4.10. Tehnica de separare a acizilor nucleici prin electroforeza orizontala (de tip submarin)

Separarea ADNului prin electroforeza

Electroforeza in geluri de agaroza reprezinta metoda standard de analiza a acizilor

nucleici. Deplasarea moleculelor se face in prezenta unui curent electric (acizii nucleici sunt incarcati negativ datorita prezentei gruparilor fosfat si migreaza spre electrodul incarcat pozitiv). Mobilitatea electroforetica este influentata de urmatorii factori: concentratia de agaroza, conformatia moleculei de ADN (monocatenar, bicatenar sau superrasucit), prezenta compusului fluorescent in gel, tamponul utilizat, tipul de agaroza si voltajul aplicat.

Tehnica se foloseste pentru determinarea puritatii ADNului sau ARNului, la verificarea existentei produsilor rezultati in urma PCRului (reactie de polimerizare a nucleotidelor) sau la analiza fragmentelor rezultate dupa clivarea enzimatica (cu ajutorul enzimelor de restrictie) a ADNului. Fragmentele analizate pot avea marimi intre 1000 si 23000 pb (pb-perechi de baze). Unul dintre avantajele acestei tehnici este acela ca ADNul nu este denaturat, pastrandu-si intacte elementele structurale. Pentru a evita fragmentarea ulterioara a ADNului manipularea trebuie facuta in asa fel incat sa se evite contaminarea cu amprente, picaturi, sauliva sau microorganisme. Din acest motiv se prefera utilizarea de materiale sterile (varfuri, etc).

Cele mai folosite sisteme tampon (pH 8) pentru electroforeza in geluri de agaroza sunt: TAE (Tris-acetat 40 mM, EDTA 1 mM), TBE (Tris- borat 45 mM, 1 mM EDTA), TPE (Tris-fosfat 90 mM, EDTA 2 mM). Solutiile tampon pentru electroforeza se pastreaza sub forma unor stocuri concentrate (10X-50X) si pastrate la temperatura camerei.

Tamponul de incarcare are in componenta un colorant (albastru de bromfenol sau rosu de crezol 0,25%) care permite vizualizarea frontului de migrare si zaharoza (40%) sau glicerina (30%) pentru a asigura o vascozitatea corespunzatoare la aplicarea probei.

Benzile sunt vizualizate cu compusi fluorescenti (bromura de etidiu sau SYBR Green) prin iradiere cu lumina UV. Sensibilitatea variaza intre 100 pg si 1 ng/banda. Datorita faptului ca acesti coloranti se intercaleaza intre bazele ADNului dublu catenar, sensibilitatea detectiei depinde de lungimea lantului acizilor nucleici.

Mod de lucru

Se toarna gelul (0,3-3% agaroza in TBE; TBE-tampon) in camera de separare; in prealabil se plaseaza doua distantatoare din material plastic care permit delimitarea gelului;

Se incalzeste amestecul timp de 60 sec la microunde; Se raceste solutia la 50C (temperatura este controlata cu ajutorul unui termometru

digital) si se adauga 0,5 l bromura de etidiu 1 mg/ml (substanta fluorescenta care

complexeaza in special cu ADNul duplex permitand vizualizarea fragmentelor de ADN separate); Atentie! Bromura de etidiu este un compus neurotoxic! Se manipuleaza numai folosind manusi!

Se aseaza pieptanul la o distanta de 1 cm de camera in care se afla asezat electrodul incarcat negativ, dupa care toarna amestecul racit la 50C si se asteapta cca 20 min., timp in care gelul se solidifica;

Se indeparteaza distantatoarele din plastic si piaptanul. Se acopera gelul cu solutie tampon (TBE) aproximativ 2-3 mm. Se aplica probele de analizat (preparate cu solutie tamponului de incarcare) si probele

de referinta (amestec de molecule de ADN cu dimensiuni cunoscute – solutie standard 100 pb si 1 Kb)

Se migreaza probele timp de 40 min la 90V si 75 mA. Se indeparteaza solutia tampon, se vizualizeaza benzile separate prin excitare la 254

nm (la intuneric). Fragmentele de ADN separate pot fi eluate prin taierea gelului si utilizate pentru

purificare sau digestie (cu enzime de restrictie) sau pot fi transferate pe membrane (tehnica Southern blot).

Gelurile pot fi redizolvate la cald in tamponul de migrare si reutilizate de 5-6 ori.

Intrebari: 1. Electroforeza este:

a) procesul de separarea a fragmentelor ADN; b) procesul de adaugare de noi nucleotide la ADN cu ajutorul campului electric; c) procesul de replicare al fragmentelor de ADN in camp electric; d) nici un raspuns.

2. Ce se intampla cu lanturile de ADN de aceeasi lungime: a) se deplaseaza cu aceeasi viteza si se plaseaza in zone diferite; b) se deplaseaza cu aceeasi viteza si se grupeaza in aceeasi zona; c) se deplaseaza cu viteze diferite si se grupeaza in aceeasi zona; d) nu se deplaseaza.

3. Ce compus este utilizat pentru developarea gelurilor in care se separa fragmente de ADN: a) agaroza; b) poliacrilamida; c) glicerina; d) bromura de etidiu.

4. Electroforeza poate fi aplicata pentru separarea: a) Lipidelor; b) Proteinelor; c) Zaharurilor.

5. Un amestec de proteine este supus electroforezei (in conditii native sau denaturante) inaintea folosirii tehnicii Western Blot. Ce metoda electroforetica se foloseste in scopul localizarii complecsilor proteici? Dar in situatia detectiei unei singure proteine?

6. Din ce motive se utilizeaza albastru de bromfenol la electroforeza acizilor nucleici? 7. Un fragment de ADN liniar a fost taiat cu o enzime de restrictie. Tinand cont de faptul ADNul

are doua situsuri de legare susceptibile la clivarea cu aceasta enzima identificati numarul de fragmente separate prin electroforeza dupa clivare.

Bibliografie:

1. Rickwood D, Hames BD (eds.) (1984) Gel electrophoresis of nucleic acids:a practical approach. IRL Press, Oxford.

2. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989)Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., vol. 1, chap. 6, Cold SpringHarbor Laboratories Press

3. Jany K-D, Hahn H (1991) In: Bertram S, Gassen G (eds.) Gentechnische Methoden. pp. 39–43. Fischer, Stuttgart.

4. Westermeier, R. (2005), Electrophoresis in practice, 4th ed., Willey, Weinheim, Germany. 5. http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/analysis2.html 6. http://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html