Laborator nr. 5Cultura de suspensii celulare: monitorizarea culturilorhttp://www.botany.unimelb.edu.au/botanyunimelb/1pages/research/labs/crc/foodgums.html

Control bun al culturiise verific:temperaturapH-ulconcentraiile diferitelor componente/metaboliicantitatea de gaze dizolvatenumrul celulelor/unitatea de msur din suspensie

Obiectivul principal n culturile de suspensii celulare = - obinerea nr. ct mai mare de celule sau- cantitate ct mai mare de metaboliiMonitorizarea curbei de cretereFuncie de nr. de celule din suspensie avem:

- faza de adaptare (lag) - adaptarea celulelor (1)- faza de cretere exponenial - dublarea nr. de celule (2)- faza de platou - sinteza metaboliilor secundari (3)- faza de senescen - celulele degenereaz (4)Aprecierea cantitativ a celulelor

Aprecierea cantitativ a celulelorSe face n funcie de:

- numrul celulelor sau - masa celulelor sau - volumul celulelorNumrarea celulelor - manual (hemocitometru) - automat (flowcitometre)Masa celulelor - n stare proaspt - uscateCntrire (exprimat n g/l, n raport cu volumul mediului de cultur)Volumul celulelor - n raport cu volumul mediului de cultur, exprimat n procente (sedimentare forat prin centrifugare)

Numrarea celulelor cu ajutorul hemocitometruluiLam de sticl1 mm2Se numr celulele din 5 ptrate cu suprafaa de 1 mm2, n ordinea indicat de sgeiNu se numr celulele n contact cu linia inferioar i cea din dreaptahttp://www.wisc.edu/ansci_repro/lab/procedures/hemacytometer/Hemocytometer%20use.htmlhttp://openwetware.org/wiki/BE.109:DNA_engineering/Restriction_map_and_tissue_culturehttp://www.biocompare.com/technicalarticle/673/The-QIAGEN-Guide-To-Animal-Cell-Culture---5-from-QIAGEN.htmlacademy.d20.co.edu/.../ptc/images/protoplast.gif

Numrarea celulelor cu ajutorul hemocitometruluiN=n*s*f*104pN = numrul de celule ntr-un mln = nr. de celule numrates = suprafaa ptratului n care s-a efectuat msurtoarea, exprimat n mm2f = factorul de diluiep = numrul de ptrate n care s-au numrat celulele

Msurarea volumului celulelor compactate - Se introduc 10 ml de suspensie celular ntr-un tub de centrifug gradat - Se centrifugheaz 3 minute la 1000 rpm - Se citete volumul de celule sedimentateV % = volumul celulelor compactate, exprimat n procenteV1 = volumul de suspensie utilizatV2 = volumul celulelor compactate citit

Msurarea masei celulare proaspete- Se cntrete un tub de centrifug gol i se noteaz masa - Se introduc 10 ml de suspensie celular n tubul de centrifug cntrit - Se centrifugheaz 3 minute la 1000 rpm - Se ndeprteaz supernatantul i se cntrete din nouM(g/l) = (g2-g1)*1000VM(g/l) = masa celulelor proaspete, exprimat n grame/litrug1 = masa tubului de centrifug golg2 = masa tubului dn centrifug mpreun cu celuleleV = volumul de suspensie utilizatMsurarea masei celulare uscateAceeai metod ca mai sus, numai c se ndeprteaz supernatantul dup centrifugare i se cntrete dup ce a fost inut n etuv 1 or la 80C

Determinarea viabilitii celulare - metode colorimetrice Testul FDA (fluorescein diacetat)FDA - compus nefluorescent - traverseaz numai membrana celulelor vii - celulele moarte - roii Vizualizarea - sub incidena razelor UV

Bibliografie:Micropropagarea ndrumtor practic, Corina Ctan, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, 2005Biotehnologii celulare, Corina Ctan , Ed. AcademicPres, Cluj-Napoca, 2005http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/cellcounting.htmlhttp://everything2.com/index.pl?node_id=1122202

http://ausubellab.mgh.harvard.edu/picturehtml/pic14.html