N5, N10 – metilen – FH4;

N5, N10 – metilenil – FH4.

Structura generală a derivaţilor N5–substituiţi în care R poate fi:

-CH3 în N5 – metil – FH4;

-CHO în N5 – formil – FH4;

-CH = NH în N5 formimino – FH4 este prezentată mai

jos

Structura generala a derivatilor acidului folic N5 - substituiti

16

Acidul N5N10 metilen tetrahidrofolic

C. Modificarea numărului reziduurilor de acid glutamic din moleculă.

Resturile de acid glutamic sunt condensate între ele într–un mod special (gruparea

– COOH din poziţia γ a unui rest se leagă de gruparea – NH2 a altui rest de acid

glutamic. Mai des întâlnite sunt formele în care n = 3 (acid pteroiltriglutamic) şi n = 5

(acid pteroilpentaglutamic) în celule animale şi

n = 7 (acid pteroilheptaglutamic) la plante.

Structura pteroilpoliglutamatilor

1. 6. Proprietăţi fizice şi chimice ale acidului folic

1. 6. 1. Proprietăţi fizice

Acidul folic este o substanţă solidă, cristalină de culoare galbenă, greu solubil în

apă (0.16mg/100ml), piridină, în fenol, în metanol, în acid acetic glacial şi insolubil în

cloroform, benzen, eter şi acetonă. Ca sare de sodiu este solubil în apă. Este optic activ

dextrogir (+) 16˚, iar în mediul acid la pH 4 – 12 este stabil, cu ionii metalelor grele

formează compuşi complecşi (cu Fe 3+ roşu, Cu2+ verde, Co2+ galben), iar în mediul bazic

17

formează săruri cu metalele alcalinopământoase. Acidul folic se descompune sub

influenţa luminii şi a razelor UV, rezultând acid pteridoxamin – 6 – carboxilic şi alţi

compuşi proveniţi din catena laterală. Spectrul său de absorbţie în ultraviolet este

asemănător cu cel al xantopterinei. Acidul folic se prezintă sub formă de plăcuţe

galbene, lenticulare, subţiri, birefringente, cu punct de topire la 250˚C. Prin autoclavare

30min, pierde 70% din activitate la pH = 1. La 100˚C, sub acţiunea acizilor se

descompune în acid p – aminobenzoil – glutamic şi partea pteridinică modificată.

Solubilitatea acidului folic în apă poate fi măsurată prin încălzire la 75˚C sau prin

adăugare de glicocol. Soluţiile neutre sunt mai stabile, iar cele alcaline se oxidează cu

uşurinţă. Este incompatibil cu substanţe oxidante sau reducătoare deoarece se

degradează. Cu Ca2+ formează o sare insolubilă, iar în soluţie alcoolică este

incompatibilă cu clorhidraţi, FeSO4, preparate acide, siropuri acide, gume şi mucilagii

vegetale. Este inactivat de acidul ascorbic, acidul nicotinic, vitaminele B1, B2, sulfamide,

etc.

1. 6. 2. Proprietăţi chimice

Dintre proprietăţiile chimice ale acidului folic menţionăm posibilitatea reducerii

ciclului pteridinic în derivaţi di – şi tetrahidrofolici; ataşarea la o serie de enzime prin

intermediul grupării – NH2 din poziţia 2 (legături peptidice); transportul de unităţi

monocarbonate în poziţiile N5, N10; atomul de carbon din poziţia 6 conferă

stereospecificitate moleculei.

18

2.FOLAŢII ÎN NATURĂ ŞI ÎN ORGANISM

2.1. Răspândire în natură

Acidul folic şi derivaţii săi au o largă răspândire în alimente. Se găsesc în cantitate

mare în ficatul animalelor, în frunzele plantelor superioare, în special în spanac, în

mazăre, germeni de grâu, drojdii, sfeclă, lămâi şi în unele microorganisme.

Conţinutul substanţelor pteroilglutamice din plantule de porumb este de 11,5μg/g,

iar în frunzele mature de 6-7 μg/g. În ierburi, conţinutul acidului folic variază între 3-7,5

μg/g. Cele mai mari cantităţi de acid folic şi de folaţi se găsesc în regnul animal. În

ficatul de bou se găsesc 290 μg%, în ficatul de pui se găsesc 370 μg%, iar în cel de porc

220 μg%. Cerealele conţin în medie 35 μg%, iar dintre fructe lămâile 80 μg%, bananele

30 μg%, portocalele 33 μg%. Legumele au un conţinut mai redus, fiind cuprins între 8 şi

25 μg%.

O bună parte din acidul folic este sintetizat de flora intestinală fapt ce îngreunează

stabilirea necesităţilor pentru om şi animale.

Acidul folic se găseşte în cantităţi variabile în toate alimentele uzuale. Ficatul şi

muşchii mamiferelor sunt sursele cele mai bogate, dar şi sursele vegetale constituie un

aport însemnat. Laptele de vacă conţine cantităţi mici de acid folic.

În timpul preparării alimentelor o parte din folaţi se distrug, dar în acelaşi timp se

eliberează cele aflate în complexe inactive sau sub formă conjugată. Cele mai multe

forme de folaţi nu au stabilitate mare în alimente. Frunzele proaspete pot pierde prin

uscare la temperatura camerii până la 70% din activitatea folaţilor în decurs de 3 zile.

Cantităţi mari de folaţi se pierd în timpul extragerii, la prepararea hranei în soluţii

apoase şi prin fierbere. Uneori pierderile totale se ridică până la 85 - 90%.

19

2. 2. Necesarul de folaţi al organismului uman

Cantitatea de acid folic total dintr-o dietă normală variază între 50 – 2000 mg

zilnic.

Necesarul minim de acid folic este de 50 μg /zi, dar această valoare poate creşte în

anumite stări fiziologice (sarcină, pubertate) sau patologice (neoplazii, dermatoze

cronice, etc.)

Comisia F. A. O.- O. M. S. recomandă următoarele valori pentru aportul zilnic de

acid folic: 60 μg/zi pentru sugari, 100 μg/zi de la 1 –12 ani, 200 μg/zi între 13 – 19 ani şi

peste 200 μg/zi pentru adult.

Folaţii existenţi în natură sunt conjugaţi cu mai multe molecule de acid glutamic,

acidul pteroilmonoglutamic negăsindu-se ca atare în vreo sursă naturală; lanţul acid

poliglutamic fiind încărcat cu o sarcină electrică negativă, împiedică absorbţia vitaminei

ca atare. Pentru a fi absorbiţi, poliglutamaţii alimentari trebuie să fie hidrolizaţi la

monoglutamaţi. Această hidroliză are loc la nivelul jejunului proximal, sub acţiunea unei

conjugaze (cel mai probabil intraenterocitară) pH-dependentă şi zinc-dependentă. După

aceea monoglutamaţii rezultaţi vor fi absorbiţi printr-un mecanism activ facilitat de

glucoză.

Această absorbţie poate fi însă pasivă pentru doze crescute de folaţi. În cursul

transportului lor intraenterocitar monoglutamaţii sunt metilaţi şi apoi reduşi la dihidro- şi

tetrahidrofolaţi sub acţiunea dihidrofolatreductazei.

La individul normal, aproximativ 80% din acidul folic administrat oral este

absorbit, indiferent de doza administrată. La o doză mai mică de 200μg

/zi, excreţia urinară este minoră sau absentă. În schimb, la doze mai mari, aceasta

poate deveni considerabilă, şi anume: 6% pentru 1mg/zi; 10% pentru 2mg/zi; 50%

pentru 50mg/zi, până la 80% pentru 15mg/zi.

Sângele conţine aproximativ 1mg% folaţi, cea mai mare parte (90%) aflându-se în

eritrocite, la nivelul cărora predomină pteroilglutamotetrahidrofolaţii.

20

Există proteine ce leagă folaţii în plasmă, dar rolul lor este încă neclar.

Folaţii plasmatici se află sub formă de monoglutamat (N5-metil-tetrahidrofolat) şi

sunt transportaţi în celule printr-un “carrier” care este specific pentru formele reduse

(FH4). Odată ajuns în celulă, folatul trece în forma poliglutamată după pierderea grupării

N5-CH3 într-o reacţie de transfer a grupării metil. Forma poliglutamată pare a fi forma în

care celulele reţin şi depozitează folaţii.

În organism folaţii sunt depozitaţi în toate ţesuturile, dar cu precădere la nivelul

rinichilor, pancreasului şi mai ales ficatului. Rezervele normale de folaţi sunt estimate

între 5-20mg, din care jumătate în ficat; ţinând seama de necesarul zilnic minim de folaţi

(50μg), reiese faptul că rezervele organismului permit menţinerea unei hematopoeze

normale timp de 2-4 luni. Totuşi, în caz de creştere importantă a necesităţilor (stări

septice, traumatisme grave), timpul scurs până la apariţia manifestărilor hematologice şi

mai ales a trombopeniei, poate fi mai scurt (15 zile sau mai puţin).

Pierderea folaţilor se produce prin descuamarea zilnică a celulelor epiteliale din

piele şi tractul intestinal, ca şi prin bilă, urină, transpiraţie şi salivă. Rata pierderii este de

doar 1-2% din totalul rezervelor hepatice, dar valoarea ei este de 10 ori mai mare decât a

vitaminei B12 deoarece cantitatea minimă de folaţi necesară a fi absorbită zilnic este de

100 de ori mai mare decât cea a vitaminei B12, iar turn-over-ul folaţilor este mult mai

mare, simptomele deficienţei de folaţi se dezvoltă mult mai rapid decât cele ale

vitaminei B12. Deficitul va fi totuşi aparent doar după câteva luni de la apariţia tulburării

primare de aport, absorbţie sau utilizare.

2.3.Manifestările clinice ale deficitului de folaţi în organism

Manifestările clinice ale deficitului de folaţi implică celulele din ţesuturile cu rată

de multiplicare rapidă, şi mai ales sângele şi mucoasa intestinală. Manifestările

neurologice ce apar în cadrul deficitului de vitamina B12 (deosebit de grave prin

potenţialul lor de ireversibilitate) sunt mai puţin frecvente.

21

Manifestările hematologice constau în primul rând în anemie megaloblastică,

datorată unei eritropoeze ineficiente.

Sinteza de ADN anormal (prin încorporarea de d-UTP în locul d-TTP) duce la

hematopoeză de tip megaloblastic, asincronism de maturaţie nucleo-citoplasmatic

(nucleii sunt mai puţin maturi decât era de aşteptat, cromatina nucleară este dispersată).

În măduva osoasă apar mitoze anormale, hipercelularitate, metamielocite gigante şi

scăderea raportului mieloido/eritrocitar. Precursorii anormali sunt distruşi prematur în

măduva osoasă, rezultând anemie prin eritropoeză ineficientă, bilirubină indirectă

crescută şi hemosiderină normală sau crescută.

În sângele periferic se identifică hematii macrocitare (VEM > de 100μ3),

hemoglobină scăzută sau chiar normală faţă de numărul de eritrocite scăzut (datorită

VEM crescut, acesta fiind şi motivul pentru care valori mici ale hemoglobinei sunt bine

suportate de către aceşti pacienţi); frotiul sanguin arată o marcată anizocitoză,

poikilocitoză şi macrocitoză.

În ceea ce priveşte celelalte serii celulare sanguine, modificările sunt mai rare, dar

şi mai precoce: numărul leucocitelor şi al plachetelor poate fi scăzut, iar apariţia PMN

hipersegmentate (mai mult de 6 lobuli) în periferie este cvasipatognomonică pentru

anemie megaloblastică.

Pe frotiul de măduvă osoasă se observă, deasemenea, precursori anormali ca

mărime şi morfologie şi pentru seria granulocitară, iar clinic se poate constata un

sindrom hemoragipar sau o scădere a imunităţii celulare.

Valorile plasmatice ale folaţilor sunt scăzute (normal 6-20ng/ml), dar aceste valori

pot reflecta variaţii recente în aportul dietetic. Măsurarea folaţilor eritrocitari este în

acest sens o măsurătoare cu grad crescut de precizie, nefiind supusă acestor fluctuaţii.

Frecvent deficitul de folaţi este asociat cu deficitul de B12 (evidenţiat prin testul

Schilling).

22

Clinic, anemia se manifestă prin slăbiciune, ameţeli, palpitaţii, angor, insuficienţă

cardiacă, tahicardie. Culoarea tegumentelor este palidă, cu nuanţă subicterică, rareori

apare purpura (datorită trombocitopeniei), iar uneori splina şi ficatul pot fi uşor mărite.

A doua mare categorie de simptome sunt cele digestive, reflectând afectarea

proliferării epiteliului intestinal (ce are un turn-over rapid) în cadrul deficitului de folaţi.

Pacienţii prezintă o limbă zmeurie (roşie, lucioasă, depapilată, dureroasă), anorexie (cu

uşoară scădere în greutate), diaree, steatoree, etc.

Manifestările neurologice şi psihice includ cel mai frecvent un tablou de

polinevrită senzitivo-motorie (mai rar sindrom piramidal), se mai poate observa un

sindrom depresiv, anxietate, demenţă sau psihoză.

Diagnosticul impune cercetarea frotiului periferic (PMN hipersegmentate, anemie

macrocitară normocromă aregenerativă), a frotiului de măduvă osoasă (hematopoeză

megaloblastică), a nivelului de folaţi plasmatic (mai puţin concludent) sau eritrocitar (se

mai pot folosi testul de supresie prin deoxiuridină, excreţia urinară de

formiminoglutamat în exces) şi excluderea unui deficit de B12 (test Schilling normal).

Diagnosticul etiologic presupune o anamneză amănunţită cu privire la dietă şi

explorarea funcţiei intestinului subţire.

2.4. Tratamentul deficitului de folaţi

Tratamentul deficitului de folaţi este un tratament de substituţie, pe toată durata

vieţii (sau până la excluderea cauzei primare).

Folaţii sunt utilizaţi în scop terapeutic sub formă de:

- acid pteroilglutamic (acid folic) administrat oral (1cp = 5mg)

- acid N5-formil-tetrahidrofolic (acid folinic) sub formă de soluţie

pentru injectare parenterală, dar la fel de eficace şi pe cale orală.

O doză de 50-100μg/zi permite obţinerea unui răspuns hematologic, dar doze mai

importante, de ordinul a 1mg/zi timp de 2-3 săptămâni sunt necesare pentru a corecta

23

rezervele organismului. Această doză, administrată pe cale orală, este suficientă chiar şi

în caz de malabsorbţie.

24

3. METABOLISMUL FOLAŢILOR

3.1. Extragere, sinteza şi biosinteza folaţilor

Acidul folic se poate obţine în stare cristalină din diferite surse naturale (ficat,

spanac, drojdii, cojile cerealelor,etc) prin extracţie cu apă la pH 3, adsorbţie pe cărbune

activ (norit), eluţie cu soluţie amoniacală 2,8%, purificat prin readsorbţie pe cărbune,

eluare cu anilină şi precipitare cu acetat de plumb, AgNO3, acid picric, baritină, etc. În

prezent se realizează iniţial inactivarea enzimelor, care distrug cofactorii naturali prin

încălzirea rapidă a materialului la 95˚C, în prezenţă de tampon ascorbat sau amestec cu

uree 6M si cloroform. Cromatografierea extractului se face pe coloane cu schimbători de

ioni şi separare prin eluare în gradient de concentraţie cu soluţii amoniacale sau de

anilină.

Prin sinteză acidul folic se obţine prin condensarea acidului p-aminobenzoil-L (-)-

glutamic, cu aldehida 2,3-dibrompropionică şi cu compusul 2,4,5-triamino-6-

hidroxipiridinclorhidrat în prezenţă de NaOH, O2 şi acetal.

Schema sintezei acidului folic

În produsele naturale acidul folic se găseşte în stare liberă în cantitate relativ

redusă, deoarece se găseşte în cantitate mai mare sub formă de compuşi chimici diferiţi,

unii cu mai multe resturi de acid glutamic, care au însă aceeaşi importanţă nutritivă

pentru organismele vii.

25

Prin experienţe “in vitro” s-a observat că prin adăugarea de acid folic pe secţiunile

hepatice din mediul de reacţie, în prezenţa acidului ascorbic, se obţine acidul folinic,

care este un derivat formilat al acidului formic. Acidul folinic obţinut prin sinteză este

de două ori mai puţin activ decât cel natural, deoarece prin sinteză se obţin 2

stereoizomeri din care numai unul este activ.

Acidul folinic (N-5-COH-FH4) se obţine “in vitro” prin formilarea şi hidrogenarea

sa la temperatură ridicată, în prezenţa acidului ascorbic, iar “in vivo” sub acţiunea

piridinnucleotidreductazei şi a vitaminei C, se formează iniţial acidul dihidrofolic (FH2),

care prin hidrogenare trece în acidul folinic.

Mecanismul biosintezei acidului folic la om nu este destul de bine cunoscut. Până

în prezent s-au efectuat cercetări în acest domeniu pe microorganisme şi pe animale, cu

ajutorul unor inhibitori. Acidul folinic este sintetizat de majoritatea bacteriilor

intestinale. Biosinteza acidului folic este stimulată de acidul ascorbic.

Experimental s-a dovedit că unele microorganisme sunt capabile să biosintetizeze

acidul folic din precursori mai simpli, prin reacţii de condensare, sub acţiunea unor

enzime. Astfel, extractele celulare de E. coli, realizează biosinteza acidului folic din acid

glutamic, acid p-aminobenzoic şi 2-amino-4-hidroxipteridin-6-carboxialdehida, iar

extractele de Lactobacillus arabinosus sunt capabile să utilizeze ca şi compuşi pteridinici

2-amino-4-hidroxi-6 hidroximetilpteridina şi 2-amino-4-hidroxi-6-

carboxildehidropteridina în prezenţa ATP şi a ionilor de Mg2+. Biosinteza acidului folic

se realizează mai repede dacă compusii pteridinici conţin acidul pirofosforic la C-9.

26

În experienţele efectuate cu Mycobacterium avium s-a observat că în prezenţa

ATP, HS-CoA şi acidului p-aminobenzoic se formează un derivat adenilic monofosforic

al acidului p-aminobenzoic, care reacţionează cu acidul glutamic şi formează compusul

p-aminobenzoilglutamic. Prin unirea acestui produs cu pterina se formează acidul folic.

Schema biosintezei acidului folic la Mycobacterium avium

Extractele de Clostridium striklandii au transformat acidul folic în acid

dihidrofolic, iar din ficatul puilor de găină s-a izolat un sistem enzimatic capabil să

transforme acidul dihidrofolic în acid tetrahidrofolic.

27

Transformarea acidului folic in acizii dihidrofolic si tetrahidrofolic

Transformarea acidului folic în acid folinic s-a pus in evidenţă atât la animale, cât

şi la microorganisme în prezenţa ATP, FAD, Mg2+, acid ascorbic şi a unor enzime

specifice. În ficatul puilor de găină s-a identificat o enzimă care în prezenţa ATP si Mg2+

realizează transformarea acidului N-5-tetrahidrofolic în acid N-10-tetrahidrofolic.

3.2. Absorbţie, excreţie şi necesităţi

Acidul folic în stare liberă, ca acid pteroilmonoglutamic este uşor şi rapid absorbit

de organism în cantităţi de până la 15-20mg/zi. Absorbţia are loc mai ales incepând din

partea proximală a intestinului subţire şi continuă, pe toată lungimea sa, cu un consum

de energie, cu implicarea unor procese active (energodependente) pentru cantităţi

fiziologice mici. Dozele mari sunt absorbite mai ales prin difuzie pasivă. În multe

produse alimentare acidul folic se prezintă predominant sub forme poliglutamate. Din

aceşti derivaţi acidul folic este absorbit numai după o deconjugare prealabilă a acestor

compuşi. În tubul digestiv şi în rinichi, s-a pus în evidenţă existenţa unor sisteme

enzimatice hidrolizante (conjugaze) care scindează complexele acidului folic. Absorbţia

28

acidului folic poate fi perturbată şi micşorată de diferiţi compuşi cum sunt:

difenilhidrantoina, pirimidine, cicloserine, etanol, glicocol, serina, homocisteina şi

metionina.

Se consideră că acidul folic, precum şi derivaţii acestora, sunt convertiţi în

mucoasa intestinală sub acţiunea unor acidfolicreductaze în derivaţi metilici (CH3-FH4),

forme sub care trec în sângele venei porte şi apoi la ficat.

Din totalul de aproximativ 70mg acizi folici şi folinici existenţi la oamenii adulţi,

aproximativ 30-40% se găsesc în ficat (5-15μg/g), de unde prin circulaţia sanguină se

aprovizionează toate organele şi ţesuturile. Imediat după absorbţie şi parţial chiar în

timpul absorbţiei, acidul folic este convertit în diferiţi compuşi metabolici activi cum

sunt:

- acid N-5-formil-tetrahidrofolic (f5FH4);

- acid N-10-formil-tetrahidrofolic (f10FH4);

- acid N-5-formimino-tetrahidrofolic (fiFH4);

- acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (f5-10FH4);

- acid N-5-metil-tetrahidrofolic (m5FH4).

În toţi aceşti derivaţi apare ca structură de bază acidul tetrahidrofolic (FH4), care

joacă rolul unei coenzime de acceptor si transportor al unei unităţi C1.

Acidul folic este transportat în organism sub formă de CH3-FH3 legat de proteine

transportoare, având în sânge o concentraţie de 300ng/ml. Folaţii se găsesc în cantitate

mai mare în eritrocite, cu variaţii normale între 160-640ng/ml de eritrocite. Conţinutul

folaţilor din eritrocite, se menţine relativ constant şi reflectă gradul de aprovizionare a

întregului organism cu aceşti compuşi. Cantitatea de folaţi din sânge scade în bolile de

cancer (leucemii), carenţa folinică şi anemie pernicioasă, în ciroza alcoolică, anemii

gravidice, etc. Plasma sanguină conţine 5-20ng/l, iar eritrocitele conţin cantităţi de 30 de

ori mai mari de folaţi.

În sânge şi ţesuturi, acizii folici suferă procese de interconversiune şi de

catabolizare. Acidul folic se transformă mai ales în derivaţi tetrahidrofolici. În eritrocite

29

acidul folic prin metabolizare dă naştere la acid p-aminobenzoilglutamic şi la un derivat

aldehidic al pterinei. În ficat, acidul folinic se degradează în compuşi similari, reacţia

fiind activată de acidul glutamic şi inhibată de acidul ascorbic. Tot la nivelul ficatului se

transformă acidul folic în acid N-10-formil-folinic.

Eliminarea folaţilor şi a metaboliţilor acestora se face în cantitate mai mare prin

fecale, aproximativ 200-500μg/zi la omul adult, cuprinzând aproximativ 20% din

cantitatea ingerată şi partea neabsorbită produsă de flora intestinală.

Excreţia prin urină este mică, aproximativ 2-5 μg/zi, dar creşte prin administrarea

de doze orale, după saturarea organismului cu folaţi. Eliminarea folaţilor prin urină

reprezintă sub 1% din cantitatea acestora în organism.

Dacă se administrează intravenos doze mici de acid folic (1μg/kg corp),

aproximativ 90% din cantitatea administrată este distribuită din fluxul sanguin în tot

corpul în decurs de 3 minute, iar aproximativ 2% se elimină prin urină. Dacă însă se

măresc dozele până la 150μg/kg corp, până la 90% din cantitatea administrată se elimină

prin urină, în decurs de 6-12 ore, sub formă de acid folic sau derivaţi apropiaţi sub

aspect structural.

La o dietă normală, corespunzătoare la o ingestie de 600 μg de acid folic pe zi,

cantitatea acestui acid din organism se apreciază a fi între 6-10mg, cantitate suficientă

pentru trei sau patru luni, dacă este blocată absorbţia. O altă cale de eliminare a acidului

folic este cea cutanată. Prin transpiraţie se elimină cantităţi destul de însemnate de folaţi,

precum şi prin bilă.

3.3. Rol şi activitate biochimică

Acizii folici, sub formă de acizi tetrahidrofolici, reprezintă coenzimele unor

sisteme enzimatice, implicate în activarea şi transportul unor fragmente monocarbonice

(C1) sub formă de hidroximetil (-CH2OH), formil (-COH), formiat (HOOC-), metil (-

30

CH3), formimino (CH=NH), care iau parte la reacţii deosebit de importante pentru

organism.

Formele coenzimatice active, care poartă fragmente sau radicali cu un atom de

carbon, sunt derivaţi ai acidului tetrahidrofolic (FH4) din care fac parte:

- acid N-5-formil-tetrahidrofolic (N-5-COH-FH4);

- acid N-10-formil-tetrahidrofolic (N-10-FH4);

- acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10=CH-FH4);

- acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10-CH2-FH4);

- acid N-5-metil-tetrahidrofolic (N-5-CH3-FH4).

31

Derivati coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic

Derivaţii coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic se pot obţine pe două căi

principale:

-tratarea directă a aldehidei formice sau a acidului formic cu acid tetrahidrofolic

(FH4);

32

-transferul direct al acestor unităţi pe FH4. Ca substanţe donatoare de unităţi C1,

cele mai active sunt serina, histidina, xantina, metionina, colina, betaine, nicotina,

timina, acidul glutamic etc. Ca acceptori de grupări C1 funcţionează glicocolul,

colamina, nornicotina, uracilul, homocisteina, gliconamidoribozida, acidul folic etc.

Existenţa acidului N-5-formil-tetrahidrofolic, care este inert, sub aspect

coenzimatic nu constituie un balast pentru organism deoarece poate fi uşor transformat

pe cale enzimatică în acid N-10-metenil-tetrahidrofolic, iar acesta cu apa dă acidul N-

10-formil-terahidrofolic care este cel mai activ metabolit.

Acidul N-10-formil-tetrahidrofolic se poate forma şi prin reacţia directă dintre

aldehida formică şi FH4:

Reacţia este catalizată de formiltetrafolatsintetaza, care a fost izolată din ficatul de

porumbel şi din diferite microorganisme. Fragmentele monocarbonice sunt, sub aspect

33

metabolic, interconvertibile, deoarece pot trece reciproc una în alta, sub acţiunea unor

sisteme enzimatice de tipul hidroximetildehidrogenazei în prezenţă de NADP+şi NAD+.

Transportul fragmentelor C1 de la o substanţă la alta se realizează de acidul

tetrahidrofolic şi derivaţii săi menţionaţi anterior.

Dintre reacţiile chimice la care iau parte coenzimele tetrahidrofolice, face parte şi

transformarea serinei în glicocol în prezenţa piridoxalfosfatului (PALP):

Din histidină, se obţine ca produs intermediar acidul formiminoglutamic care

transferă radicalul formimino pe FH4 cu formare de acid N-5-formimino-tetrahidrofolic.

34

Acidul N-5-formimino-tetrahidrofolic (N-5-fi-FH4), sub acţiunea unei

ciclodezaminaze, formează acidul N-5,N-10-metilenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10=CH-

FH4). Acelaşi mecanism de reacţie se produce şi la transformarea xantinei în

formiminoglicocol.

Glicocolul, printr-o reacţie de transaminare, formează acid glicoxalic, care

cedează gruparea formil acidului glutamic, în prezenţă de NAD+ cu formare de acid N-

formil-glutamic.

Acidul formilglutamic cedează radicalul formil acidului FH4 şi se formează acidul

folinic, care este mai puţin activ. Acesta în prezenţa ATP se transformă în acidul N-10-

formil-tetrahidrofolic.

35

Coenzimele folinice, care au fixate unităţi C1, se comportă ca donori în reacţiile

care necesită acceptarea fragmentelor –CH2OH, -CHO, -CH=NH, HCOO-, -CH3. În

funcţie de felul compuşilor care se sintetizează în urma transferului de unităţi C 1,

participă la reacţie una sau alta din formele active.

În reacţiile cu cedare de radicali formil vor funcţiona ca donori acizii N-10-formil-

FH4 şi N-5, N-10=CH-FH4. Ca donori de grupări –CH2-OH este mai activ acidul N-5, N-

10-CH2-FH4, iar ca donori de radicali CH3 funcţionează acidul N-5-CH2-FH4 şi uneori

acidul N-5,N-10-CH2-FH4.

Acceptorii de grupări C1 active sunt mai numeroşi în procesul de biosinteză a

bazelor şi a nucleotidelor purinice, în biosinteza colinei, betainei, nicotinei, etc. În

procesul de biosinteză a bazelor purinice sunt cedate două grupări formil, localizate la

C-2 si C-8 al nucleului purinic. Dintre compuşii intermediari care se formează în

procesul de biosinteză a bazelor purinice, în urma primirii unor unitaţi C1 active fac

parte :

-formilglicinamidoribozida(FGAR)

-formilaminoimidazolcarboxiamidribozida(FAICAR)

Datorită participării coenzimelor folinice în biosinteza nucleotidelor purinice, ce

iau parte la formarea acizilor nucleici, rezultă rolul important pe care îl au acizii folici în

procesele de creştere şi reproducere celulară.

Acidul N-5,N-10-metilen-FH4 are un rol însemnat în biosinteza ADN, deoarece se

comportă ca o coenzimă în reacţia de transformare a uracilului în nucleozide şi

nucleotide în timină. Ea donează un radical metil la 2’-deoxiuridin-nucleotide (sau

nucleozide) şi acestea se transformă în 2’-deoxitimidin-nucleotide, respectiv nucleozide.

Transformarea uracilului în timină se face în molecula nucleotidelor (nucleozidelor),

care reprezintă cărămizile de bază în biosinteza acidului deoxiribonucleic.

36

În cazul biosintezei metioninei se realizează transferul grupării metil de la N-5-

CH3-FH4 la homocisteină.

În procesul de biosinteză a metioninei se produce neogeneza grupei metil şi nu

transferul acesteia de la alţi donori. Metionina are rol însemnat în formarea

colinfosfolipidelor deoarece grupele metil din colină provin din metionina activată (S-

adenozilmetionina).

Dintre reacţiile la care participă N-10-formil-FH4 si N-10-CH2OH-FH4,e

importantă trasformarea betainei în serină.

37

Ultima reacţie este reversibilă fapt important deoarece serina se poate transforma în

glicocol, constituind o importantă sursă de fragmente –CH2OH.

Există date experimentale care dovedesc că timina poate substitui acidul folic în

stimularea creşterii unor microorganisme (Str. faecalis), iar efectul optim al acidului

folic asupra acestor microorganisme se obţine când se administrează împreună cu

vitamina B12. Datorită acestor corelaţii se consideră că acidul folic funcţionează direct

sau indirect ca o coenzimă în biosinteza timinei. Unele microorganisme transformă uşor

uracilul în timină sau citozină, dar pentru biosinteza timinei au nevoie de acid folic. În

prezenţa formiatului marcat cu 14C, acesta se regăseşte în atomul de carbon al grupării

metil din timină.

Acidul N-5-formil-tetrahidrofolic, pe lângă transformarea glicocolului în serină, şi

a homocisteinei în timină, contribuie activ la transformarea uracilului în timină şi a

metioninei în creatină precum şi la biosinteza inelelor porfirinice. Prin administrarea de

formiat marcat cu 14C se regăseşte în hem, numai la animalele tratate cu acid folic, nu şi

la cele aflate în carenţă de folaţi.

Acidul folic stimulează activitatea colinesterazei, a cărei diminuare ar duce la o

creştere a acetilcolinei, cu influenţă negativă asupra hematopoezei, dar inhibă activitatea

tirozinazei şi a xantinoxidazei. Acidul tetrahidrofolic stimulează biosinteza nucleelor

porfirinice şi a nucleoproteidelor. La maimuţe cu deficienţe de acid folic, conţinutul

nucleoproteidelor scade în mod accentuat, iar situaţia se redresează prin administrare de

acid folic.

Acidul folic este un factor important pentru creşterea animalelor tinere şi pentru

microorganisme. Este utilizat tot mai mult în lupta împotriva cancerului. Asigură

funcţionarea optimă a sistemului nervos. A manifestat efecte antiteratogene la animalele

tratate cu pirimetamină.

38

4. PERTURBAREA METABOLISMULUI FOLAŢILOR LA OM

4.1. Cauze ce duc la scăderea acidului folic în organism

Cauzele ce duc la scăderea acidului folic în organism sunt multiple, implicând

aportul de acid folic, necesităţile metabolice crescute (sarcină, anemie cronică

hemolitică, neoplasm), malabsorbţia (sprue, medicamente-fenitoina, barbiturice, etanol)

sau interferarea căilor metabolice (inhibitori DHFR-Metotrexat, etanolul) şi altele.

Deficitul de aport dietetic de acid folic este mai frecvent întâlnit decât deficitul de

vitamină B12. Dintre categoriile mai frecvent afectate fac parte bătrânii cu aport

alimentar nediversificat (conserve, regimul “tea and toast”) şi ocazional adolescenţii-

alcoolicii şi toxicomanii. În cazul alcoolicilor sursa lor principală o constituie băuturile

alcoolice, acestea având conţinut de acid folic scăzut (berea, vinul) sau practic nul

(băuturile distilate). În alcoolismul cronic se cumulează aportul scăzut cu scăderea

utilizării acidului folic.

Necesităţile metabolice crescute de folaţi apar atât în condiţii fiziologice (sarcină,

perioadele de creştere în copilărie şi adolescenţă) precum şi în condiţiile patologice de

creştere a ratei de multiplicare a ţesuturilor cu turn-over crescut (mucoasa intestinală,

măduva osoasă).

Astfel, în timpul sarcinii necesarul zilnic de acid folic este crescut de câteva ori faţă

de normal, iar deficitul de acid folic este de 3 ori mai frecvent la multipare faţă de

primipare. Pentru un organism sănătos şi o dietă raţională, echilibrată, necesităţile

suplimentare nu constituie un impediment. Anemia ce apare in timpul sarcinii este

rezultatul unui consum crescut de acid folic pe fondul unor factori favorizanţi ca:

alimentaţie deficitară, ignoranţa, etc. Important de reţinut este că anemia poate fi

anterioară sarcinii şi o agravează prin necesităţile crescute; existând cazuri în care

anemia din perioada iniţială a sarcinii se datorează unor deficienţe alimentare sau

menometroragiilor.

39

Cauza principală a deficienţei de folaţi în sarcină este reprezentată de creşterea

sintezei de ARN, ADN asociată cu dezvoltarea fătului, placentei şi uterului, precum şi

cu expansiunea masei eritrocitare a mamei. Pot interveni şi alţi factori precum: anorexia,

reducerea absorbţiei de folaţi şi creşterea necesarului favorizată de infecţiile urinare

frecvente. Gemelaritatea accentuează nevoile de acid folic, determinând creşterea de

aproximativ 5 ori a posibilităţii de apariţie a deficienţei de acid folic în ultimul trimestru

al sarcinii.

Lipsa acidului folic, necesar pentru sinteza ADN, determină tulburări de maturaţie

şi multiplicare celulară, cu repercursiuni asupra produsului de concepţie, mergând de la

malformaţii ale tubului neural, pâna la avort. Rolul acidului folic în etiologia defectului

de tub neural precum şi metodele de profilaxie ale acestor malformaţii prin

suplimentarea dietei femeii gravide sunt foarte importante.

În condiţii patologice, necesităţile de acid folic cresc cel mai frecvent datorită unei

eritropoeze foarte active (de ex. anemia hemolitică cronică). Malabsorbţia poate duce la

un deficit de acid folic în condiţiile unui aport de folaţi normal; ea are drept cauză

afecţiuni ale intestinului (sprue tropical, enteropatia glutenică etc.), alcoolismul cronic

sau medicamente ce acţionează probabil pe această cale (fenitoina, barbiturice).

Interferarea căilor metabolice ale acidului folic se datorează alcoolului, unor rare

deficite enzimatice (DHFR) sau cel mai frecvent inhibitorilor DHFR (Metrotrexat). În

celulele în care aceşti inhibitori de DHFR se acumulează este împiedicată transformarea

deoxiuridinmonofosfat (dUMP) în deoxitimidinmonofosfat (dTMP) şi drept consecinţă

are loc fosforilarea dUMP ce va fi inserat în lanţurile de ADN într-o proporţie ce va

depăsi cantitativ capacitatea sistemelor ce recunosc, excizează şi repară eroarea,

rezultând astfel false lanţuri de ADN ce explică eritropoeza megaloblastică.

I aport inadecvat dieta neechilibrată(alcoolici, adolescenţi,

copii în creştere)

I necesităţi 1.sarcina

40

I crescute

2.copilărie

3.neoplasm

4.eritropoeză crescută(anemie hemolitică

cronică)

5.boli cronice exfoliative ale pielii

6.hemodializă

I

II

malabsorbtia 1.sprue tropical

2.enteropatie glutenică

3.medicamente:fenitoina, barbiturice

I

V

interferarea

căilor metabolice

1.inhibitori DHFR(Metotrexat)

2.etanol

3.rare deficite enzimatice (DHFR)

Cauzele deficitului de folati

4.2. Folaţii şi sarcina; profilaxia malformaţiilor fetale prin administrarea

acidului folic

Datorită rolului fundamental al folaţilor în replicarea celulară, s-a stabilit pentru

prima oară în 1964, de către Hibbard că deficitul de folaţi, cunoscut deja ca fiind

răspunzător de hematopoeza anormală, ar putea induce modificări şi asupra produsului

de concepţie şi a placentei, putând (mai ales dacă apare la începutul gestaţiei) da avorturi

spontane sau malformaţii. În ultimul timp, interesul cercetătorilor a fost focalizat mai

ales spre relaţia deficit de acid folic –malformaţii ale tubului neural (prima asociere în

acest sens a fost facută de Hibbard, 1965, când 66% dintre mamele cu produs de

concepţie afectat au avut concentraţii crescute de acid forminoglutamic în urină). Un

studiu prospectiv privind nivelul folaţilor eritrocitari la gravide în primul trimestru de

41

sarcină a arătat o incidenţă semnificativ crescută a malformaţiilor la gravidele cu nivel al

folaţilor eritrocitari redus (<130μg/ml).

Problema efectului protector al administrării preventive a acidului folic a fost

obiectul unui amplu program de cercetare administrat în Marea Britanie în 1983 şi

finalizat în 1991 (MRC Vitamin Study Group 1991); astfel, una din patru femei având în

antecedente o sarcină afectată din această cauză a primit 4 mg acid folic timp de

minimum 12 săptămâni înaintea concepţiei şi în timpul primelor 3 luni de sarcină. Riscul

apariţiei malformaţiilor de tub neural la produsul de concepţie a fost semnificativ mai

mic la gravidele ce au primit acid folic faţă de lotul martor.

Confirmarea efectului protector al suplimentării folaţilor în profilaxia recurenţei

malformaţiilor de tub neural susţine utilitatea administrării de folaţi la femeile ce aparţin

unei grupe de risc (din punct de vedere al apariţiei malformaţiilor neurale fetale) şi pune

problema extinderii administării profilactice a folaţilor la toate femeile gravide.

Un mare număr de femei gravide au un aport dietetic de folaţi sub valorile

recomandate (300μg de folaţi/zi), dar numai o mică parte din acestea vor avea un produs

de concepţie normal; oricum până în prezent este imposibilă determinarea certă a

apartenenţei gravidei la o grupă de risc crescut din acest punct de vedere, făcând foarte

greu o profilaxie ţintită.

Cele trei mari direcţii ale strategiei privind profilaxia deficitului de folaţi şi a

consecinţelor acestuia, sunt: educaţia generală privind dieta (cu o atenţie specială privind

grupurile cu cerinţe crescute: utilizatorii de medicamente citotoxice, sindroame de

malabsorbţie, tulburări metabolice), suplimentare a alimentelor cu acid folic şi

administrarea suplimentară de acid folic la toate femeile ce vor deveni gravide în scurt

timp.

Din punct de vedere al avizului privind dieta, se recomandă consumul crescut de

legume proaspete, spanac, fulgi de porumb, lapte (de exemplu o supă de spanac conţine

aproximativ 125 μg, o porţie de fulgi de porumb cu un pahar de lapte 80 μg). Astfel, se

combate ipoteza că deficitul de acid folic s-ar datora exclusiv unui statut socio-economic

42

scăzut, accentul fiind pus pe alimentele populare şi nici foarte scumpe. Orientarea

populaţiei pe baza unui aviz dietetic a specialistului este extrem de deficitară, atât în

perioada antenatală, cât şi în şcoli şi în rândurile adolescenţilor.

Suplimentarea artificială cu folaţi a alimentelor comerciale disponibile pune

problema libertăţii de opţiune şi a posibilelor reacţii adverse, precum neuropatia datorată

unui exces de acid folic la vârstnici. Alimentele alese trebuie să fie consumate cu

precădere de către populaţia ţintă, iar nivelul suplimentării trebuie să fie cel minim

protector (pentru a evita aportul excesiv de acid folic); cele mai frecvente alimente

îmbogăţite în folaţi sunt pâinea (există deja pâine suplimentată cu conţinut în folaţi

120μg/100 grame), iar fulgii de porumb sunt fortificaţi la 250 μg/100g (75μg/porţie

medie); aceste evaluări aparţin Expert Advisory Group şi sunt valabile pentru produse

alimentare in Marea Britanie.

Problema suplimentării acidului folic la femeile gravide se pune mai ales pentru

marea masă a populaţiei, întrucât numărul restrâns al celor cu risc crescut va beneficia

probabil de consult şi tratament adecvat. Din nefericire, în general concepţia nu este

planificată şi numai un număr restrâns de cupluri se vor prezenta la un consult prenatal.

Multe studii au recomandat folosirea dozelor farmacologice de acid folic (4mg/zi)

în scop profilactic, dar grija unei supradozări a ridicat problema folosirii unor doze

“fiziologice” (0,5mg/zi) pentru profilaxia generală antenatală. Astfel, deşi nu se cunosc

posibilele reacţii adverse ale acidului folic asupra femeilor în perioada de fertilitate, se

recomandă doze mici pentru mamele cu risc mic şi doze mari (4mg/zi) pentru femeile cu

risc crescut. În orice caz, suplimentarea trebuie începută cu trei luni înaintea concepţiei

şi continuată primele 8-12 săptămâni de sarcină. Un efect protector, dar de intensitate

mai mică, poate fi obţinut şi dacă suplimentarea este începută mai tarziu, chiar la

începutul gestaţiei.

În concluzie, dozele sugerate au fost stabilite empiric şi nu se ştie dacă efectul

protector al folaţilor împotriva apariţiei malformaţiilor este la fel de cert ca şi cel

împotriva recurenţei lor. Deşi nu s-au evidenţiat încă reacţiile adverse pentru doze mari,

43

ele pot apărea abia după mulţi ani, aşa cum a fost cazul unor posibile efecte teratogene

ale vitaminei A (1990). Strategia cea mai corectă ar consta în evitarea administrării

dozelor farmacologice dacă nu există o justificare clară.

Punerea la punct a unui protocol de “screening” prenatal privind femeile cu risc

crescut ar putea reorienta întreaga strategie profilactică şi poate fi obiectul unor cercetări

ulterioare la noi în ţară.

4.3. Acidul folic, ţinta terapiei anticanceroase

Terapia antineoplazică depăşeşte în vechime vârsta de 50 de ani. Dacă înainte de

1940 cuvântul cancer apărea în indexul tratatelor de farmacologie doar accidental, astăzi

chimioterapia reprezintă o piatră de temelie în terapia cancerului. Principalul progres al

ultimilor ani nu constă în lărgirea numărului de agenţi antineoplazici descoperiţi, ci în

dezvoltarea conceptuală a terapeuticii. Aceasta constă în: stabilirea unor regimuri

terapeutice mai eficace prin administrarea simultană a diverse medicamente, incluzând

agenţi antineoplazici şi stimulatori ai răspunsului biologic; înţelegerea mecanismelor de

acţiune ale medicamentelor, lucru care duce la prevenirea sau micşorarea efectelor

toxice; aprofundarea mecanismelor de rezistenţă la terapie; creşterea întrebuinţării

terapiei adjuvante (prevenirea recidivelor şi distrugerea micrometastazelor, după

radioterapie şi/sau chirurgie) şi neoadjuvante (administrarea înainte de radioterapie sau

chimioterapie sau chirurgie pentru scăderea masei tumorale); lărgirea cunoştinţelor

despre iniţierea tumorală, diseminarea, implantarea şi creşterea metastazelor.

Antimetaboliţii sunt substanţe proiectate ca inhibitori competitivi ai reacţiilor

enzimatice ale metabolismului intermediar, sau cu analogi inactivi ai substraturilor

reacţiilor specifice. Majoritatea sunt specifici doar în timpul anumitor faze ale ciclului

celular. Antimetaboliţii nu sunt administraţi obişnuit ca medicatie unică, datorită

specificităţii de fază şi a faptului că afectează sinteza macromoleculară în puncte

multiple.

44

Acidul folic reprezintă o ţintă atractivă pentru chimioterapia antitumorală, datorită

rolului său esenţial în sinteza precursorilor ADN. Formele reduse de acid folic

(tetrahidrofolaţi) sunt necesare pentru sinteza purinelor şi a timidilatului. N10-formil-FH4

şi N5, N10-metenil-FH4 contribuie cu o grupare monocarbonată la sinteza acidului

inozinic, precursorul adenilatului (AMP) şi guanilatului (GMP). Într-o altă cale

metabolică importantă, N5, N10-metilen-FH4 asigură o grupare metil şi doi atomi de

hidrogen pentru sinteza timidilatului (dTMP) din deoxiuridilat. Farber şi colab. au

propus că analogii acidului folic pot inhiba proliferarea celulelor maligne, o ipoteză care

a fost confirmată de testele iniţiale, cu aminopterină (acid 2,4 diamino 4 dezoxifolic), în

1948. Acest compus a fost înlocuit mai târziu cu derivatul său N10 metilat, metotrexatul

(MTX).

Antifolaţii ocupă un loc important în terapia antineoplazică; aceştia au produs

prima remisie temporară a leucemiei (Farber et al. 1948) şi prima vindecare a unei

tumori solide, coriocarcinomul (Hertz, 1963). Procentajul crescut de remisiuni complete

ale coriocarcinomului a impulsionat cercetarea în domeniul chimioterapiei. Interesul

pentru antifolaţi a crescut semnificativ după introducerea terapiei cu doze mari

combinate cu leucovorină (acid folinic, factor C), care scade efectul toxic al

metotrexatului. Folosirea dozelor crescute de MTX a extins utilitatea acestuia la tumori

ca sarcomul osteogenic, tumori ce nu răspund la doze mici. MTX este folosit şi în

terapia psoriazisului, o boală non-neoplazică caracterizată prin proliferare rapidă,

anormală a celulelor epidermoide (McDonald 1981). În plus, antifolaţii sunt inhibitori

puternici ai reactivităţii imune mediate celular, având şi rol de agenţi imunosupresori ce

se folosesc în transplantele de organe, în tratamentul artritei reumatoide şi în

granulomatoza Wegener (Jackson 1984, Chabner et al. 1985).

Metotrexatul (ametopterina) a fost primul antimetabolit care a primit recunoaştere

clinică, ca medicament eficace, cu toxicitate acceptabilă. În ultimii 20 de ani au fost

testaţi clinic noi compuşi antifolaţi, cum ar fi diaminopirimidinele şi chinazolinele. Cel

mai recent dintre acestea este trimetrexatul, un antifolat chinazolinic lipofil, care

45

ocoleşte obligativitatea din cazul folaţilor şi a metotrexatului de a folosi transportul

activ. Trimetrexatul are activitate puternic antiparazitară şi efecte antineoplazice, testate

încă în ambele specialităţi. Un alt folat din ce în ce mai interesant este 10-EDAM (10-

etil-5-diazo-aminopterina), un inhibitor potent al dihidrofolat reductazei, care posedă

transport şi poliglutamare îmbunătăţite faţă de metotrexat. Trimetrexatul şi 10-EDAM

au demonstrat o activitate antitumorală în tratamentul carcinoamelor de intestin, plămân.

MTX face parte din clasa drogurilor specifice pentru ciclul celular faza S (CCS),

alături de toţi ceilalţi antimetaboliţi. În general, drogurile CCS s-au dovedit eficace

împotriva malignităţilor hematologice şi a altor tumori în care proliferează o proporţie

relativ crescută de celule.

O problemă majoră a chimioterapiei anticanceroase este rezistenţa la drog. Unele

tipuri tumorale, cum ar fi cancerul colonic sau cancerul pulmonar prezintă o rezistenţă

primară, adica o lipsă de răspuns la prima expunere la drog. Rezistenţa dobândită se

dezvoltă în diferite tipuri de tumori iniţial sensibile la tratament. Experimental, se poate

observa apariţia unei rezistenţe specifice pentru un anumit drog, care apare datorită

fenomenului de amplificare genică. Alteori se observă un fenotip cu rezistenţă multiplă,

după expunerea la un singur agent. Acesta este frecvent asociat cu creşterea expresiei

genei MDR 1 pentru o glicoproteină membranară (glicoproteina-P), implicând efluxul

medicamentului. Această proteină transportoare, care apare atât în celule normale cât şi

în celule tumorale, foloseşte energia ATP pentru evacuarea multor molecule străine,

nefiind limitată doar la agenţii antineoplazici. Un alt mecanism de rezistenţă multiplă

implică modificări calitative şi cantitative în topoizomeraza II, enzima care repară

leziunile produse în ADN de medicamentele antineoplazice.

Principalele mecanisme de rezistenţă cunoscute sunt:

- transportul deficitar al MTX în celule (Assaraf & Shimke 1987);

- producţia de forme de DHFR alterată, care are afinitate scăzută

pentru inhibitor (Thill et colab. 1988);

- creşterea concentraţiei intracelulare a DHFR;

46

- scăderea abilităţii de a sintetiza poliglutamaţi de MTX;

- scăderea activităţii timidilat-sintetazei (Curt 1985).

47

Structura chimica a unor analogi structurali ai folatilor

4.4. Mecanisme de acţiune şi rezistenţă

Activitatea antitumorală a analogilor de folaţi este rezultatul substituţiei unei

grupări amino cu una hidroxil în poziţia 4 a inelului pteridinic, schimbare care

transformă molecula de folat din substrat, într-un inhibitor ce se leagă strâns de enzima

cheie a metabolismului folic intracelular, dihidrofolatreductaza (DHFR).

Pentru a întelege acţiunea metotrexatului şi a altor antifolaţi, este necesar să se

determine rolul determinant al DHFR în metabolismul folaţilor. Derivaţii acidului folic

sunt coenzime active doar în forma complet redusă de tetrahidrofolaţi. În reacţia

timidilat sintetazei (TS), acidul N5, N10 metilen FH4 este convertit la DHF. Acest

cofactor inactiv devine apoi substrat pentru DHFR, care transferă doi atomi de hidrogen

de la cofactorul NADPH la DHF pentru a forma FH4. În celulele cu ritm crescut a

sintezei de timidilat, inhibiţia DHFR cu MTX sau analogi similari duce la acumularea de

cofactori folat în formă inactivă, de DHF, ceea ce are ca rezultat inhibiţia sintezei

purinelor şi timidilatului.

Astfel, citotoxicitatea MTX-ului este determinată de perturbarea sintezei de novo a

purinelor şi a sintezei timidilatului, iar importanţa relativă a fiecărui efect variază la

48

diferitele tipuri de celule cultivate in vitro şi, probabil, la celulele normale şi maligne in

vivo.

Borsa şi Whitmore au demonstrat că citotoxicitatea MTX-ului faţă de limfocite de

şoarece poate fi crescută prin administrarea de purine, probabil datorită creşterii

efectului antitimidilat al MTX. Totuşi, în modelele de limfom L5178, MTX a avut un

efect antipurinic letal. În general, întreruperea sintezei de novo a purinelor apare în

prezenţa unor nivele crescute de timidilat sintază şi se produce prin consumarea

rezervelor de folaţi reduşi necesare sintezei acestora. Deoarece legarea strânsă de DHFR

şi depleţia consecutivă a folaţilor reduşi sunt esenţiale pentru mecanismul de acţiune a

MTX, activitatea timidilat sintazei modulează citotoxicitatea MTX. Inhibiţia timidilat

sintazei (prin administrarea F-pirimidinelor şi reducerea rezervelor de dUMP) scade

turnover-ul folaţilor reduşi şi reduce citotoxicitatea MTX. Importanţa activităţii timidilat

sintazei în determinarea citotoxicităţii MTX a fost confirmată recent de Tattetersall şi

colaboratorii, care au investigat capacitatea timidinei de a proteja culturi de celule

mamare împotriva unei doze letale de MTX. Când a fost administrată cu două ore

înaintea MTX, timidina a protejat ambele linii celulare, normale şi maligne. Măsurarea

rezervelor intracelulare de nucleotide a demonstrat că timidina realizează o depleţie a

rezervei de dUMP (prin inhibiţia cu TTP a dCMP deaminazei) şi încetineşte reacţia

timidilat sintazei, conservând astfel folaţii reduşi şi păstrând sinteza de novo a purinelor.

MTX-ul poliglutamat are un efect inhibitor puternic şi direct asupra timidilat sintazei şi

a enzimelor sintezei purinelor; prin aceste efecte inhibitorii pot contribui direct la

citotoxicitatea drogului.

Evenimentele care conduc la acţiunea citotoxică a MTX, începând cu transformarea

membranelor celulare, transformarea în derivaţi poliglutamaţi, legarea de DHFR, deleţia

folaţilor reduşi intracelulari şi inhibiţia sintezei ADN constituie paşi importanţi în

determinarea răspunsului la tratament şi a toxicităţii acestui medicament.

49

4.5.Transportul transmembranar

Traversarea de către antifolaţi a membranelor celulare a fost studiată cu multă

atenţie datorită legăturii dintre anomaliile de transport şi rezistenţă. Studiile clasice ale

lui Goldman şi colab. au stabilit că MTX intră în celule pe baza unui proces activ

sensibil la temperatură, dependent probabil de o proteină transmembranară. Influxul

poate fi observat şi în vezicule membranare izolate.

Aportul celular de folaţi se produce prin cel puţin două mecanisme independente:

folaţii reduşi sunt internalizaţi printr-un sistem “carrier” (RFC-reduced folate carrier) cu

afinitate redusă (Km=1-5μM) prin transport anionic, întâlnit în majoritatea celulelor, iar

acidul folic şi 5-metil-FH4 intră în celulă în complex cu o proteină membranară care

leagă folatul (FBP folate binding protein). FBP leagă folaţii cu afinitate crescută (Kd de

ordinul nM) şi apoi îi eliberează în citoplasmă printr-un proces de endocitoză mediată de

receptori. Se pare că FBP acţionează la concentraţii scăzute de folaţi (<50 nM) iar

carrierul la concentraţii normale sau crescute.

Macromoleculele care leagă folaţii au fost izolate din membranele unor celule de

mamifere, dar nu li s-a dovedit vreun rol în transport. Mecanismul transportor al MTX în

celulele leucemice murinice şi umane este deasemenea utilizat de folaţii reduşi naturali,

incluzând agentul de salvare 5-formil-FH4 (leucovorina). MTX şi folaţii reduşi

concurează, deci, pentru a intra în celulă. În plus, printr-un proces cunoscut sub numele

de heteroschimb, MTX intracelular liber este forţat să iasă din celule atunci când intră în

celule cantităţi crescute FH4 extracelular.

Gena RFC e localizată distal, pe braţul lung al cromozomului 21. Afinitatea

“carrier”-ului pentru MTX se situează între 1μM-6μM pentru diverse linii de celule

tumorale (murine şi umane), în timp ce afinitatea celulelor epiteliale intestinale este

oarecum mai scăzută Km=87 μM. Acestă afinitate mai mare a carrier-ului celulelor

tumorale este considerată ca fiind explicaţia persistenţei mai îndelungate a MTX liber

intracelular şi poate contribui la selectivitatea acţiunii antifolaţilor împotriva tumorilor,

50

faţă de celulele normale. Acumularea MTX în celulele tumorale poate fi influenţată de

alţi agenţi antitumorali, incluzând medicamente frecvent utilizate ca antifolaţi în

terapiile combinate. Vincristina creşte MTX intracelular, inhibând efectul

medicamentului. Concentraţia vincristinei necesară pentru a produce acest efect (10μM)

nu este uşor obţinută în timpul chimioterapiei clinice, care produce frecvent niveluri

sanguine maxime ale vincristinei mai mici de 0,1μM. Influxul MTX este inhibat de

ouabaină, glucocorticoizi şi cefalotin, în timp ce acumularea este crescută de probenecid,

prin inhibarea efluxului. Nici una dintre aceste interacţii nu a dovedit că afectează

chimio terapia clinică.

Faza proliferativă sau cinetică a celulelor influenţează puternic procesul de

transport. Celulele leucemice murinice rapid proliferative au o viteză de preluare a MTX

de 3 ori mai mare şi o viteză de eflux a drogului cu 50% mai mică decât o au celulele în

faza staţionară de creştere. Aceste modificări cresc nivelele MTX intracelular de 5-6 ori.

Dependenţa transportului de ritmul de creştere poate contribui la creşterea citotoxicităţii

MTX pentru celulele care se divid rapid, dar şi mărirea necesarului de folaţi reduşi în

fazele de creştere rapidă pentru a contribui la aceasta. În continuare la procesul de

transport activ cu afinitate crescută, descris mai sus, un al doilea mecanism de intrare

apare la concentraţii crescute ale drogului (peste 20μM). Acest al doilea proces poate fi

difuzie pasivă, sau un proces realizat pentru un “carrier” specific. Alte aspecte ale

acestui proces de transport sunt lipsa competiţiei dintre MTX şi FH4 pentru intrare,

precum şi absenţa heteroschimbului dintre MTX si FH4. Mecanismul de intrare explică

abilitatea celulelor rezistente la transport de a prelua drogul la concentraţii extracelulare

crescute şi reprezintă o motivaţie raţională a utilizării dozelor crescute de MTX în

chimioterapie. Un studiu recent a lui Henderson şi Zeveny a evidenţiat doar o singură

cale de influx cu afinitate crescută pentru concentraţii de până la 50μM, dar trei sisteme

de eflux pentru MTX. Cel mai important dintre acestea pare să fie acelaşi care mediază

şi influxul de MTX. A doua cale a fost caracterizată prin sensibilitatea la

bromosulfonftaleină, în timp ce a treia a fost insensibilă la această substanţă şi la

51

inhibitori competitivi ai MTX. Contribuţia acestor componente la eflux poate fi

modificată în funcţie de prezenţa extracelulară a anionilor glucozei, sau a inhibitorilor

metabolici. Acumularea şi persistenţa drogului în tumori faţă de ţesutul normal

determină în mod clar durata sa de acţiune în teritorii specifice. Au fost observate nivele

maxime intracelulare mai mari şi o persistenţă mai îndelungată a drogului în celulele

leucemice ale murinelor, sensibile la MTX, faţă de epiteliul intestinal, în timp ce linia

celulară sarcomatoasă 180 rezistentă, a acumulat concentraţii mai scăzute de drog, a avut

perioade mai scurte ale inhibiţiei sintezei ADN şi a fost neafectată în experimentele

chimioterapice. Analiza specifică in vitro a ratelor de preluare a medicamentului de către

celulele leucemice a evidenţiat o relaţie pozitivă similară între răspunsul la medicament

şi transport.

Există diferenţe semnificative ale caracteristicelor de transport între diverşi

antifolaţi. Antifolaţii chinazolinici au o rată de eflux mai crescută. Aceste diferenţe se

corelează cu acumularea intracelulară mai mare a chinazolinelor şi aminopterinei faţă de

MTX, după doze echimolare în vivo. Importanţa transportului MTX în determinarea

răspunsului clinic este nesigură. Alte mecanisme de rezistenţă, în special creşterea

concentraţiei de DHFR ca urmare a amplificaţiei genice, au fost observate în tumori

umane şi murinice expuse la creşteri treptate ale concentraţiei drogului in vitro care

poate fi un mecanism la fel de important şi în practica clinică. Înţelegerea rezistenţei la

antifolaţi la nivel clinic rămâne incompletă. Au fost propuse noi investigaţii, cu scopul

de a ocoli rezistenţa cauzată de deficienţa de transport. Antifolaţii liposolubili, cum sunt

esterii de MTX, diaminopirimidinele, triazinaţii şi trimetrexatul au o excelentă activitate

antitumorală în culturile de celule în tratamentul experimental al tumorilor la rozătoare

şi ar trebui să penetreze celulele deficiente în transport. Dibutilester-MTX are

deasemenea proprietatea neobişnuită de a inhiba încorporarea timidinei în ADN, aparent

datorită inhibiţiei transportului nucleozidelor. Diesterii MTX sunt rapid hidrolizaţi la

compusul de bază în plasma de şoarece, dar sunt mai stabili în plasma maimuţei,

câinelui şi omului; când sunt inhibate în aceste plasme dibutilesterii sunt convertiţi la

52

derivaţi α şi γ monobutilici, fiind inhibitori stabili şi eficace ai DHFR. Proprietăţile de

transport ale monobutilesterilor nu au fost încă definite. Conjugaţii de MTX şi polilizină,

care sunt toxici pentru culturile de celule ovariene de hamsteri cu transport eficient,

oferă şi posibilitatea de a ocoli rezistenţa la transport. Deoarece conjugatul polilizin-

MTX nu inhibă direct DHFR şi toxicitatea sa poate fi anulată prin administrarea

simultană de leucovorină, este probabil că şi compusul suportă liza intracelulară, cu

eliberarea antifolatului.

Shen şi colab. au postulat că conjugatul intră în celulă prin pinocitoză şi prin liza

enzimatică ce apare în lizozomi. Astfel, conjugatul polilizină-MTX este transportat

printr-un sistem “carrier” independent. Tiamin pirofosfatul, care inhibă transportul

MTX, protejează fibroblaştii de şoarece de toxicitatea MTX, dar nu de aceea a polilizin-

MTX. Deşi acidul folic este capabil să salveze celulele hepatom Reuber H35 de

citotoxicitatea MTX, este incapabil să salveze o murină rezistentă la transport de

efectele polilizin-MTX, probabil deoarece, ca şi MTX, acidul folic este incapabil să intre

în celulele rezistente la transport.

O altă încercare de a depăşi rezistenţa la transport este încapsularea MTX în

vezicule fosfolipidice bistrat, numite lizozomi. Aceste plachete microscopice ce conţin

medicament pot, teoretic, transporta MTX la suprafaţa celulară, unde intrarea poate fi

făcută prin pinocitoză, sau prin contopirea membranelor celulare şi lipozomice.

Lasserman şi colab. au reuşit să îndrepte lipozomi cu purtători de haptene, conţinând

MTX, spre celulele mielomatoase murinice care exprimau pe suprafaţa lor

imunoglobuline cu afinitate pentru haptene. Deşi lipozomii localizau celule ţintă

mielomatoase cu acurateţe nu a fost observată nici o inhibiţie a încorporării

deoxiuridinei, deoarece conţinutul veziculelor nu a putut intra în celulă. Deşi rezultate

încurajatoare cu lipozomi încărcaţi cu MTX au fost raportate pe modele animale,

majoritatea dovezilor sugerează că îmbunătăţirea supravieţuirii provine de la întârzierea

nespecifică a clearence- lui plasmatic şi nu din transportul selectiv al medicamentului la

tumora. O excepţie posibilă a acestei concluzii este tehnica de încapsulare a MTX in

53

lipozomi termolabili. Dacă tumora este apoi incălzită, eliberarea preferenţială a MTX

apare la sediul tumorii, ducând la o activitate terapeutică îmbunătăţită.

MTX – γ - aspartat

Legarea reziduurilor de aspartat la MTX prin legături γ - peptidice

Un alt experiment a fost folosit de Heath şi colab., folosind MTX-γ aspartat,

conţinut în lipozomi înveliţi în anticorpii specifici antitumorali. Acest analog de MTX

are capacitate limitată de a traversa membrana celulară şi este de 200 de ori mai puţin

toxic decât MTX, datorită transportului deficitar. Citotoxicitatea a apărut doar prrin

eliberarea intracelulară a drogului via lipozomi îmbrăcaţi cu anticorpi specifici pentru

fibroblaşti murinici L 929. În mod ideal, va fi nevoie de identificarea unor antigene

tumorale umane comune în scopul de a face acest experiment util din punct de vedere

clinic.

4.6. Legarea metotrexatului la dihidrofolatreductază

Caracteristicile fizice ale legării NADPH şi a MTX de DHFR au fost stabilite prin

studii cristalografice cu raze X şi prin determinarea secvenţelor de aminoacizi ale

enzimelor naturale şi ale celor modificate chimic. Au fost studiate enzime bacteriene şi

54

de la mamifere; secvenţele de aminoacizi posedând similitudini puternice în poziţiile

implicate în legarea cofactorilor sau a inhibitorilor. În general, MTX este legat printr-o

porţiune lungă, hidrofobă, formată din izoleucina-7 (sau leucina-7), alanina-9, leucina-

31, fenilalanina-34 şi alte reziduuri. Două interacţii mai importante participă la

potenţarea legării 4-amino-antifolaţilor:

a) oxigenul carbonilic al izoleucinei-7 realizează o legătură de

hidrogen cu gruparea 4-aminei ;

b) gruparea carboxil a aspartatului-30 (sau glutamatului-30)

protonează atomul N al MTX, dar nu şi pe cel al substratului fiziologic

(FH4). În plus, substratul fiziologic pare să se lege de enzimă într-o

configuraţie răsturnată, în comparaţie cu inhibitorul.

În prezenţa NADPH-ului în exces, afinitatea de legare a MTX de reductază a fost

estimată între 1nM şi 1pM. Această afinitate este crescută de pH-ul acid, potenţată de

ionii de K+ şi oxidarea grupărilor sulfhidril ale enzimei. În condiţiile unui pH scăzut, a

excesului de NADPH şi a unei afinităţi scăzute a inhibitorului faţă de enzimă, legarea

este stoechiometrică, ceea ce inseamnă că fiecare moleculă de MTX va lega o moleculă

de enzimă. Complexul enzimă-NADPH-inhibitor este extrem de stabil, supravieţuind

electroforezei în gel şi filtrării în gel.

NADH are deasemenea capacitatea de a acţiona ca şi cosubstrat pentru DHFR în

locul NADPH, pentru reducerea folatului şi a dihidrofolatului. Spre deosebire de

NADPH, NADH nu asigură legarea MTX de DHFR. Importanţa raportului dintre

NADH şi NADPH în determinarea răspunsului la MTX rămâne să fie stabilită.

Legarea MTX la reductaza izolată de la Streptococcus faecium generează lent un

complex cu un Ki al inhibitorului de 58 pM. Procesul a fost denumit inhibiţie strâns

legată şi lentă. Alţi analogi de folaţi, incluzând diaminopirimidinele, trimetroprimul şi

aminopterina urmează acelaşi proces cinetic, de “legare strânsă şi lentă”, în timp ce

pteridinele ce nu au gruparea acid amino benzoic se comportă ca inhibitorii competitivi

clasici ai enzimei. Cinetica a fost evaluată folosind şi modele de simulare .

55

În terapeutică, MTX acţionează ca un inhibitor cu legare strânsă, dar reversibil. În

condiţiile unor concentraţii crescute de substrat competitiv şi la un pH normal, este

necesar un exces considerabil de MTX liber pentru realizarea unei inhibiţii complete a

enzimei. În culturile de celule şi în sisteme acelulare, 3H-MTX (MTX marcat cu 3H)

legat de enzimă poate fi deplasat de pe aceasta prin expunere la noi doze de drog,

fenomen ce indică o disociere lentă, dar stabilă a MTX de pe enzimă. Acestă disociere

lentă este considerabil mai rapidă decât cea calculată în experimente cu enzimă pură în

prezenţa unui exces de NADPH. Motivul acestei diferenţe este încă neclar, dar poate fi

rezultatul diferenţelor din mediul ionic, de legare prin complexe cu afinitate scăzută a

drogului cu DHFR şi NADP+, sau doar cu enzima. Deci este necesar un exces de drog

liber, nelegat, pentru a menţine inhibiţia totală a DHFR şi a sista sinteza timidilatului.

De exemplu, dacă se incubează celule tumorale cu cantităţi crescute de MTX pentru a

permite titrarea totală a enzimei şi apoi se scoate drogul nelegat din soluţie, sinteza

timidilatului va reîncepe imediat în ciuda persistenţei MTX intracelular legat de enzimă.

56

5. REZULTATE EXPERIMENTALE

În studiul prezent am folosit o metodă spectrofotometrică pentru a determina

concentraţia de acid folic din omogenate tisulare din diferite organe (ficat, rinichi, creier,

splină) la şobolanii albi; acest studiu a fost

realizat în scopul aflării variaţiei concentraţiei de acid folic în funcţie de:

- vârstă;

- organ.

Pentru curba de etalonare am folosit:

- metoda biuretului pentru determinarea proteinelor celulare;

- reactivul naftiletilendiamină pentru determinarea acidului folic.

Concentraţiile acidului folic în funcţie de vârstă şi de organ le-am estimat prin

metoda descrisă de Lowry (Lowry, 1951), cu ajutorul acidului

fosfomolibdenowolframic.

Determinarea concentraţiei de acid folic la şobolani

5.1. Material şi metodă

Animale şi dietă

Pentru studiu s-au folosit trei grupuri de şobolani albi, de sex masculin, fiecare grup

constând în cinci şobolani de vârstă şi greutăţi apropiate, astfel:

1)-primul grup: şobolani tineri, cu vârsta mai mică de şase luni şi greutate mai mică

de 50 de grame;

2)-al doilea grup: şobolani adulţi, cu vârste cuprinse între şase luni şi un an şi

greutate cuprinsă între 100 grame şi 125 grame;

3)-al treilea grup: şobolani bătrâni, cu vârste în jur de un an sau chiar mai mult şi

greutate mai mare de 125 grame.

Toţi şobolanii au fost supuşi la aceeaşi dietă.

57

Prepararea omogenatelor tisulare

Toate operaţiunile de preparare a omogenatelor tisulare pentru investigaţii

biochimice se fac la 0-4˚ C. Sticlăria de lucru, eprubetele şi cupele de centrifugă,

soluţiile de spălare şi mediile de omogenizare au fost păstrate la gheaţă şi au fost reci în

momentul întrebuinţării.

Animalele de laborator au fost decapitate şi apoi supuse exsanguinării.

S-au izolat organele necesare experimentului: ficat, rinichi, creier şi splină, iar

apoi s-au presat uşor pe hârtie de filtru, pentru a îndepărta sângele. S-au cântărit foarte

repede.

Fiecare organ a fost spălat de câteva ori (într-un pahar Berzelius menţinut în

gheaţă) cu soluţie rece de NaCl 0,15M până ce lichidul de spălare a rămas limpede.

Apoi, cu o foarfecă s-a mărunţit bine organul şi s-a spălat cu NaCl 0,15M, pâna ce

soluţia de spălare a rămas limpede.

Pentru omogenizare 5 ml de soluţie de NaCl 0,15M au fost adăugaţi pe gramul de

ţesut (cu scopul de a obţine un omogenat de concentraţie 10%).

Ţesuturile uşor poterabile (ficat şi creier) au fost omogenizate la 1500rpm, timp

de 2 minute, într-un omogenizator de sticlă tip Potter-Elvehjem. Ţesuturile mai dure

(rinichi şi splină) au necesitat o omogenizare cu o durată mai crescută.

Omogenatele obţinute s-au centrifugat la 700 g timp de 10 minute (după o

prealabilă echilibrare). Sunt sedimentaţi:

-nucleii;

-celulele întregi;

-debriurile celulare;

-hematiile.

Supernatantul se decantează şi se păstreaza în gheaţă pentru alte determinări

biochimice.

58

Pentru a putea compara şi interpreta rezultatele determinărilor biochimice pe

omogenate, materialul biologic s-a standardizat în două moduri:

-prin raportare la greutatea produsului la începutul determinării (standard de

preparare);

-prin raportare la conţinutul proteic al omogenatului.

Standard de preparare

Iniţial organul sau fragmentul de organ se cântăreşte. În funcţie de greutatea sa se

realizează omogenate de 10-20%, diverse soluţii de omogenizare.

Standardizarea se obţine preparând totdeauna omogenate de aceeaşi concentraţie.

Raportarea la conţinutul proteic

Este metoda de standardizare cea mai utilizată.

Metoda de determinare a proteinelor celulare folosită pentru standardizare

(metoda biuretului)

-sensibilitate de 0,25-10mg/ml omogenat

Principiu:

Proteinele celulare dau cu reactivul biuret un derivat de culoare albastră

caracteristică, a cărei intesitate este direct proportională cu concentraţia proteinelor din

probă.

Reactivi:

1.reactivul biuret;

2.NaOH 10%.

59

Reactivul biuret se prepară astfel:

-tartrat de sodiu şi potasiu –9g;

-CuSO4·5H2O –3g;

-KI-5g;

Se dizolvă şi se aduce la 1000ml cu NaOH 0,2N.

Reactivul preparat corect este de culoare albastră. Se păstrează timp nelimitat. Dacă

reactivul este contaminat cu alte substanţe apare un precipitat roşcat şi nu se mai

foloseşte.

Tehnica

Deoarece omogenatele tisulare nu sunt soluţii limpezi, ele prezintă o anumită

turbiditate, dând cu reactivul biuret un efect secundar ce interferă cu reacţia de culoare.

Se face pentru fiecare determinare şi un martor de turbiditate.

Martor de

culoare

Martor de

turbiditate

Proba

2 ml apa distilată 1,8 ml apa distilată 1,8 ml apa distilată

0,2 ml omogenat 0,2 ml omogenat

1 ml NaOH-10% 1 ml NaOH-10% 1 ml NaOH-10%

3 ml reactiv biuret 3 ml apa distilată 3 ml reactiv biuret

Se agită bine. Se lasă în repaus 30 de minute la temperatura camerei, după care se

citeşte extincţia la lungimea de undă de 540 nm, cu grosimea stratului de 10 nm.

Se citeşte extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare , iar extincţia

martorului de turbiditate faţă de cea a apei distilate.

Calculul cantităţii de proteine se face prin raportarea valorii corespunzătoare

diferenţei dintre cele două mărimi la o curbă etalon.

60

Curba etalon

-se prepară o soluţie standard de albumină serică de bou;

-se pregăteşte o scară de diluţii de concentraţii cunoscute cuprinse între 0,25-60

mg/ml ;

-se respectă pentru fiecare diluţie protocolul prezentat în tabelul anterior ;

-se reprezintă grafic modul de variaţie a extincţiei în funcţie de concentraţia soluţiei

de proteine

Concentraţie (mg/ml) Extincţie (p/c-t/H2O)*

60 0,617

30 0,320

15 0,166

7,5 0,090

3,75 0,042

1,875 0,024

0,9375 0,012

0,46875 0,006

0,234375 0,003

*)-extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare minus extincţia martorului

de turbiditate faţă de cea a apei distilate

61

5.2.Determinarea conţinutului în acid folic

Reactivi

-fosfat dibazic de potasiu soluţie 3%;

-permanganat de sodiu 0,4%;

-azotit de sodiu soluţie 2%;

-acid clorhidric soluţie 5N;

-acid sulfamic soluţie 5%;

-diclorhidrat de N (1-naftil) etilendiamina NED soluţie 0,1%.

Tehnica

Proba Martor de

turbiditate

Martor de

culoare

2,5 ml omogenat 2,5 ml omogenat 2,5 ml KmnO4

0,5 ml KMnO4 0,5 ml apă 0,5 ml KMnO4

Se lasă 2-3 minute

0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2

0,5 ml HCl 0,5 ml HCl 0,5 ml HCls

Se agită puternic şi se lasă 2 minute

O,5 ml acid

sulfamic

O,5 ml acid

sulfamic

O,5 ml acid

sulfamic

Se agită puternic până la îndepărtarea NO2

0,5 ml NED 0,5 ml NED 0,5 ml NED

62

Se citeşte extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare şi a martorului de

turbiditate faţă de cea a apei distilate după 10 minute la lungimea de undă 530 nm în

cuvă de 10 mm.

Calculul cantităţii de acid folic se face prin raportarea valorii corespunzătoare

diferenţei dintre cele două mărimi la o curbă etalon.

Curba etalon:

-se prepară o soluţie standard de acid folic;

-se pregăteşte o scară de diluţii cu concentraţii cunoscute cuprinse între 1,2023-130

μg/ml;

-se respectă pentru fiecare diluţie protocolul prezentat în tabelul anterior;

-se reprezintă grafic modul de variaţie al extincţiei în funcţie de concentraţia

soluţiei de acid folic.

Concentraţie

μg/ml

Extincţie

p/t*

Extincţie

p/c –t/H2O

130 1,226 1,2648

108,33 1,0508 1,0728

86,66 0,8756 0,8555

65 0,6198 0,565

43,33 0,3585 0,2905

21,66 0,2758 0,1766

10,83 0,1555 0,0718

7,22 0,1394 0,0431

3,61 0,1180 0,0303

*)extincţia probei faţă de cea a martorului de turbiditate

63

**)-extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare minus extincţia martorului

de turbiditate faţă de a apei distilate.

Măsurarea cantităţilor de acid folic din omogenatele tisulare

Concentraţiile de acid folic au fost estimate prin metoda NED (N-1-naftiletilen

diamina), o metodă de bază, spectrofotometrică. Această metodă se foloseşte ca tehnică

de dozare în industria farmaceutică (Atanasiu şi colab., 1989)

.

Reactivi

-_monofosfat de potasiu –3%;

- permanganat de potasiu –0,4% ;

- NaNO2 -2%

- acid hidrocloric – 5%;

- acid sulfamic –5%

- NED-0,1%

Tehnica

64

Proba Martor de culoare

2,5 ml omogenat 2,5 ml K2HPO4

0,5 ml KMnO4 0,5 ml KMnO4

Se lasă 2-3 minute

0±,5 ml HCl 0,5 ml HCl

0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2

Se agită şi se lasă 2 min

0,5 ml acid sulfamic 0,5 ml acid sulfamic

Se agită până când N2 este complet înlăturat

0,5 ml NED 0,5 ml NED

Se lasă 10 minute

Se citeşte extincţia faţă de martorul de culoare la lungimea de undă de 530 de nm;

concentraţia de acid folic corespunzătoare acestei extincţii s-a calculat prin raportarea la

curba standard (prin metoda expusă anterior).

Rezultatele obţinute s-au exprimat atât în funcţie de greutatea iniţială a organului

(μg de acid folic/g de ţesut), cât şi în funcţie de concentraţia de proteine din omogenat

(μg de acid folic/mg de proteine).

Măsurarea concentraţiei de proteine din omogenat

65

Concentraţia de proteine a fost calculată prin metoda descrisă de Lowry (Lowry,

1951), metodă bazată pe acidul fosfomolibdenowolframic (reactivul “Folin-Ciocalteu”).

Reactivi

Reactivul A: - 4g NaOH;

-10g sare Seignette;

-apă distilată până la 1000ml;

Reactivul B: -5g CuSO4·5 H2O;

-apă distilată până la 1000 ml;

Reactivul C: -25 ml reactiv A + 0,5 ml reactiv B;

Reactivul D: -acid fosfomolibdenowolframic.

Tehnica

Peste 20 μl de omogenat se adaugă 180 μl de apă distilată, iar apoi se adaugă 5ml

reactiv C şi 0,5ml reactiv Folin-Ciocâlteu; întregul amestec a fost agitat şi după aceea

lăsat timp de 30 de minute. Extincţia s-a citit la o lungime de undă de 660 nm, faţă de un

martor ce conţinea 20μl de apă distilată în loc de 20μl de omogenat. Rezultatele au fost

deasemenea raportate la o curbă etalon, curbă construită pe baza unor concentraţii

proteice cunoscute (prin metoda descrisă anterior).

66

67

5.3.Rezultate şi discuţii

Variaţia concentraţiei de acid folic: în funcţie de vârstă şi organ

Acid folicConcentraţie(valoare ±eroare)

ProteineConcentraţi

e(valoare±er

oare)

OrganGru

pa de μg de

acid folic/g μg de

acid mg de

proteină/ml

68

vârstă de ţesut folic/mg de proteine

omogenat

Ficat

tânăr 431,48±4,76

25,74±1,76

2,80±0,99

adult 322,07±3,36

30,12±1,12

2,71±0,43

bătrân

195,52±2,83

18,54±2,55

2,11±0,33

Rinichi

tânăr 333,13±8,08

27,93±6,54

2,13±0,41

adult 208,57±4,54

20,37±3,88

1,25±0,13

bătrân

227,31±2,03

46,73±9,07

1,13±0,13

Creier

tânăr 336,36±9,23

29,04±1,43

2,06±0,72

adult 110,48±3,17

27,81±2,87

1,61±0,33

bătrân

27,08±2,31

7,44±2,77

1,23±0,27

Splină

tânăr 120,73±1,68

20,03±3,88

1,07±0,04

adult 109,03±9,74

17,08±2,53

1,13±0,17

bătrân

91,53±3,83

6,41±1,74

1,25±0,28

69

Variaţia concentaţiei de acid folic pe grupe de vârstă exprimată în μgAF/g de ţesut

Variaţia concentaţiei de acid folic pe grupe de vârstă exprimată în μgAF/mg prot.

70

Variatia concentratiei de acid folic pe grupe de varsta exprimata in μg AF/g de tesut

Variaţia concentraţiei de acid folic pe grupe de vârstă

Din studiul grafic al variaţiei concentraţiei de acid folic pe grupe de vârstă

(exprimată în μg de AF/g de ţesut) s-a observat o scădere gradată de la tineri spre adulţi

şi spre bătrâni, cu excepţia concentraţiilor de acid folic din omogenatul din rinichi. În

acest caz particular concentraţia de acid folic scade de la tineri la adulţi, ca apoi să

crească paradoxal la şobolanii bătrâni.

Sunt două posibile explicaţii prentru aceste variaţii neaşteptate.

1) prezenţa unei concentraţii crescute de folaţi în omogenatul de rinichi

la tineri;

2) prezenţa unei concentraţii scăzute de proteine în acest omogenat.

Dintre aceste două ipoteze ultima este mai plauzibila. Această ipoteză

s-a justificat prin corelarea cu valorile calculate a concentraţiilor proteinelor din

omogenatul de rinichi de la tineri şi de la adulţi.

71

În ceea ce priveşte concentraţiile de acid folic din creier nu are valoare faptul că s-a

obţinut o scădere a concentraţiilor de acid folic (de aproximativ trei ordine de mărime)

de la tineri spre adulţi.

Variaţiile concentraţiilor de acid folic în funcţie de organ:

Din toate tipurile de reprezentări grafice, pe grupe de vârstă, rezultă faptul că

indiferent de modalitatea de exprimare a acidului folic (μg acid folic/g de ţesut sau μg

acid folic/ mg de proteine) nivelul cel mai crescut de folaţi s-a obţinut în omogenatul de

ficat; aceste rezultate sunt în concordanţă cu studiile histologice făcute anterior

(Onicescu şi colab., 1979) şi cu nivelul activităţii metabolice din ficat (implicând

metabolismul hepatic a unei singure unităţi carbonice).

S – au obţinut cantităţi mult mai mari de acid folic în ficat şi rinichi, faţă de valorile

corespunzătoare din splină şi creier.

Variaţiile concetraţiilor de acid folic în funcţie de organ (exprimate în μg AF/mg de proteine)

72

Concluzii

În acest studiu s-a dovedit o incidenţă crescută a deficitului de acid folic la bătrâni,

deficit cauzat în principal de malnutriţie. Este necesară o evaluare ulterioară pentru a

demonstra rolul patogenic a deficitului de acid folic în diferite sindroame clinice la

bătrâni (ca de exemplu deficite imunologice şi neuropsihiatrice). Tabloul clinic

nespecific al malnutriţiei la bătrâni (care este adesea greşit diagnosticată) însoţit de

deficienţă de folaţi induc homocisteinemia şi se asociază cu un risc crescut

cardiovascular. Aceste observaţii sunt argumente în favoarea următoarelor concluzii:

1) stării nutriţionale a bătrânilor trebuie să i se acorde o mai mare

importanţă decât unui diagnostic de rutină

2) soluţia este suplimentarea de acid folic la bătrâni (măcar la pacienţii

cu risc de a dezvolta o deficienţă de acid folic, la pacienţi instituţionalizaţi la

geriatrie, la pacienţii ce consumă mâncare conservată etc.); această soluţie este

atât sigură cât şi ieftină (singura reacţie adversă a fost observată la epileptici).

73