1

Ingineria proceselor chimice şi biologice/12

Departamentul Ingineria şi Managementul Mediului

Universitatea Tehnică “Gheorghe Asachi” din IaşiFacultatea de Inginerie Chimică şi Protecţia Mediului

2

Cinetica reacţiilor enzimatice

Enzimele au rol de catalizator şi intensifică viteza de reacţie, dar nu afectează echilibrul termodinamic.

Reacţiile catalizate de enzime utilizează exact aceiaşi reactanţi (substrat) şi generează exact aceleaşi produse ca şi reacţiile necatalizate. Ca şi catalizatorii convenţionali, enzimele nu alterează poziţia echilibrului între reactanţi şi produse de reacţie.

În reacţiile catalizate enzimatic însă, constanta de viteză kpoate fi cu câteva ordine de mărime mai mare decât în cazul reacţiilor necatalizate.

3

Reactia necatalizata (in absenta enzimelor)

Reactia catalizata (in prezenta enzimelor)

Continutul energetic al produsilor de reactie

Continutul energetic al reactantilor

4

Enzimele se caracterizează prin două proprietăţi cinetice importante:

• cât de rapid se pot satura cu un anumit substrat• care este viteza maximă a transformării enzimatice pe

care o pot asigura

Aceste proprietăţi depind de condiţiile de reacţie.

Reacţia enzimatică se desfăşoară pe măsura saturării enzimei cu substrat, dar viteza de reacţie nu are un profil liniar cu creşterea cantităţii de substrat. Dacă viteza iniţială a reacţiei se măsoară pe un anumit domeniu al concentraţiei substratului (notată cu [S]), viteza de reacţie v va creşte dacă [S] creşte.Totuşi, pe măsură ce [S] devine mai mare, enzima se saturează cu substrat şi viteza reacţie atinge un maxim, vmax .

5

Concentratia substratului [S] (mol/L)

Viteza maxima, vmax (1/L.s]

Viteza initiala de reactie, v (1/L.s)

Enzima este saturata, concentratia substratului este mult mai mare decat cea necesara enzimei

6

Prima treaptă în reacţiile catalitice enzimatice este formarea complexului enzimă-substrat (ES).Complexul este stabil datorită formării legăturilor de hidrogen, a forţelor van der Vaals şi a unor interacţiuni de natură ionicădintre enzimă şi substrat.

Acestea sunt consecinta apariţiei interacţiunilor intermoleculare şi intramoleculare între enzimă şi substrat.

Produsele de reacţie odată formate sunt puse în libertate atunci când disociază complexul enzimă-produs (EP).

Pentru majoritatea enzimelor viteza de reacţie poate fi descrisă de ecuaţia Michaelis – Menten, formulată în 1913.

Cinetica reacţiilor enzimatice este analizată după modelul propus de Michaelis - Menten.

7

Cinetica reacţiilor enzimatice cu un singur substrat

Această ecuaţie oferă o expresie pentru a descrie viteza unei reacţiienzimatice şi este fundamentală pentru interpretarea modului în care o enzimă reacţionează cu un substrat.

O relaţie între concentraţiile enzimei şi substratului a fost propusă în 1903 de către Victor Henry.

Ecuaţia Michaelis - Menten în ipoteza stării staţionare (particularizată de Briggs - Haldane)

8

Ulterior, în 1913, Leonor Michaelis şi Maud Menten au propus o interpretare a mecanismului reacţiilor enzimatice la nivel microscopic, pornind de la studiile lui Archibald Hill.

Conform acestui mecanism, enzima (catalizatorul) şi substratul (reactantul) sunt într-un echilibru, cu un complex, enzimă-substratES, echilibru care se stabileşte rapid.

Maud Menten

(1879–1960)Leonor Michaelis

(1875–1949)

9

Se consideră cea mai simplă schemă de reacţie între o enzimă şi substrat:

(1)

treapta de formare a

complexului enzimă-substrat

treapta catalitică

10

enzima libera +substratul liber

complexul enzima-substrat complexul enzima-produs

enzima libera +produs liber

11

Conform acestui mecanism, enzima (catalizatorul) şi substratul (reactantul) sunt într-un echilibru care se stabileşte rapid, cu un complex, enzimă-substrat ES. Acesta apoi disociază, formând produsul P şi enzima liberă E

Briggs şi Haldane au studiat mecanismul reacţiilor enzimatice în stare staţionară, când concentraţiile complexului ES nu se modifică.

12

Se presupune că:

• reacţia de disociere a complexului ES este ireversibilă

• produsul P nu interacţionează cu enzima E

• descompunerea complexului ES este reversibilă

• descompunerea complexului ES este treapta limitativă de viteză

• descompunerea complexului ES are loc în regim staţionar, iarconcentraţia produsului ES se poate considera constantă

• în regim staţionar, concentraţia totală a enzimei este mică în raport cu cea a substratului

• întrucât s-a presupus constantă concentraţia complexului ESviteza de variaţie în timp a concentraţiei complexului este zero.

13

Viteza de generare a produsului P, este considerată ca fiind viteza de reacţie v.

dtPd

Viteza de reacţie v depinde de constanta vitezei de conversie k2 care mai poartă numele şi de constanta reacţiei catalitice kcat

Deoarece concentraţia [ES] este greu de determinat în mod curent, ea se exprimă în funcţie de parametri cunoscuţi ai sistemului, adică [E] şi [S] adăugate iniţial.

14

Deoarece complexul ES s-a format pe un singur drum chimic, dar se poate descompune prin două, atunci ecuaţia cinetică va fi următoarea:

0][][][ 211 ESkESkESkdtESd

(2)

(3)

15

Se defineşte constanta Michaelis-Menten astfel:

(4)

Ecuaţia (3) se va putea scrie astfel:

(5)

16

Concentraţia totală a enzimei [E0] este suma dintreconcentraţiei enzimei aflată liberă în soluţie [E] şi cea care este legată sub forma complexului enzimă-substrat [ES] :

[E0] = [E] + [ES]

[E] = [E0] − [ES](6)

17

Atunci, relaţia (5) se poate scrie astfel:

(7)

Prin rearanjarea ec. (7 ) se obţine în final forma (10):

(8)

(9)

(10)

18

Viteza de reacţie este exprimată prin ec. (11):

]ES[kdtdPv 2 (11)

Prin combinarea ec. (10) cu ec. (11) se obţine (ec. 12):

(12)

Din aceste relaţii este evident că în expresiile cinetice, nu este implicat mecanismul de acţiune al enzimei, ci ţine seama de vitezele de reacţie parţiale.

002 rSK

SvSK

SEkdtPd

mmax

m

19

Se pot întâlni două situaţii:

a) la concentraţii mici ale substratului, reacţia este de ordinul 0 în raport cu substratul

m

max

KSvr

0 (13)

b) la concentraţii mari, de saturaţie, a substratului reacţia este limitată de concentraţia enzimei

r0 = vmax (14)

Km - reprezintă concentraţia substratului necesară pentru a atinge jumătate din viteza de reacţie.

20

Reprezentarea grafică a relaţiei dintre viteza de reacţie şi concentraţia substratului în reacţii enzimatice

r0 = vmax

mKSvr

max0

Km

21

Transformări ale ecuaţiei M - M

Sunt transformări grafice şi sunt utile deoarece permit obţinerea valorilor vmax şi Km , dificil de obţinut din experimente.

Aceste transformări sunt linearizări realizate în diferite moduri:

Linearizarea Lineweaver - Burk

SvK

SvS

r max

m

max

0

1(15)

(inversarea ec. Michaelis-Menten)

22

maxmax

m

vSvK

r11

0

(16)

Reprezentarea grafică a 1/r0 în funcţie 1/S

23

Această formă de linearizare prezintă o serie de dezavantaje pentru că erori experimentale mici pot genera erori mari pentru valorile constantei Km determinate grafic în special la valori mici aleconcentraţiei substratului.

Dacă ec. (16) se multiplică cu vmax şi se rearanjează, rezultă forma (17):

maxmo vsrKr 0 (17)

Se poate realiza reprezentarea grafică ro = f(ro/S) cu tăietura la ordonată vmax , panta -Km , şi intersecţia cu abscisa vmax/Km.

24

vmax

ro

tgα = - Km

ro/s0

vmax/Km

25