7/30/2019 lp9

1/20

VECTORII FOLOSII N BIOLOGIAMOLECULAR

Descrierea unui plasmid i a unui fagemid

Plasmidelei fagemidelese dezvolt n bacteriii sunt foarte frecvent utilizate pentrumanipularea fragmentelor de gene indiferent deorganism ca urmare a utilizrii enzimelor derestricie, PCR i a clonrii moleculare.

Un plasmid este o molecul de ADN dublucatenar circular, extracromozomial, capabilde a se replica, independent de cromozomulbacterian, ntr-o celuli de a fi transferat la o

altcelul la alta.

7/30/2019 lp9

2/20

Aceste plasmide sunt molecule mici de 3-10Kb.

Plasmidele utilizate n ingineria genetic au fostmodificate.

Conin o regiune de replicare (regiuneaprincipal), una sau mai multe gene derezisten (la antibiotice de ex. care permitselectarea bacteriilor care au integrat acestplasmid) i un situs de policlonaj.

Situsul de policlonaj este o secven de ADNconstituit dintr-o succesiune de secvenerecunoscute isecionate de diferite enzime de

restricie.

7/30/2019 lp9

3/20

7/30/2019 lp9

4/20

Fagemidelesunt molecule hibride dintre un plasmid iun fag.

Sunt molecule de ADN bicatenar circulare care pot fiobinute sub formmonocatenar n anumite condiii.

Ele posed origine a replicrii, cel puin o gen derezisten la antibiotice, un sit de policlonaj i o

secven provenit de la fagul M13 care permiteobinerea formei monocatenare.

n general, promotorii de ARN polimeraz au fostintrodui n amonte sau n aval de situsul de policlonajpentru a produce ARNm prin transcrpiein vitro.

Fragmentele de ADN de cteva Kb pn la 10 Kb potfi introduse n aceti vectori.

7/30/2019 lp9

5/20

Descrierea unui bacteriofag i a unui cosmid

Bacteriofagii i cosmidele sunt utilizai la fel ca

i plasmidele ca vectori de clonaj ndeosebipentru a realiza bnci.

Ei pot integra fragmente de ADN mai mari

dect plasmidele. Bacteriofagul este un virus cu tropism

bacterian.

Cel mai utilizat este bacteriofagul care are50 Kb ADN bicatenar, dar liniar, prezintextremiti coezive (secvene cos) care-i permit

s se circularizeze n caz de infecie.

7/30/2019 lp9

6/20

Fagul (A); fagul T4 (B)

7/30/2019 lp9

7/20

Cosmidele sunt vectori hibrizi de talie micavnd caracteristicile plasmidului (originilereplicrii, gena de selecie)i a unui bacteriofag (secvena cos necesarncapsidrii ADN-ului n particulele fagice).

Fragmentele de ADN exogen introduse n

cosmid ntre dou situsuri cos trebuie s aibdimensiunea de 35-50 Kb.

Astfel dup legarea unui cosmid n prealabil

linearizat i a unui fragment de ADN, strin demrimeconvenabil, ADN recombinant poate fi

ncapsidat i apoi utilizat pentru a infecta

bacterii.

7/30/2019 lp9

8/20

Odat ptruns n bacterie cosmidul se replic ca unplasmid deoarece nu posed genele fagului pentruproducerea de noi particule fagice.

Cosmidele sunt vectori utilizai pentru construireabncilorde ADN genomic.

Aceste bnci sunt mai greu de construit i de meninutdect cele de bacteriofagi.

Bncile de cosmide sunt utilizate cnd mrimea genei

de cercetat este foarte mare peste 20 Kb.

ADN-ul fagic este nvelit ntr-un strat proteic. n cazulinfectrii unei bacterii, particula fagic se fixeaz la

exteriorul acesteea ielibereaz molecula de ADN ninteriorul celulei bacteriene. Echipamentul enzimatic al bacteriei este folosit pentru

transcripia i transducia proteinelor codificate deADN fagului , ndeosebi a proteinelor care constituienveliul proteic sau capsida.

7/30/2019 lp9

9/20

7/30/2019 lp9

10/20

ADN fagic se va replica totodat de un numrmare de ori.

Moleculele de ADN nou sintetizate vor fi ncapsulate

n noi nveliuri de capside fagice sintetizate ninteriorul celulei bacteriene. n acest caz se numescvirioni.

Celula bacterian se va liza i va elibera mii departicule fagice identice cu fagul care a infectatbacteria.

Aceti noi fagi la rndul lor vor infecta bacteriile

vecine. Avantajul unui vector fagic fa de unul plasmidic este

c ADN-ul suaccept un fragment mai mare de ADNexogen (n medie 20 Kb fa de 4 Kb pentru unplasmid).

7/30/2019 lp9

11/20

Totui din cauza mrimii, este mai greamanipularea in vitro a vectorilor fagici

n practic fagii sunt utilizai ca vectori pentruconstruirea bncilorde ADN complementar saugenomice.

Dac genele de cercetat de ADN exogen aufost reperate ele vor fi decupate de enzimelede restricie i fragmentele obinute suntintegrate ntr-un vector plasmidic i fenomenulse numetesubclonaj.

D i i Y

7/30/2019 lp9

12/20

Descrierea unui Yac Cercetrile care vizeaz caracterizarea structurii

genomului n ntregime, necesit utilizarea vectorilorde clonaj care spermitinseria unor fragmente mari

de ADN. Aceasta determin manipularea unui numr restrns

de vectori recombinai pentru descoperirea genomuluintreg.

YaciBACsunt vectori care accept fragmente maride ADN. Cuvntul Yac provine de la Yeast ArtificialCromozom sau cromozomul artificial de drojdie.

Yac-urile sunt vectori construii din secvene de ADNcromozomial al levurilor (drojdiilor).

Ei posed o origine de replicare (ARS), un sitcentromeric (CEN) i secvene telomerice (TEL),care le permit ca s se comporte ca un cromozomatunci cnd sunt introduse sub formliniar ntr-o

levur.

7/30/2019 lp9

13/20

De asemenea prezint:

mai multe gene de selecie care codific enzimele cepermit selectarea levurilor care au ncorporat un

vector viabil (TRP1, URA3); un sit de clonaj unic, situat pe gena SUP4, care

permite introducerea ADN strin. Aceasta permitedetectarea unui vector recombinat.Aceti vectori suntintrodui n levur.

Fragmentele foarte mari de ADN exogen 150-1000 Kbpot fi introduse n Yac.

La ora actual cele mai mari inserii clonate aumrimea de 2900 Kb. Aceti vectori sunt instrumentede alegere pentru analiza genomurilor complexe nparticular a celui uman, dar i pentru cartagrafiereagenelor.

7/30/2019 lp9

14/20

Pentru clonajul fragmentelor mari de ADN semai folosesc Bac (Bacterial Artificial

Cromozome) sau fagul P1. Aceti vectori sunt capabili ca i Yac s

ncorporeze fragmente mari de ADN. Ei se

comport ca i plasmidele de mrime foartemare, darse manipuleaz ca bacteriofagi detip I.

BAC sunt frecvent utilizate. n clonajul ADNsunt cele mai sigure i eficace n E.coli dect

n levuri. Mrimea fragmentelor integrate nudepete300 Kb.

7/30/2019 lp9

15/20

CLONAJUL MOLECULAR

Clonajul const n inseria unui fragment de ADNexogen ntr-un vector (plasmid, fagemid, bacteriofag,

cosmid, YAC, BAC).Principiul metodei:

Vectorii de clonaj (de exemplu plasmidele) suntdecupai prin enzime de restricie recunoscute de un

situs unic (n general situat n situsul de policlonaj). Vectorul dup secionare este liniarizat i posed la

fiecare extremitate o parte din secvena de ADNrecunoscut de enzima de restricie.

ADN exogen organismului donator, este digerat deaceeaienzim de restricie ca i cea utilizat pentruliniarizarea vectorului; diferitele fragmente obinuteposed deci la cele dou extremiti n mod egal oparte din secvena de ADN recunoscut de enzima de

restricie.

7/30/2019 lp9

16/20

Atunci cnd plasmidul linearizat i fragmentelede ADN donator sunt confruntate, se realizeazhibridizarea extremitilor coezive

complementare (formndu-se legturi de H),urmtoarele fiind adugate pe baz decomplementaritate (AT, GC).

Se adaug o enzim care permite formareaunor legturi covalente ntre aceste fragmentede ADN hibridizat.

Aceasta este o ADN ligaz, care realizeazlegturi fosfodiesterice ntre extremitilecoezive ale fragmentului ADN exogen i ale

plasmidului (5P i 3

OH) devenite adiacente.

7/30/2019 lp9

17/20

Plasmidul obinut este din nou circular, esterecombinant pentru c a integrat o inserie.

Dac ADN plasmidic i inseria sunt digerate printr-o

singur enzim de restricie, inseria poate s seintegreze cu douorientrintmpltoare, fie cu 3 fiecu 5. Va trebui determinat sensul de inserie.

Inseria se poate integra n dou sensurintmpltoare, fie 3 fie cu 5. Va trebui determinatsensul de inserie a fragmentului secvenializndplasmidul recombinant.

n clonajul realizat dup secionarea cu o singurenzim de restricie se pot produce dou tipuri de

legri: legarea la plasmid a moleculei de inserat saurecircularizarea plasmidului pe el nsi frinserie.

Aceastultim posibilitate este frecvent de aceea seurmrete dirijarea legriiinseriei.

7/30/2019 lp9

18/20

n scopul favorizrii inseriei fragmentului deADN strini deci dembogire a populaiei cuplasmidele recombinate, recircularizarea

vectorului pe el nsi este mpiedicat printratamentul cu fosfataza alcalin. Grupurile fosfat prezente la extremitata 5P din

vectorul liniarizat sunt eliminate de fosfatazaalcalin. Ligaza nu poate s catalizeze formarea de

legturi fosfodiesterice ntre dou

extremiti defosforilate ale plasmidului. Ea poate s catalizeze legtura ntre o

extremitate defosforilat a plasmidului i o

extremitate fosforilat a inseriei.

7/30/2019 lp9

19/20

Cazurile mai puin favorabile se pot ntlni atuncicnd plasmidul i fragmentul de ADN strin suntsecionate prin enzime derestricie, genernd capete

drepte. Principiul este acelai, dar eficacitatea legturii esteredus. Totui avantajul acestei metode este de apermite legarea oricrei extremiti chiar dac ea nu

posedsecvene complementare. Acesta este cazul pentru clonarea n plasmide a

fragmentelor de ADN obinute prin PCR. n cazul unui clonaj realizat prin capete drepte, inseria

unui fragment de ADN exogen poate avea loc cudouorientri la ntmplare. Va trebui determinat sensul inseriei fragmentului n

secvenializare, de exemplu a plasmidelor

recombinante.

7/30/2019 lp9

20/20

Dac vectorul, n situsul de policlonaj i ADN-ulexogen, nu a fost digerat de aceeai enzim derestricie i nu posed extremitile drepte sau

compatibile, este indispensabil de a se creaextremitile drepte pentru a insera ADN exogen nvector.

Acest lucru se realizeaz prin aciunea unei ADN

polimeraze care completeaz, prin adugareanucleotidelor la extremitile 5 P a protuberanei.Prin activitatea enzimei 3 -5 exonucleaz serealizeaz ajustarea extremitii 3 protuberante.

n unele cazuri fragmentul ADN de digerat i plasmidulsunt digerate fiecare prin 2 enzime de restriciediferite. n acest caz, clonajul este direcionatdeoarece integrarea inseriei se realizeaz ntr-un

singur sens