REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014 39

REZUMATTuberculoza (TB) rmne i n secolul XXI o mare problem de sntate public i cea mai mare cauz de decese datorate unui singur agent infecios la nivel mondial. Cu toate c numrul de cazuri de TB este n scdere n ultimii ani n Romnia, ele sunt tot mai difi cil de tratat atunci cnd apare rezistena la medicamentele antituberculoase. Este nevoie de o mai rapid detecie a Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) n laborator i de testare a rezistenei sale la medicamentele antituberculoase. Din acest motiv metodele de testare n laboratoarele de micobacteriologie se dezvolt continuu. Chiar dac metodele clasice de microscopie i cultur sunt considerate standard de aur n bacteriologia TB, progresele recente ale biologiei moleculare i o mai bun nelegere a bazelor moleculare ale rezistenei la medicaia antituberculoas au determinat apariia unor noi instrumente pentru un diagnostic rapid. Scopul noilor metode este acela de a crete sensibilitatea i specifi citatea abordrii terapeutice i de a determina o scdere a timpul necesar diagnosticului.Acest articol este o trecere n revist a metodelor de laborator mai noi i mai vechi ce pot servi unui diagnostic rapid i pus cu acuratete n infeciile micobacteriene, ceea ce ar putea permite administrarea unui tratament corect i instituit la timp de ctre clinician.

Cuvinte cheie: tuberculoz (TB), Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), diagnostic molecular

ABSTRACTTuberculosis (TB) remains even in the XXI century a major problem of public health and one of the major causes of death from a single infectious agent worldwide. Although the number of cases continues gradually to decrease in Romania in last years, cases get more diffi cult to threat, specifi cally those that are multidrug-resistante.The rapid detection of Mycobacterium tuberculosis(M. tuberculosis) in laboratory and the tests of susceptibil-ity to antituberculous drugs become a necessity. In light of this, the laboratory testing in the mycobacteriology fi eld is continuously developing. Recent advances in molecular biology and a better understanding of the molecular basis of drug resistance in tuberculosis have provided new tools for rapid diagnosis.The aim of this article is to focus on current old and new methods useful for an accurate and rapid laboratory diagnosis of mycobacterial infections.

Keywords: tuberculosis (TB), Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), molecular diagnosis

Adres de coresponden: Dr. Adriana Moisoiu, Institutul de Pneumoftiziologie Marius Nasta, os. Viilor 90, BucuretiE-mail: amoisoiu55@gmail.com

7REFERATE GENERALE

METODE NOI I VECHI N DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL TUBERCULOZEI I N DEPISTAREA REZISTENELOR

LA MEDICAIA ANTITUBERCULOAS Old and new methods for the laboratory diagnosis of tuberculosis and for the detection of resistant strains to antibuberculous drugs

Dr. Adriana MoisoiuInstitutul de Pneumoftiziologie Marius Nasta, Bucureti

Diagnosticul de laborator al TB se face n mod clasic prin microscopie i cultur. Acestea sunt ns procedee inadecvate pentru un control efectiv al TB, pentru c sunt mari consumatoare de timp.

Diferenierea M.tuberculosis de alte micobacterii reprezint i ea o important problem de sntate, tiut fi ind c doar TB se transmite de la persoan la persoan. Diferenierea micobacteriilor tuberculoase

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 201440

de cele netuberculoase este necesar, dar i util, n vederea stabilirii unei scheme adecvate de trata-ment.

Necesitatea scurtrii timpului de diagnostic, pre cum i necesitatea diferenierii micobacteriilor tuberculoase de cele netuberculoase, au determinat n ultimii ani apariia metodelor moleculare de di-agnostic.

METODE CLASICE DE DIAGNOSTIC

Identi fi carea fenoti pic a complexului Mycobacterium tuberculosis (MTC)1.1. Microscopia

Microscopia specimenului clinic n coloraie Ziehl-Neelsen este cea mai rapid i mai ieftin metod de identifi care a micobacteriilor. Principalul dezavantaj al acestei metode este acela c este o metod cu sensibilitate redus, pragul pozitivitii fi ind de 5.000-10.000 bacili/ml de prelevat clinic. Colorarea fl uorescent a lamelor (ex. cu auramina-rodhamina) este superioar coloraiei Ziehl-Neelsen, ea ducnd la scderea timpului de examinare a unei lame. Dar nici ea nu poate face diferena ntre ba-cilii viabili i cei neviabili din respectivul specimen clinic i nici nu poate face diferena ntre diversele specii de micobacterii. De aceea este obligatoriu ca examinarea microscopic a unui specimen clinic s fi e urmat de cultivarea sa.

1.2. CulturaCultura este o metod net superioar microsco-

piei n depistarea M. tuberculosis. Ea poate fi efec-tuat pe medii solide (Lowenstein-Jensen, Middle-brook 7H10 sau 7H11) sau pe medii lichide (Youmans, Dubos, Middlebrook 7H9). Pe mediile solide se poate observa foarte bine morfologia coloniilor de M. tuberculosis. Coloniile dintr-o prim cultur de M. tuberculosis obinute pe mediul Lowenstein-Jensen au o textur caracteristic. Ele apar rugoase, conopidiforme, de culoare alb-crem (Fig. 1). La examinarea microscopic a unui frotiu dintr-o astfel de colonie se observ numrul foarte mare de corzi formate de celulele bacteriene, ceea ce face posibil diferenierea lor de alte specii micobacteriene. Con-versia morfologic a coloniilor de M. tuberculosis la colonii netede pare a fi un semn de cretere a patogenicitii determinat de modifi cri n compo-ziia peretelui celular.

Rata de cretere pentru micobacterii este defi nit ca fi ind timpul necesar pentru apariia unor colonii vizibile cu ochiul liber pe un mediu solid. Mico-bacteriile ce cresc n mai puin de 7 zile sunt de-numite cu cretere rapid, n timp ce apariia colo-

niilor la mai mult de 7 zile de la inoculare defi nete micobacteriile cu cretere lent.

FIGURA 1. Aspectul coloniilor de M. tuberculosis pe mediul Lowenstein-Jensen

Micobacteriile aparinnd MTC sunt cu cretere lent. Temperatura lor optim de cretere este de 35-37C i sunt noncromogene (au o culoare alb-crem ce nu se schimb dup expunerea la lumin).

M. tuberculosis crete extrem de ncet n labo-rator, necesitnd 3-8 sptmni de cretere pe me-diile solide i cel puin 2 sptmni pe medii lichide. Aceast cretere lent determin o mare ntrziere n diagnosticul TB. Pe de alt parte, s-a observat c la aproximativ 30% dintre pacienii cu TB aceasta nu poate fi confi rmat prin cultura pe mediu solid.

Au aprut ns mediile lichide selective, n care detecia creterii M. tuberculosis se poate face n 1-2 sptmni, n funcie de numrul bacililor tu-berculoi din specimenul clinic. Exist mai multe tipuri de aparate automate pentru cultura micobac-teriilor pe medii lichide selective: BACTEC TB 460, BACTEC MGIT 960, BacT/Alert3D, Versa TREK.

BACTEC TB 460 utilizeaz mediul Middlebrook 7H9 n care acidul palmitic este marcat radioactiv cu 14C. Dac exist micobacterii viabile n pre-levatul clinic introdus n fl aconul de cultur, acestea vor metaboliza acidul palmitic radioactiv, elibernd CO2 radioactiv. Rata de producere a CO2 radioactiv este direct proporional cu rata de multiplicare a micobacteriilor.

BACTEC MGIT 960 (Mycobacteria Growth In-dicator Tube) este un sistem automat ce utilizeaz un mediu Middlebrook 7H9 modifi cat cu indicator de cretere fl uorescent (fi lm siliconat cu sare de ru-teniu). Multiplicarea micobacteriilor poate fi citit prin vizualizarea precipitatelor ce apar n partea inferioar a tubului sau prin utilizarea unui emitor portabil de lumin UV.

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014 41

BacT/Alert3D utilizeaz mediul Middlebrook 7H9 n tuburi ce au n partea lor inferioar un de-tector colorimetric ce-i schimb culoarea de la ver de nchis la galben pe msura acumulrii de CO2 produs de creterea micobacteriilor. Cu aju torul unui dispozitiv refl ectometric este semnalat optic i acustic pozitivarea culturii.

Versa TREK este un sistem automat ce utilizeaz fl acoane speciale care conin un burete cu structur alveolar. Mediul de cultur este Middlebrook 7H9 mbogit cu substane antibacteriene. Detecia cre-terii micobacteriilor se face prin monitorizarea con-sumului de O2 i msurarea presiunii din fl acon cu ajutorul unui manometru. Flacoanele n care se constat scderea presiunii de O2 sunt raportate po-zitive i semnalate vizual i acustic de ctre aparat.

Aceste tipuri de aparate ce utilizeaz mediul lichid pentru detecia creterii M. tuberculosis sunt n uz n diverse laboratoare de micobacteriologie din Romnia.

1.3. Teste biochimice i de identifi care antigenicTestele biochimice au fost mult vreme princi-

pala modalitate de difereniere a micobacteriilor. Dar ele necesit o perioad lung de timp pentru efectuare.

Testele uzuale de difereniere n cadrul MTC sunt: testul reducerii nitratului, testul acumulrii niacinei, creterea n prezena tiofen-2-hidrazidei carboxilice (TCH), testul catalazei la temperatura camerei, testul arilsulfatazei, testul ureazei, testul cu pirazinamidaza, tolerana la clorur de sodiu, testul reducerii teluritului, testul hidrolizei Tween 80. Diferitele laboratoare folosesc teste diferite de identifi care biochimic. De exemplu rezistena la TCH este o caracteristic a M. africanum, dar con-centraia critic folosit pentru acest test variaz ntre 1 i 5g/ml i aceast lips a standardizrii tes te lor creeaz ambiguitate n interpretarea rezulta-telor. Clasic, n laboratoarele ce utilizeaz teste biochimice, doar M. tuberculosis este considerat a fi rezistent la TCH. Se admite c pentru diferenierea bacililor din MTC de micobacteriile netuberculoase (MNT) este necesar efectuarea a minimum 4 teste biochimice (1).

Actualmente s-au dezvoltat i teste rapide de identifi care a micobacteriilor, cum ar fi : BBL Taxo TB Niacin test pe strip pentru detectarea produciei de niacin; BBL Taxo Nitrite Test Strip test pe strip pentru reducerea nitratului.

S-au dezvoltat i teste imunocromatografi ce ce pot detecta tulpinile de micobacterii aparinnd MTC n mai puin de 15 minute. Un astfel de test este cel ce pune n eviden antigenul specifi c pentru

M. tuberculosis (Ag MPT 64). Testul se efectueaz n primele 24-48 de ore dup pozitivarea culturii pe mediu solid sau lichid, pentru a putea evita falsele reacii negative. Sensibilitatea testului este de 98,6%, iar specifi citatea de 97,7% (2). Programul Naional de Control a Tuberculozei din Romnia recomand utilizarea de rutin a acestui test pentru toate culturile de micobacterii obinute n labora toarele de micobacteriologie de nivel 2 i 3.

METODE MOLECULARE DE DIAGNOSTIC

n ultimii ani s-au dezvoltat mai multe metode moleculare pentru detecia direct a micobacteriilor din prelevalul clinic, identifi carea speciilor i tes-tarea rapid a sensibilitii la medicamentele anti-tuberculoase pentru M. tuberculosis din culturi bac-teriene, metode ce au fcut posibil scurtarea tim pu lui de diagnostic (3,4).

Totodat, metodele de tipare molecular au fcut posibil descrierea unor variaii ale fenotipurilor de M. tuberculosis cum ar fi virulena, caracterele de cretere, imunogenicitatea i transmisibilitatea (5).

Detecia micobacteriilor din prelevate clinice i/sau din cultur

Apariia metodelor de amplifi care a acizilor nu-cleici (AAN) au fcut posibil punerea n eviden a ADN-ului sau ARN-ului micobacterian direct din prelevatele clinice, anterior unui rezultat al culturii produsului respectiv, iar dezvoltarea lor ulterioar le-a fcut accesibile laboratoarelor clinice de mico-bacteriologie.

Exist mai multe metode de AAN: Enhanced Mycobacterium tuberculosis Direct Test (E-MTD, Gen-Probe, San Diego, CA); Amplicor Mycobac-terium tuberculosis Test (Amplicor, Roche Diag-nos tic Systems, Inc., Branchburg, NJ); sistemul Geno Type MTBDRplus ver 2.0 (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany).

Identifi carea genotipic a acizilor nucleiciSe efectueaz folosind sonde nucleare (Gen-

Probe, AccuProbe Culture Confi rmation Test, San Diego, CA, etc). Acurateea de confi rmare este de 100% pentru M. tuberculosis (6). AccuProbe pentru MTC poate fi efectuat pe culturi att din mediu solid, ct i lichid i detecteaz prezena tuturor mem brilor MTC. Amplifi carea unitii 16S din ARNr sau elementul de inserie IS6110 sunt cele mai obinuite inte utilizate. Alte regiuni folosite pentru amplifi care conin gena rpoB care codifi c subunitatea din ARN polimeraza, gena hsp65,

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 201442

gena dnaJ, gena recA, gena sodA. Aceste teste se pot efecua uor, rezultatul se obine n cteva ore i au o mare specifi citate (7).

Teste comercialeTestul Amplicor MTB

Testul Amplicor (Roche Molecular Systems, Basel, Switzerland) se bazeaz pe o metod de pro-tein chain reaction (PCR) prin care ADN-ul mico-bacterian este amplifi cat cu primeri biotinai formai pe baza genei 16S a ARNr.

Amplifi carea i detecia ADN-ului se efectueaz automat cu ajutorul aparatului Cobas Amplicor, n care, fr manevre suplimentare, produsul de am-plifi care este transferat automat n staia de detecie unde va avea loc reacia colorimetric de developare i citire.

Timpul necesar ntregului proces este de cca 6-7 ore. Controlul intern al acestui sistem de detecie a micobacteriilor este un ADN sintetic caracterizat prin secvene identice de inte micobacteriene; cnd acesta nu este amplifi cat semnaleaz prezena inhi-bitorilor. Exist i kit-uri Amplicor pentru detecia ADN ului M. avium i M. intracellulare din prele-vate clinice.

n literatura de specialitate se arat c specifi -citatea sistemului Amplicor MTB este apropiat de 100%, n timp ce sesibilitatea variaz ntre 90% i 100% n specimenele clinice pozitive la micro-scopie. (8) Dup ali autori sensibilitatea esutului Amplicor (comparativ cu cultura) pentru probele de provenien respiratorie este de 79,4-91,9%; specifi citatea este de 99,6-99,8%, iar valoarea pre-dictiv pozitiv este de 92,6-96,6 i valoarea pre-dictiv negativ este de 98,6-98,7% (9).

Sensibilitatea pentru specimenele negative la microscopie este ntre 40% i 73,1% comparativ cu cea a E-MTD i de aceea testul Amplicor a fost aprobat de FDA n SUA doar pentru detecia direct a M. tuberculosis n specimenele respiratorii BAAR pozitive la microscopie.

Sistemul E-MTDE-MTD (Gen-Probe, San Diego, CA) este un

sistem de amplifi care izoterm (42C) ce se bazeaz pe amplifi carea transcripiei mediate dezvoltat de Kwoh i colaboratorii, n care ARNr este eliberat din celulele tin prin sonicare, dup care primer-ul promoter se leag de intele ARNr. Revers trans-criptaza este apoi utilizat pentru a copia ARNr pe un hibrid cADN-ARN.

O regiune complex-specifi c a genei 16S a ARN-ului produce un dublu standard de ADN prin aciunea combinat a revers transcriptazei i ribo-

nucleazei. n contrapartid, ARN polimeraza catali-zeaz sinteza ARN-ului ribozomal din ADN-ul ribozomal sintetizat anterior. n acest fel, un nou ciclu va ncepe n momentul n care noul produs ARN ribozomal iniiaz noi transcripii prin revers transcriptaz.

Ampliconii ARN sunt apoi detectai chemilumi-niscent cu un ester de acridinium etichetat ADN ntr-o soluie de hibridizare. ntreaga procedur de amplifi care este izoterm i se produce ntr-un sin-gur tub, ceea ce duce la scderea riscului de conta-minare. Dup efectuarea decontaminrii preleva-tului clinic, testul E-MTD poate fi fi nalizat n cca 3 ore. Acest test nu are nevoie de control intern pentru a monitoriza prezena sau absena inhibitorilor.

Testul E-MTD funcioneaz att n cazul pre-levaelor clinice BAAR pozitive la microscopie, ct i n cazul celor BAAR negative la microscopie. Sensibilitatea acestui test pentru specimenele cli-nice respiratorii este de 90,9-95,2%, specifi citatea sa este de 98,8-100%, valoarea predictiv pozitiv este de 83,3-100%, iar valoarea predictiv negativ este de 98,4-99,6% (8-10).

Sistemul BD Probe Tec ETSistemul BD Probe Tec ET (Becton Dickinson,

Sparks, MD) utilizeaz ADN polimeraza i ampli-fi carea izotermal pentru a produce multiple copii ale IS6110, un element de inserie unic pentru M. tuberculosis.

Anterior introducerii probei n sistemul automat sunt necesare cteva manevre: proba este inactivat iniial la 105C i apoi sonicat pentru a extrage ADN-ul, transferat ntr-un godeu la 72,5C i subsecvent ntr-un godeu de amplifi care la 54C. n aparatul BD Probe Tec ET microplcile coninnd probele i reactivii de amplifi care se incubeaz la 52,5C i fl uorescena emis este monitorizat n mod continuu. Timpul de fi nalizare al unei probe cu acest test este de 3,5-4 ore. Testul conine un control intern caracterizat de aceeai secven ca i inta micobacterian. Cnd amplifi carea nu s-a fcut, acest control este cel ce d alert pentru prezena inhibitorilor. n literatura de specialitate se descriu rate ale sensibilitii testului ntre 98,5% i 100% pentru probele pozitive la microscopie i foarte variabile (ntre 0,33% i 100%) pentru probele ne-gative la microscopie (8).

Sistemul de hibridizare pe band (line probe assay) Exist dou sisteme comerciale de hibridizare

pe band: Geno Type Mycobacterium i INNO LiPA Mycobacteria.

Geno Type Mycobacterium este un sistem de revers hibridizare bazat pe multiplex-PCR, produs

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014 43

de fi rma Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germania. Poate detecta att MTC, ct i micobacteriile atipice (M. avium, M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. ulcerans, comple-xul M. tuberculosis i M. xenopi).

Sistemul se bazeaz pe detecia polimorfi smului unei singure nucleotide din gena gyrB i pe prezena sau absena regiunilor de difereniere (RD). Di-feritele probe specifi ce de ADN apar imobilizate ca linii paralele pe o band i sunt detectate colori-metric.

Sistemul Geno Type Mycobacterium are mai multe kit-uri: Geno Type MTBDRplus v 2.0, kit de analiz ge-ne tic pentru identifi carea complexului M. tubercu-losis i identifi carea rezistenei la rifampicin (RIF) i izoniazid (INH) din specimen clinic pozitiv i/sau negativ microscopic i probe din cultura bacterian.

Acest test se efectueaz de rutin n cele 2 la-boratoare naionale de referin din Romnia pen-tru toate prelevatele clinice pozitive n microscopie. Geno Type MTBC, kit de difereniere a comple-xului M. tuberculosis din culturi, ce difereniaz urmtoarele specii aparinnd complexului M. tu-berculosis: M. tuberculosis/M canettii, M. afri ca-num, M. microti, M. bovis subsp. bovis, M. bovis subsp. caprae i M. bovis BCG. Acest kit este cea mai fi abil metod direct de identifi care a mem-brilor MTC, dar nu poate diferenia M. canetii de ali membri ai MTC. Geno Type Mycobacterium CM (Common Myco-bacteria) ver 1.0, kit de analiz genetic pentru iden tifi carea celor mai relevante specii micobac-teriene cu importan clinic din culturi, identifi c urmtoarele specii micobacteriene: M. avium ssp. M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gor-donae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. in-terjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. pere-grinum, M. marinum/M. ulcerans, complexul M. tuberculosis i M. xenopi.

Testele Geno Type sunt relativ uor de efectuat, sunt uor de interpretat i sunt rapide.

Sensibilitatea acestor teste, comparativ cu sec-vena 16S din gena ARNr este de 97,9-99,3%, iar specifi citatea de 92,4-99,4% (8).

Sistemul INNO LiPA Mycobacteria v.2 este bazat pe principiul revers hibridizrii. Materialul ADN biotinat este hibridizat cu probe de oligo-nucleotide specifi ce imobilizate ca linii paralele pe o band. Dup hibridizare se adaug streptavidina etichetat cu fosfataza alcalin ce se leag de orice hibrid biotinat format anterior. Incubarea cu 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfat i nitroblue tetra-zolium (BCIP/NBT) determin apariia unui preci-pitat brun purpuriu. Pentru a lucra testul INNO-LiPA Mycobacteria v.2, trebuie efectuat am pli- fi carea regiunilor spacer 16S-23S din ARNr. Apoi produsul de amplifi care este hibridizat folosind o band pe care sunt fi xate 22 de probe paralele de ADN i 2 probe de control (Fig. 2).

Apariia unor linii clar vizibile pe band este considerat ca reacie pozitiv. Rezultatele obinute se interpreteaz folosind un ablon furnizat de productor. Pot fi astfel identifi cate 17 din cele mai frecvent izolate specii micobacteriene: MTC, M avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. xenopi, M. chelonae, M. gordonae, M. fortuitum, M. malmoense, M. genavense, M. simiae, M. smegmatis, M. haemophilum, M. marinum/M. ulcerans i M. celatum. Sensibilitatea este de 100%, iar specifi citatea de 94,4%. (8) Dar INNO LiPA Mycobacteria v.2 nu poate fi lucrat dect pe probe din cultur i nu direct din prelevate clinice.

Alte tehnici de biologie molecular prin care se pot obine rezultate rapide i de mare acuratee n identifi carea speciilor micobacteriene sunt:

Tehnica de secveniere a ADN-ului. Ea const n efectuarea unei amplifi cri a ADN-ului mico bac-terian extras din cultura cu primeri genus-spe cifi ci, urmat de o secveniere a ampliconilor ntr-un sis-tem automat. Identifi carea ulterioar a tulpinii mi-co bacteriene se face prin compararea secvenei de nucleotide cu o baz cunoscut de secveniere.

FIGURA 2. Localizarea diverselor probe pe banda de INNO LiPA Mycobacteria v2.

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 201444

Asfel de baze de secveniere sunt GenBank, Ribo-somal Differentiation of Medical Microsystems Data base (RIDOM)(11), European Molecular Bio-lo gy Laboratory (EMBL). Cea mai utilizat int pentru secveniere este 16S ARNr. Instrumentul comercial cu care se poate efectua secvenierea 16S ADNr este MicroSeq System (Applied Biosistems, CA). Prin aceast tehnic nu poate fi difereniat M. canetti de ali membri ai MTC, dup cum nu pot fi difereniate nici alte specii de micobacterii ca M. chelonae, M. abscessus, M. immunogenum. Pen tru diferenierea acestora este necesar o a doua tehnic de analiz a deleiei.

Reacia de polimerizare n lan i analiza en-zimelor de restricie pentru identifi carea mico-bac teriilor din cultur

Este o metod dezvoltat n 1993 de Teleni i colaboratorii, ce se bazeaz pe amplifi carea secven-ei 441-bp a genei hsp65 prin tehnica de PCR, urmat de restricia produsului de amplifi care cu ajutorul a dou enzime de restricie BstEll i Haell. Fragmentele rezultate n urma digestiei cu enzime restrictive sunt apoi analizate prin electrofereza n gel de agaroza i comparate cu un algoritm preexis-tent. Testul poate fi fi nalizat ntr-o singur zi. (8)

Metod de genotipare IS6110 RFLP (Restriction Lenght Fragment Polymorphism) detecteaz varia-iile generate de inseria elementului IS6110. Acest element de inserie este capabil de autocopiere i apoi se poate insera oriunde n genom printr-un pro ces denumit transpoziie. Diversele tulpini dife-r ntre ele att prin numrul de copii al elementului IS6110, ct i prin poziia acestor copii n ADN-ul bacterian. Aceasta a devenit actualmente cea mai folosit metod pentru diferenierea tulpinilor de M. tuberculosis izolate. Metoda se poate aplica doar culturilor de micobacterii de 20-40 de zile pentru a putea obine sufi cient material ADN. Perioada mare de timp limiteaz utilitatea metodei de tipare RFLP, n special n studiile de transmisie nozocomial a tuberculozei n uniti clinice. (12)

Spoligotiparea (spacer oligonucleotide typing), o nou metod de selecie i tipare a MTC dezvoltat n ultimii ani, este o metod de hibridizare ce detecteaz variabilitatea n regiunile direct repeti-tive (DR) din ADN-ul M. tuberculosis. Spoligoti-parea este, de fapt, o amplifi care a locusurilor DR ce implic o reacie de PCR, urmat de hibridizarea produilor de reacie pe o membran ce conine oligonucleotidele corespunztoare celor 43 de spaceri legai covalent (Fig. 3). Fiecare tulpin de micobacterie are un semnal pozitiv sau negativ pentru fi ecare spacer. Rezultatul se poate obine dintr-o cultur de M. tuberculosis ntr-o singur zi.

Datele din studii internaionale de spoligotipare au identifi cat un numr mare de clade sau genogrupuri (12).

FIGURA 3. Spoligotiparea aspectul spacerilor n diverse tulpini micobacteriene (13).

Recombinarea genetic, rearanjrile i inseriile/deleiile asociate acestor elemente, locaia cromo-zomal i numrul de copii au fost utilizate ca markeri specifi ci epidemiologici pentru tulpinile de M. tuberculosis.

Secvena de ADN cu cel mai mare potenial de amplifi care este elementul de inserie IS6110. Depinznd de organismul n care a fost caracterizat, acest element este denumit IS6110 sau IS986 (M. tuberculosis) sau IS987 (M. bovis BCG).

Huard i colaboratorii au investigat profi lul DR al MTC i, bazndu-se pe acest profi l, au dezvoltat o metod rapid i simpl de tipizare a MTC care utilizeaz, regiunile cromozomale ale MTC ca re-giuni de difereniere a deleiei locilor. Ei au utilizat apte perechi de primeri PCR pentru a amplifi ca loci specifi ci cu care au efectuat un panel de tipare PCR a MTC.

Acest panel nu face doar diferenierea ntre sub-speciile MTC, ci face i o difereniere a izolatelor MTC de speciile importante de NTM. (14)

Este cunoscut faptul ca diferitele tulpini de M. tuberculosis au caractere clinice i epidemiologice distincte. Unele tulpini de M. tuberculosis au o mare capacitate de diseminare i de a deveni MDR, n timp ce altele tind s aib doar o limitare local. De aceea, n ultimul timp a nceput s se acorde o atenie sporit identifi crii tulpinilor de M. tuber-culosis. Filogenetic, distribuia specifi c a clonelor de M. tuberculosis sau a tulpinilor de MDR-TB poate fi urmrit prin metode de tipare molecular la nivel regional, de ar sau chiar la nivel global. Instrumentul folosit pentru tiparea epidemiologic a tulpinilor de M. tuberculosis este spoligotiparea (15;16).

Exist o baz internaional de date de spoli go-tipare. Cea mai recent versiune, cea de-a patra baz de date, SpolDB4 conine cca 60.000 de mo-dele distribuite n 2 300 SIT.

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014 45

Metoda de tipare VNTR (Variable Number Tandem Repeat) se bazeaz pe analiza segmentului de ADN ce conine secvena de tandem repeat; numrul de copii al acestei secvene variaz ntre tulpini. Metoda const n calcularea numrului de repetiii pe baza mrimii produsului de amplifi care. Lungimea elementelor repetitive refl ect numrul de copii VNTR amplifi cate. Rezultatul fi nal este un cod numeric, corespunztor fi ecrui locus VNTR. Acest tip de genotipare numeric permite studii comparative intra i interlaboratoare. n comparaie cu metod IS6110 RFLP, metoda de tipare VNTR este mai rapid i virtual potrivit pentru toate izo-latele de M. tuberculosis, inclusiv pentru acelea cu doar cteva copii. (17)

Toate aceste teste de AAN existente pe pia fac posibil scurtarea perioadei de diagnostic, dar ele nu nlocuiesc examenul microscopic sau cultur.

Pentru c testele nu pot face distincia ntre ba-cilii tuberculosi vii i cei mori, ele nu pot fi folosite pentru monitorizarea terapiei antituberculoase. Cli-nicianul trebuie s interpreteze rezultatul testelor AAN doar n context clinic (9).

Teste pentru identifi carea rezistenei la medicamentele antituberculoase

TB-MDR constituie actualmente o serioas ame-ninare din cauza faptului c exist doar un numr foarte limitat de medicamente antituberculoase ce se pot administra n asemenea cazuri.

Testele de sensibilitate la medicamentele antitu-berculoase se efectueaz n mod curent n labo-ratoarele abilitate prin metodele clasice pe medii solide sau lichide cu medicamente antituberculoase i prin defi nirea rezistenei ca i cretere a mico-bacteriei testate mai mare sau egal cu 1% mpotriva medicamentului testat. (18)

M. tuberculosis devine rezistent la medicamen-te le antituberculoase n urma mutaiilor ce apar la ni velul locilor cromozomali. Mutaiile punctiforme determin apariia rezistenei la un singur medi-cament, iar acumularea mai multor astfel de mutaii punctiforme duce la apariia MDR-TB i XDR-TB. Apariia tulpinilor de M. tuberculosis rezistente la antituberculoase se produce n special atunci cnd tratamentul antituberculos este aplicat cu inter mi-ten, cnd el nu este adecvat, cnd pacientul pri-mete un singur antibiotic antituberculos, cand pa-cientul nu este compliant la tratament, cnd me di -ca mentele antituberculoase sunt de calitate slab i rareori datorit slabei absorbii la nivel intestinal.

Detecia tulpinilor de M. tuberculosis rezistente la antituberculoase se face n mare parte prin me-tode fenotipice n urma cultivrii pe medii solide cu medicamente antituberculoase (LJ) sau medii lichi-de n apatate de tip BACTEC TB-460, BACTEC MGIT 960, Bact/Allert 3D sau VersaTrek. Culti-varea micobacteriilor pe medii lichide a determinat o oarecare scurtare a timpului de identifi care, dar nu sufi cient pentru orientarea clinicienilor n pre-

FIGURA 4. Mecanismul rezistenei la medicamentele antituberculoase (19)

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 201446

scrierea tratamentului optim. Apariia metodelor moleculare este cea care a fcut posibil scurtarea perioadei de detectare a rezistenei. Zhang i co-laboratorii au sistematizat mecanismele de rezis-ten la medicamente antituberculoase, redate n Figura 4. (19)

Mutaia cea mai bine studiat este cea care determin rezistena M. tuberculosis la rifampicina (RIF). RIF este un antibiotic antimicobacterian ce face parte din terapia standard a TB. n 96% din cazurile de rezisten la RIF, aceasta se datoreaz mutaiilor n segmentul 81-pb al genei rpoB ce codeaz subunitatea a ARN polimerazei (9,20,21).

Rezistena la izoniazid (INH) este determinat de alterri n mai multe gene, dar mutaiile n genele katG i inhA s-au gsit n proporie de 75-85% la tulpinile de M. tuberculosis rezistente la INH.

Bazele genetice ale rezistenei la alte antibiotice antituberculoase sunt mult mai complexe: rezistena la streptomicin i la alte aminoglicozide este determinat de mutaii n gena 16S ARNr sau pe gena rpsL; rezistena la pirazinamid (PYZ) este determinat de mutaii n gena pncA; rezistena la ethambutol (ETH) este determinat de mutaii n gena embB(9).

Tehnicile care permit detecia mutaiilor ce de-ter min rezistena la diverse medicamente antitu-ber culoase sunt:

Secvenierea ADN-ului prin reacia de poli-me ri zare n lan se bazeaz pe amplifi carea regiu-nii asociate rezistenei, dup care ampliconii sunt secveniai pentru a putea determina prezena sau absena mutaiilor specifi ce.

Tehnici de hibridizare pe band, cu cele dou sisteme comerciale: Inno-LiPA RifTB (Innoge-netics, Gent, Belgium) i Geno Type MDRTBplus (HAIN Lifescience, Nehren, Germany) ce detec-teaz rezistena la RIF i/sau INH i Geno Type MDRTBsl, pentru detecia rezistenelor la fl uoro-quinolone, etambutol i aminoglicozide. Am bele tehnici sunt specifi ce pentru MTC.

Inno-LiPA RifTB conine 10 oligonucleotide pe banda de nitroceluloz: una pentru MTC, 5 pentru tulpinile slbatice (S1-S5) i 4 (R) pentru probe n vederea deteciei celor mai frecvente mu-taii ce determin rezistena la RIF. Probele R folo-site sunt: R2 Asp615Val, R4 His526Tyr, T4b His 526Asp, R5 Ser531Leu. O tulpin de M. tuberculosis este considerat sensibil la RIF dac toate cele 5 probe slbatice dau un semnal pozitiv i dac cele 4 probe pentru rezisten sunt negative. Absena hi-bridizrii n una sau mai multe din probele S semnifi c o mutaie ce trebuie identifi cat prin prin una din probele R. Inno-LiPA RifTB se recomand

a fi utilizat numai n probele n care exist o cantitate mare de ADN i nu poate fi utilizat direct n specimenele clinice.

Geno Type MTBDRplus identifi c simultan MTC i detecteaz cele mai comune rezistene n gena rpoB (rezistenta la RIF), katG i inhA (re zis-tena la INH) (Fig. 5). Rezistena la rifampicin este identifi cat n 98,7% dintre cazuri, iar rezistena la HIN n 92% dintre cazuri folosind Geno-Type MTBDRplus. Acest test poate fi folosit att pentru detecia rezistenelor la RIF i INH n tulpinile de M.tuberculosis izolate pe medii de cultur solide sau lichide, ct i direct din produsele patologice pozitive la microscopie (22).

Geno Type MTBDRsl pentru detecia rapid a rezistenelor la fl uoroquinolone, aminoglicozide de linia a 2-a (amikacin i kanamicin), etambutol i peptide ciclice (capreomicin) direct din prelevaele clinice i/sau din cultur. Specifi citatea i sensi-bilitatea sunt ntre 70-80%. Acest test este foarte util n detecia rapid a pacienilor XDR-TB (23).

PCR-SSCP (protein chain reaction single strand conformation polymophisms) se bazeaz pe distorsiunea conformaional pe care substituia unei nucleotide o poate determina ntr-un singur fi r al unui fragment ADN. Aceast schimbare confor-maional determin o mobilitate electroforetic diferit de cea a fragmentului unui singur fi r al tulpinii slbatice. Aceast metod are o specifi citate de 100% pentru rezistena la RIF i INH i o sensibilitate de 96% pentru RIF i 87% pentru INH, utiliznd 4 regiuni genetice (rpoB, katG, inhA i ahpC). (8)

Metodologia Real-time PCR are o specifi citate de 100% att pentru rezistena la RIF, ct i pentru cea la INH, iar sensibilitatea este de 98% pentru detecia mutaiilor responsabile de rezistena la RIF i 85% pentru detecia mutaiilor responsabile de rezisten la INH.

Metoda Microarray are la baz regula de com-plementaritate a bazelor din mostre de ADN cu-noscute cu cele din ADN-ul de identifi cat (24). Prin analiza unui singur fragment se pot afl a informaii despre mii de gene. O astfel de tehnic este cea cunoscut sub denumirea de TB-Biochip, prin care se pot depista rezistene la RIF i INH. Tehnica biocipurilor a fost dezvoltat de A.D. Mirzabekov n anii 1980 n Federaia Rus i a fost primul test de genetic molecular de uz comercial folosit n diagnosticul TB-MDR.

GeneXpert MTB/RIF (Cepheid GeneXpert System, Sunnyvale) este un sistem nchis, complet automatizat, cu card, pentru detecia MTC i a re-zistenei la RIF. Metoda const ntr-o reacie de

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014 47

PCR n timp real i analiza fragmentelor genetice de amplifi care. Rezultatul se obine n decurs de dou ore i riscul de contaminare este foarte mic. Dezavantajul este dat de costul ridicat al echipa-mentului i al cardurilor de unic folosin.

Prin comparaie cu antibiograma fenotipic pen-tru detecia rezistenei la RIF, sensibilitatea metodei este de 99,2%, pn la 100% pentru prelevatele clinice pozitive la examinarea microscopic i de 72,5% pn la 84,6% pentru prelevatele clinice negative la examinarea microscopic, dar pozitive la cultur (25,26). OMS recomand nc din anul 2010 utilizarea acestui sistem n rile cu endemie TB crescut n diagnosticul iniial al suspecilor de MDR-TB i al celor cu asociere HIV/TB, tiut fi ind c n 85% dintre cazuri rezistena la RIF se asociaz rezistenei la INH.

Pirosecvenierea este o metod relativ nou de secveniere a ADN-ului micobacterian i de depis-tare a rezistenelor la medicamentele antituberculoase i care s-a dovedit foarte bun. Exist studii care au artat o sensibilitate a metodei de 96,7% i o spe ci-fi citatea de 97,3%. (27) Este o metod mai puin

costisitoare dect GeneXpert, dar rezultatele se obin n 1-3 zile.

Metoda cromatografi ei lichide de nalt per-forman (HPLC) este o metod de difereniere a micobacteriilor bazat de diferenele de profi l din acidul micolic. Acizii micolici sunt acizi grai cu greutate molecular mare ce se pot separa croma-tografi c, iar cromatograma este apoi interpretat dup un model specifi c pentru fi ecare specie de micobacterie. Este o metod cu mare sensibilitate i specifi citate, dar care necesit o nalt expertiz n recunoaterea speciilor i este greu de aplicat n laboratoarele de diagnostic curent i nici nu poate fi folosit direct pe prelevatele clinice. (28)

Utilitatea clinic a metodelor moleculare este deosebit, ele scurtnd perioada de diagnostic, dar niciuna din aceste metode nu nlocuiete micro-scopia frotiului din prelevatul clinic i cultur. Ele mresc capacitatea de diagnostic n msura n care sunt corect interpretate, n context clinic i n con-cordan cu caracteristicile lor de performan, dar i ale laboratorului ce le efectueaz.

FIGURA 5. Exemple cu benzi Geno Type MDRTB plus prezentnd diverse tipuri de rezistene: 1) MT sensibil la RIF i INH; 2) MT cu rezisten la RIF i INH (MDR-TB); 3) MT cu monorezisten la INH; 4) MT cu rezisten la RIF i INH (MDR-TB); 5) MT cu rezisten la RIF i INH (MDR-TB).

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 201448

1. Cornaglia G., Courcol R., Herrmann J.-L., Kahlmeter G., Peigue-Lafeuille H., Vila J. European Manual of Clinical Microbiology, fi rst edition, ESCMID, 2012

2. WHO New laboratory tools for tuberculosis control. 2009.3. A. Somoskovi, Z. Bartfai, C. Kodmon, I. Hutas Routine direct

detection of Mycobacterium tuberculosis with a rapid test of polymerase chain reaction applied to a Hungarian patient population. Orv Hetil, 2001. 142 (38): 2085-2090.

4. A. Somoskovi, Judit Mester, Yvonne M. Hale, Linda M. Parsons, M. Salfi nger, MD. Laboratory diagnosis of nontuberculous mycobacteria. Clin Chest Med, 2002. 23 (3): 585-597.

5. S. Narayanan Molecular epidemiology of tuberculosis, Indian J Med Res 120, October 2004, p.233-247.

6. Lebruni L, Espinasse F., Poveda J.V. Vincent-Levy-Frebault Evaluation of nonradioactive DNA probes for identifi cation of mycobacteria. J Clin Microbiol. 1992; 30: 2476-2478.

7. Karen L. Kaul Molecular Detection of Mycobacterium tuberculosis; Impact on Patient Care, Clinical Chemistry, 2001, vol.47, No.8, 1553-1558.

8. Sharma N, Sharma V, Singh PR, Jawed B, Babu V, Kandpal J, Nautiyal SC, Singh RK Tuberculosis and Molecular Diagnosis, WebmedCentral Biotechnology 2013; 4(2):WMC003992.

9. Hanna Soini and James Musser Molecular Diagnosis of Mycobacteria, 2001. Clinical Chemistry 47:5, p. 809-814.

10. Bergman JS, Youh G, Fish G, Woods GL. Clinical evaluationof the enhanced Gen-Probe amplifi ed Mycobacterium tuberculosis direct test for rapid diagnosis of tuberculosis in prison inmates, J Clin Microbiol 1999; 37:1419-1425.

11. Dag Harmsen, Jorg Rothgange, Matthias Frosch, and Jurgen Albert RIDOM: Ribosomal Differentiation of Medical Micro-organisms Database, Nucleic Acids Research, 2002, January 1; 30(1):416-417.

12. Andrea Gori, Alessandra Bandera, Giulia Marchetti, Anna Degli Esposti, Lidia Catozzi, Gian Piero Nardi, Lidia Gazzola, Giulio Ferraio, Jan D.A. van Embden, Dick van Soolingen, Mauro Moroni, and Fabio Franzetti Spoligotyping and Mycobacterium tuberculosis. Emerging Infectious Diseases, vol.11, No.8, August 2005.

13. ECDC/WHO Regional Offi ce for Europe Tuberculosis surveillance and monitoring in Europe, Stockholm: ECDC 2013.

14. Richard C. Huard, Luiz Claudio de Oliveira Lazzarin, W. Ray Butler, Dick van Soolingen, and John L. Ho. PCR-Based Method To Differentiate the Subspecies of the Mycobacterium tuberulosis Complex on the Basis of Genomic Deletion, 2003. J Clin Microbiol, p. 1647-1650.

15. E.M. Streicher, T.C. Victor, G. van der Spuy, C. Sola, N. Rastogi, P. D. Van Helden, and R. M. Warren Spoligotype Signatures in the Mycobacterium tuberculosis Complex. J Clin Microbiol, 2007, p.237-240.

16. CDC http://cdc.gov/tb/programs/genotyping/17. Philip Supply Multilocus Variable Number Tanden Repeat

Genotyping for Mycobacterium tuberculosis. Technical Guide.2005. Institute de Biologie/Institute Pasteur de Lille.

18. G. Canetti, S. Froman, J. Grosset, P. Hauduroy, Miloslava Langerova, H. T. Mahler, Gertud Meissner, D. A. Mitchinson, and L. Sula. Mycobacteria: Laboratory Methods for Testing Drug Sensivity and Resistance. Bull WHO. 1963, 29: 565-578.

19. Zhang Y, Yew W. W. Mechanism of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. 2009. Int J Tuberc Lung Dis, 139(11):1320-1330.

20. M. Syaifudin Molecular Identifi cation of Mycobacterium tuberculosis and Analysis of Its Resistance to Rifampin in Sputa From Tuberculosis Suspected Patients, Atom Indonesia, vol.36, no.2(2010), 51-58.

21. Morgan M., Kalantri S., Flores L., and Pai M. A commercial line probe assay for the detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta-analysis: BMC Infect. Dis, 2005, 5: 62.

22. Somoskovi A., Dormandy J., Mitsani D., Rivenburg J., Salfi nger M. Use of smear-positive samples to assess the PCR-based genotype MTBDR assay for rapid, direct detection of the Mycobacterium tuberculosis complex as well as its resistance ti isoniazid and rifampin, 2006, J. Clin. Microbiol, 44, 4459-4463.

23. Crudu V., Romancenco E. Diagnosticul microbiologic al tuberculozei GHID. Ministerul Sanatatii din Rep. Moldova. Institutul de Ftiziopneumologie. Lab. National de Referinta in microbiologia tuberculozei, 2012.

24. Heyman S.J., Brewer T.F., Wilson M.E. (1999). The need for global action against multiresistant tuberculosis. JAMA, vol 281, No.1, 2138-2140.

25. Sandgren A., Hollo V., Huitric E., Kodmon C. Epidemiology of tuberculosis in EU/EEA in 2010 monitoring the progress towards tuberculosis elimination. Euro Surveill.2012;17(12):pii=20124.

26. WHO New laboratory diagnostic tools for tuberculosis control. Geneva: World Health Organization, 2008. http://whqlibdoc.who.int/publication/2008/9789241597487.

27. Lulette Tricia C. Bravo, Marion J. Tuohy, Concepcion Ang, Raul V. Destura, Myrna Mendoza, Gary W. Procop, Steven M. Gordon, Geraldine S. Hall, and Nabin K. Shrestha. Piroquencing for Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis Resistance to Rifampin, Isoniazid, and Fluoroquinolones. J Clin Microbiol, 2009, p. 3985-3990.

28. N. Esther Babady and Nancy L. Wengenack. Clinical Laboratory Diagnostics for Mycobacterium tuberculosis (2012), Understanding Tuberculosis Global Experiences and Innovative Approaches to the Diagnosis, Dr. Pere-Joan Cardona(Ed).

BIBLIOGRAFIE