EVALUAREA FENOTIPICÅ ªI FUNCºIONALÅ A LIMFOCITELOR ... · Odatå cu înaintarea în vârstå,...

REVISTA ROMÂNÅ DE BOLI INFECºIOASE – VOL. XI, NR. 4, AN 2008 197

3

INTRODUCERE

Disfunc¡ia imunå progresivå legatå de vârsta-imunosenescentå, rezultå din pierderea anumitoractivitå¡i imune simultan cu cre¿terea altora.Imunosenescen¡a are trei consecin¡e majore:cre¿terea inciden¡ei ¿i severitå¡ii bolilor infec¡ioase,apari¡ia bolilor autoimune ¿i a cancerelor.

Evaluarea fenotipicå ¿i func¡ionalå apopula¡iilor de celule ale sistemului imun esteimportantå pentru definirea stårii de sånåtate sauboalå a unui pacient. Obiectivul studiului actual afost analizarea modificårii fenotipice ¿i func¡ionalea limfocitelor din sângele periferic ¿i corelarea lorcu statusul clinic, la popula¡ia vârstnicå.

EVALUAREA FENOTIPICÅ ªIFUNCºIONALÅ A LIMFOCITELOR

PERIFERICE LA VÂRSTNICIFunctional phenotypic evaluation of

peripheral lymphocytes in elderly

Iuliana Apostol*, Petre Calistru**, Emanoil Ceausu**, Alma Tudor*,Gheorghe Voiculescu*, Cristina Voinea*, Cazan Andreea***

*Funda¡ia „Dr. Victor Babe¿“, Bucure¿ti**UMF „Carol Davila“ - Clinica de Boli Infec¡ioase ¿i Tropicale „Dr.Victor Babe¿“

***UMF „Carol Davila“ - Facultatea de Medicinå Generalå (student)

REZUMATEste cunoscut faptul cå func¡ia imunå scade odatå cu vârsta. Existå posibilitatea ca modificarea sistemului imun så fie un factorpredispozant critic în procesul îmbåtrânirii; identificarea modificårilor imunitå¡ii la vârstnici poate aduce informa¡ii noi în elucidareamecanismelor îmbåtrânirii. Odatå cu înaintarea în vârstå, existå alteråri în imunitatea dobânditå, în special în celulele sistemulimun-limfocite T ¿i B. Mai pu¡in documentate apar ¿i modificårile legate de imunitatea înnåscutå (celule dendritice, macrofage, PMN¿i complement) cât ¿i de imunitatea mucoasei.Cuvinte cheie: imunosenescenta; flowcitometrie; interleukine; limfocite T, varstnici.

ABSTRACTIt is known that immune function decreases with age. There is the possibility that changes in the immune system to be a criticalpredisposing factor in the aging process; defining the immunological dysfunctionality in the elderly can add a new insight into theaging mechanisms. Getting older, there are alterations in the acquired immunity, especially in cells of the immune system T and Blymphocytes. Less scientifically proved are alterations in the innate immunity (dendritic cells, macrophages, polymorphonuclearleucocytes and complement) and in the mucosal immunity.Keywords: immune senescence, flowcytometry, interleukins; T-lymphocytes, elderly.

Evaluarea fenotipicå s-a efectuat princuantificarea numårului de celule din serialimfocitarå-în principal limfocite T, pe baza flow-citometriei. În identificarea celulelor este aplicatåtehnologia citometriei în flux, bazatå pe markeriiantigenici. Principiul metodei: anticorpiimonoclonali marca¡i fluorescent sunt pu¿i încontact cu proba de sânge periferic; anticorpii sevor fixa pe markerii antigenici ai celulelor sanguineiar trecerea celulelor marcate prin tubul capilar alaparatului va fi înso¡itå de o måsurare a numåruluiacestor celule. Celulele apar ca aglomeråri depuncte ¿i alcåtuiesc popula¡ii celulare distincte iaraparatul înregistreazå valorile sub formå graficå¿i procente de clase ¿i subclase din popula¡iilecelulare testate.

Adresa de coresponden¡å:Dr. Iuliana Apostol, Funda¡ia „Dr. Victor Babe¿“, ªos. Mihai Bravu, Nr. 281, Sector 3, Bucure¿ti

198 REVISTA ROMÂNÅ DE BOLI INFECºIOASE – VOL. XI, NR. 4, AN 2008

Determinarea func¡ionalitå¡ii limfociteloreste poate mai importantå decât determinareacantitativå a subseturilor de limfocite. Panelul dedeterminåri cel mai frecvent cuprinde inter-leukinele de tipul: IL1, IL2R, IL6, IL8 ¿i tumornecrosis factor: TNF alpha. IL1 activeazånespecific limfocitul T, B, NK ¿i macrofagul. IL2activeazå cre¿terea ¿i diferen¡ierea celulelor T. IL6activeazå celulele B, secre¡ia plasmocitelor ¿icelulele stem hematopoetice. IL8 activeazåchemotaxia neutrofilelor. Hiperproduc¡ia de TNFalpha este legatå de o varietate de boli inflamatorii(poliartita reumatoida, boala Crohn etc) ¿i cancere.

MATERIAL ªI METODA

În perioada Oct 2006-Mai 2008, în cadrulcontractului de cercetare CEEX 137/2006, a fostefectuat un studiu clinic prospectiv pe un lot de49 vârstnici (persoane peste 60 ani), fårå infec¡iirespiratorii acute sau semne de inflama¡ie acutå înmomentul înrolårii (L0). Vârstnicii au fostexamina¡i geriatric pentru apari¡ia de infec¡ii acuterespiratorii, cancere ¿i boli autoimune ¿i din punctde vedere imunologic, prin fenotipareasubpopula¡iilor de limfocite T ¿i determinarea deinterleukine. Evaluarile clinico-imunologice aufost efectuate la momentele ini¡ial (L0), 1 lunå (L1),3 luni (L3), 12 luni (L12) ¿i 13 luni (L13),concomitent cu douå interven¡ii preventive:vaccinare dualå - antigripalå ¿i antipneumococicåcu Vaxigrip ¿i Pneumo23 (la L0) si vaccinareaantigripala cu Vaxigrip (la L12).

Metodele utilizate au constat în:– Examinare geriatricå pentru eviden¡ierea de

infec¡ii, boli autoimune sau cancere.– Hemoleucograme - efectuate din probe de

sânge recoltat pe K3-EDTA, cu ajutorulanalizorului CELL DYN 3700 (ABBOTT);

– Fenotiparea limfocitelor T - din probe de sânge

recoltat pe K3-EDTA, cu ajutorul citometruluiFACSCalibur, cu reactivi TriTEST CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP, cu TruCOUNT (BectonDickinson).

– Determinarea cantitativå a interleukinelor(IL2R, IL6, IL8) si TNF? din ser - princhemiluminiscentå, cu ajutorul analizoruluiIMMULITE (DPC).Endpointul primar urmårit a fost apari¡ia

infec¡iei gripale sau pneumococice, în ciuda stra-tegiilor preventive aplicate. Endpointul secundarurmårit a fost apari¡ia altor infec¡ii, cancere sauboli autoimune. Din punct de vedere geriatric s-aurmårit determinarea unui profil de risc desusceptibilitate la infec¡ii, a anumitor parametriclinico-biologici, care pot diagnostica în faze sub-clinice sau precoce infec¡ii acute/cronice, boli auto-imune ¿i cancere.

RezultateStructura lotului de vârstniciLotul de vârstnici a fost compus din 49 pacien¡i

iar tabelul urmåtor aråta structura pe grupe devârsta este cea din tabel.

Tabel 1 – fenotiparea limfocitelor, valori normale

Tabel 2 – structura pe grupede vârste ¿i sexe a lotului

Evaluarea geriatricåNu s-au înregistrat cazuri de gripå sau infec¡ie

pneumococicå, dar au existat alte afec¡iuni dedisreglare imunå în cadrul lotului de vârstnici(infec¡ii acute ¿i cronice, cancere, boli autoimune).Au fost aplicate douå interven¡ii preventive: L0-vaccinare dualå ¿i L12-vaccinarea antigripalå.

199REVISTA ROMÂNÅ DE BOLI INFECºIOASE – VOL. XI, NR. 4, AN 2008

Tabel 3 – afec¡iunile clinice legate de disreglarea imunå


Tabel 4 – Fenotipare limfocite la momentele L0, L1, L3, L12 si L13.


Tabel 5 – determinarea IL2, IL6 la momentele L0, L1, L3, L12 si L13

Valori normale

Ltot=4400-10000/microl; L=1000-4800/microl;CD3=720-2330/mm3; CD4=500-1500/mm3;CD8=200-1100/mm3; CD4/CD8=0,8-3,4/mm3;NK=90-590/mm3; LB=90-660/mm3 .

Imunologic-determinarea interleukinelor

IL1 a condus la valori normale (sub 5 U/ml)pentru întreg lotul, la vizita L0 ¿i L1, motiv pentrucare s-a renun¡at la aceastå determinare. Au fostdeterminate IL2R, IL6, IL8 ¿i TNF alpha lamomentele L0, L1, L3, L12 si L13.


Tabel 6 – determinare IL8 si TNFá la momentele L0, L1, L3, L12 si L13


REZULTATE

Evaluarea geriatricå

În cadrul lotului nu a fost înregistrat endpointulprimar (infec¡ii gripalå ¿i infec¡ia pneumococicå).Au fost înregistrate infec' acute-11 cazuri (bron¿itaacutå, cistita acutå) ¿i infec¡ii cronice-4 cazuri(infec¡ie urinarå cronicå, panari¡iu deget picior laun diabetic, plasmocitoza cronicå, infec¡ie viralåHCV).

Din cei 49 pacien¡i vârstnici am înregistrat 6cazuri confirmate de cancere (1 cancer mamar, 1colo-rectal, 1 corp uterin, 1 sigmoid, 1 buzåsuperioarå, 1 caz de tumorå primarå mamarå ¿icarcinom bazocelular), 1 suspiciune cancer mamar(încå neconfirmatå bioptic) ¿i 1 tumora benignapleoapa superioarå, operatå. În lot 1 pacient a fostînregistrat cu boala autoimunå: tiroidita autoimunå¿i lichen plan.

Evaluarea imunologicå

Am efectuat o corelare a clinicii cu testeleimunologice, analizând ini¡ial cazurile cudiagnostic confirmat de cancere sau alte tumori,infec¡ii acute sau cronice ¿i boli autoimune.

Cazuri de cancer/suspiciune cancer/tumori

• Pacientul 8, B.A/F, Neoplasm de corp uterin,operat; a prezentat limfocite scazute sau lalimita inferioara (L0, L1, L3 si L12), cu CD3scazut (la L1, L3) si CD4 scazut (L0, L1, L3 siL12); interleukinele au prezentat valori normale.

• Pacienta 22, G.V./F, Neoplasm mamar operat+ RT, Carcinom bazocelular operat; a prezentatvalori scåzute pentru CD3 si CD8 (L1 ¿i L13)¿i numår scåzut de limfocite ¿i CD4 (la L1);interleukinele au fost normale.

• Pacientul 28, H.I./B, Neoplasm de sigmoidoperat (în urmå cu 20 ani); a prezentat valorinormale la fenotiparea limfocitelor T; valoricrescute pentru IL6 ¿i TNF? (L13).

• Pacienta 29, M.A./F, Neoplasm mamar operat

+ CT +RT; a prezentat valori scåzute pentruCD4 (L0, L1 ) ¿i valori normale pentruinterleukine.

• Pacientul 32, N.J./B, Neoplasm de buza operat+ recidivat local + tratat chirurgical; a prezentatlimfocite scåzute (L0 si L12), cu CD3 ¿i CD4scåzute (L0, L1, L12); interleukine crescute:IL2R ¿i IL6 (L1) si TNF? crescutå (L13).

• Pacienta 39, P.P/F, Neoplasm colo-rectal operat+ RT + CT; a prezentat valori scåzute delimfocite, CD3, CD4 ¿i CD8 (L12, L13); valorinormale interleukine.

• Pacienta 42, R.I/F, Neoplasm mamar operat(recent, pe perioada monitorizårii), Infec¡ierespiratorie superioarå acutå (Bron¿itå acutå);CD8 scåzute (L13) iar IL valori normale.

• Pacienta 41, P.I./F, Suspiciune neoplasmmamar, necesitå biopsie; infec¡ie urinarå joasåacutå; a prezentat valori scåzute pentru CD3 ¿iCD4 (la L1); IL2R valori crescute (L1, L3,L13), IL6 valori crescute (L1, L13), TNF?crescutå (L12).

• Pacienta 47, S.M./ F, Tumora marginalåpleoapa superioarå, operatå; valori normalepentru fenotipare limfocite ¿i interleukine.

Boli autoimune

• Pacienta 40, P.V./F, Tiroidita autoimunå ¿ilichen plan; a prezentat leucocite totale scåzute(L12 si L13), cu inversarea raportului CD4/CD8(L3, L12 ¿i L13) ¿i cre¿terea TNF? lamomentele L0, L3 si L13.

Infec¡ii cronice

• Pacienta 15, C.V./F, Infec¡ie urinarå cronicå,acutizatå; CD4 scåzut (L0 si L1); interleukinenormale.

• Pacienta 19, F.F./F, infec¡ie cronicå cu virushepatic C; leucocite valori scåzute (L0, L1, L12si L13) ¿i limfopenie (L0, L1, L12 ¿i L13);valori intens crescute pentru IL2R (L0, L1, L3,L12 ¿i L13); IL6 crescutå (L13); IL8 intenscrescutå (L0, L1, L3, L12 ¿i L13).


• Pacienta 23, G.E./F, infec¡ie urinarå cronicå,acutizatå; fenotipare normalå; IL2R valorifoarte crescute (L0, L1, L3, L12 ¿i L13) ¿i IL8valori crescute (L0, L1, L3, L12 ¿i L13).

• Pacienta 46, S.D./F, panari¡iu deget picior;limfocite scåzute (L1, L12), CD3 scåzut (L1,L12 si L13), CD4 scåzut (L1 si L13); IL6crescutå ( L12) .

• Pacienta 48, T.M./F, plasmocitoza cronicå ¿izona-zoster fesier; leucocitoza (L0, L1, L12)¿i CD4 scåzut (L3 ¿i L12); IL2R mult crescutå(L0, L1, L3, L12, L13), IL8 crescutå (L0, L1,L3, L12, L13).

Infec¡ii acute

• Pacienta 9, B.V/F, Bron¿ita acutå; leucocitetotale scåzute ¿i raport CD4/CD8 inversat (L0,L1 si L13) ; IL normale .

• Pacienta 10, B.G./F, Cistita acutå; CD4 scåzut(L0, L1, L3, L12 ¿i L13), IL6 ¿i TNF? crescutela toate determinårile.

• Pacientul 12, C.Ez./B, Bron¿ita acutå; leucocitetotale crescute (L12) ¿i TNF? crescute (L0, L1si L12).

• Pacientul 16, D.I./B, Bron¿ita acutå; fenotiparenormalå; TNF? crescute în toate determinårile.

• Pacientul 30, N.N./B, Bron¿ita acutå;fenotiparenormalå; IL normale

• Pacientul 31, N.A./F, Bron¿ita acutå;CD3 siCD4 crescute (L0 ¿i L1); Il2Rsi TNF? crescuteîn toate determinårile

• Pacientul 37, P.C./F, Bron¿ita acutå;fenotiparenormalå; IL6 crescutå (L3, L12 si L13) ¿i TNF?(L0, L1, L3, L12 ¿i L13)

• Pacientul 38, P.A./F, Cistita acutå; CD8 scåzut¿i raport CD4/CD8 inversat (L1, L12 ¿i L13);IL8 crescutå (L13) si TNF? crescutå (L0 ¿i L13)

• Pacientul 49, T.V/B, Bron¿ita acutå; fenotiparenormalå; IL8 crescutå (L3)

DISCUºII

Cazurile identificate cu neoplasme au înregistratmodificåri în fenotiparea limfocitelor T (CD3, CD4sau CD8 scåzute) ¿i numår scåzut de limfocite,exceptând 1 pacient operat cu peste 10 ani în urmå,la care fenotiparea este normalå. La aceste cazuricu neoplasme, valorile interleukinelor au fostnormale în 5 cazuri, iar în alte 3 cazuri au prezentatvalori crescute (pentru IL2R, IL6 ¿i TNF? – 3 cazuri¿i pentru IL8 – 1 caz).

Cazul de boalå autoimunå a prezentatmodificåri în fenotiparea limfocitelor-inversarearaportului CD4/CD8 dar ¿i cre¿terea TNF?, dar

numårul insuficient de cazuri nu premite oconcluzie în acest sens.

Cazurile de infec¡ii cronice sunt înso¡ite decre¿terea IL: IL2R, IL6 ¿i IL8, diferit în func¡ie detipul infec¡iei incriminate. Din cele 9 cazuri deinfec¡ii acute, 6 cazuri au prezentat cre¿teri aleTNF? ¿i 3 cazuri au avut IL normale.

Acest studiu nu a inclus analizarea influen¡eivaccinårii pe func¡ia imunå-prin fenotipare saudeterminare a interleukinelor, dar momentele L0,L1, L3, L12 ¿i L13 au fost utilizate ca momentecheie în monitorizarea pacien¡ilor, concomitentevaccinårii, în care au fost efectuate testårile imune.

CONCLUZII

1. Studiul clinico-imunologic a fost efectuat peun lot de 49 vârstnici (persoane peste 60 ani),fårå infec¡ii respiratorii acute sau semne deinflama¡ie acutå în momentul înrolårii (L0).

2. Structura pe grupe de vârstå ¿i sexe a lotuluide studiu a aråtat: 49 pacien¡i, 36 femei(73,46%) ¿i 13 barba¡i (26,53%), cu vârstamedie de 70.68 ani.

3. Monitorizarea pentru infec¡ii la vârstnici aaråtat: infec¡ii acute-11 cazuri (bron¿ita acutå,cistita acutå) ¿i infec¡ii cronice-4 cazuri (infec¡ieurinarå cronicå, panari¡iu deget picior la undiabetic, plasmocitoza cronicå, infec¡ie viralåHCV).

4. Monitorizarea pentru cancere la vârstnici aaråtat: 6 cazuri confirmate de cancere (1 cancermamar, 1 colo-rectal, 1 corp uterin, 1 sigmoid,1 buza superioarå, 1 caz de tumorå primaråmamarå ¿i carcinom bazocelular); 1 suspiciunecancer mamar (încå neconfirmatå bioptic); 1tumora benignå pleoapa superioarå, operatå.

5. Monitorizarea pentru boli autoimune a aråtat:1 pacient cu tiroiditå autoimunå ¿i lichen plan.

6. În cadrul lotului au existat 24 subiec¡i vârstnicicu cel pu¡in una din consecin¡ele alteråriiimunitå¡ii (tumori, infec¡ii acute/cronice, boliautoimune); aceste cazuri au prezentatmodificåri în fenotiparea limfocitelor T cât ¿imodificåri func¡ionale ale limfocitelor. Restulde 25 subiec¡i vârstnici nu au prezentatmodificåri clinice; cel pu¡in 50% dintre ace¿tiaau prezentat alteråri în fenotiparea limfocitelorT ¿i interleukinelor, ceea ce ar putea fi utilizatîn definirea unui anumit profil de riscimunologic asociat dezvoltårii uneia dinconsecin¡ele imunosenescen¡ei.Identificarea unui profil de risc imunologic

råmâne un deziderat în vederea diagnosticåriiprecoce a susceptibilitå¡ii de dezvoltare de boliasociate îmbåtrânirii sistemului imun.


BIBLIOGRAFIE

1. Andrei Olinescu, Mircea Panait – Introducere în imunologie,editura Medica 2004; ISBN 973-7912-22-5;

2. The Merck Manual of Geriatrics, Chapter 131: Aging and theImmun System.

3. Giuseppina Colonna-Romano, Arne N. Akbar, AlessandraAquino, Matteo Bulati, Giuseppina Candore, Domenico Lio,Pietro Ammatuna, Jean M. Fletcher, Calogero Caruso andGraham Pawelec – Impact of CMV and EBV seropositivity on CD8T lymphocytes in an old population from West-Sicily; ExperimentalGerontology, Volume 42, Issue 10, October 2007, Pages 995-1002;

4. Juda Liu(1), Shu Wang, Hongtao Liu, Chunling Zhang, Liping Yang,Jinglian Zhang5 – The immunomarker of aging and the modulatoryeffect of Chinese medicinal herbs on the dysfunction of lymphocytesin the elderly; Journal of environmental pathology, toxicology andoncology ISSN 0731-8898 CODEN JEPOEC; 2000, vol. 19, no1-2, pp. 153-158;

5. Lia Ginaldi, Massimo De Martinis, Marco Modesti, FrancescaLoreto, Maria Pia Corsi, Dennis Quaglino– Immunophenotypical Changes of T Lymphocytes in the Elderly,Gerontology 2000;46:242-248

6. Ronny A. Bell, PhD, MS, Kevin P. High, MD – Alterations ofImmune Defense Mechanisms in the Elderly: The Role of Nutrition,Top Nutrition Newsletter, volume 1, no 4, APRIL 1998; BowmanGray School of Medicine.

7. Kopinski P. – Use of flow cytometry in evaluation of cellularchanges in interstitial lung diseases; Folia Med Cracov, 1997; 38 (3-4);69-115; PMID: 10481384 [PubMed-indeed for MEDLINE];

8. Wolters M, Strohle A, Hahn A. – Age-associated changes in themetabolism of vitamin B12 and acid folic: prevalenceaetiophatogenesis and pathophysiological consequences; Z GerontolGeritr. 2004 Apr; 37 (2):109-35; PMID: 151003481[PubMed-indeedfor MEDLINE];

9. Lia Ginaldi, Massimo De Martinis, Marco Modesti, FrancescaLoreto, Maria Pia Corsi, Dennis Quaglino –Immunophenotypical changes of T lymphocytes in the elderly;International Journal of Experimental, Clinica, Behavioral,Regenerative and Technological Gerontology , Vol 46, Nr 5, 2000;

10. V Pope, S A Larsen, R J Rice, S N Goforth, C E Parham, andM B Fears – low cytometric analysis of peripheral blood lymphocyteimmunophenotypes in persons infected with Treponema pallidum;Clin Diagn Lab Immunol. 1994 January; 1(1): 121-124

11. HG Hoffkes, G Schmidtke, M Uppenkamp and U Schmucker– Multiparametric immunophenotyping of B cells in peripheral bloodof healthy adults by flow cytometry; Department of Medicine,University of Essen, Germany; Clinical and Diagnostic LaboratoryImmunology, 01 1996, 30-36, Vol 3, No. 1

12. Inmaculada Gayoso, M. Luisa Pita, Esther Peralbo, CoronaAlonso, Olga DelaRosa, Javier G. Casado, Julian de la TorreCisneros, Raquel Tarazona and Rafael Solana – Remodellingof the CD8 T Cell Compartment in the Elderly: Expression of NKAssociated Receptors on T Cells Is Associated with the Expansion ofthe Effector Memory Subset; http://www.eurekah.com/chapter/3434

13. Sudhir Gupta – A Matter of Life and Death of T – Lymphocytes inImmunosenescence; http://www.eurekah.com/chapter/3583

EVALUAREA FENOTIPICÅ ªI FUNCºIONALÅ A LIMFOCITELOR ... · Odatå cu înaintarea în vârstå,...

Documents

Transcript of EVALUAREA FENOTIPICÅ ªI FUNCºIONALÅ A LIMFOCITELOR ... · Odatå cu înaintarea în vârstå,...