8/13/2019 Lab3 Influenta Ph Ului Asupra Vitezei de Reactie

1/4

Introducere n laboratorul de biochimie148

6.1.2. Determinarea activit ii catalazei. Influena pH-ului,temperaturii i a t riei ionice asupra vitezei de reacie

Peroxidul de hidrogen (H2O2) este un agent oxidant nociv, produsde corpul uman n urma oxid rii acizilor gra i sau n cazul n carecelulele albe sangvine atac bacteriile care pot avea efecte negativeasupra metabolismului celular. Catalaza este prezent ntr-o varietate desurse: plante (fructe), carne sau ficat. De asemenea catalaza poate fiutilizat la identificarea bacteriilor. Dat fiind faptul c aceast enzimnu este prezent n streptococi, dar este prezent n stafilococi, aceast

enzim poate fi utilizat la diferenierea dintre aceste specii. Catalaza seafl n concentra ie foarte mare n organitele celulare (ale plantelor sauanimalelor) numite peroxizomi i protejeaz astfel celula fa deperoxidul de hidrogen, compus care poate fi convertit n radicalihidroxil i implicit s creeze mutaii genetice. Catalaza utilizeaz deasemenea apa oxigenat n scopul de a oxida o serie de compu i toxici,incluznd fenoli, acidul formic, formaldehida sau alcoolii.

M surarea vitezei reac iei enzimatice se poate face direct (cuajutorul unui electrod de oxigen) sau indirect. n acest experiment,viteza de reac ie este m surat indirect. Pentru determinarea vitezei dereac ie se utilizeaz o hrtie de filtru care este acoperit cu enzima iapoi imersat ntr-o solu ie de substrat (ap oxigenat ). Enzima

(catalizatorul biochimic) m re te viteza de descompunere a apeioxigenate n ap i oxigen, iar moleculele de gaz formate constituiefor a motrice de deplasare a hrtiei de filtru de la baza tubului lasuprafa . Timpul necesar hrtiei de filtru pentru a parcurge aceastdistan (de la baz la suprafa ) este un indicator al vitezei reac ieienzimatice.

Viteza de reac ie =n l imea lichidului din vas (mm) / timp (s)

Aparatura i materialele necesare:- aparat cu ultrasunete;- pH-metru;- tuburi din plastic cilindrice;

- penset ;- cronometru de laborator;- un cartof, m r sau de preferat cantitate mic de ficat;

8/13/2019 Lab3 Influenta Ph Ului Asupra Vitezei de Reactie

2/4

Activitatea enzimatic 149

- plnie i hrtie de filtru;- centrifug .Reactivi:- acetat de sodiu 20 mM pH=5- fosfat de sodiu 20 mM pH=7- borat de sodiu 20 mM pH=9- glicin 20 mM pH=11

Aten ie catalaza este stabil la temperatura redus (dup obinere

extractul se p streaz pe ghea ) i la pH 7!

Modul de lucruntr-un pahar Berzelius sau un tub de plastic de 50 ml se cnt resc

2 g de ficat. Se taie m runt ficatul i se resuspend n 10 ml solu ietampon fosfat 20 mM pH 7. Se p streaz amestecul omogen pe gheai se supune ultrasonic rii timp de 30 de secunde. Se repet procedeul

de 3-5 ori cu pauze de un minut. Dup sonicare se pipeteaz cte 1 mln dou tuburi Eppendorf i se centrifugheaz amestecul 5 min la 10000rotaii pe minut (rpm). Se pipeteaz supernatantul (partea superioar dintub) i se folose te extractul (se p streaz pe ghea !) pentru experi-mentele ulterioare.

Dilu ia enzimeise va face n trei serii (1:100, 1:200, 1:500). Se vam sura viteza reac iei enzimatice pentru fiecare dilu ie. Cu ajutorulunui perforator se obin rondele de hrtie de filtru. Se va imersa unadintre rondele n solu ia care conine enzima diluat . n paralel seprepar ntr-un tub solu ia cu ap oxigenat 1% n tamponul pH 7(n l imea solu iei va fi de 40 mm). Se imerseaz hrtia de filtru, care afost mbibat n solu ia enzimei, n tubul cu substrat (apa oxigenat ) ise m soar timpul parcurs de rondeaua de hrtie de la baz pn lasuprafa a lichidului. Se repet fiecare determinare de 5 ori.

O solu ie de catalaz (100 l) se nc lze te la fierbere 10 min. nparalel se incubeaz la temperatura camerei o solu ie cu acela i volum.Se repet experimentul de mai sus utiliznd o solu ie diluat (1:100) i

se compar viteza de reac ie ob inut n cele trei experimente.

8/13/2019 Lab3 Influenta Ph Ului Asupra Vitezei de Reactie

3/4

Introducere n laboratorul de biochimie150

Se efectueaz determin rile de activitate folosind o dilu ie 1:500pentru enzim i concentraii diferite pentru ap oxigenat (0,5; 1respectiv 2%). Se noteaz timpul de reac ie.

Se efectueaz determin rile de activitate folosind o dilu ie 1:500pentru enzim i valori diferite de pH (5, 7, 9, 11). Se reprezint graficviteza de reac ie n func ie de pH.

Se efectueaz determin ri de activitate folosind o dilu ie 1:200, 1%ap oxigenat i concentraii diferite de clorur de sodiu (0, 2, 10%NaCl n aceea i solu ie tampon). Se reprezint grafic viteza de reac ie

n func ie de concentraia de NaCl (t ria ionic a solu iei).Op ional se poate compara viteza reac iei (la pH 7 i dilu ie 1:100)catalizat de enzima extras din diverse surse: drojdie uscat , cartof,ficat. Procedeul de extracie din toate sursele va fi identic.

ntreb ri:a) Care este rolul catalazei n organism?b) Ce efect are temperatura asupra activit ii enzimatice?c) Cum variaz viteza reac iei enzimatice n func ie de dilu ie?d) Cum variaz viteza de reac ie n func ie de concentraia

substratului?e) Ce efect are pH-ul asupra activit ii enzimatice?f) Ce efect are concentraia s rii asupra activit ii enzimatice?Bibliografie:1. Forbes, B.A., Sahm, D.F. i Weissfeld, A.S. (2007) Bayley and

Scotts Diagnostic Microbiology (Editia a 12-a), Weissfeld.2. Cojocaru, D.C. (2009) Enzimologie practic , Editura Tehnopress,

Ia i.3. Dogan, T. (2008) The effects of hydrogen peroxide, gallic acid and

resveratrol on growth and catalase production of Aspergillusfumigatus, Master thesis, Middle East Technical University.

4. Eisenthal, R. i Danson, M.J. (2002) Enzyme assays: a practicalapproach (2nd ed), Oxford University Press Inc., New York, US.

5. Goldberg, D.T. (2007) Barron's AP Biology. (2nd ed), New York,NY:Barron's Educational series.6. Cordts, M., Ridenour, N. i Hickey, M.K. (2008) The Properties ofEnzymes: A study of catalase, Cornell University.

8/13/2019 Lab3 Influenta Ph Ului Asupra Vitezei de Reactie

4/4

Activitatea enzimatic 151

7. http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/catalase_lab.html8. http://www.horton.ednet.ns.ca/staff/jfuller/selig/labs/bio12ap_adv/Ca

talase_paperdiscs.pdf.9. http://www.explorebiology.com/documents/03LabEnzymeCatalysis2

004.pdf10. http://www.biologyjunction.com/ap_sample_lab_2_catalysis_2.htm6.1.3. Caracterizarea polifenoloxidazei din bananePolifenoloxidazele sunt enzime responsabile pentru modificarea

enzimatic a culorii (nchiderea culorii) fructelor i vegetalelor care

sunt distruse / por ionate. Polifenoloxidaza din banan catalizeaz oxi-darea diver ilor orto-difenoli la chinonele corespunz toare. Chinonelereactive formeaz la rndul lor n urma unor reac ii neenzimatice pig-menii numi i melanine. Melaninele care apar n plante sunt rezultatulcondens rii o-chinonelor cu aminoacizi, peptide sau proteine.

Partea experimentalExtrac ia enzimeiEnzima activ poate fi extras din pulpa bananei cu ajutorul unui

tampon care conine un agent care are rolul de a proteja enzima deprecipitare n prezena taninurilor.

Toate operaiile se desf oar pe ghea !4 g de fruct (banan ) se taie cu ajutorul unui cu it n buc i de di-

mensiuni reduse i se introduc n 36 ml de tampon (fosfat 0,1 M pH 7;r cit n prealabil pe ghea ) care conine 1% Triton X-100 (detergentneionic). Omogenizarea se realizeaz cu ajutorul unui aparat deultrasunete (3 ori, 2 min, amplitudinea 50%, 1 s sonicare, 1 s pauz ),dup care se centrifugheaz timp de 10 min la 5000 rpm. Supernatantulse folose te pentru determinarea activit ii enzimatice ulterioare.

Determinarea activit ii enzimaticeActivitatea enzimei se poate determina prin m surarea producerii

chinonelor corespunz toare. Astfel, dac pentru dopamin (10 mM) seurm re te formarea 2,3-dihidroindol-5,6-chinonei, un produs de culoarero ie (470 nm), pentru orto-difenol (10 mM) nesubstituit activitatea sem soar la 412 nm (coloraie galben -portocalie). Activitatea catalitic

se nregistreaz timp de 2-3 min la 25 C. n general, dilu ia enzimeieste de 1:20. n cazul m sur torilor de activitate este necesar