Ing. Receanu Cristina Monica - usamvcluj.ro · Celulele stem specifice Ńesutului sunt de asemenea...

UNIVERSITATEA DE ŞTIINłE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII

Ing. Receanu Cristina Monica

Cercetări privind utilizarea anticorpilor monoclonali şi policlonali în

evidenŃierea celulelor stem umane neuronale în creierul fetal ovin

(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

CONDUCĂTOR ŞTIINłIFIC

Prof. Dr. Ing. Vlaic Augustin

Cluj-Napoca

2010

INTRODUCERE

Pentru prima data celulele stem au fost izolate din masa celulară internă a

blastocistului şi crescute in vitro . Variante ale acestor tehnici de obŃinere şi cultivare sunt

utilizate şi astăzi în laboratoarele din întreaga lume.

Cele mai importante publicaŃii legate de celulele stem au fost centralizate în anii 2001

şi 2002 de către R. Edwards.

Creşterea embrionului preimplantaŃional in vitro a constituit tema de cercetare a

multor echipe, pioneratul realizându-l Heope în 1980, care a obŃinut produşi de la iepuroaică,

după transferul embrionar la receptoare. (Gottlieb, D.I. and Huettner, J.E., 1999).

Primele cercetări privind cultivarea in vitro a celulelor stem (fig. 1) au fost realizate în

1963, de către J. Paul şi E. Edwards, care au pregătit pentru cultivare un grup de celule din

embrion de iepure preimplantaŃional, în picături de NCTC 109, 199, F10. (Theise, N.D.,

2000).

O celulă stem deŃine două proprietăŃi principale: capacitate de autoreînnoire pe termen

lung fără senescenŃă şi pluripotenŃă şi abilitatea de a se diferenŃia în una sau mai multe tipuri

de celule specializate. Aceste celule pot furniza o sursă inepuizabilă de celule pentru

transplant. Celulele stem totipotente care au abilitatea de a genera toate tipurile de Ńesut joacă

un rol critic în dezvoltarea umană, furnizând materialul pentru dezvoltarea tuturor Ńesuturilor

şi organelor în embrion şi în toate Ńesuturile extra embrionare.

Celulele stem specifice Ńesutului sunt de asemenea depozitate în diferite nişe din corp,

precum măduva osoasă, creier, ficat şi piele, ca un mecanism pentru menŃinerea Ńesutului,

creşterea acestuia şi reînnoirea la maturitate. La început s-a crezut că aceste celule stem adulte

regenerau doar un set foarte restrâns de linii celulare, dar s-a demonstrat cu timpul că au o

plasticitate mult mai mare.

CAPITOLUL I

IMPORTAN łA CELULELOR STEM

Bolile neurodegenerative sunt caracterizate de către deteriorările graduale şi

progresive sau pierderea celulelor nervoase şi a Ńesutului neural. Bolile cunoscute sunt

Alzheimer, Parkinson şi Scleroza multiplă. DisfuncŃiile neurodegenerative afectează peste 22

de milioane de persoane din întreaga lume. Unele tratamente simptomatice au devenit posibile

în ultimii 15 ani, dar încă nu s-a descoperit tratamentul complet al acestor boli.

Sclerozele multiple produc distrugerea treptată a creierului şi a foiŃei de mielină

protectoare a neuronilor coloanei vertebrale cu progres înspre boli ireversibile. Se estimează

că peste 2,5 milioane de persoane de pe Glob suferă de această boală. Acest număr include şi

pe cele 10000 de persoane din România. S-a dovedit că din celulele stem embrionare şi din

cele provenite din surse fetale se pot genera celule neuronale ce pot fi folosite pentru a

înlocui neuronii pierduŃi. Celulele stem mezenchimale dau neuronilor capacitatea de a migra

prin creier şi măduva spinării la locurile din Ńesut unde sunt prezente disfuncŃii sclerotice

1.1.CELULELE STEM - CARACTERIZARE GENERALĂ

Celulele stem sunt celule primare nediferenŃiate, care deŃin abilitatea da a se diferenŃia

în alte tipuri de celule. În această categorie intră atât celulele măduvei osoase şi celulele

sângelui periferic, cât şi celulele embrionare, a căror capacitate de diferenŃiere ajunge până la

200 de alte linii celulare diferite, proprietate care denumită plasticitate evolutivă (Erghelegiu,

Marina, 2005).

Fig.1. DiferenŃierea celulelor stem embrionare (http://www.srsp.net/kassel/images/Pluripotent_Stem_Cells.jpg)

Cercetătorii sunt de părere că terapia cu celulele stem, numită şi medicină

regenerativă, are potenŃialul de a schimba faŃa bolilor întâlnite la om şi animale prin utilizarea

lor la înlocuirea unor Ńesuturi specifice sau dezvoltarea de organe. Terapia cu celule stem se

experimentează, în prezent, în diverse centre medicale din întreaga lume. Există cel puŃin 10-

15 astfel de studii clinice în derulare.

Cea mai importantă aplicaŃie a celulelor stem umane este generarea de celule şi Ńesuturi care

pot fi folosite în aşa numitele ,,cell-based therapies’’ (tratamente pe bază de celule stem).

1.2. CLASIFICAREA CELULELOR STEM

1.2.1. Celule stem embrionare

Celulele stem embrionare provin din blastocişti. Blastocistul reprezintă stadiul de

dezvoltare embrionară preimplantaŃional, când embrionul murin este compus din 150 de

blastomere compactate, dispuse sub formă sferică (Gottlieb, D.I.., 1999).

În stadiul de blastocist, celulele embrionare se împart în celule care formează

embrioblastul (la interior) şi celule care formează trofoblastul (la exterior). Celulele

embrioblastului sunt celule stem pluripotente, deci dau naştere la toate tipurile de Ńesuturi ale

organismului, cu excepŃia celor care alcătuiesc placenta şi învelitorile fetale. Celulele

trofoblastului pot da naştere doar la placentă şi la învelitorile fetale (I. Vintilă, 2005 ).

Celulele stem embrionare [ES], asemănătoare celulelor embrionare germinale [EG],

pot să provină şi din celule germinale primordiale din care se formează ovulele şi

spermatozoizii, putând fi izolate şi cultivate in vitro unde îşi continuă multiplicarea şi îşi

menŃin capacitatea de diferenŃiere (Soria, B.,2000).

.

1.2.2. Celule stem adulte

Celula stem adultă este nediferenŃiată, dar se află într-un Ńesut diferenŃiat. Este

capabilă să se reînnoiască pe toată durata de viaŃă a organismului, dar în acelaşi timp

generează precursori ai Ńesutului diferenŃiat. Sunt celule pluripotente ce pot da naştere la toate

tipurile de Ńesuturi, exceptând placenta şi învelitoarele fetale.

Celulele stem adulte, deşi sunt greu de izolat din diferitele organe şi Ńesuturi şi au o

durată mică de viaŃă, nu dezvoltă tumori, iar probabilitatea rejecŃiei de organism este redusă,

mai ales în cazul pacienŃilor ce primesc celule recoltate din organe şi Ńesuturi proprii.

1.3 SURSELE ŞI CAPACITATEA DE DIFERENłIERE A CELULELOR STEM

SOMATICE PLURIPOTENTE ALE ADULTULUI

În ceea ce priveşte celulele stem embrionare (fig. 2), sursa principală o reprezintă

embrionul aflat în stadiul de blastocist. Pot fi obŃinute din blastocişti (ne)clonaŃi, o sursă

importantă fiind embrionii rezultaŃi prin fecundare ,,in vitro” (Fraichard, A., 1995).

A 2-a sursă sunt celulele rezultate din fecundarea ,,in vitro’’a ovulelor cu

spermatozoizi aflaŃi în ,,bănci de fertilitate’’. Cercetătorii nu sunt nevoiŃi să creeze embrioni

din spermatozoizi şi ovule, pentru că îi pot obŃine de la clinicile de fertilizare.

Uneori cuplurile care încearcă să aibă un copil crează mai mulŃi embrioni, dar nu sunt

toŃi folosiŃi. Aceştia îi pot dona pentru cercetare, altfel vor fi distruşi.

A 3-a sursă sunt celulele stem embrionare create prin SCNT (Somatic Cell Nuclear

Transfer = transfer nuclear de la celule somatice).

Acesta este procesul prin care materialul genetic al unei celule oarecare din corp este

transferat la un ovul enucleat, rezultând deci un ,,embrion’’ obŃinut fără fertilizarea cu ajutorul

unui spermatozoid. Se presupune că de fapt aceasta este o tehnică de clonare, lucru care ridică

multe întrebări în jurul acestui subiect.Clonarea terapeutică reprezintă dezvoltarea embrionilor

pentru a fi utilizaŃi în tratamentul bolilor. Metoda presupune ca informaŃia genetică a unei

celule somatice (de exemplu, o celulă din piele) să fie transferată într-un ovul din care ADN-

ul a fost eliminat.Când ovulul manipulat e pus într-un mediu de cultură, începe să se

multiplice, iar când atinge stadiul de blastocist, cercetătorii izolează şi cultivă celulele stem

din masa interioară.

Ultima sursă sunt fetuşii proveniŃi din avorturi în primul trimestru de sarcină.

Recoltarea celulelor stem adulte este practicată în lumea medicală de mai bine de 30

de ani, cel puŃin în ceea ce priveşte recoltarea lor de la nivelul măduvei osoase (fig. 11). 200 x

109 de hematii sunt create în fiecare zi în corpul uman din celulele stem hematopoetice

(Eglitis, M.A. and Mezey, E., 1997).

De exemplu, doar 1 din 10.000-15.000 de celule din măduva osoasă este celula stem

hematopoietică (formează sângele).

Fig. 2 DiferenŃierea celulelor stem din maduva osoasă http://stemcells.nih.gov/info/basics/basics4.asp

Recoltarea de la nivel sanguin pare să aibă unele avantaje faŃă de recoltarea de la nivel

medular (Ferrari, G., 1998), în sensul că se poate recolta un număr suficient de mare de celule

stem, care să poată susŃine mai multe şedinŃe intense de chimioterapie.

De asemenea, s-a demonstrat că, în caz de daune localizate, celulele stem

mezenchimale primesc semnale, provenite de la Ńesuturile distruse, care pun în mişcare

mecanismele reparatorii (Tavasolli et al., 1991).

Celulele stem mezenhimale şi hematopoietice au fost găsite în sângele din cordonul

ombilical. În studiile experimentale a fost demonstrat, că în timpul de cultivare pe termen

lung a mononuclearelor din sângele ombilical, celulele endoteliale-predecesori sub acŃiunea

anumitor citochine formează în cultură colonii de fibroblaste. (Nieda M., 1997).

CAPITOLUL II

EVIDENłIEREA CELULELOR STEM UMANE CU AJUTORUL ANTICORPILOR, ANTIGENILOR, MARKERILOR ŞI A TEHNICII DE

CITOMETRIE ÎN FLUX CONTINUU -

2.1. ANTICORPII

2.1.1. Caracterizarea generală a anticorpilor

Anticorpii sunt un tip de molecule proteice, fiind cunoscuŃi şi sub denumirea de

imunoglobuline. Există 5 tipuri de imunoglobuline: IgG, IgA, IgD, IgE şi IgM. Anticorpii

sunt produşi de limfocitele B pe calea naturală a exocitozei în ambele forme: plasma

membranară integrală şi secretorie. Ei formează receptorul specific antigenului celulelor B.

Anticorpii se găsesc în plasmă şi lipi Ńi de receptorii specifici ai regiunii invariabile ai

imunoglobulinei. Se mai găsesc şi în fluide secretori cum sunt mucusurile şi laptele.

Anticorpii sunt molecule având forma literei Y (fig. 3) fiind formaŃi din câte 2 lanŃuri grele şi

2 lanŃuri uşoare de polipeptide Aceste lanŃuri sunt unite prin legături covalente şi necovalente

(www.sinauer.com).

Fig. 3. Structura unui anticorp (http://images.google.ro/imgres?imgurl=http://www.capemaster.net)

2.1.2. Anticorpii primari

Anticorpi primari sunt anticorpi formaŃi împotriva antigenilor de interes (o proteină,

peptidă, glucide, sau de alte molecule mici) şi sunt, de obicei neconjugaŃi. Anticorpii primari

care recunosc şi se leagă cu mare afinitate şi specificitate de epitopii unici.

(http://en.wikipedia.org/wiki/Primary _antibodies).

Anticorpii primari specifici utilizaŃi de mine în experimentele mele au fost:

Synaptophisin, NPT II, DsRed murin, CD 31 murin şi Cytokeratina 20 murină.

2.1.3. Anticorpii secundari

Un anticorp secundar este un anticorp care se leagă de anticorpul primar sau de

fragmente de anticorpi. De obicei ei sunt etichetaŃi cu sonde care îi fac uşor de folosit pentru

detectarea, purificarea sau sortarea celulelor.

Anticorpii secundari specifici sunt de obicei folosiŃi în diferite aplicaŃii de laborator.

Sunt selectaŃi în funcŃie de anticorpii primari folosiŃi, clasa de anticorpi primari (de exemplu,

IgG sau IgM), precum şi de tipul de sondă care este de preferat. Identificarea anticorpilor

secundari optimi se realizează în mod normal prin mai multe încercări

(http://en.wikipedia.org/wiki/Secondary_antibody).

Fig. 4 Ataşarea anticorpului secundar de anticorpul primar http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/fc/Primary-Secondaryantibody.svg/300px-Primary-Secondaryantibody.svg.png

Anticorpii secundari specifici utilizaŃi de mine în experimentele mele sunt: Alexa Flor

488 atât capră anti murin cât şi capră anti iepure, Alexa Flor 633 atât capră anti murin cât şi

capră anti iepure şi Alexa Flor 594 capră anti murin.

.

2.2. ANTIGENII

Antigenul (greacă: anti=contra şi geano=a naşte, a genera) este termenul care

defineşte orice substanŃă de origine endogenă sau exogenă, care, odată ajunsă în

organism, nu este recunoscută ca proprie şi determină apariŃia unui răspuns imun, ce

vizează neutralizarea şi eliminarea ei ( http://ro.wikipedia.org/wiki/Antigen).

2.3. CITOMETRIA ÎN FLUX CONTINUU

Citometria în flux continuu este o tehnică de numărare şi de examinare a

particulelor microscopice, cum ar fi celule şi cromozomi, prin suspendarea lor într-un

curent de fluid şi trecerea lui printr-un aparat electronic de detectare. Aceasta permite

analiza simultană a caracteristicilor fizice şi chimice a mii de particule pe secundă.

Citometria în flux este utilizată în mod curent în diagnosticul unor tulburări de

sănătate, în special în cazurile de cancer de sânge, dar are multe alte aplicaŃii, atât în

cercetare cât şi în practică clinică (Recktenwald DJ. 1993).

►Principiul citometriei în flux continuu

Un fascicul de lumină (lumina laser, de obicei) dintr-o singură lungime de undă

este direcŃionat pe un flux de lichid concentrat hidrodinamic. O serie de detectori sunt

îndreptaŃi înspre punctul în care fluxul trece prin fascicul de lumină: unul, în

conformitate cu fascicul de lumină cu dispersia pe direcŃia înainte (Forward Scatter) şi

fasciculul de lumină cu dispersia perpendiculară (Side Scatter). Fiecare particulă de

dimensiuni de la 0.2 - 150 micrometri ce trece prin fasciculul de lumină şi substanŃele

chimice fluorescente găsite în particule sau ataşate de particule pot fi excitate să emită

lumină la o lungime de undă mai mare decât sursa de lumină. Această combinaŃie de

lumină fluorescentă şi lumină dispersată este preluată de către detectoare şi prin

analizarea fluctuaŃiilor de luminozitate, la fiecare detector, după care este posibilă

obŃinerea diferitelor tipuri de informaŃii despre structura fizică şi chimică a fiecărei

particule individuale. FSC este corelat cu volumul celulelor şi SSC depinde de

complexitatea interioară a particulei. (Givan A. 2001).

CAPITOLUL III REZULTATE PRIVIND CERCET ĂRILE EFECTUATE PE PLAN NA łIONAL ŞI INTERNA łIONAL ÎN CEEA CE PRIVE ŞTE CULTURA DE CELULE

STEM

3.1. STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR PE PLAN NAłIONAL

► Prima bancă publică de sânge placentar din Ńara noastră, la care au acces gratuit toŃi

cetăŃenii români, funcŃionează la Cluj-Napoca, cu ajutorul FundaŃiei Eurocord România. O

altă bancă privată de sânge placentar a fost deschisă în Bucureşti, de către Centrul Medical

Unirea, în colaborare cu Stem-Health Grecia (http://www.contraboli.ro/ banca-de-celule-

stem-la-cluj).

► Cercetări s-au efectuat si de către Groza Daria Maria în teza sa de doctorat cu

titlul ,,Cercetări experimentale privind comportamentul in vitro şi in vivo al celulelor

stem în reproducerea umană’’, 2009. Scopul acestei teze de doctorat este reprezentat

de aplicarea în practică a cunoştinŃelor actuale privind celulele stem din anexele fetale

şi sângele cordonului ombilical precum şi de cercetarea experimentală a izolării,

diferenŃierii şi transplantării in utero a celulelor stem umane obŃinute pe model animal,

utilizând biotehnologii de ultimă oră.

3.2. STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR PE PLAN INTERNAłIONAL

► O etapă nouă în folosirea celulelor stem adulte o constituie, din 1989, descoperirea şi

folosirea ca sursă a celulelor stem adulte, sângele extras din cordonul ombilical. Chiar în acel

an, s-a efectuat cu succes transfuzia sângelui din cordonul ombilical. Aceasta a fost prima

dovadă clinică privind faptul că sângele cordonului ombilical este într-adevar o sursă de

celule stem adulte. (http://www.produsenaturiste.net/pages/Stimularea-pe-cale-naturala-a-

celulelor-stem-adulte.html).

► În America a avut loc un experiment de acest fel. În condiŃii de laborator din celulele

stem ale unei vaci au obŃinut un rinichi funcŃional pe care l-au transplantat în animal. Noul

rinichi a funcŃionat asemănător cu cel original, producând urină. Dar cercetările şi

experienŃele privind celulele stem adulte ridică, numeroase întrebări morale şi etice.

(http://dictionar.romedic.ro/transplant-de-celule-stem).

CAPITOLUL IV

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCET ĂRII

4.1. SCOPUL CERCETĂRII

Studiile internaŃionale efectuate până în prezent în domeniul celulelor stem au

demonstrat caracteristicile acestora, devenite în zilele noastre un instrument foarte important

al medicinii regenerative. În România, există doar câteva studii care urmăresc această direcŃie

de cercetare, acestea fiind axate preponderent pe elucidarea particularităŃilor celulelor stem

adulte. Studiul de faŃă a fost întreprins în vederea testării capacităŃii următorilor anticorpi

monoclonali primari Synaptophisin, NPT II, DsRed murin, CD 31 murin şi Cytokeratina 20

murină, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 atât capră anti murin cât şi capră anti iepure,

Alexa Flor 633 atât capră anti murin cât şi capră anti iepure şi Alexa Flor 594 capră anti

murin. Aceştia sunt citaŃi de literatura de specialitate (J. W. Goding, 1984; A. M. Campbell,

1984) şi sunt utilizaŃi cu scopul de a evidenŃia celulele stem umane existente în creierul

fetusului ovin.

IncidenŃa tot mai frecventă a unor boli de gravitate foarte mare, cu conseciŃe severe

asupra vieŃii sociale umane, cum sunt boala Parkinson, Alzheimer şi sclerozele multiple

(Aponso P.M. et al., 2007), constituie pentru cercetători o continuă provocare în găsirea de

soluŃii curative eficiente. Trebuie subliniat faptul că deşi există cercetări în acest domeniu care

implică utilizarea celulelor stem, rezultatele obŃinute sunt încă departe de a fi satisfăcătoare.

Acesta este motivul pentru care am ales efectuare a studiului de faŃă.

4.2.OBIECTIVUL CERCERĂRII

Obiectivul cercetării a constat în identificarea celei mai adecvate metode de

evidenŃiere a celulelor stem umane migrate în creierul fetal ovin. Obiectivele metodologice au

vizat testarea mai multor seturi de anticorpi monoclonali şi policlonali în vederea identificării

posibilităŃii acestora de a fi utilizaŃi în evidenŃierea celulelor stem umane în creierul fetal ovin.

În acest scop, a fost întocmit planul experimental al cercetării, luându-se în studiu 8 seturi de

anticorpi monoclonali şi policlonali, a căror eficienŃă a fost testată pe creier provenit de la

fetus ovin. S-a practicat aceeeaşi metodologie de testare, bazată pe principiul emisiei de

fluorescenŃă specifică, respectiv coloraŃie roşie în cazul celulelor nervoase ovine şi dublă roşu

– verde, în cazul neuronilor umani. Prin tehnica citometriei în flux continuu, am determinat

care dintre anticorpi se pretează la identificarea celulelor stem umane.

CAPITOLUL V

CERCETĂRI PRIVIND UTILIZAREA UNOR ANTICORPI MONOCLONALI ÎN EVIDEN łIEREA CELULELOR STEM UMANE

5.1. MATERIALE ŞI METODE

5.1.1. Materiale utilizate

A). Materiale biologice:

În vederea testării anticorpilor monoclonali a fost studiat un lot de ovine si fetuşii

acestora, aparŃinând rasei Merinos, din efectivul de animale al fermei din Reno, Nevada.

Ca şi materiale biologice au fost folosite:

-Creier fetal ovin, celule stem provenite din linii celulare existente în banca de celule a

laboratorului din Reno, Nevada, anticorpi, antigeni, markeri.

B). Materiale chimice:

-SoluŃii de PBS (Phosphate Buffered Saline), NGS, soluŃie de blocare (bloking buffer),

Etanol, Metanol, Alcool de diferite concentraŃii (100, 95 şi 75 %), SoluŃie de recuperare a

antigenului (antigen retrival),DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) –colorant fluorescent ce

se leagă de ADN, Hoecst, Medii Dako, Dulbeco, DMEM (Dulbeco Modified Eagle medium),

Apă sterilă, Spirt medicinal şi soluŃii pentru dezinfecŃii.

C). Aparatura de laborator:

Aparatura utilizată în vederea realizării experimentelor a fost: Microtomul, Microscopul

electronic, Microscopul confocal, Microscopul Olympus Bx 60 (Epifluorescence Microscop),

Aparate PCR, Lămpi UV, Centrifugi, Agitator ultraturax (Helidolph), Aparat pentru produs

gheaŃă (Brema), Autoclav (Raypa), Baie marină (Fisher Bioblock Scientific polystat),

BalanŃa analitica (Schimadzu AW 320M), Containere Biohazard pentru deşeuri (Brema),

deionizator de apă (Smeg WP 3000), Etuvă (Memmet), Frigidere, congelatoare, Hotă pentru

chimicale (Kottermann),Hotă PCR (Steril), Microcentrifuge (Sigma 1-15), pH - metru

(InoLab), Spectrofotometru UV-VISNano Drop ND-1000, Vortex (Schimadzu).

D).Matriale consumabile de laborator:

Sticlăria de laborator, Lamele, Lame, Eprubete, Bisturie, mănuşi, Pipete (Eppendorf) cu

volume reglabile de la 0,2-5 µl, 5-10 µl, 50-100 µl şi 100-1000 µl, Tuburi (Eppendorf) de

1,5 ml, Vârfuri de pipete de dimensiuni diferite (dimensiuni mari, medii şi mici), cu volume

de 0,2-5 µl, 5-10 µl, 50-100 µl şi 100-1000 µl.

5.1.2. Metode de colorare

Se utilizează metodica specifică testării anticorpilor şi pentru a ajunge la etapa de

colorare trebuiesc parcurse mai întâi alte etape, după cum urmează:

1). Prelevarea materialului biologic (a Ńesutului din creier fetal ovin)

→Recoltarea

Recoltarea este operaŃiunea de prelevare a unor mici fragmente de Ńesut sau organ, fie

din organismul viu, fie de la cadavre. Deşi este considerată de multe ori o operaŃiune banală,

ea reprezintă de fapt una din cele mai importante etape ale efectuării preparatului permanent.

→ Modul de prelevare a creierului

Animalele adulte gestante în 58-60 de zile au fost supuse unei operaŃii chirurgicale, în

care li s-au scos prin incizia făcută coarnele uterine, injectându-se intraperitoneal fetuşilor o

anumită cantitate de celule stem umane. După o săptămână de la operaŃie animalele adulte

sunt sacrificate, iar fetuşilor le sunt prelevate organele de interes. Acestea sunt tratate şi apoi

păstrate.

PărŃi din Ńesuturile acestor organe se păstrează în blocuri de parafină sau gheaŃă. În

acest fel pot fi păstrate pe perioade îndelungate de timp.

2). Includerea materialului biologic în blocuri de parafină

→Preparatul permanent

Efectuarea unui preparat permanent necesită o procedură mult mai complicată în

comparaŃie cu preparatul proaspăt. Pentru executarea lui trebuie parcurse un număr mare de

etape sau timpi de lucru, fiecare având o influenŃă hotărâtoare asupra calităŃilor preparatului.

În cele mai multe cazuri aceste etape sunt următoarele: recoltarea, fixarea, spălarea (şi

decalcificarea când este cazul), includerea, secŃionarea, colorarea şi montarea. Modul de

realizare a acestor etape este de cele mai multe ori adaptat la necesităŃile pieselor prelucrate.

Astfel, aceşti timpi de lucru pot fi scurtaŃi sau prelungiŃi, simplificaŃi sau complicaŃi în funcŃie

de situaŃie. Cert este faptul că numai cel care ştie să adapateze aceşti timpi de lucru la

necesităŃile probei va obŃine în final un preparat histologic de calitate.

→Fixarea

Pentru studiul histologic nu este suficient ca proba de examinat să fie transparentă şi

să posede un contrast optic adecvat.

Celulele şi Ńesuturile (mai ales cele prelevate de la animale) sunt instabile din punct de

vedere fizic şi chimic. Celulele şi materialele extracelulare trebuie “conservate” astfel încât

modificările structurale şi de compoziŃie chimică ale pieselor prelucrate histologic să fie

minime. Această “conservare” este subiectul fixării. Mai simplu spus, fixarea are ca scop

întreruperea fenomenelor vitale din celule şi Ńesuturi, cu păstrarea cât mai fidelă a structurii

acestora.

Formaldehida este un gaz, însă în histologie este folosită sub formă de soluŃie 37 –

40 % formaldehidă în apă, soluŃie ce poartă numele de formalină. Dacă formalina este

utilizată ca un fixator în soluŃii apoase simple, ea trebuie diluată cu câteva zile înainte, iar

când se foloseşte ca formalină neutralizată poate fi utilizată imediat.

→Spălarea

După încheierea fixării acŃiunea fixatorului trebuie stopată prin îndepărtarea acestuia

din piese. În caz contrar, acŃionând în continuare, fixatorul va denatura treptat unele

componente ale pieselor biologice. Singurul fixator în care piesele pot fi păstrate un timp mai

îndelungat fără să determine modificări majore, este formalina. Pentru spălarea fixatorului din

piese la încheierea fixării se foloseşte apă sau alcool, în funcŃie de compoziŃia fixatorului

utilizat.

Spălarea trebuie făcută obligatoriu în apă după fixare cu bicromat, acid cromic sau

tetraoxid de osmiu. Se pot folosi în acest scop recipiente speciale cu pereŃii perforaŃi şi

astupate cu un dop mare de plută.

→Includerea în parafină

După spălare, apa din piese este extrasă (deshidratare) şi înlocuită cu solvenŃi ai

parafinei (clarificare), iar în final piesa este infiltrată cu parafină topită (parafinare). Procedura

standard este valabilă pentru piesele cu o grosime de 3–5 mm. Timpii de deshidratare,

clarificare, infiltrare cu parafină pot fi scurtaŃi sau prelungiŃi, după cum piesele sunt mai mari

sau mai mici.

Dacă se folosesc fixatorii alcoolici stadiile iniŃiale ale deshidratării sunt omise. Pentru

întreaga procedură volumul de lichid trebuie să fie de 10 – 20 ori mai mare decât volumul

piesei.

3). SecŃionarea

După solidificarea blocurilor de parafină care conŃin piesele biologice, se poate trece

la secŃionarea acestora. OperaŃiunea se execută cel mai frecvent cu un microtom rotativ, deşi

se pot folosi şi microtoame basculante sau culisante. SecŃiunile se obŃin sub formă de felii

subŃiri, cu o grosime medie de 6 – 7 µm. Cu o îndemânare deosebită este posibilă obŃinerea

unor panglici constituite dintr-o succesiune de secŃiuni ce pot avea o grosime de numai 4 µm.

SecŃiunile obŃinute vor fi lipite pe lame de sticlă cu ajutorul unui strat subŃire de albumină

Mayer.

4). Deparafinizarea

Se înlătură parafina, folosindu-se xylenă. Se lasă lamele în această soluŃie 10 minute,

la temperatura camerei. Dacă este necesar se repetă pâna la îndepartarea totală a parafinei.

5). Colorarea

Histologii utilizează numeroase soluŃii colorante, folosite de obicei la temperatura

camerei.

Acest procedeu de extragere a colorantului este numit diferenŃiere sau decolorare.

Succesul ambelor metode de colorare depinde de faptul că în general coloranŃii au o mai mare

afinitate faŃă de anumite structuri decât faŃă de altele.

ColoraŃia se numeşte simplă când se utilizează un singur colorant (ex. coloraŃia simplă

cu albastru de metilen), dublă când se folosesc două soluŃii colorante (ex. coloraŃia dublă cu

hematoxilină-eozină) şi tricromică când se folosesc trei soluŃii colorante (ex. tricrom Masson).

Cea mai utilizată metodă de colorare a secŃiunilor histologice este coloraŃia dublă cu

hematoxilină (hemalaun) şi eozină.

6). Montarea

După colorare, secŃiunile sunt montate într-o substanŃă care protejează secŃiunea şi nu

influenŃează contrastele. Cel mai utilizat mediu de montare este balsamul de Canada. Acesta

este un mediu de montare natural, fiind o răşină a speciei Abies balsamea. Balsamul de

Canada natural este un lichid vâscos galben, care se înmoaie prin încălzire. Prin uscare el

devine solid şi pentru a fi făcut corespunzător pentru montare trebuie amestecat cu xilen.

5.2. TEHNICI DE COLORARE

5.2.1. Colorarea in vivo

Această tehnică este tehnica colorării Ńesuturilor vii. Determinând anumite celule sau

structuri să capete o culoare contrastantă, acestora li se poate studia mai uşor morfologia sau

poziŃia în interiorul unui Ńesut. Scopul principal al colorării este de a descoperii anumite

amănunte citologice ce ar putea fi omise.

Prin această tehnică se poate arăta unde există anumite chimicale sau unde au loc

reacŃii chimice specifice în interiorul celulelor sau Ńesuturilor.

5.2.2. Colorarea in vitro

Colorarea in vitro înseamnă colorarea celulelor sau Ńesuturilor ce nu mai sunt în viaŃă.

AnumiŃi coloranŃi sunt deseori combinaŃi pentru a avea o putere de colorare mai mare decât

un singur colorant şi pentru a dezvălui mai multe detalii si calităŃi decât un singur colorant.

Folosită alături de protocoale de fixare şi preparare a probelor, această tehnică poate fi folosită

în punerea de diagnostice sigure.

5.2.3. Tehnica ,,Counterstain’’

Aceasta este tehnica ce se foloseşte atunci când cu ajutorul tehnicii simple de coloraŃie

nu se găsesc rezultate, facând celulele sau structurile celulare mult mai vizibile. De exemplu,

,,cristal violetul” colorează doar bacteriile gram-positive. Tehnica counterstainingului cu

safrarin este folosit pentru toate celulele, peermiŃând şi identificarea bacteriilor gram-

negative.

De multe ori aceste tehnici se numesc ,,tehnici vitale’’, deoarece coloranŃii sunt

introduşi în organisme vii. Totuşi, unii coloranŃi sunt toxici pentru organisme.

Pentru a atinge rezultatele dorite, coloranŃii sunt folosiŃi în diluŃii de la 1:5000 la

1:500000. (Howey, 2000).

5.3. INTERPRETAREA PREPARATULUI COLORAT IMUNOHISTOCHIMIC

Deşi imunoreacŃiile pozitive elimină mult din subiectivismul examinatorului, este

necesară în primul rând o evaluare strictă a calităŃii preparatului. În acest sens trebuie să se

Ńină cont de o serie de parametri:

►Controlul pozitiv extern – se va include împreună cu lama de studiat în tehnica de

lucru (e.g. investigarea cu anti-CD3, control pozitiv extern pe secŃiune de timus; investigarea

cu enolază neuronal specifică, control pozitiv extern secŃiune cortex cerebral).

►Control negativ extern – este o secŃiune din biopsia de studiat pe care în loc de

anticorp se aplică soluŃia „control negativ”; rezultatul se va compara cu cel obŃinut pe

secŃiunea tratată cu anticorp. Majoritatea anticorpilor sunt livraŃi împreună cu soluŃia control

negativ.

►Controlul pozitiv intern – anticorpul colorează pe secŃiune substraturi potenŃial

pozitive (e.g. anti-von Willebrand colorează citoplasma celulelor endoteliale; anti-actina

muschi neted colorează miocitele netede, celule mioepiteliale şi miofibroblastele).

►Controlul negativ intern – anticorpul nu colorează substraturi care potenŃial sunt

negative (e.g. citokeratina 8 nu colorează epiteliile scuamoase; desmina nu colorează celulele

epiteliale sau conjunctive ).

5.3.1. Protocolul de imunohistochimie

I. Pentru Ńesuturi fixate în parafină

1.Se înlătură parafina, folosindu-se xylenă. Se lasă lamele în această soluŃie 10 minute,

la temperatura camerei. Dacă este necesar se repetă pâna la îndepartarea totală a

parafinei.

2.Are loc rehidratarea Ńesutului de pe lamă, prin transfer repetat în soluŃii de etanol de

concentraŃii 100 %, 95 % şi 75 %, timp de câte un minut în fiecare concentraŃie. La

final se lasă în apă un minut.

3.Se incubează în soluŃie de antigen retrival (soluŃie de recuperare a antigenului) la

temperature de 93ºC, timp de 5 minute, apoi se lasă să se răcească la temperature

camerei.

4. Se lasa în soluŃie de PBS.

După efectuarea acestor paşi, lamele cu Ńesutul fixat sunt pregătite pentru colorarea cu

ajutorul anticorpilor primari şi secundari, în scopul de a evidenŃia celulele de interes.

II. Pentru Ńesuturi fixate în parafină şi blocuri de gheaŃă

1. Se clătesc lamele în PBS de 3 x 5 minute

5. Se incubează în soluŃie NGS, care este un buffer – soluŃie tampon (formată din PBS + 10

% ser normal de capră), timp de 1 oră, la 4ºC, sau 15 – 30 minute la temperatura camerei

6. Se clătesc lamele cu soluŃie de PBS + 2 % NGS, de 2 x 5 minute

7. Se incubează cu anticorpul primar diluat cu PBS + 2 % NGS timp de 3 ore la temperatura

camerei, sau peste noapte la 4ºC într o cameră umidificată. Anticorpul primar se pune pe

toate lamele, mai puŃin pe lama de control negativ, pe care se pune doar anticorpul secundar.

8. Se clătesc lamele cu soluŃie de PBS + 2 % NGS, de 3 x 5 minute

9. Se incubează cu anticorpul secundar, diluat în PBS + 2 % NGS, timp de 1 oră la

temperatura camerei. Anticorpul secundar se pune pe toate lamele, în cantitate de 2,5 µl/

lamă.

10. Se clătesc lamele cu soluŃie de PBS + 2 % NGS, de 3 x 5 minute.

11. Se clătesc lamele cu soluŃie de PBS

12. Se adaugă pe fiecare lamă câteva picături din colorantul DAPI şi se lasă 5 minute. Dacă

nu există DAPI, se poate folosi soluŃie HOECHST, în diluŃie de 1 µl/ 5 ml PBS

13. Se clăteşte cu soluŃie de PBS

14. Se uscă lamele la temperatura camerei şi se sigilează cu lamela, folosind Cytoseal 60

pentru sigilarea lamelor .

5.4. IMPORTANłA TEHNICII DE COLORARE

Tehnica staining este procedura prin care un specimen histologic este vizualizat cu

rezoluŃie maximă prin fixarea lui pe o lamă plasată pe suportul situat pe fanta luminoasă a

microscopului.

Stainingul este o tehnică auxiliară folosită în microscopie, pentru a amplifica

contrastul în imaginea văzută la microscopul electronic.

În biochimie la această tehnică sunt folosiŃi la substrat şi coloranŃi specifici ADN-ului,

proteinelor, lipidelor şi carbohidraŃilor, pentru a califica şi cuantifica prezenŃa componenŃilor

specifici.

Această tehnică e foarte folosită în biologie şi medicină pentru a evidenŃia structuri în

Ńesutul biologic. Stainingul mai poate fi folosit pentru a defini şi examina fibre musculare sau

Ńesut conjunctiv, populaŃii de celule sau organite celulare.

5.5.TESTAREA SETURILOR DE ANTICORPI 5.5.1. Testarea primului set de anticorpi prin efectuarea unei coloraŃii duble, pe Ńesuturi

fixate in parafina parafină

5.5.1.1. Rezultate şi discuŃii

La testul 1, la care s-au folosit anticorpii primari Synaptophisina murină şi NPT II de

iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de

capră anti iepure, deşi au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie, concentraŃie şi

succesiunea de reacŃii recomandate de protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele aşteptate.

În figura 5 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea

celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul

2246.

Fig.5. Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari Synaptophisină murină şi NPT II de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de capră anti iepure

(original)

În literatură nu au fost găsite date care să facă referire la testarea acestor anticorpi în

evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente în creierul fetusului ovin.

5.5.2. Testarea celui de-al II- lea set de anticorpi prin efectuarea unei coloraŃii simple,

pe Ńesuturi fixate in parafină

Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în

creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2269.

S-a efectuat o coloraŃie simplă pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele

umane şi ovine, folosindu-se ca şi anticorp primar DsRed murin, iar ca anticorp secundar

Alexa Flor 488 de capră anti murin. S-au folosit 10 lame.


În cazul testului 2, au fost utilizaŃi anticorpul primar DsRed murin, iar ca anticorp

secundar Alexa Flor 488 de capră anti murin. Şi în acest caz, cu toate că au fost respectate cu

stricteŃe condiŃiile de reacŃie, concentraŃia şi succesiunea de reacŃii recomandate de

protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele aşteptate.



2246.

Fig.6. ColoraŃie, cu anticorpul primar DsRed murin şi anticorpul secundar Alexa Flor 488 de

capră anti murin (oroginal)

Nici pentru acest set de anticorpi nu au fost găsite în literatură date care să facă

referire la testarea acestor anticorpi în evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente

în creierul fetusului ovin.

5.5.3. Testarea celui de-al III- lea set de anticorpi prin efectuarea unei duble coloraŃii,



creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2267. S-a efectuat o dublă coloraŃie

pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi ovine, folosindu-se ca şi

anticorpi primari CD 31 murin şi Cytokeratina 20 murin, iar ca anticorpi secundari Alexa

Flor 488 capră anti-murin şi Alexa Flor 633 capră anti murin. S-au folosit 20 lame.


Nici testul 3 care a fost efectuat cu anticorpii primari CD 31 murin şi Cytokeratina 20

murin, iar ca anticorpi secundar Alexa Flor 488 capră anti-murin şi Alexa Flor 633 de capră

anti murin, nu a condus la obŃinerea rezultatelor aşteptate. MenŃionăm că şi în acest caz, au

fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie, concentraŃie şi succesiunea de reacŃii

recomandate de protocoale.



2267.

Fig.7. Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari CD 31 murin şi Cytokeratina 20 murin şi cu anticorpii Alexa Flor 488 capră anti-murin şi Alexa Flor 633 de capră anti murin(original)




5.5.4. Testarea celui de-al IV-lea set de anticorpi, prin efectuarea unei coloraŃii duble,

pe Ńesuturi din parafină


creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2248. S-a efectuat o dublă coloraŃie,

având la dispoziŃie 30 lame. Pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi

ovine, s-au folosit ca şi anticorpi primari UCHL1 policlonal, de iepure şi DsRed monoclonal

murin, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 633 de capră anti iepure şi Alexa Flor 488 de

capră anti murin.


La testul 4, unde s-au folosit anticorpii primari UCHL1 policlonal, de iepure şi DsRed

monoclonal murin, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 633 de capră anti iepure şi Alexa

Flor 488 de capră anti murin., deşi au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie,

concentraŃie şi succesiunea de reacŃii recomandate de protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele

aşteptate.



2248.

Fig.8 . Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari UCHL1 policlonal, de iepure şi DsRed monoclonal murin, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 633 de capră anti iepure şi Alexa

Flor 488 de capră anti murin (original)

În literatură nu au fost găsite date care să facă referire la testarea acestor anticorpi în

evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente în creierul fetusului ovin.

5.5.5. Testarea celui de-al V-lea set de anticorpi, prin efectuarea unei coloraŃii duble, pe

Ńesuturi fixate in parafină




ovine, s-au folosit ca şi anticorpi primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A de


capră anti iepure.

5.5.5.1.Rezultate şi discuŃii

În cazul testului 5, au fost utilizaŃi anticorpii primari DsRed monoclonal murin şi

Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi

Alexa Flor 633 de capră anti iepure.

Şi în acest caz, cu toate că au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie,


aşteptate.



2270.

Fig.9 .Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de

capră anti iepure (original).




5.5.6. Testarea celui de-al VI- lea set de anticorpi prin efectuarea unei duble coloraŃii,





ovine, s-au folosit ca şi anticorpi primari Oligodendrocyte murin şi Chromatogranină A de


capră anti iepure. .


În cazul testului 6, au fost utilizaŃi anticorpii primari Oligodendrocyte murin şi

Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 594 de capră anti murin

şi Alexa Flor 633 de capră anti iepure .



aşteptate.



2280.

Fig.10 Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari Oligodenrdocyte murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 594 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de





5.5.7. Testarea celui de-al VII- lea set de anticorpi prin efectuarea unei duble coloraŃii,



creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2281. S-a efectuat o dublă coloraŃie

pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi ovine, folosindu-se ca şi

anticorpi primari DsRed murin şi Chromatogranina A de iepure, iar ca anticorpi secundari

Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594 de capră anti iepure. S-au folosit 20

lame.


În cazul testului 7, au fost utilizaŃi anticorpii primari DsRed murin şi Chromatogranină

A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594

de capră anti iepure .



aşteptate.



2281.

Fig.11 Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari DsRed murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594 de capră anti

iepure (original)




5.5.8. Testarea celui de-al VIII- lea set de anticorpi prin efectuarea unei duble

coloraŃii, pe Ńesuturi fixate in parafină


creierul fetusului ovin, s-au folosit indivizii 2270, 2271, 2272, 2273, 2274. S-a efectuat o

dublă coloraŃie, având la dispoziŃie cate 4 lame de la fiecare individ, adică 20 lame.

Pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi ovine, s-au folosit ca

şi anticorpi primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca

anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594 capră anti iepure.


Testul 8 care a fost efectuat cu anticorpii primari DsRed monoclonal murin şi

Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi

Alexa Flor 594 capră anti iepure.

Este singurul test care a condus la obŃinerea rezultatelor aşteptate. MenŃionăm că şi în

acest caz, au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie, concentraŃie şi succesiunea de

reacŃii recomandate de protocoale.

În figura 12 se poate observa că a avut loc colorarea şi s-a putut face identificarea

celuleor stem uname, deci s-a putut stabili existenŃa lor în creierul tuturor indivizilor

analizaŃi, care a avut o reacŃie pozitivă la anticorpul primar DsRed murin şi Chromatogranină

A de iepure împreună cu anticorpii secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa

Flor 594 capră anti iepure.

Fig. 12 Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594


CAPITOLUL VI CARACTERIZAREA ANTICORPILOR CU AJUTORUL TEHNICII DE

CITOMETRIE ÎN FLUX CONTINUU

Citometria în flux este o tehnologie care permite unei singure celule să fie măsurată

pentru o varietate de caracteristici, măsurătorile fiind determinate doar prin observarea

celulelor la trecerea printr-un lichid. Instrumentele folosite pentru acest lucru pot aduna

informaŃii despre celulele, prin măsurarea emisiilor de lumină vizibilă şi fluorescentă, care să

permită o triere a celulelor bazate pe trăsături fizice, biochimice şi antigenice

(http://en.wikipedia.org/wiki/ Flow_cytometry)

6.1. MATERIALE ŞI METODE

6.1.1. Materiale utilizate

A). Materiale biologice:

Ca şi materiale biologice au fost folosite: Creier fetal ovin, Celule stem provenite din

linii celulare existente în banca de celule a laboratorului din Reno, Nevada, sânge fetal ovin

B). Materiale chimice:

-coloranŃi fluorescenŃi- FITC (fluorescein izotiocianat), PE (ficoeritrină), APC

(aloficocianină) , anticorpi: CD4, CD8, CD25, Mouse IgG 1

C). Aparatura de laborator:

-aparatul de citometrie în flux continu

D).Matriale consumabile de laborator:

-Sticlăria de laborator, Eprubete, Mănuşi, Pipete (Eppendorf) cu volume reglabile de la 0,2-5

µl, 5-10 µl, 50-100 µl şi 100-1000 µl, Tuburi (Eppendorf) de 1,5 ml,Vârfuri de pipete de

dimensiuni diferite (dimensiuni mari, medii şi mici), cu volume de 0,2-5 µl, 5-10 µl, 50-100

µl şi 100-1000 µl.

6.2. REZULTATE ŞI DISCUłII

În urma aplicării tehnicii de citometrie în flux în vederea identificării celulelor stem

umane din creierul fetal ovin, s-au constatat următoarele:

1. Se observă populaŃia pozitivă la ov CD4 PE marcată cu P1 reprezentând 9 de

evenimente, respectiv 0,41% din total şi populaŃia pozitivă ov CD 25 FITC marcată cu P2,

reprezentând 77 evenimente, respectiv 3,50 % din totalul celulelor (fig. 13 ). Pornind de la

premisa că anticorpii folosiŃi au fost creaŃi pentru a recunoaşte celule stem umane, putem

afirma faptul că 3,91% din celulele analizate sunt celule stem umane la individul 2164

(ANEXA nr. 1).

Fig. 13. Rezultatele analizării anticorpilor ov CD4 şi ov CD25 (original)

2. Se observă populaŃia pozitivă la ovCD8 PE marcată cu P1 reprezentând 40 de

evenimente, respectiv 1,07 % din total şi populaŃia pozitivă la ov CD4 FITC marcată cu P2,

reprezentând 767 evenimente, respectiv 20,49% din totalul celulelor (fig. 14). Pornind de la



(ANEXA nr 1).


P1

P2

P1

P2


evenimente, respectiv 1,31 % din total şi populaŃia pozitivă la ov CD4 FITC marcată cu P2,




(ANEXA nr 2)

Fig. 15 . Rezultatele analizării anticorpilor ov CD8 şi ov CD4 (original)


evenimente, respectiv 0,68 % din total şi populaŃia pozitivă la ov CD 25 FITC marcată cu P2,




(ANEXA nr 2).


P2

P1

P1

P2

CAPITOLUL VII

PRELUCRAREA STATISTIC Ă A DATELOR REFERITOARE LA NUM ĂRUL

TOTAL DE CELULE, NEURONI OVINI ŞI CELULE STEM UMANE,

EVIDENłIATE CU AJUTORUL ANTICORPILOR UTILIZA łI

Numărul mediu de celule evidenŃiate în creierul fetal ovin a înregistrat valori cuprinse

între 764,05 când evidenŃierea s-a efectuat cu setul de anticorpi VIII şi 614,33 când

evidenŃierea s-a efectuat cu setul de anticorpi V. S-a înregistrat o variabilitate cuprinsă între

1,67% pentru setul VI de anticorpi şi 0,47% pentru setul III de anticorpi (tabelul 1 ).

Tabelul 1 Mediile şi parametrii dispersiei pentru totalul celulelor evidenŃiate cu cele 8 seturi de

anticorpi utilizate Table 1

The averages and dispersion parameters for the total emphasized cells with 8 sets of antibodies

Specificare (Issue) n X ± X

s V%

Setul I de anticorpi Set I of antibodies

20 674,95

± 1,79 1,19

Setul II de anticorpi Set II of antibodies

10 691,50

± 1,72 0,79

Setul III de anticorpi Set III of antibodies

20 757,10

± 0,79 0,47

Setul IV de anticorpi Set IV of antibodies

30 675,03

± 1,67 1,36

Setul Vde anticorpi Set V of antibodies

30 614,33

± 1,28 1,14

Setul VI de anticorpi Set VI of antibodies

30 680,60

± 2,08 1,67

Setul VII de anticorpi Set VII of antibodies

20 744,05

± 1,67 1,01

Setul VIII de anticorpi Set VIII of antibodies

20 764,05

± 1,21 0,71

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

I II III IV V VI VII VIII

Tot

alul

cel

ulel

or e

vide

nŃia

te c

u ce

le 8

setu

ri de

ant

icor

pi u

tiliz

ate

Setul de anticorpi

Media Coeficientul de variabilitate, V%

Fig. 17. Mediile totalului celulelor evidenŃiate cu cele 8 seturi de anticorpi şi coeficienŃii de variabilitate

The averages of the total emphasized cells with all 8 sets of antibodies and coefficients of

variability (original)

Numărul mediu de neuroni ovini evidenŃiaŃi în creierul fetal ovin a înregistrat valori

cuprinse între 123,90 când evidenŃierea s-a efectuat cu setul de anticorpi III şi 225,90 când

evidenŃierea s-a efectuat cu setul de anticorpi I.

S-a înregistrat o variabilitate cuprinsă între 22,87% pentru setul VIII de anticorpi şi

56,97% pentru setul II de anticorpi (tabelul 2). Aceasta a fost mult mai mare decât cea

obŃinută pentru totalul celulelor evidenŃiate, indicânt o mai mare neomogenitate a probelor.

Tabelul 2 Mediile şi parametrii dispersiei pentru neuronii ovini evidenŃiaŃi cu cele 8 seturi

de anticorpi utilizate Table 2

The averages and dispersion parameters for the sheep nerones emphasized with 8 sets of antibodies


s V%

Setul I de anticorpi Set I of antibodies

20 225,90

± 1,74 39,43

Setul II de anticorpi Set II of antibodies

10 192,40

± 1,59 56,97

Setul III de anticorpi Set III of antibodies

20 123,90

± 1,65 35,39

Setul IV de anticorpi Set IV of antibodies

30 160,60

± 0,93 27,30

Setul Vde anticorpi Set V of antibodies

30 167,23

± 1,48 32,72

Setul VI de anticorpi Set VI of antibodies

30 213,47

± 0,98 34,99

Setul VII de anticorpi Set VII of antibodies

20 175,50

± 1,31 39,66

Setul VIII de anticorpi Set VIII of antibodies

20 158,90

± 1,19 22,87

0

50

100

150

200

250

I II III IV V VI VII VIII

Număru

l de

neu

roni o

vini

evid

enŃiaŃ

i cu c

ele

8 se

turi d

e

antico

rpi u

tiliz

ate

Setul de anticorpi

Media Coeficientul de variabilitate, V%

Fig. 18. Mediile numărului de neuroni ovini evidenŃiaŃi cu cele 8 seturi de anticorpi şi coeficienŃii de variabilitate

The averages of the number of sheep neurons emphasized with all 8 sets of antibodies and coefficients of variability (original)

Celule stem umane au fost identificate doar când testarea s-a efectuat cu setul VIII de

anticorpi. S-a obŃinut o valoare medie de 4,80 celule şi un coeficient de variabilitate foarte

ridicat, respectiv 36,04%.

Dacă ne raportăm la numărul total de celule din creier evidenŃiate cu ajutorul Setului

de anticorpi VIII (tabelul 3), constatăm că numărul de celule stem umane identificate

reprezintă doar 0,63% din acestea şi 3,02% din numarul de neuroni ovoni evidentiati.

Tabelul 3

Mediile şi parametrii dispersiei pentru celulele stem umane evidenŃiate cu setul de anticorpi VIII

Table 3 The averages and dispersion parameters for the human stem cells emphasized

with VIII th set of antibodies


s V%

Setul VIII de anticorpi Set 8 of antibodies

20 4,80

± 0,39 36,04

CAPITOLUL VIII

CONCLUZII

1. În urma efectuării experimentului de testare a posibilităŃii utiliz ării tehnicilor de

colorare (staining) a celulelor stem neuronale din Ńesut ovin cu o serie de anticorpi

monoclonali, a rezultat următoarea concluzie:

Setul de anticorpi 1, constituit din anticorpii primari Synaptophisin şi NPT II, iar ca

anticorpi secundari Alexa 488 şi Alexa 633, nu se pretează la utilizare în vederea evidenŃierii

celulelor stem neuronale din Ńesut ovin prin tehnica de colorare dezvoltată şi perfecŃionată în

Laboratorul Departamentului de Biotehnologii a UniversităŃii Reno, Nevada, SUA.

2. Nici setul de anticorpi 2, constituit din anticorpul primar DsRed murin şi anticorpul

secundar Alexa 488 de capră antimurin, nu se pretează la utilizare în vederea evidenŃierii



Şi în acest caz presupunem că structura acestora nu se pretează la formarea cu celulele

stem a unui compex ce produce fluorescenŃă, vizibil la microscopul confocal.

3. Rezultatele au fost, de asemenea, negative şi în cazul setului de anticorpi 3,

constituit din anticorpii primari CD 31 murini şi Cytokeratina 20 murin şi cu anticorpul

secundar Alexa 488 capră anti-murin, care nu se pretează la utilizare în vederea evidenŃierii



Rezultatele noastre arată că nici structura anticorpilor primari CD 31 murini şi

Cytokeratina 20 murin şi cu anticorpul secundar Alexa 488 capră anti-murin nu este

compatibilă cu celulele stem în vederea constituirii unui compex ce produce fluorescenŃă,

vizibil la microscopul confocal.

4. Setul 4 de anticorpi, constituit din anticorpii primari UCHL1 policlonal, de iepure şi

DsRed monoclonal murin, iar ca anticorpi secundari Alexa 633 de capră anti iepure şi Alexa

488 de capră anti murin nu se pretează la utilizare în vederea evidenŃierii celulelor stem

neuronale din Ńesut ovin prin tehnica de colorare dezvoltată şi perfecŃionată în Laboratorul

Departamentului de Biotehnologii a UniversităŃii Reno, Nevada, SUA.

Presupunem că structura acestora nu se pretează la formarea cu celulele stem a unui

compex ce produce fluorescenŃă, vizibil la microscopul confocal.

5. Nici setul de anticorpi 5, 6 şi 7 nu s-au obŃinut rezultatele dorite.

6. Rezultatele au fost pozitive în cazul setului de anticorpi 8, constituit din anticorpii

primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A, iar ca anticorpi secundari Alexa 488

de capră anti iepure şi Alexa 594 capră anti murin, care nu se pretează la utilizare în vederea

evidenŃierii celulelor stem neuronale din Ńesut ovin prin tehnica de colorare dezvoltată şi

perfecŃionată în Laboratorul Departamentului de Biotehnologii a UniversităŃii Reno, Nevada,

SUA.

Rezultatele arată că structura anticorpului primar DsRed de iepure împreună cu

anticorpul secundar Alexa 488 de capră anti iepure este compatibilă cu celulele stem în

vederea constituirii unui compex ce produce fluorescenŃă vizibil la microscopul confocal.

7. MenŃionăm că este pentru prima dată când acest tip de testări a fost efectuatpe celule

stem neuronale.

8. Este necesară continuarea şi extinderea cercetărilor în vederea identificării altor

anticorpi a căror structură prezintă disponibilitate pentru evidenŃierea celulelor stem umane

neuronale.

9. Prin tehnica citometriei în flux continuu s-au determinat anticorpii care pot identifica

celulele stem umane existente în creierul fetal ovin, cât şi cantitatea în care acestea se găsesc

în fiecare individ analizat.

10 Prin analiza globală a datelor obŃinute după fluorocitometrie în flux se pot constata

următoarele: cel mai mare procent de grefare a celulelor stem umane în creierul fetal ovin în

valoare de 37,26 % s-a obŃinut la individul cu numărul 2183, iar cel mai mic procent de

grefare al celulelor stem umane în creierul fetal ovin , în valoare de 0,91 % a fost obŃinut la

individul cu numarul 2179.

Ing. Receanu Cristina Monica - usamvcluj.ro · Celulele stem specifice Ńesutului sunt de asemenea...

Documents

Transcript of Ing. Receanu Cristina Monica - usamvcluj.ro · Celulele stem specifice Ńesutului sunt de asemenea...