- 1 -

DETERMINAREA CONŢINUTULUI TOTAL DE ANTOCIANI

METODA PRIN VARIAŢIE DE PH

Principiul metodei

În mediul acid, există un echilibru între formele colorate şi formele incolore ale

antocianilor. Acest echilibru este în funcţie de pH. Variaţia intensităţii colorante între

două valori de pH este proporţională cu conţinutul de antociani. Se alege pH = 0,6 şi

pH = 3,5. Prin această variaţie, funcţia fenolică nu este afectată şi se admite că

ceilalţi compuşi fenolici (taninuri) de asemeni nu intreferează cu determinarea.

Aparatură şi materiale

- spectrofotometru care să permită citiri la 520 nm;

- cuve de sticlă de 5 şi 10 mm;

- baloane cotate de 50 şi 100 cm3;

- vase conice de 50 şi 100 mL,

- pipete gradate şi cotate de 1; 2; 5 şi 10 ml;

- hârtie de filtru.

Reactivi

- soluţie cu pH = 0,6 (soluţie de HCl 2 % (v/v) - 20 mL HCl conc. se dizolvă în

1000 mL apă distilată);

- soluţie tampon cu pH = 3,5 (tampon citrat-fosfat) preparat astfel:

Într-un balon cotat de 1000 mL se introduc: 151 mL soluţie de fosfat disodic

0,2 M (71,7 g/L Na2HPO4 · 12 H20 sau 53,65g/L Na2HP04 · 7H20); 349 mL

soluţie de acid citric 0,1 M (19,21 g/L C6H8O7). Se amestecă şi se completează

la semn cu apă distilată.

- soluţie alcoolică de 0,1 % HCl (0,1 mL HCl concentrat se amestecă cu 100 mL

alcool etilic de 96 % vol (v/v)).

Modul de lucru

În două vase conice de 100 mL se introduc:

− -în vasul 1 ce constituie proba: 1 mL vin, 1 mL soluţie alcoolică de 0,1 % HCl,

1.0 mL soluţie cu pH = 0,6 (soluţie de HCl 2 % (v/v)).

- 2 -

− -în vasul 2 ce constituie martorul: 1 mL vin, 1 mL soluţie alcoolică de 0,1 % HCl,

10 mL soluţie tampon cu pH = 3,5.

Se măsoară absorbanţa (densitatea optică) la 520 nm atât pentru proba cât şi

pentru martor cu o cuvă de sticlă de 10 nm (l cm) traseu optic în comparaţie cu apă

distilată.

Observaţii:

1. Pentru deblocarea antocianilor din combinaţiile cu bioxidul de sulf se

procedează astfel:

− se prepară o soluţie alcoolică de acetaldehidă 10 % (10 mL acetaldehidă c.p. se

amestecă cu 90 mL alcool etilic de 96 % vol (v/v)) care se lasă în repaos timp de

1 oră;

− la 20 mL vin de analizat se adaugă 3 mL soluţie alcoolică de acetaldehidă 10 %

şi se lasă în repaos 20 minute;

− se prelevează pentru analiză câte 1 mL de vin tratat ca mai sus, iar valoarea

absorbanţelor citite la spectrofotometru se înmulţeşte cu raportul de diluţie 1,15.

2. Pentru vinurile foarte colorate, se va lucra cu cuve de 2 sau 5 mm, traseu

optic.

3. Pentru a se evita erorile de analiză trebuie ca absorbanţele citite să aibă

valori cuprinse între 0,3 şi 0,8.

Calculul şi exprimarea rezultatelor

Exprimarea conţinutului de antociani în mg/L se face cu ajutorul metodei

curbei de etalonare trasată pe baza datelor prezentate în tabelul 2.

Datele din tabelul 1 se înscriu într-un sistem de două axe coordonate astfel

(figura 2):

− în abscisă conţinutul de antociani în mg/L;

− în ordonată (coordonată) diferenţa dintre absorbanţele (A520 probă - A520 martor)

corespunzătoare fiecărei concentraţii de antociani.

Unind punctele coorespunzătoare fiecărei perechi de date se obţine curba de

etalonare care este o dreaptă care trece prin originea axelor coordonate.

Ecuaţia acestei drepte este descrisă de ecuaţia de gradul I de forma:

y = 386,15 · x - 1,3713

în care:

y - conţinutul de antociani, mg/L;

x - valoarea diferenţei de absorbantă. (A520 probă - A 520 martor).

Prin raportarea diferenţei de absorbanţă(A520 probă -A520 martor) la curba de

etalonare se obţine conţinutul de antociani, în mg/L. Exemplu:

A520 (probă) A520 (martor) Diferenţă A520 probă –

A520 martor Antociani,

mg/L 0.082 0.021 0.061 25 0.163 0.037 0.126 50 0.234 0.051 0.183 73 0.543 0.108 0.435 170 0.867 0.173 0.694 270 1.200 0.230 0.970 375

Tabelul 1 - Conţinutul de antociani în funcţie de diferenţa de absorbanţă (A520 probă - A520 martor)

Antociani, mg/L

Figura 2 – Conţinutul de antociani în funcţie de diferenţa de absorbanţă(A520 probă – A520 martor)