2/8/2010

1

FIZIOLOGIA BACTERIILOR. FIZIOLOGIA BACTERIILOR.

METABOLISMUL METABOLISMUL

MICROBIAN.MICROBIAN.

NUTRINUTRIIA I RESPIRAIA IA I RESPIRAIA

BACTERIILORBACTERIILOR

Fiziologia bacterianFiziologia bacterian studiaz viaa i studiaz viaa i activitile bacteriilor activitile bacteriilor nutriia, respiraia, nutriia, respiraia, creterea i multiplicarea, condiiile de creterea i multiplicarea, condiiile de cultivare a bacteriilor.cultivare a bacteriilor.

MetabolismulMetabolismul bacterian reprezint bacterian reprezint ansamblul de reacii biochimice care au loc ansamblul de reacii biochimice care au loc n celula vie. n celula vie.

-- CatabolismCatabolism reacii chimice de reacii chimice de descompunere a substanelor complexe n descompunere a substanelor complexe n elemente simple, nsoit de degajarea elemente simple, nsoit de degajarea energiei (metabolism energetic)energiei (metabolism energetic)

-- Anabolism Anabolism reacii chimice de sintez a reacii chimice de sintez a substanelor complexe din elemente simple, substanelor complexe din elemente simple, necesit energie (metabolism constructiv, de necesit energie (metabolism constructiv, de sintez)sintez)

Particularitile metabolismului bacterianParticularitile metabolismului bacterian::

1.1. Este un metabolism Este un metabolism necompartimentatnecompartimentat , , toate toate procesele metabolice se desfoar intrprocesele metabolice se desfoar intr--o singur o singur celulcelul

2.2. Este foarte flexibil, realiznduEste foarte flexibil, realizndu--se prin diverse ci se prin diverse ci metabolice (bacteriile se adapteaz rapid la metabolice (bacteriile se adapteaz rapid la condiiile mediului)condiiile mediului)

3.3. Este foarte intens (viteza reaciilor este mare)Este foarte intens (viteza reaciilor este mare)

4.4. Produsele intermediare din procesele catabolice Produsele intermediare din procesele catabolice pot fi utilizate direct pot fi utilizate direct n calitate de precursori n calitate de precursori pentru reacpentru reaciile anabolice (amfibolism) iile anabolice (amfibolism)

n toate reaciin toate reaciile metabolicele metabolice intervin catalizatori intervin catalizatori proteici specifici proteici specifici -- enzimeleenzimele

Enzimele bacterieneEnzimele bacteriene. . Caractere generale:Caractere generale:

-- Substane proteiceSubstane proteice

-- Active n limite largi de temperaturi (0Active n limite largi de temperaturi (0--6565 C) C) i de pH (2i de pH (2--9) 9)

-- Specificitate de substrat i de aciune Specificitate de substrat i de aciune (reacioneaz cu un substrat cataliznd un (reacioneaz cu un substrat cataliznd un tip de reacie)tip de reacie)

-- Specificitatea este determinat de centrul Specificitatea este determinat de centrul activ al enzimei, complementar cu activ al enzimei, complementar cu receptorul de pe substratreceptorul de pe substrat

-- Nu se modific n cursul reacieiNu se modific n cursul reaciei

Clasificarea enClasificarea enzzimelorimelor

I.I. ConstitutiveConstitutive ((permanentepermanente))

II.II. InductiveInductive ((adaptiveadaptive)), se sintetizeaz n prezena , se sintetizeaz n prezena substratului (ex.: lactaza)substratului (ex.: lactaza)

III.III. Represive, Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea n sinteza lor este inhibat de acumularea n exces a proexces a proddusului reaciei catalizateusului reaciei catalizate

Dup locul de aciuneDup locul de aciune ((exoenzime, endoenzimeexoenzime, endoenzime))

Dup tipul reaciei catalizateDup tipul reaciei catalizate ((oxidooxido--reductaze, hidrolaze, reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze, ligazetransferaze, liaze, izomeraze, ligaze))

Dup impactul asupra ma/oDup impactul asupra ma/o

-- Enzime metaboliceEnzime metabolice

-- Enzime de patogenitateEnzime de patogenitate, responsabile de modificri , responsabile de modificri patologice ale esuturilor, celulelor ma/o : patologice ale esuturilor, celulelor ma/o : hialuronidaza, hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza, proteaze,lecitinaza, proteaze, etc.etc.

Importana practic a studierii enzimelorImportana practic a studierii enzimelor

1.1. Rol n identificarea i clasificarea Rol n identificarea i clasificarea

bacteriilor (enzimele determin activitatea bacteriilor (enzimele determin activitatea

biochimic specific a bacteriilor)biochimic specific a bacteriilor)

2.2. Unele substane chimice, antibiotice Unele substane chimice, antibiotice

interfereaz cu activitatea unor enzime, interfereaz cu activitatea unor enzime,

inhibnd creterea bacteriilor (tratament)inhibnd creterea bacteriilor (tratament)

3.3. Determinarea mecanismelor patogenezei Determinarea mecanismelor patogenezei

infeciilor (unele enzime sunt responsabile infeciilor (unele enzime sunt responsabile

de producerea leziunilor n esutul gazdei)de producerea leziunilor n esutul gazdei)

4.4. Aplicarea industrial a enzimelor Aplicarea industrial a enzimelor

2/8/2010

2

NUTRIIA BACTERIANNUTRIIA BACTERIAN

NutriiaNutriia modalitile prin care bacteriile modalitile prin care bacteriile asimileaz din mediu substanele necesare asimileaz din mediu substanele necesare pentru metabolism. pentru metabolism.

ModulModul (tipul) de nutriie la bacterii este (tipul) de nutriie la bacterii este absorbtivabsorbtiv. .

NutrieniNutrieni substane, soluiile crora pot substane, soluiile crora pot traversa MCP pentru a fi antrenate n traversa MCP pentru a fi antrenate n metabolismul celulei. Se obin din metabolismul celulei. Se obin din alimentealimente prin prin solviresolvire (sruri minerale, CO(sruri minerale, CO22, O, O22) sau dup o ) sau dup o digestiedigestie prealabil (proteine, polizaharide, lipide).prealabil (proteine, polizaharide, lipide).

La bacterii digestia este extracelular (la La bacterii digestia este extracelular (la bacteriile Gbacteriile G-- n spaiul periplasmic) n spaiul periplasmic)

Nutrienii servesc n calitate de Nutrienii servesc n calitate de material material

de construciede construcie i i surs de energiesurs de energie

pentru sinteza compuilor i meninerea pentru sinteza compuilor i meninerea

vieii bacteriei. vieii bacteriei.

Transportul transmembranarTransportul transmembranar

1. 1. Difuzie simplDifuzie simpl (conform gradientului de (conform gradientului de

concentraie, fr utilizarea energiei): concentraie, fr utilizarea energiei):

OO22, CO, CO22, acizi grai, nutrieni liposolubili, acizi grai, nutrieni liposolubili

2. 2. Difuzie facilitatDifuzie facilitat (conform gradientului de (conform gradientului de concentraie) concentraie) permite transportul permite transportul transmembranar al moleculelor mari prin transmembranar al moleculelor mari prin intermediul proteinelor de transport intermediul proteinelor de transport specifice specifice -- permeazepermeaze. .

3. 3. Transport activTransport activ (contra gradientului de (contra gradientului de concentraie, necesit energie). Particip concentraie, necesit energie). Particip permeazele i alte proteine de transportpermeazele i alte proteine de transportspecifice. Nutrienii nu suport modificri.specifice. Nutrienii nu suport modificri.

4. 4. TranslocaieTranslocaie substratul este modificat substratul este modificat (ex.: fosforilat) n timpul transportului (ex.: fosforilat) n timpul transportului membranar; necesit energiemembranar; necesit energie

Substanele care au ptruns n citoplasm Substanele care au ptruns n citoplasm

sunt descompuse de ctre enzimele sunt descompuse de ctre enzimele

bacteriene conform cilor metabolice proprii bacteriene conform cilor metabolice proprii

fiecrei specii bacteriene (ex.: Embdenfiecrei specii bacteriene (ex.: Embden--

Meyerhof, EntnerMeyerhof, Entner--Doudoroff, ciclul Doudoroff, ciclul

pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obine pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obine

energie i precursori care vor fi antrenai n energie i precursori care vor fi antrenai n

biosintez (anabolism).biosintez (anabolism).

Excreia metaboliilor Excreia metaboliilor difuzie, proteine de difuzie, proteine de

transport, liza bacterieitransport, liza bacteriei

2/8/2010

3

Necesitile nutritive ale bacteriilorNecesitile nutritive ale bacteriilor

-- Necesiti elementareNecesiti elementare, de baz: , de baz: C, H, O, NC, H, O, N n n cantiti importantecantiti importante;; S, P, Fe, Ca, Mg, KS, P, Fe, Ca, Mg, K n n cantiti mici i urme de cantiti mici i urme de Co, Cu, Zn, MoCo, Cu, Zn, Mo..

Bacteriile Bacteriile prototrofeprototrofe sunt capabile asunt capabile a--i realiza i realiza integral sinteza metaboliilor eseniali.integral sinteza metaboliilor eseniali.

-- Necesiti specificeNecesiti specifice. . BacBacteriiteriilele auxotrofeauxotrofesolicit suplimentar compui organici solicit suplimentar compui organici preformaipreformai ((factori de creterefactori de cretere)), care nu pot fi , care nu pot fi sintetizai de sintetizai de bacteriebacterie (ex.: AA, baze purinice, (ex.: AA, baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul de cultur este indispensabil creterii acestor de cultur este indispensabil creterii acestor bacterii. bacterii.

Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbonClasificarea bacteriilor dup sursa de carbon

Bacterii Bacterii autotrofeautotrofe utilizeaz COutilizeaz CO22 ca unic ca unic surs de carbon (nepatogene)surs de carbon (nepatogene)

Bacterii Bacterii heterotrofeheterotrofe utilizeaz carbonul din utilizeaz carbonul din compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli, compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli, etc) etc)

-- Bacteriile care utilizeaz materia organic Bacteriile care utilizeaz materia organic momoaart rt suntsunt saprofitesaprofite (reciclarea materiei (reciclarea materiei organice)organice)

-- BacteriiBacteriilele paraziteparazite (obligate, facultative)(obligate, facultative) triesc triesc pe contul organismelor vii, aducndupe contul organismelor vii, aducndu--le le prejudiciiprejudicii

-- BacteriileBacteriile patogenpatogenee reprezintreprezint parazit parazitee care care afecteaz grav gazda, provocnd maladie sau afecteaz grav gazda, provocnd maladie sau moartemoarte..

Surse de azotSurse de azot

-- AA sau acizi nucleiciAA sau acizi nucleici

-- Sruri de amoniu, nitrii, azot atmosfericSruri de amoniu, nitrii, azot atmosferic

Surse de substane mineraleSurse de substane minerale: :

-- S S -- din AA, sulfuri, sulfai; din AA, sulfuri, sulfai;

-- P P -- din fosfaidin fosfai;;

-- K, Mg, Ca, Na K, Mg, Ca, Na -- din sruri minerale; din sruri minerale;

-- Zn, Cu, Mn, Mo Zn, Cu, Mn, Mo din apdin ap

Clasificarea bacteriilor dup sursa de energieClasificarea bacteriilor dup sursa de energie

Bacterii Bacterii fototrofefototrofe utilizeaz energia solar utilizeaz energia solar (fotosint)(fotosint)

Bacterii Bacterii chemotrofechemotrofe folosesc energia degajat din folosesc energia degajat din reaciile chimice de oxidoreaciile chimice de oxido--reducere. Ele necesit un reducere. Ele necesit un substrat substrat donordonor de hidrogende hidrogen (e(e-- i Hi H++) i un substrat ) i un substrat acceptoracceptor de hidrogende hidrogen. n transfer particip . n transfer particip transportori intermediari de electroni (lanul transportori intermediari de electroni (lanul respirator, NAD, NADH, FAD, etc.)respirator, NAD, NADH, FAD, etc.)

-- Bacteriile Bacteriile chemolitotrofechemolitotrofe donorul de H este o donorul de H este o substan anorganicsubstan anorganic

-- Bacteriile Bacteriile chemoorganotrofechemoorganotrofe donorul de H este o donorul de H este o substan organic (glucoza, lipide...)substan organic (glucoza, lipide...)

Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofeBacteriile patogene sunt chemoorganotrofe

Mecanismele de obinere a energieiMecanismele de obinere a energiei la la

chemoorganotrofechemoorganotrofe n funcie de acceptorul n funcie de acceptorul

final de H :final de H :

Respiraie aerobRespiraie aerob. Acceptorul final este . Acceptorul final este

oxigenul gazos. Implic lanul respirator de oxigenul gazos. Implic lanul respirator de

transport al electronilor asociat MCP. Produs transport al electronilor asociat MCP. Produs

final final HH22O sau HO sau H22OO2 2 . .

Respiraie anaerobRespiraie anaerob. Acceptori finali . Acceptori finali

compui anorganici (nitrat, sulfatcompui anorganici (nitrat, sulfat, S, S). ).

Transportul de electroni prin lanul respirator. Transportul de electroni prin lanul respirator.

Produse finale Produse finale nitritul, amoniacul, sulfuranitritul, amoniacul, sulfura

((n prezenn prezena O a O HH22OO22))..

FermentaieFermentaie. Substratul organic este . Substratul organic este

metabolizat fr intervenia unui agent metabolizat fr intervenia unui agent

oxidant extern. Const n procese de oxoxidant extern. Const n procese de ox--red red

care realizeaz numai o oxidare parial a care realizeaz numai o oxidare parial a

substratului, donorul i acceptorul de Hsubstratului, donorul i acceptorul de H+ + fiind fiind

substane organice. Astfel se ajunge de la un substane organice. Astfel se ajunge de la un

substrat mai redus la o molecul mai oxidat substrat mai redus la o molecul mai oxidat

(ex.: fermentare lactic, fermentare (ex.: fermentare lactic, fermentare

alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc). alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc).

Fermentaia se poate desfura n prezena Fermentaia se poate desfura n prezena

OO22, dar fr intervenia acestuia., dar fr intervenia acestuia.

2/8/2010

4

Conservarea energieiConservarea energiei

O parte din energia eliberat se pierde sub O parte din energia eliberat se pierde sub form de cldur sau poate fi utilizat direct form de cldur sau poate fi utilizat direct sub form de energie electrosub form de energie electro--chimic (fpm) la chimic (fpm) la nivelul MCP (ex.: rotaia flagelilor, transport nivelul MCP (ex.: rotaia flagelilor, transport transmembranar) sau transmembranar) sau stocatstocat n compui n compui chimici macroergici bogai n energie: chimici macroergici bogai n energie: ATPATP((sintetizat prin fosforilare oxidativ sau sintetizat prin fosforilare oxidativ sau fosforilare la substratfosforilare la substrat), ), fosfoenolfosfoenol--piruvat, piruvat, acetilfosfat i acetilacetilfosfat i acetil--CoA.CoA.

n procesele de respiraie se elimin mai mult n procesele de respiraie se elimin mai mult energie dect din fermentaieenergie dect din fermentaie ((n glicoliz dintrn glicoliz dintr--un un mol mol de de glucozglucoz -- 38 mol38 molii ATPATP, prin fermentaie , prin fermentaie -- 2 2 moli moli ATP)ATP). n procese de fermentare se formeaz . n procese de fermentare se formeaz deeuri rejetate de ctre celul.deeuri rejetate de ctre celul.

Clasificarea bacteriilor dup Clasificarea bacteriilor dup

sursele de energie i carbonsursele de energie i carbon

I.I. Bacterii fotoautotrofe (energie solar, Bacterii fotoautotrofe (energie solar,

COCO22))

II.II. Bacterii fotoheterotrofe (en. sol., Bacterii fotoheterotrofe (en. sol.,

subst.org) subst.org)

III.III. Bacterii chemoautotrofe Bacterii chemoautotrofe

IV.IV. Bacterii chemoheterotrofe Bacterii chemoheterotrofe

(chemolitoheterotrofe, (chemolitoheterotrofe,

chemoorganoheterotrofechemoorganoheterotrofe))

2/8/2010

5

CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILORCRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR

Creterea Creterea mrirea coordonat a masei i mrirea coordonat a masei i

volumului structurilor bacteriene ca rezultat al volumului structurilor bacteriene ca rezultat al

proceselor de sintezproceselor de sintez

MultiplicareaMultiplicarea creterea numrului de celule pe creterea numrului de celule pe

o unitate de suprafa sau de volumo unitate de suprafa sau de volum

-- DiviziDiviziuune binarne binar

-- nmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)nmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)

-- Autoreproducere (virusuri)Autoreproducere (virusuri)

-- Spori (micete)Spori (micete)

-- Fragmentare (actinomicete)Fragmentare (actinomicete)

Ciclul celularCiclul celular procesele care au loc procesele care au loc de de

la formarea la formarea celulcelulei pei pna la urmna la urmtoareatoarea

diviziundiviziunee

1.1. Faza C Faza C replicarea ADNreplicarea ADN

2.2. Faza G Faza G de laten, segregarea de laten, segregarea

cromozomilorcromozomilor

3.3. Faza D Faza D de diviziune, formarea septuluide diviziune, formarea septului

Replicarea ADN depinde de masa critic a Replicarea ADN depinde de masa critic a

celulei, iar separarea cromozomilor i celulei, iar separarea cromozomilor i

diviziunea intervin n momentul cnd diviziunea intervin n momentul cnd

celula atinge o lungime celula atinge o lungime -- limitlimit

Perioada dintre 2 diviziuni reprezintPerioada dintre 2 diviziuni reprezint timpul timpul

(perioada) de generaie(perioada) de generaie ((TTGG))..

Durata TDurata TGG depinde de specie i de condiiile de depinde de specie i de condiiile de

cretere (condiii optime cretere (condiii optime vitez maxim)vitez maxim)

Bacteria TG in vitro

(min)

TG in vivo

(ore)

Escherichia coli 20-40 5

Staphylococcus aureus 40 3-5

Vibrio cholerae 10 2-3

Mycobacterium

tuberculosis

120-240 24-48

2/8/2010

6

Creterea bacteriilor n laborator Creterea bacteriilor n laborator cultivarecultivare. .

Se cultiv bacteriile pentru izolarea lor din Se cultiv bacteriile pentru izolarea lor din

medii naturale (prelevate patologice, medii naturale (prelevate patologice,

alimente, ap, etc). alimente, ap, etc).

Izolarea bacteriilor se realizeaz pentru:Izolarea bacteriilor se realizeaz pentru:

1.1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic) Identificarea mi/o (scop de diagnostic)

2.2. TestaTestarrea sensibilitii lor fa de antibioticeea sensibilitii lor fa de antibiotice

3.3. Obinerea unor produi de biosintez Obinerea unor produi de biosintez

(antibiotice, AA), bioconversie (hormoni (antibiotice, AA), bioconversie (hormoni

steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici, steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici,

etc), producerea vaccinurilor, probioticelor... etc), producerea vaccinurilor, probioticelor...

Pentru cretere bacteriile au nevoie de Pentru cretere bacteriile au nevoie de

nutrieni i condiii fiziconutrieni i condiii fizico--chimice adecvate. chimice adecvate.

Condiiile (principiile) Condiiile (principiile) de de cultivarecultivare

-- Surs nutritiv adecvatSurs nutritiv adecvat

-- Surs de energieSurs de energie

-- ApAp

-- Temperatura potrivitTemperatura potrivit

-- pH adecvatpH adecvat

-- Concentraie optim a oxigenului i a Concentraie optim a oxigenului i a COCO22

-- Presiune osmotic adecvatPresiune osmotic adecvat

Temperatura de cretereTemperatura de cretere

Exist temperaturi minime, maxime i optime Exist temperaturi minime, maxime i optime de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu temperatura optim deosebim:temperatura optim deosebim:

1.1. Bacterii psichrofile Bacterii psichrofile tt optim 10optim 10--2020 C. C. Cresc i la 0Cresc i la 0 C.C.

2.2. Bacterii mezofile Bacterii mezofile optimum 30optimum 30--3737 C C (limite 15(limite 15--4545 C)C)

3.3. Bacterii termofile Bacterii termofile optimum 50optimum 50--6060 C C (pn la 95(pn la 95 C)C)

4.4. Bacterii hipertermofile (cresc la 70Bacterii hipertermofile (cresc la 70110110 C)C)

pHpH

1.1. Bacterii Bacterii neutrofileneutrofile (majoritatea, inclusiv cele (majoritatea, inclusiv cele patogene) patogene) pH 6pH 6--7,57,5

2.2. Bacterii Bacterii acidofileacidofile pH 2pH 2--66 (Lactobacillus)(Lactobacillus)

3.3. Bacterii Bacterii alcalofile alcalofile pH pH >>88 (Pseudomonas, (Pseudomonas, Vibrio)Vibrio)

Presiunea osmoticPresiunea osmotic

1.1. Bacterii Bacterii halotolerante halotolerante (osmotolerante) (osmotolerante) cresc cresc n concentraii reduse de NaCl (mediu n concentraii reduse de NaCl (mediu izotonic cu mediul intern al gazdei) izotonic cu mediul intern al gazdei) mi/o mi/o patogenepatogene

2.2. Bacterii Bacterii halofilehalofile prefer concentraii mari de prefer concentraii mari de NaCl (1NaCl (1--30%) 30%) stafilococi, vibrioni (stafilococi, vibrioni (VVibrioibrioparahaemolyticusparahaemolyticus) )

Oxigenul Oxigenul

1.1. Bacterii Bacterii strict aerobestrict aerobe cresc doar n prezena Ocresc doar n prezena O22. . Obin energia prin respiraie aerob Obin energia prin respiraie aerob

2.2. Bacterii Bacterii microaerofilemicroaerofile necesit concentraii reduse necesit concentraii reduse de Ode O22 i 2i 2--10%10% COCO22. Obin energia prin respiraie . Obin energia prin respiraie sau fermentaie (Neisseria, Brucella, sau fermentaie (Neisseria, Brucella, CampylobacterCampylobacter))

3.3. Bacterii Bacterii strict anaerobestrict anaerobe cresc doar n absena Ocresc doar n absena O22. . Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie anaerob. Toxicitatea Oanaerob. Toxicitatea O22 formarea Hformarea H22OO2,2, a a radicalilor superoxizi Oradicalilor superoxizi O22

--, sau peroxizi O, sau peroxizi O2222-- pe care pe care

anaerobii nu le pot descompune (absena catalazei, anaerobii nu le pot descompune (absena catalazei, superoxid dismutazei, peroxidazei) superoxid dismutazei, peroxidazei) Clostridium, Clostridium, BacteroidesBacteroides

4.4. Bacterii Bacterii anaerobe aerotoleranteanaerobe aerotolerante pot crete n pot crete n prezena Oprezena O22, obin energia prin fermentaie, posed , obin energia prin fermentaie, posed peroxidaz (Lactobacillus, streptococi)peroxidaz (Lactobacillus, streptococi)

5.5. Bacterii Bacterii facultativ anaerobefacultativ anaerobe cresc n orice condiii, cresc n orice condiii, obin energia prin respiraie sau fermentaie obin energia prin respiraie sau fermentaie

2/8/2010

7

Mediile de culturMediile de cultur soluii sau substrate solide soluii sau substrate solide care asigur nutrienii i condiiile fizicocare asigur nutrienii i condiiile fizico--chimice chimice necesare cultivrii bacteriilor. Ele pot fi utilizate necesare cultivrii bacteriilor. Ele pot fi utilizate pentru cpentru cultivaultivarea rea (izolarea) (izolarea) bacteriilor, testarea bacteriilor, testarea sensibilitii la antibiotice, stocarea sau transportul sensibilitii la antibiotice, stocarea sau transportul culturilor bacculturilor bacteteriene.riene.

Cerinele fa de mediile de culturCerinele fa de mediile de cultur

-- S asigure necesitile nutritive i energeticeS asigure necesitile nutritive i energetice ale ale bacteriilorbacteriilor

-- Umiditate optimalUmiditate optimal

-- pH optimal (7,2pH optimal (7,2--7,4) i constant (caracter de 7,4) i constant (caracter de tampon) tampon)

-- Potenial de oxidoPotenial de oxido--reducere optimal (anaerobi reducere optimal (anaerobi --rHrH2210)10)

-- S fie izotonice (0,5% NaCl)S fie izotonice (0,5% NaCl)

-- S fie sterile i transparenteS fie sterile i transparente

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURCLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTUR

Dup provenienDup provenien

1.1. Empirice, naturaleEmpirice, naturale. Au la baz produse de . Au la baz produse de

origine animal sau vegetal (snge, ser, origine animal sau vegetal (snge, ser,

lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord, lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord,

creier, ficat, pete, levuri, etc)creier, ficat, pete, levuri, etc). C. Compoziia ompoziia

lor lor chimic precis nu poate fi controlatchimic precis nu poate fi controlat

2.2. SinteticeSintetice includ ingrediente chimicinclud ingrediente chimicee pure, pure,

compoziia chimic este cunoscut cu compoziia chimic este cunoscut cu

exactitate exactitate

3.3. Semisintetice Semisintetice

Dup consistenDup consisten

1.1. Medii lichideMedii lichide (bulion)(bulion) utilizate pentru utilizate pentru

obinerea biomasei bacterieneobinerea biomasei bacteriene i a i a

produselor lor (antibiotice, enzime, toxine)produselor lor (antibiotice, enzime, toxine)

2.2. Medii solideMedii solide conin 10conin 10--15% gelatin sau 215% gelatin sau 2--3% 3%

agaragar--agar (polizaharid extras din alge roii, tagar (polizaharid extras din alge roii, t

topire 80topire 80--100100 C, solidificare 42C, solidificare 42 CC)). Placa de . Placa de

geloz n cutii Petri geloz n cutii Petri este utilizateste utilizat pentru pentru

izolarea culturilor pureizolarea culturilor pure, geloza nclinat (n , geloza nclinat (n

pant) pant) pentru pentru acumularea culturilor pureacumularea culturilor pure

3.3. Medii semisolideMedii semisolide 0,2 0,2 0,5 % agar0,5 % agar--agar. Se agar. Se

utilizeaz pentru utilizeaz pentru studierea activitii studierea activitii

biochimice sau a mobilitii bacteriilor.biochimice sau a mobilitii bacteriilor.

Dup compoziia chimic Dup compoziia chimic (complexitate) (complexitate) i i

destinaiedestinaie

A. Medii uzuale (universale, simple) A. Medii uzuale (universale, simple)

1.1. Ap peptonatAp peptonat (ap+1% pepton+0,5% (ap+1% pepton+0,5%

NaCl)NaCl)

2.2. Bulion peptonatBulion peptonat BP BP (extract apos din carne (extract apos din carne

+ 1% pepton+0,5% NaCl)+ 1% pepton+0,5% NaCl)

3.3. GelozaGeloza nutritivnutritiv (BP + 2(BP + 2--3% agar3% agar--agar)agar)

4.4. Gelatina nutritivGelatina nutritiv (BP + 10(BP + 10--15% gelatin)15% gelatin)

Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor

nepretenioase la cultivarenepretenioase la cultivare

Sterilizarea prin autoclavare: 120Sterilizarea prin autoclavare: 120 C, 20 minC, 20 min

B.B. Medii complexeMedii complexe

I.I. Medii electiveMedii elective formate din medii simple cu adaos formate din medii simple cu adaos

de componente care permit creterea mi/o de componente care permit creterea mi/o

exigente nutritiv (exigente nutritiv (bulionbulion--ser, bulion glucozat, ser, bulion glucozat,

gelozgeloz--sngesnge streptococi,streptococi, neisseriineisserii; ; ser ser

coagulatcoagulat corinebacteriicorinebacterii, etc), etc)

II. Medii selectiveII. Medii selective medii solide cu adaos de medii solide cu adaos de

componente sau cu condiii fizicocomponente sau cu condiii fizico--chimice chimice

particulare care stimuleaz creterea unor specii particulare care stimuleaz creterea unor specii

i inhib creterea altor specii (i inhib creterea altor specii (geloza salingeloza salin --

stafilococistafilococi, , geloza alcalingeloza alcalin -- vibrionivibrioni, mediul , mediul

PloskirevPloskirev -- Salmonella, Shigella, etc) Salmonella, Shigella, etc)

2/8/2010

8

Mediile de mbogireMediile de mbogire reprezint medii selective reprezint medii selective lichide, utilizate pentru mbogirea florei lichide, utilizate pentru mbogirea florei patogene i inhibarea florei de asociaie dintrpatogene i inhibarea florei de asociaie dintr--un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale)un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale). . EtapEtap premergtoare nsmnrii pe medii premergtoare nsmnrii pe medii selective.selective.

-- Mediul MullerMediul Muller (BP+Lugol+CaCO(BP+Lugol+CaCO33+hiposulfit )+hiposulfit )

-- Mediul KauffmannMediul Kauffmann ((mediul mediul Muller+bil+verde de Muller+bil+verde de briliant) briliant) SalmonellaSalmonella

-- Bulion cu selenitBulion cu selenit Shigella, SalmonellaShigella, Salmonella

-- Ap peptonat alcalinAp peptonat alcalin (pH(pH==8)8) Vibrio choleraeVibrio cholerae

-- KittKitt--TarTarrrozziozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) pentru anaerobipentru anaerobi

III. Medii diferenialIII. Medii diferenial--diagnostice (DD)diagnostice (DD) permit permit diferenierea speciilor bacteriene n baza diferenierea speciilor bacteriene n baza activitii lor biochimice (zaharolitice, activitii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxidoproteolitice, lipolitice, de oxido--reducerereducere))

Sunt construite dup urmtoarea schem:Sunt construite dup urmtoarea schem:

Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)

Medii DD pentru izolarea culturii pureMedii DD pentru izolarea culturii pure

Studierea proprietilor Studierea proprietilor zaharoliticezaharolitice

EndoEndo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit(geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Nade Na))

Levin Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen)(geloz+lactoz+eozin+albastru metilen)

PloskirevPloskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de acizi biliari+verde de briliant)acizi biliari+verde de briliant)

Coloniile Coloniile lactozolactozo--pozitivepozitive vor fi vor fi coloratecolorate ((roroiiii pe pe Endo, Ploskirev, Endo, Ploskirev, albastrualbastru--violeteviolete pe pe LevinLevin))

Studierea proprietilor de oxidoStudierea proprietilor de oxido--reducerereducere

Mediul cu sulfit de BiMediul cu sulfit de Bi pentru Salmonellapentru Salmonella

(c(colonii negreolonii negre reducerea reducerea sulfitului sulfitului n n

sulfura de Bi)sulfura de Bi)

2/8/2010

9

Mediul KlaubergMediul Klauberg (geloz(geloz--snge cu telurit de snge cu telurit de

K) K) pentru pentru Corynebacterium diphtheriaeCorynebacterium diphtheriae

(colonii negre)(colonii negre)

Studierea proprietilor lipoliticeStudierea proprietilor lipolitice

Geloza cu glbenu de ouGeloza cu glbenu de ou bacteriile cu bacteriile cu

lecitinaz formeaz un halou opac n jurul lecitinaz formeaz un halou opac n jurul

colonieicoloniei

Studierea proprietilor hemoliticeStudierea proprietilor hemolitice

GelozaGeloza--sngesnge (geloza+5(geloza+5--15% snge 15% snge

defibrinat)defibrinat)

n cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o n cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o

zon clarzon clar

Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar i identificare preliminar

RusselRussel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicatorgeloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator

KliglerKligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea Hidentic Russel+sulfat de Fe (detectarea H22S)S)

OlkenikiOlkeniki identic Kligler+1% zaharoz+ureeidentic Kligler+1% zaharoz+uree

Indicatorul Andrede Indicatorul Andrede fucsin+NaOH fucsin+NaOH

Scindarea glucidelorScindarea glucidelor ((acid acid -- AA, , acidacid i i gazgaz -- AG) duce la AG) duce la modificarea pH i virajul culorii mediului din rou n modificarea pH i virajul culorii mediului din rou n galben. galben.

n pant n pant se apreciazse apreciaz lactoza/zaharoz lactoza/zaharozaa (oxidare), n (oxidare), n coloancoloan--glucoza (fermentare).glucoza (fermentare).

Producerea HProducerea H22SS nnnnegrirea mediuluiegrirea mediului

Medii DD pentru identificarea Medii DD pentru identificarea finalfinal

a a culturii pureculturii pure

-- irul pestri Hissirul pestri Hiss (lichid sau semi(lichid sau semi--solid)solid) un ir un ir de tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite de tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite glucide i indicator.glucide i indicator.

Aprecierea Aprecierea dup modificarea culorii (acid dup modificarea culorii (acid -- A) A) i apariia bulelor de gaz (acid i gaz i apariia bulelor de gaz (acid i gaz -- AG)AG)

-- Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i indicatoriindicatori

IV. Medii specialeIV. Medii speciale pentru izolarea unor pentru izolarea unor anumite bacterii (anumite bacterii (Finn, Popescu, Finn, Popescu, LoLoeewensteinwenstein--JensenJensen pentru agenii pentru agenii tuberculozeituberculozei, , SabouraudSabouraud fungifungi) )

V. Medii de transportV. Medii de transport destinate transportrii sau destinate transportrii sau

stocrii unui material (prelevat), care va fi stocrii unui material (prelevat), care va fi

examinat ulterior.examinat ulterior.

Menine n via bacteriile, fMenine n via bacteriile, frr a favoriza a favoriza multiplicarea lor.multiplicarea lor.

-- Mediul cu glicerinMediul cu glicerin 30%30%

-- Soluie tamponSoluie tampon--fosfatfosfat

-- Soluie NaCl 3%Soluie NaCl 3%

-- Mediul CaryMediul Cary--BlairBlair

-- Mediul StuartMediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de

Na, albastru de metilen) Na, albastru de metilen) pentru anaerobi, pentru anaerobi,

neisserii, etcneisserii, etc

2/8/2010

10

Pentru Pentru cultivareacultivarea bacteriilor o cantitate mic bacteriilor o cantitate mic

de material ce conine bacterii (de material ce conine bacterii (inoculuminoculum) se ) se

ntroduce ntrntroduce ntr--un mediu de cultur un mediu de cultur

((nsmnare, inocularensmnare, inoculare), care ulterior va fi ), care ulterior va fi

incubatincubat n termostat (pentru asigurarea n termostat (pentru asigurarea

temperaturii optime). temperaturii optime).

n timpul incubrii (18n timpul incubrii (18--2424--48 ore48 ore....) bacteriile ) bacteriile

cresc i se divid, formnd o cresc i se divid, formnd o cultur cultur

bacterianbacterian (totalitatea bacteriilor acumulate (totalitatea bacteriilor acumulate

prin multiplicare intrprin multiplicare intr--un mediu)un mediu). .

M.tuberculosis M.tuberculosis 33--5 sptmni5 sptmni

V.choleraeV.cholerae 66--12 ore12 ore

Cultur purCultur pur format din bacterii de format din bacterii de

aceeai specie (indispensabil identificrii)aceeai specie (indispensabil identificrii)

Cultur mixtCultur mixt compus din bacterii de compus din bacterii de

specii diferitespecii diferite

TulpinTulpin populaie microbian constituit populaie microbian constituit

din descendenii unei singure izolri n din descendenii unei singure izolri n

cultur pur, care va fi studiat ulterior.cultur pur, care va fi studiat ulterior.

Clon Clon populaie care rezult din populaie care rezult din

multiplicarea unei singure celulemultiplicarea unei singure celule

Manifestarea creterii i multiplicrii Manifestarea creterii i multiplicrii

bacteriilorbacteriilor

nn mediu lichid mediu lichid

-- Turbiditate uniformTurbiditate uniform

-- Formarea unei peliculeFormarea unei pelicule la suprafaa la suprafaa

mediului (vibrioni, yersinia)mediului (vibrioni, yersinia)

-- Formarea unui sedimentFormarea unui sediment

la fundul tubului sau pe perei la fundul tubului sau pe perei

(streptococi, (streptococi, Bacillus anthracisBacillus anthracis) )

n mediu solidn mediu solid formarea formarea coloniilorcoloniilor

ColonieColonie o aglomerare de bacterii care o aglomerare de bacterii care

se dezvolt dintrse dezvolt dintr--o singur celul sau o singur celul sau

un grup de celule (UFCun grup de celule (UFC -- unitate unitate

formatoare de coloniiformatoare de colonii) pe suprafaa unui ) pe suprafaa unui

mediu solidmediu solid

Fiecare specie bacterian formeaz Fiecare specie bacterian formeaz

colonii specifice (caracter util n colonii specifice (caracter util n

identificare)identificare)

Caracteristica coloniilorCaracteristica coloniilor

DimensiuniDimensiuni colonii mici (0,1colonii mici (0,1--1mm), medii (11mm), medii (1--2mm), mari (22mm), mari (2--3mm)3mm)

ConturContur (margini) (margini) neted, ondulat, zimat, lobat, neted, ondulat, zimat, lobat, etcetc

SuprafaSuprafa plat, bombat, convex, ombilicat, plat, bombat, convex, ombilicat, etcetc

Form Form punctiform, circular, filamentoas, punctiform, circular, filamentoas, neregulatneregulat

CuloareCuloare (pigmentaie) (pigmentaie) alb, galben, aurie, etcalb, galben, aurie, etc

Densitate Densitate opac, transparent, etcopac, transparent, etc

ConsistenConsisten cremoas, untoas, uscat, cremoas, untoas, uscat, mucoidmucoid

Tipurile de coloniiTipurile de colonii

Colonii SColonii S (smouth) (smouth) rotunde, netede, umede, rotunde, netede, umede,

lucioase lucioase

Colonii RColonii R (rough) (rough) margini neregulate, suprafaa margini neregulate, suprafaa

uscat, rugoasuscat, rugoas

2/8/2010

11

Caracterele de culturCaracterele de cultur ale bacteriilor ale bacteriilor

reprezint exigenele nutritive (medii, reprezint exigenele nutritive (medii,

temperatur, pH, aerare, etc), temperatur, pH, aerare, etc), timpul timpul

apariapariiei culturii i manifestarea iei culturii i manifestarea

creterii pe medii lichide i solidecreterii pe medii lichide i solide

Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturiDinamica multiplicrii bacteriilor n culturi

n funcie de modul de dezvoltare a culturilor n funcie de modul de dezvoltare a culturilor

bacteriene se disting:bacteriene se disting:

-- Culturi discontinue/periodiceCulturi discontinue/periodice

-- Culturi continueCulturi continue

-- Culturi sincroneCulturi sincrone

Culturile discontinueCulturile discontinue se obin la cultivarea se obin la cultivarea

bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de

culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul

microbiologicmicrobiologic

Fazele dezvoltrii unei culturi discontinueFazele dezvoltrii unei culturi discontinue

I.I. Faza de lagFaza de lag faza de adaptare la condiiile faza de adaptare la condiiile

mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc

n dimensiuni, dar nu se divid.n dimensiuni, dar nu se divid.

Durata este variabil (2Durata este variabil (2--4 ore); depinde de starea 4 ore); depinde de starea

bacteriei, condiiile mediului, etcbacteriei, condiiile mediului, etc

II.II. Faza logaritmicFaza logaritmic bacteriile cresc i se divid cu bacteriile cresc i se divid cu

vitez maximal constant, curba evolueaz vitez maximal constant, curba evolueaz

exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la

ageni antimicrobieni (ageni antimicrobieni (culturi culturi utile pentru testarea utile pentru testarea

sensibilitii la antibiotice). sensibilitii la antibiotice).

Durata Durata 88--10 ore10 ore

III. Faza staionarIII. Faza staionar rata celulelor care se multiplic rata celulelor care se multiplic

scade treptat, numrul celulelor vii rmne scade treptat, numrul celulelor vii rmne

constant mai multe ore.constant mai multe ore.

Cauza Cauza consumarea nutrienilor, acumularea consumarea nutrienilor, acumularea

metaboliilor toxici.metaboliilor toxici.

Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar

incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare). incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare).

Sensibilitatea la ageniSensibilitatea la agenii i antimicrobieni scade. antimicrobieni scade.

Durata Durata 1010--12 ore12 ore

IV. Faza de declinIV. Faza de declin (letalitate) (letalitate) bacteriile mor bacteriile mor

progresivprogresiv

2/8/2010

12

CulturCultura a continucontinu se realizeaz cnd mediul se realizeaz cnd mediul

de cultur este continuu rennoit i de cultur este continuu rennoit i

mbogit cu oxigen cu evacuarea unei mbogit cu oxigen cu evacuarea unei

cantiti de cultur. Se realizeaz n cantiti de cultur. Se realizeaz n

chemostatechemostate sau sau turbidostateturbidostate, cultura , cultura

aflnduaflndu--se permanent n faza exponenial. se permanent n faza exponenial.

Se utilizeaz n microbiologia industrial. Se utilizeaz n microbiologia industrial.

n intestin n intestin culturi continue.culturi continue.

Culturi sincroneCulturi sincrone culturi n care bacteriile se culturi n care bacteriile se

divid n acelai timpdivid n acelai timp

EXAMENUL BACTERIOLOGICEXAMENUL BACTERIOLOGIC

EExamenxamenulul bacteriologibacteriologicc constconst nn inocularinoculareaea

(nsmnarea) (nsmnarea) prelevprelevaattelorelor pepe memediidii de de

culturcultur pentru pentru izolareaizolarea culturculturilorilor purepure de de

bacterii (tulpinilor)bacterii (tulpinilor) care vor fi ulteriorcare vor fi ulterior

identifiidentificatecate, , testtestateate la sensibilitate la sensibilitate visvis--aa--vis vis

de antibiotide antibioticece, eventu, eventuaal conservl conservatate.e.

EExamenxamenulul bacteriologibacteriologicc const din cteva const din cteva

etape succesiveetape succesive,, de la de la prelevprelevarea area

(recoltarea)(recoltarea) probelorprobelor biologibiologice pn la ce pn la

remiremitereaterea rerezzultatultatelorelor. .

Faza preFaza pre--analiticanalitic (responsabilitatea medicului)(responsabilitatea medicului)

Prescrierea investigaieiPrescrierea investigaiei (n funcie de datele (n funcie de datele

examenului clinic i paraclinic). n ordonan se examenului clinic i paraclinic). n ordonan se

fixeaz identitatea medicului, a pacientului, fixeaz identitatea medicului, a pacientului,

scopul analizei, manifestrile patologice, locul, scopul analizei, manifestrile patologice, locul,

data apariiei, alte date: imunosupresie, data apariiei, alte date: imunosupresie,

tratament cu antibioticetratament cu antibiotice, graviditate, etc., graviditate, etc.

Prelevarea probelorPrelevarea probelor

-- Alegerea prelevatuluiAlegerea prelevatului (de la poarta de intrare, (de la poarta de intrare,

locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare ale locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare ale

agentului patogen) iagentului patogen) i momentul prelevriimomentul prelevrii

Materiale de examinat (prelevate) de la pacieniMateriale de examinat (prelevate) de la pacieni::

-- Secreii rinoSecreii rino--faringiene, bronicefaringiene, bronice

-- SputSput

-- PuroiPuroi

-- Exsudate, transsudateExsudate, transsudate

-- SngeSnge

-- LCRLCR

-- Urin, secreii genitaleUrin, secreii genitale

-- Mase fecale, bil, suc duodenalMase fecale, bil, suc duodenal

-- Bioptate, punctateBioptate, punctate

-- Material cadavMaterial cadaveerricic, etc, etc

Materiale de examinat din mediul externMateriale de examinat din mediul extern::

-- ApAp

-- AlimenteAlimente

-- SolSol

-- AerAer

-- LavajeLavaje

-- Vectori, etcVectori, etc

Modul de prelevare (recoltare) Modul de prelevare (recoltare)

-- n recipiente sterilen recipiente sterile

-- Respectnd regulile de autoprotecieRespectnd regulile de autoprotecie

-- La debutul boliiLa debutul bolii

-- Pn la administrarea antibioticelorPn la administrarea antibioticelor

-- Cantitate suficientCantitate suficient

TransportareaTransportarea

-- Imediat sau utiliznd medii de transport, cu Imediat sau utiliznd medii de transport, cu respectrespectarea condiiilor speciale dup necesitatearea condiiilor speciale dup necesitate

-- n ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)n ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)

-- n fia de nsoire s fie indicat identitatea n fia de nsoire s fie indicat identitatea pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data, pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevrii, scopul investigaiei, .a.)ora prelevrii, scopul investigaiei, .a.)

2/8/2010

13

EXAMENUL BACTERIOLOGICEXAMENUL BACTERIOLOGICPENTRU PENTRU CULTURILE AEROBECULTURILE AEROBE

-- PPrelevrelevaattulul estestee susupupus s examenexamenuluiuluimacroscopimacroscopicc ((modificamodificarearea aspectaspectuluiului, , a a mirosuluimirosului, , etc) etc) -- orientare norientare n diagnosticdiagnostic

-- Dup necesitate, probele sunt supuse Dup necesitate, probele sunt supuse pregtirii pentru investigaie (diluare, pregtirii pentru investigaie (diluare, omogenizare, centrifugare, etc)omogenizare, centrifugare, etc)

-- Examinarea microscopicExaminarea microscopic (preparate (preparate native, Gram, Ziehlnative, Gram, Ziehl--Neelsen, BurriNeelsen, Burri--HinsHinsss...) ...) prezena mi/o, forma, prezena mi/o, forma, cantitatea, G+/cantitatea, G+/--..

I etap I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE IZOLAREA CULTURILOR PURE

Scopul izolriiScopul izolrii -- dede a oba obiinene o o culturcultur purpur dintrdintr--unun melanmelanjj de celule bacteriene de celule bacteriene sasau u dintrdintr--un un produproduss patologipatologicc. . OO coloniecolonie separatseparatconstituie constituie oo culturcultur purpur..

TTehniehnici utilizate:ci utilizate:

1.1. Prin ePrin epuipuizarea inocululuizarea inoculului pe suprafaa gelozei pe suprafaa gelozei din cutia Petri din cutia Petri ((nsmnarensmnare n strin striuri paraleleuri paralele, , nsnsmmnnareare n n ccadranadranee, etal, etalareaarea consecutivconsecutivpepe trtreiei cutiicutii).).

2.2. Metoda diluiilor logaritmice a inoculului n Metoda diluiilor logaritmice a inoculului n geloz topit i rcit la 50geloz topit i rcit la 50 C (10C (10--11, 10, 10--22,...), ,...), apoi turnate n cutii Petri sau eprubete.apoi turnate n cutii Petri sau eprubete.

Incubare n termostat la 37Incubare n termostat la 37 C, 18C, 18--24 h (n funcie 24 h (n funcie de Tde TGG).).

2/8/2010

14

Metode speciale de izolare n culturi pure:Metode speciale de izolare n culturi pure:

-- A bacteriilor sporulate: nclzirea prealabil a A bacteriilor sporulate: nclzirea prealabil a

prelevatului 80prelevatului 80 C C 20 min20 min

-- A bacteriilor acidoA bacteriilor acido--rezistente: tratarea prealabil rezistente: tratarea prealabil

cu acid a prelevatului i neutralizarea ulterioar cu acid a prelevatului i neutralizarea ulterioar

cu o bazcu o baz

-- A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene: A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene:

mbogirea prealabil a florei patogene utiliznd mbogirea prealabil a florei patogene utiliznd

medii de mbogiremedii de mbogire

-- A bacteriilor cu virulen nalt i pretenioase la A bacteriilor cu virulen nalt i pretenioase la

cultivare: inocularea cultivare: inocularea la la animalelanimalelee de laborator de laborator

sensibile sensibile

II etap II etap ACUMULAREA CULTURII PUREACUMULAREA CULTURII PURE

-- Examinarea macroscopic a coloniilor crescute Examinarea macroscopic a coloniilor crescute

(form, culoare, dimensiuni, etc)(form, culoare, dimensiuni, etc)

-- Examinarea microscopic (frotiu Gram) a Examinarea microscopic (frotiu Gram) a

coloniilor suspecte, confirmarea puritii culturiicoloniilor suspecte, confirmarea puritii culturii

-- Repicarea coloniilor suspecte pe geloz n Repicarea coloniilor suspecte pe geloz n

pant (nclinat) pentru acumularea culturii pant (nclinat) pentru acumularea culturii

purepure

-- Termostat, 37Termostat, 37 C, 18C, 18--24 ore24 ore

III etap III etap IDENTIFICAREA CULTURII PUREIDENTIFICAREA CULTURII PURE

-- Verificarea puritii culturii (frotiu Gram)Verificarea puritii culturii (frotiu Gram)

-- IdentificareaIdentificarea culturii pureculturii pure const n evidenierea unor const n evidenierea unor caractere specifice ale caractere specifice ale acestei culturiacestei culturi pentru a o include ntrpentru a o include ntr--o o familie, gen, specie, variantfamilie, gen, specie, variant

Se studiaz caracterele:Se studiaz caracterele:

-- MorfologiceMorfologice

-- TinctorialeTinctoriale

-- De culturDe cultur

-- Biochimice Biochimice

-- Antigenice (seroidentificarea)Antigenice (seroidentificarea)

-- De patogenitateDe patogenitate

-- Sensibilitatea la bacteriofagi (fagoSensibilitatea la bacteriofagi (fago--identificarea)identificarea)

-- Sensibilitatea la antibioticeSensibilitatea la antibiotice

2/8/2010

15

STUDIEREA ACTIVITII STUDIEREA ACTIVITII

BIOCHIMICE A BACTERIILORBIOCHIMICE A BACTERIILOR

1.1. Activitatea zaharoliticActivitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea (irul Hiss, coagularea lapteluilaptelui, etc, etc) )

2.2. Activitatea proteoliticActivitatea proteolitic

-- Degradarea proteinelor native (lichefierea Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea lapteluilaptelui, etc, etc))

-- Evidenierea enzimelor ce intervin n Evidenierea enzimelor ce intervin n degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze, degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze, desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele finale ale descompunerii AA: Hfinale ale descompunerii AA: H22S, NHS, NH33, indol, , indol, etcetc

Depistarea producerii Depistarea producerii HH22S: S: formarea sulfurii formarea sulfurii de fer de culoare neagr n mediile de fer de culoare neagr n mediile multitest multitest Kligler, Olkeniki, etc; plasarea Kligler, Olkeniki, etc; plasarea unei benzi de hrtie de filtru mbibat cu unei benzi de hrtie de filtru mbibat cu acetat de Pbacetat de Pb deasupra BP n care crete deasupra BP n care crete cultura studiat (formarea sulfurii de Pb cultura studiat (formarea sulfurii de Pb nnegrete hrtia)nnegrete hrtia)

Depistarea Depistarea indoluluiindolului (produs al hidrolizei (produs al hidrolizei triptofanului) triptofanului) benzi de hrtie mbibate cu benzi de hrtie mbibate cu acid oxalicacid oxalic. n prezena indolului indicatorul . n prezena indolului indicatorul vireaz n roz.vireaz n roz.

Depistarea Depistarea amoniacului amoniacului (ureaza) (ureaza) hrtia de hrtia de turnesolturnesol se coloreaz n albastru.se coloreaz n albastru.

Depistarea Depistarea catalazeicatalazei (H(H22OO22 .... H.... H22O + OO + O22))

(cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat (cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat apariia bulelor de gaz)apariia bulelor de gaz)

Depistarea Depistarea oxidazei oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei din lanul respirator)din lanul respirator)

Reactiv Reactiv di (tetra)metildi (tetra)metil--parafenilenparafenilen--diamindiamin (benzi sau (benzi sau rondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc)rondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc)

Oxidarea reactivului Oxidarea reactivului culoare violetculoare violet--neagrneagr

Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, PseudomonasOxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas

OxidazoOxidazo-- : Enterobacteriaceae: Enterobacteriaceae

Depistarea Depistarea lecitinazeilecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% mediu cu glbenu de ou 10% --formarea unui halou opac n jurul coloniilorformarea unui halou opac n jurul coloniilor

Depistarea Depistarea lipazei lipazei mediu cu Twin 80 1%mediu cu Twin 80 1% halou opac n halou opac n jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai)jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai)

Depistarea Depistarea hemolizineihemolizinei gelozgeloz--snge 5snge 5--10% 10% -- zon clar n zon clar n jurul colonieijurul coloniei

Depistarea Depistarea ADNazei, fosfatazeiADNazei, fosfatazei, etc , etc

Probele sunt incubate la 37Probele sunt incubate la 37 C, 18C, 18--24 h24 h

Identificarea rapidIdentificarea rapid

Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde

(economie de timp, spaiu, material)(economie de timp, spaiu, material)

SistemulSistemul APIAPI o galerie din plastic format o galerie din plastic format

din numeroase alveoledin numeroase alveole care conin fiecare care conin fiecare

un mediu deshidratat diferit (glucide, AA, un mediu deshidratat diferit (glucide, AA,

etc)etc). . Alveolele sunt inoculate cu o Alveolele sunt inoculate cu o

suspensie bacterian testat i incubatesuspensie bacterian testat i incubate. .

Ulterior la necesitate se adaug reactive Ulterior la necesitate se adaug reactive

pentru detectarea metaboliilor particularipentru detectarea metaboliilor particulari..

Lectura Lectura conform unui cod de cifre sau conform unui cod de cifre sau

computerizatcomputerizat

2/8/2010

16

IV etap IV etap EVALUAREA EVALUAREA

REZULTATELOR, REZULTATELOR, FORMULAREA SI FORMULAREA SI

ELIELIBEBERAREA RSPUNSULUIRAREA RSPUNSULUI

-- Compararea rezultatelor obinute cu Compararea rezultatelor obinute cu

caracterele speciilor bacteriene caracterele speciilor bacteriene

cunoscute pentru a gsi asemnri.cunoscute pentru a gsi asemnri.

-- Exemplu de rspuns: Exemplu de rspuns: Din proba Din proba

examinat a fost izolat tulpina de examinat a fost izolat tulpina de

Corynebacterium diphtheriaeCorynebacterium diphtheriae, biovar , biovar

gravisgravis, tox+, sensibil la ...., rezistent la , tox+, sensibil la ...., rezistent la

..... .....

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBECULTURI ANAEROBE

(clostridiene, neclostridiene)(clostridiene, neclostridiene)

Condiia principal Condiia principal cultivare n absena cultivare n absena oxigenului oxigenului

1.1. Utilizarea mediilor anaerobeUtilizarea mediilor anaerobe (Kitt(Kitt--TarTarrrozzi ozzi regeneratregenerat -- 100100 C, 20 min, rcit, acoperit cu C, 20 min, rcit, acoperit cu vazelinvazelin;; nsmnarea n geloz n coloan)nsmnarea n geloz n coloan)

2. 2. Crearea condiiilor de anaerobiozCrearea condiiilor de anaerobioz

-- Metoda fizicMetoda fizic utilizarea anaerostatuluiutilizarea anaerostatului

-- Metoda chimicMetoda chimic n exicator se ntroduc n exicator se ntroduc substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz); substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz); utilizarea gautilizarea gass--pachetelorpachetelor

-- Metoda biologicMetoda biologic Fortner Fortner cultivarea cultivarea concomitent a aerobilor i anaerobilorconcomitent a aerobilor i anaerobilor

Recoltarea Recoltarea cu precauie, evitnd contactul cu precauie, evitnd contactul

cu aerul (n seringi, utiliznd medii cu aerul (n seringi, utiliznd medii

speciale)speciale)

I etap I etap MBOGIREA ANAEROBILORMBOGIREA ANAEROBILOR

-- nsmnarea prelevatului n 2 eprubete cu nsmnarea prelevatului n 2 eprubete cu

mediul Kittmediul Kitt--TaTarrrozzi regenerat rozzi regenerat

-- nclzirea unui tub la 80nclzirea unui tub la 80 CC,, 20 min 20 min

distrugerea florei nesporogenedistrugerea florei nesporogene

-- Incubarea la 37Incubarea la 37 C, 24C, 24--48 h (va avea loc 48 h (va avea loc

nmulirea anaerobilor)nmulirea anaerobilor)

2/8/2010

17

II etap II etap -- IZOLAREA CULTURII PUREIZOLAREA CULTURII PURE

DE ANAEROBIDE ANAEROBI

-- Studierea caracterelor de cultur Studierea caracterelor de cultur tulburarea tulburarea

mediului, descompunerea bucilor de ficat, mediului, descompunerea bucilor de ficat,

etcetc

-- Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda

ZeisslerZeissler (nsmnarea a 0,1 ml din mediul (nsmnarea a 0,1 ml din mediul

KK--T pe 3 cutii cu gelozT pe 3 cutii cu geloz--snge glucozat snge glucozat

consecutiv). Incubarea n consecutiv). Incubarea n

anaerostat/exicator/gaanaerostat/exicator/gass--pack, 24pack, 24--48 h48 h

-- Metoda Metoda WeinbergWeinberg diluii succesive ale diluii succesive ale culturii n geloz glucozat lichefiat i culturii n geloz glucozat lichefiat i aspirarea n tuburi lungi i nguste, nchise aspirarea n tuburi lungi i nguste, nchise ermetic. Incubarea n termostat, 24 hermetic. Incubarea n termostat, 24 h

III etap III etap -- ACUMULAREA CULTURII PUREACUMULAREA CULTURII PURE

-- Studierea macroscopic a coloniilorStudierea macroscopic a coloniilor

-- Examinarea microscopic (frotiu Gram) a Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspectecoloniilor suspecte

-- Repicarea n mediul KRepicarea n mediul K--T regenerat pentru T regenerat pentru acumularea culturii pureacumularea culturii pure

-- Incubarea n termostat, 24 hIncubarea n termostat, 24 h

IV etap IV etap -- IDENTIFICAREA CULTURII IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBIPURE DE ANAEROBI

-- Verificarea puritii Verificarea puritii culturii pureculturii pure (frotiu (frotiu Gram)Gram)

-- Studierea caracterelor culturii pure izolate Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiiilor de (cu respectarea condiiilor de anaerobioz)anaerobioz)

V etap V etap -- EVALUAREA REZULTATELOR, EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA I ELIBERAREA FORMULAREA I ELIBERAREA

RSPUNSULUIRSPUNSULUI