UNIVERSITATEA „BABEŞ–BOLYAI” CLUJ–NAPOCA

FACULTATEA DE FIZICĂ

LUCRARE DE DIPLOMĂ

ANALIZA DROGURILOR PRIN

CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU

SPECTROMETRIE DE MASĂ

ÎNDRUMĂTOR, ABSOLVENT,Lector dr. Culea Monica Mariş Grigoriţă-Ioan

CUPRINS :

I. CAPITOLUL 1………………………………………………………….21. Analiza calitativă şi cantitativă………………….…….………………………2

II. CAPITOLUL 2………………………………………………………….61. Spectrometria de masă…………………………………………..…………….6

a. Elementele spectrometrului de masă………………………...….7b. Sistemele de introducere……………………………...…………8c. Surse de ioni………………………………………………….....9d. Analizorul de masă………………………………………...…..12e. Procesul de fragmentare moleculară. Procesul de

ionizare…………………………………………..…………….14f. Spectrul de masă…………………………………………….....15g. Detecţia ionilor. Sensibilitatea spectrometrului…………….....15h. Înregistrarea şi achiziţia datelor MS…………………………...16

III. CAPITOLUL 3………………………………………………………...181. CROMATOGRAFIA DE GAZE………………………………...18

a. Detecţia………………………………………………………...21b. Metode de prelucrare a informaţiei cromatografice…………...25c. Lărgimea benzii cromatografice……………………………….26d. Numărul de talere…………………………...…………………30e. Rezoluţia ……………………………………………...……….31

IV. CAPITOLUL 4………………………………………….……………..331. Droguri………………………………………………………………...332. ANALIZA DROGURILOR CU AJUTORUL CUPLAJULUI

GC-MS..…………………………………………………….383. Determinarea unor compuşi toxici din substanţe de

abuz……………………………………………………………………46CONCLUZII……….…………………………………………………………52Bibliografie…………………………………………………………………….54

1

CAPITOLUL 1

ANALIZA CALITATIVĂ ŞI CANTITATIVĂ

Determinarea calitativă şi cantitativă a unor compuşi prezenţi în diferite medii

biologice cum ar fi în organismele vii sau în diferite produse rezultate în urma unor

tehnologii mai mult sau mai puţin complicate, este un subiect de cercetare modern. Pentru a

obţine determinarea până la nivel de nanograme sau picograme a unor compuşi de interes,

este nevoie să se facă de mai multe ori analiza acelor probe. Domeniului de interes pot să îi

aparţină compuşii poluanţi din mediul înconjurător, medicamentele din diferite matrici,

compuşi organici de relevanţă biomedicală din organismele vii, etc. Indiferent de compusul

de interes de identificat, este nevoie să se parcurgă două etape la fel de importante:

a) scoaterea compusului de interes din matrice, cu randament ridicat;

b) aducerea compusului de interes la nivelul de sensibilitate al metodei de analiză abordate

(îmbogăţirea compusului de interes) printr-o procedură de extracţie adecvată şi determinarea

sa cantitativă printr-o metodă de analiză de încredere.

Metodele de analiză trebuie să fie validate, adică să li se demonstreze corectitudinea.

Validarea metodei de analiză parcurge testarea unor parametrii de validare utilizând probe

etalon cu concentraţii cunoscute ale compuşilor de interes. De asemenea, metodele de analiză

trebuie să fie precise şi exacte, să beneficieze de un detector cu liniaritate de răspuns în

domeniul de interes, să aibă selectivitate, sensibilitate, specificitate, reproductibilitate, să

permită automatizarea datelor, să permită standardizarea acestor date, adică prelucrarea

datelor experimentale să fie posibilă on-line.

În general, orice metodă de analiză cuprinde următoarele etape:

Extracţia. Analiţii pot fi izolaţi prin diferite proceduri: extracţia lichid-lichid (LLE =

liquid-liquid extraction), extracţia pe fază mobilă(SPE = solid phase extraction), ultrasonicare

(USE = ultrasonication extraction), extracţia cu microunde (MWE=microwave extraction),

extracţia la temperatură supercritică (SFE). Extracţiile cu o cantitate mare de impurităţi se

purifică cu alumină, florisil, silicagel.

Analiza calitativă detectează prezenţa în probă a compusului de interes (analitului).

Acesta va fi obţinut în funcţie de sensibilitatea detectorului aparatului, randamentul de

2

extracţie, a aşa numitei limite de detecţie a metodei de analiză. Deci analiza calitativă infirmă

sau confirmă prezenţa compusului de interes în proba analizată.

Analiza cantitativă. În acest scop, sunt necesare etaloane şi amestecuri de etaloane în

cantităţi bine determinate - kituri, materiale de referinţă certificate (MRC), pentru testarea

metodelor. Dacă analiza calitativă confirmă sau infirmă existenţa compusului de analizat în

probă, analiza cantitativă ne dă cantitatea de compus aflată în probă. Această analiză este

foarte complexă când este vorba de a determina cantităţi de ordinul microgramelor,

nanogramelor şi picogramelor de analit. De aceea este necesar ca limita de determinare

cantitativă să atingă nivelul de cantitate dorit.

Importanţa analizei cantitative constă în faptul că datele pe care le dă aceasta sunt

uneori elemente de bază în deciziile economice, juridice, criminalistice, medicale ce vor fi

luate. Importanţa acestei metode este prezentată în capitolul Analiza drogurilor cu ajutorul

GC-MS.

Dacă se urmăreşte evoluţia cantitativă a unui analit în timp spunem că realizăm

monitorizarea lui, adică analiza cantitativă fizico-chimică în timp.

Detecţia. Se utilizează foarte multe tipuri de detectori. De exemplu, pentru

cromatografia de gaze, cele mai comune sunt detectoarele cu ionizare în flacără, (FID - flame

ionization detection), sau cazul ideal este detectorul spectrometru de masă (MS - mass

spectrometry) care dă siguranţa lipsei suprapunerilor de componenţi în cazul analitului

studiat. Detecţia se realizează cu un detector care este înglobat într-un instrument sau

echipament de obicei foarte complex.

Validarea metodelor de analiză. A valida o metodă de analiză înseamnă a demonstra

că metoda este corectă. Strategia validării cuprinde scopul, caracteristicile, performanţele,

limitele de acceptanţă. Peste 90% din valoarea erorii statistice ce însoţesc o determinare

analitică sunt produse din cauza efectuării necorespunzătoare a etapelor premergătoare

analizei adică: prelevarea şi pregătirea probelor, dizolvarea şi pretratarea lor pentru a le aduce

într-o formă măsurabilă, adică la nivel de concentraţie măsurabilă. Se examinează parametrii

metodei de analiză:

liniaritatea de răspuns

domeniul de interes

precizia şi reproductibilitatea de la o zi la alta

3

exactitatea

limita de detecţie (LOD) şi limita de determinare cantitativă (LOQ)

randamentul de extracţie

specificitatea

selectivitatea şi robusteţea

Liniaritatea de răspuns a unei metode de analiză reprezintă capacitatea metodei de a

evidenţia o relaţie de directă proporţionalitate între semnalele analitice şi concentraţiile

analiţilor din probe pentru un domeniu dat al acestor concentraţii. Ecuaţia dreptei de regresie

liniară y = ax + b, aplicată rezultatelor trebuie să aibă ordonata în origine (intercept), b,

apropiată de zero. Se calculează panta dreptei de regresie (slope), a, şi coeficient3ul de

regresie r, care pentru o bună liniaritate trebuie să tindă la 1.

Domeniul de liniaritate (interes) al metodei este intervalul de concentraţii între

nivelul minim şi maxim.

Precizia şi reproductibilitatea de la o zi la alta caracterizează concordanţele dintre

rezultatele măsurătorilor individuale sau a seriilor multiple de măsurători. Precizia este deci o

eroare statistică. Reproductibilitatea de la o zi la alta se referă la repetarea determinărilor în

cadrul unui laborator, într-un interval de mai multe zile (n =10), cu o siguranţă acceptabilă.

Exactitatea sau acurateţea este concordanţa rezultatelor obţinute prin metoda de

analiză considerată şi valoarea acceptată ca fiind adevărată.

Randamentul se poate calcula dacă dizolvăm MRC (materiale de referinţă certificate)

în matrice şi în solvent pur şi comparăm rezultatele, calculând procentele de analit care se

extrag din matrice prin metoda de extracţie aleasă.

Limita de detecţie (LOD) este reprezentată de cantitatea cea mai mică de analit ce se

poate detecta prin metoda considerată. Cantitatea de analit la limita de detecţie trebuie să fie

mai mare decât eroarea asociată măsurătorii (raportul semnal-zgomot să fie 2 sau 3).

Limita de cantitate (LOQ) este reprezentată de cantitatea cea mai mică de analit care

dă măsurători precise, cu un raport semnal/zgomot = 10.

Specificitatea este caracteristica unei metode de analiză care dă răspuns pentru un

singur analit.

Selectivitatea este caracteristica unei metode care permite măsurarea cu exactitate a

unui anumit analit în prezenţa unor compuşi de interferenţă.

4

Sensibilitatea. Dacă se consideră „funcţia de răspuns” a unui analit y=f(c), unde y

este răspunsul analitic iar c este concentraţia analitului, atunci panta curbei este chiar

sensibilitatea.

Robusteţea se referă la efectul condiţiilor de lucru asupra rezultatelor obţinute. O

metodă este cu atât mai robustă cu cât acest efect este mai scăzut.

CAPITOLUL 2

SPECTROMETRIA DE MASĂ

5

Spectrometria de masă este una dintre cele mai importante metode fizice de analiză.

Ea se bazează pe ionizarea şi fragmentarea moleculelor, ca urmare a unei acumulări de

energie ce provoacă ruperea legăturilor interatomice. Fragmentele care se formează (ionii),

sunt accelerate în interiorul unui câmp care le separă în funcţie de raportul lor m/z

(masă/sarcină electrică). Ionii astfel separaţi ajung la un detector, unde sunt transformaţi în

semnale electrice proporţionale cu numărul de ioni de fiecare fel, permiţând înregistrarea

spectrului de masă caracteristic fiecărei substanţe organice.

Aplicaţiile analitice ale spectrometriei de masă sunt foarte generale: analize

structurale complexe, studiul căilor de fragmentare, analize calitative şi cantitative de mare

precizie la cantităţi în urme, identificarea şi analiza cantitativă a compuşilor unui amestec.

Tehnică de analiză ce aplică legile fizicii pentru caracterizarea materiei, spectrometria

de masă s-a născut la începutul secolului nostru şi a deservit în primele decenii fizica:

determinări de masă exactă a atomilor, potenţiale de ionizare, măsurători izotopice. Termenul

de spectrometrie de masă a apărut în anul 1920, când F. W. Aston a raportat prima dată masa

atomică exactă a neonului-20 şi a neonului-22.

Dezvoltarea spectroscopiei UV, IR, RMN, a defavorizat spectrometria de masă, care

era mai complexă, mai scumpă şi mai dificil de mânuit. Acurateţea şi sensibilitatea ridicată a

spectrometriei de masă au făcut ca aceasta să fie utilizată în analize cantitative de urme şi în

determinarea izotopilor stabili. După anul 1950 s-a început analiza unor compuşi cu greutăţi

moleculare mai mari. Inventarea cromatografului de gaze pentru separarea amestecurilor şi în

special cuplajul cromatograf de gaze - spectrometru de masă, (GC/MS), tehnică modernă de

analiză calitativă şi cantitativă, sensibilă şi selectivă, şi-a găsit un număr foarte mare de

aplicaţii în ultimele decenii. Computerizarea a permis o importantă diminuare a costurilor

analizelor şi a aşezat tehnica GC/MS printre tehnicile de vârf cu aplicaţii în foarte multe

domenii.

Un aspect foarte important al spectrometriei de masă este cantitatea mică de probă

necesară pentru obţinerea spectrului de masă şi putem spune că această tehnică dă cea mai

mare cantitate de informaţii specifice per microgram comparativ cu alte metode

experimentale.

Un alt aspect deosebit al spectrometriei de masă este relaţia bine conturată structură -

spectru de masă, încât putem spune că spectrul de masă este o amprentă a substanţei.

6

Metoda pune în evidenţă părţile constituente ale moleculei. Este o metodă unică pentru că

poate preciza cum se leagă grupările funcţionale ale moleculei.

Elementele spectrometrului de masă

Fig.1 Schema de principiu a unui spectrometru de masă Spectru de masă

Părţile componente ale unui spectrometru de masă sunt:

sistemul de introducere al probei, unde proba este introdusă în forma şi cantitatea

potrivită;

sursa de ioni, unde se produce un fascicul de ioni din substanţa de analizat adusă sub

formă de vapori;

analizorul, care separă ionii în funcţie de masă (m/z);

detectorul, care înregistrează abundenţa relativă sau intensitatea în funcţie de masă.

Trebuie remarcat faptul că atât în sistemul de introducere, cât şi în sursa de ioni, şi în

analizor trebuie creat vid pentru ca procesul de analiză al probei să nu fie influenţat de

prezenţa moleculelor din aer, în situaţia în care unii din compuşii analizaţi se află în

concentraţii extrem de mici (de ordinul nanogramelor).

Sistemele de introducere

Spectrometria de masă este o metodă fizică de analiză strict legată de practică.

Fenomenele fizice care stau la baza spectrometriei de masă sunt:

7

Sistem de introducere

Probă

Analizor Detector Sursa de ioni

Calculator

Pompe de vid

Pompe de vid

Pompede vid

- interacţiunea particulelor încărcate cu substanţa poliatomică;

- deviaţia în câmp a ionilor încărcaţi.

Sistemul de producere a ionilor moleculari şi a ionilor fragment este următorul: în

cazul spectrometrelor de masă cu bombardament electronic, compuşii în stare de vapori care

sunt admişi în camera de ionizare a spectrometrului sunt bombardaţi cu electroni care, având

energie suficientă, ciocnesc substanţa, în urma acestei interacţiuni substanţa se ionizează, se

supraexcită şi disociază, formând ioni moleculari şi ioni fragment. Spectrul de masă este

reprezentarea abundenţei relative a ionilor în funcţie de masa lor.

Sistemul de introducere este partea instrumentului care conţine rezervorul, căile de

introducere a probei şi pompele de vid necesare pentru îndepărtarea probei din rezervor după

analiză.

Există diferite sisteme de introducere: sisteme de introducere pentru gaze şi sisteme

de introducere pentru lichide care se folosesc pentru introducerea indirectă a probei. Sistemul

de introducere pentru lichide se foloseşte la introducerea probelor de referinţă, de aceea se

mai numesc şi sisteme de referinţă. Mai există şi sisteme de introducere pentru solide,

sisteme folosite la introducerea directă a probei. Sistemele de introducere pentru gaze

utilizează rezervoare de capacitate de câţiva litri, încălzite sau reci, iar proba trece în

spectrometru printr-o duză, gazele putând fi determinate cantitativ prin măsurarea presiunii

prin măsurarea presiunii.

Fig.2 Sistem de introducere

8

unde (a) reprezintă locul de introducerea probei, (b) robinetele, (c) rezervorul, (d) orificiu, (e)

manometru.

Surse de ioniIonizarea prin impact electronic (EI)

Cea mai veche metodă de ionizare a moleculelor organice este cea prin

bombardament electronic. Această metodă are sensibilitate şi stabilitate bună şi continuă să

fie importantă în special în scopuri de identificare de componenţi.

Proba adusă în stare gazoasă difuzează în camera de ionizare în care există un vid de

10-6 torr. Aici ea este supusă acţiunii unui fascicul subţire de electroni generaţi de un catod

încălzit sub vid şi care este străbătut de un curent de 50-200A. Electronii emişi de filament

sunt acceleraţi la o diferenţă de potenţial catod-anod având energia de 70 eV. Ei traversează

camera de ionizare şi intră în coliziune cu moleculele din fluxul gazos al probei de analizat.

Impactul dintre un electron şi o moleculă determină ionizarea moleculei prin expulzarea unui

electron:

M + e- => M+ + 2e

Pentru a împiedica ciocnirile dintre ioni şi molecule, camera de ionizare, analizorul şi

colectorul se menţin la un vid de10-6 torri cu un sistem de pompe.

Fig 3 Schema de principiu a sursei de ioni cu impact electronic:(1) filament (2) trapă (3) sursă de ioni ţinută la un potenţial pozitiv ridicat pentru extracţie de ioni pozitivi (sau tensiune negativă pentru extracţie de ioni negativi) (4) "repeller" (5) regiunea de ionizare (6) plăci de extracţie (7) fantă de focalizare (8) plăci de deflexie (9) fanta sursei (10) fascicul de ioni.

Ionizarea chimică

Energia mare la care sunt supuse moleculele în ionizarea EI produce adesea

abundenţă de ioni de fragmentare şi rearanjare. Ionizarea chimică s-a dezvoltat pentru a

produce ioni cu transfer de energie redus, dând ioni moleculari mai stabili. Se utilizează

9

pentru determinarea masei moleculare, mai ales în cazul compuşilor care nu prezintă ion

molecular în spectrul de masă EI.

Principiul ionizării chimice constă în introducerea probei în amestec cu un gaz în

camera de ionizare. Amestecul este bombardat cu un fascicul de electroni. Deoarece

proporţia probei de analizat este foarte mică faţă de cea a gazului reactiv, practic numai

moleculele acestuia din urmă vor fi ionizate şi fragmentate. Fragmentele gazului reactiv sunt

deosebit de reactive şi vor reacţiona cu moleculele probei producând ionizarea acestora.

Ionizarea chimică este utilizată pentru obţinerea de informaţii asupra masei moleculare şi în

analiza cantitativă unde specificitatea ionului este dublată şi de o mai mare sensibilitate şi

stabilitate.

Ionizarea chimică negativă (NCI)

Ionii negativi se aplică cu succes în studii de interes biochimic şi toxicologic. Există

diferite metode de producere a ionilor negativi, cele mai importante modalităţi sunt:

-captură de electroni

-reacţii ioni-moleculă.

Pentru detecţia ionilor negativi este necesar să se inverseze curentul prin magnet.

Ionizarea EI nu este favorabilă producerii de ioni negativi care sunt cu mai multe ordine de

mărime mai puţini decât ionii pozitivi.

În tabelul de mai jos sunt prezentate metodele de ionizare şi sistemele de introducere

corespunzătoare acestora.

Sistem de introducere Metoda de ionizare ObservaţiiIntroducere directă EI, CI Probe cu un singur compus,

MS/MS amestecRezervor EI, CI si FI Gaze, lichideGC EI, CI şi FI Amestecuri volatile, aplicaţii

biochimiceCromatografie supercritică de lichide

EI, CI Compuşi labili termic

HPLC EI, CI, TSP, FAB Amestecuri fără derivaţi, aplicaţii biochimice

Tija cu emiter FD Compuşi polari, labiliTija DCI CI Probe nevolatileTija ţintă FAB FAB Probe polare, labileTijă LD LD VolatileFolie aluminiu PD Molecule mariTabel 1 Sisteme de introducere şi metoda de ionizare utilizate în spectrometria de masă

10

unde: EI – impact electronic; CI- ionizare chimică; FD- ionizare în câmp; TSP- termospray;

FAB- ionizare cu atomi rapizi; DCI- iomizare chimică cu desorbţie; LD- desorbţie laser; PD-

desorbţie în plasmă.

Alte metode de ionizare cu aplicaţii speciale sunt:

- ionizarea cu bombardament de ioni (utilă în studiul suprafeţelor); (SIMS -

spectrometrie de masă cu ioni secundari);

- ionizarea prin bombardament de atomi rapizi (FAB), utilizată în analiza

biomoleculelor;

- termoionizarea (evaporarea sub formă de ioni de pe un filament metalic încălzit)

permite măsurarea rapoartelor izotopice la elementele solide (metale).

- ionizarea într-o descărcare în plasmă la presiune înaltă cuplată inductiv (ICP) pentru

analiza de solide;

- ionizarea într-o descărcare electrică în scânteie sau cu o descărcare luminiscentă

pentru analiza de solide;

- fotoionizare (cu laser) pentru analize de amestecuri.

Analizorul de masă

Separarea maselor are la bază fenomenul deviaţiei traiectoriei ionilor în câmpuri

magnetice şi electrice. Fenomenul trebuie să aibă loc în absenţa ciocnirii ionilor cu alţi atomi

sau molecule şi din acest motiv spectrometrele de masă funcţionează în condiţii de vid înalt

(10-6-10-9 torr).

Cele mai comune şi cu aplicaţii mai generale sunt analizoarele de masă magnetice şi

cuadrupolare. Analizorul de masă în cazul instrumentelor cu timp de zbor şi transformată

Fourier este utilizat în aplicaţii speciale.

Se utilizează diferite tipuri de analizoare de ioni, denumite după principiul care stă la

baza separării:

analizor magnetic

analizor electric

analizor cu timp de zbor

analizor cu radiofrecvenţă (cuadrupolare)

11

analizor cu focalizare cicloidală.

În timp ce radicalii şi moleculele neutre sau încărcate negativ sunt eliminate de

pompele de vid, ionii pozitivi sunt acceleraţi de o diferenţă de potenţial V către analizor.

Acest lucru se realizează prin punerea sursei de ioni la un potenţial ridicat (3kV) şi

menţinerea restului aparatului la potenţial zero. Energia potenţială a unui ion de sarcină e,

eV, va fi egală cu energia cinetică a ionului după accelerare.

Deflexia în câmp magnetic a maselor încărcate este dată de mărimea tensiunii de

accelerare V şi a câmpului magnetic B:

Bev=mv2/r

Pentru a focaliza un ion la detector trebuie satisfăcute ecuaţia generală:

m/r=B2r2/2V

unde r este raza magnetului r2=

Separarea maselor are loc prin acţiunea câmpului asupra unui fascicul de ioni obţinut

prin delimitare de către o fantă la ieşirea din sursa de ioni. Câmpul magnetic realizează

imaginea acestei fante în vecinătatea colectorului unde trece printr-o a doua fantă. Din jocul

celor două fante se pot obţine diferite forme de pic, pentru fante de lăţimi comparabile se

obţine pic triunghiular, iar pentru cazul în care lărgimea unei fante este sensibil mai mare

decât cealaltă se obţine pic trapezoidal.

Există şi spectrometre de masă cu dublă focalizare. La acestea, ionii care ies din

camera de ionizare, după ce trec prin fanta de ieşire a acestuia, vor trece printr-un analizor

electrostatic, şi apoi printr-unul magnetic şi de abia apoi vor ajunge pe colector în care intră

trecând prin fanta colectorului. Schema de principiu a spectrometrului de masă cu dublă

focalizare este prezentată mai jos.

12

Fig.4 Spectrometru de masă cu dublă focalizare

Separarea ionilor se poate realiza şi fără utilizarea câmpului magnetic şi anume prin

supunerea ionilor la oscilaţiile unui câmp electric cuadrupolar de înaltă frecvenţă. În acest

caz ionii se deplasează între 4 bare metalice, paralele cu acest câmp. Pe câte două bare opuse

se aplică potenţiale electrice de acelaşi semn dar decalate cu 180. Acest analizor se numeşte

analizor cuadrupolar.

Fig.5 Focalizarea în cuadrupol

Peste această tensiune se aplică un câmp de înaltă frecvenţă. Cele 4 bare sunt de fapt

electrozi, de unde şi denumirea de „cuadrupol” a sistemului format de aceştia. Datorită

13

câmpului de înaltă frecvenţă, ionii vor oscila pe axa Oz. Numai ionii cu un raport m/z bine

determinat vor putea ajunge la fanta de ieşire, ceilalţi căzând pe electrozi.

Avantajele folosirii focalizării în cuadrupol sunt: cost mai scăzut, greutate redusă,

lipsa de histerezis, posibilitate de control prin computer. Aceste instrumente sunt potrivite

aplicaţiilor în modul de lucru monitorizare de ion selectat (SIM).

Procesul de fragmentare moleculară. Procesul de ionizare.

Sub acţiunea fasciculului de electroni în camera de ionizare se va produce

transformarea moleculelor din probă în diverse specii de ioni care vor apare în spectrul de

masă, după ce vor fi separaţi şi colectaţi pe specii, sub forma unor linii aşezate în funcţie de

raportul m/z. Aceste transformări depind de energia cu care sunt bombardate moleculele

probei. Valoarea energiei de ionizare ale moleculelor este de 7-15 eV. Dacă această energie

nu este suficient de mare, spectrul de masă nu se mai obţine, din cauză că electronii nu mai

pot să producă modificări în structura moleculelor din probă. Când o moleculă este

bombardată de electroni de energie moderată, dar mai mare decât energia de ionizare a

moleculei, sunt posibile următoarele procese:

1) M + e- M+ + 2e-

2) M + e- Mn+ + (n+1)e-

3) M + e- M-

Procesul cel mai frecvent este 1), şi de aceea el are cea mai mare importanţă în

obţinerea spectrului de masă.

Dacă se măreşte energia electronilor, se ajunge la limita la care începe fragmentarea

moleculelor. Tensiunea de accelerare la care începe fragmentarea ionilor se numeşte potenţial

de apariţie a ionilor fragmentaţi.

Spectrul de masă

Spectrul de masă se reprezintă în literatură sau în colecţiile de spectre de masă de

referinţă fie normat faţă de picul de bază, fie grafic sub formă de spectre de linii cu

intensitate relativă în ordonată şi număr de masă în abscisă. Spectrele de masă sunt adevărate

14

amprente ale moleculelor fiind folosite la identificarea acestora. Interpretarea spectrelor este

foarte dificilă din cauză că apar prea multe linii în spectru. Din această cauză utilizarea

computerului este foarte importantă pentru că liniile se pot deosebi mai bine, şi pentru că se

poate folosi o bancă de spectre de referinţă, cu care sunt comparate spectrele obţinute în

urma analizei.

Detecţia ionilor. Sensibilitatea spectrometrului

Intensitatea curenţilor de ioni se situează în intervalul 10 -9-10-16 A şi măsurarea

acestora necesită amplificatoare electromagnetice corespunzătoare. Colectorul se poate

realiza sub formă de cuşcă Faraday, iar pentru analize izotopice precise se utilizează doi

colectori pentru înregistrarea simultană a curenţilor de ioni şi măsurarea directă a raportului.

Ca detectori se pot utiliza :

placa fotografică

cuşca Faraday

multiplicator de electroni

electrometre

Detectorul cel mai uzual la spectrometre de masă este multiplicatorul de electroni

secundar („secondary electron multipler” SEM), care detectează curenţi de 10 -10-10-18 A, şi-i

amplifică cu un câştig de aproximativ 106.

Eficienţa utilizării probei în operaţiile GC-MS este de importanţă practică în

obţinerea sensibilităţii maxime. Sensibilitatea spectrometrului de masă este funcţie de

numărul de ioni care lovesc detectorul faţă de masa substanţei introduse în sursa de ioni şi

factorul de amplificare al detectorului. Doar un ion ajunge la detector din 106 molecule

introduse în sursa de ioni la rezoluţie joasă.

Înregistrarea şi achiziţia datelor MS

Spectrul de masă reprezintă înregistrarea abundenţei ionilor unui compus în funcţie de

masă (m/z) şi este specific substanţei, caracterizând-o. Spectrometrul de masă reprezintă un

detector ideal pentru compuşii separaţi prin cromatografie de gaze. Spectrul de masă poate fi

utilizat pentru identificarea unui compus necunoscut. Spectrul compusului necunoscut se

15

compară cu spectrul de masă al unor compuşi cunoscuţi. Picurile spectrului de masă ale

compusului necunoscut se pot utiliza pentru determinarea structurală a acestuia. Prin

corelarea structurii moleculare cu configuraţia spectrului de masă, spectrometria de masă dă

informaţii privind natura şi numărul atomilor care compun molecula, existenţa unor grupări

funcţionale şi modul în care sunt acestea aşezate în structura moleculei.

Spectrele EI conţin alături de ionul molecular [M]+, ioni fragment, care pot fi explicaţi

logic prin pierderi de grupări funcţionale din ionul molecular. Studiul căilor de fragmentare

ale compusului utilizând tehnicile de măsurare ale maselor exacte în înaltă rezoluţie şi

măsurarea ionilor metastabili, dau informaţii şi mai precise asupra structurii, mecanismelor

de formare şi fragmentare a ionilor, tăriei legăturilor compusului de analizat.

Una dintre cele mai importante informaţii pe care le oferă spectrul de masă este masa

moleculară, dar nu toate moleculele au ion molecular. Majoritatea spectrelor de masă dau

informaţia legată de masa moleculară prin prezenţa ionului fragment M-15 (m/z 15 reprezintă

CH3, prezent în majoritatea moleculelor organice).

Ordinea descreşterii stabilităţii ionului molecular în spectrele de masă este

următoarea: compuşi aromatici - olefine conjugate - compuşi ciclici – sulfuri - hidrocarburi

neramificate – mercaptani – cetone – amine – esteri – eteri – acizi carboxilici – hidrocarburi

ramificate – alcooli.

Pentru achiziţia datelor se foloseşte un computer care controlează baleiajul şi

optimizează condiţiile în sursa de ioni. În cazul în care nu există un computer, se utilizează

înregistratorul pe hârtie pentru înregistrarea spectrelor probelor introduse prin introducerea

de gaze, lichide şi solide şi un oscilograf pentru înregistrarea spectrelor de masă în cuplajul

GC/MS.

Biblioteca de spectre este utilizată pentru identificarea componenţilor prin comparaţie

cu spectrele de masă a unor componenţi cunoscuţi. Identificarea unui component necunoscut

poate fi asistată de măsurători de masă exactă, măsurători metastabile, utilizarea unor

derivatizări, încorporare de izotopi stabili, metode de ionizare alternative, MS/MS, etc.

Spectrometria de masă cunoaşte o continuă dezvoltare cu un larg număr de aplicaţii:

determinări de mase exacte

determinări de căi de fragmentare

determinări structurale complexe

16

măsurători izotopice

determinări cantitative precise

Aceste aplicaţii sunt de un real folos mai ales fizicienilor şi chimiştilor care

desfăşoară o activitate de cercetare .

CAPITOLUL 3

CROMATOGRAFIA DE GAZE

Cromatografia grupează o variată şi importantă grupă de metode care permit

cercetătorului să separe compuşi foarte asemănători din amestecuri complexe. În toate

separările cromatografice, proba este dizolvată într-o fază mobilă: gaz, lichid sau fluid

supercritic. Această fază este frecvent numită eluent, iar după ce trece de capătul coloanei se

numeşte eluat.

Metoda cromatografică a fost descoperită de botanistul rus Mihail Tsvet în 1906, şi a

fost folosită mai întâi pentru separarea unor substanţe colorate pe coloană, sau ca eluate

colorate. Dacă substanţele sunt incolore, prezenţa lor pe coloană sau în eluate se recunoaşte

prin alte metode.

Metodele cromatografice sunt bazate pe absorbţia amestecului de substanţe (solid-

lichid, lichid-lichid, lichid-gaz), pe un material absorbant, urmat de dezabsorbţia succesivă

(cu ajutorul unui dizolvant adecvat-eluant) a componentelor din amestec.

Coloana de absorbant poate fi înlocuită în unele variante şi cu o foaie de hârtie

poroasă preparată în mod special (cromatografia pe hârtie), sau cu un strat subţire de

absorbant fixat pe o placă de sticlă cu ajutorul unui liant (cromatografia pe strat subţire).

17

Spectrometria de masă, şi în special spectrometria de masă cuplată cu cromatografia

de gaze (GC/MS), este o tehnică modernă de analiză cantitativă şi calitativă, sensibilă şi

selectivă, care şi-a găsit un număr mare de aplicaţii în ultimele decenii. Computerizarea a

permis o importantă diminuare a costurilor analizelor şi a aşezat tehnica GC/MS printre

tehnicile de vârf cu aplicaţii în foarte multe domenii: fizică, chimie, biologie, medicină,

farmacie, geologie, ecologie, toxicologie, criminalistică, arheologie, etc. Tehnicile de

marcare a compuşilor cu izotopi stabili au permis utilizarea trasorilor izotopici şi analiza lor a

cerut o tehnică capabilă să măsoare concentraţii cât mai mici. Tehnica GC/MS permite

analiza concentraţiilor de ordinul pg/ml şi chiar mai puţin.

Separarea compusului de analizat de potenţialele interferenţe este unul din paşii

esenţiali în analiza chimică. Cromatografia este una dintre cele mai utilizate metode de a

realiza aceste separări analitice. Aplicaţiile cromatografiei cresc exponenţial cu timpul, în

mare parte datorită faptului că ea îşi găseşte aplicaţii în toate ramurile ştiinţei.

O analiză cromatografică se rezumă în general la următoarele concepte fundamentale:

proba este dizolvată în starea mobilă; faza staţionară este cel mai adesea un lichid absorbit la

suprafaţa unor particule de solid utilizate pentru a împacheta coloana; faza mobilă este

trecută peste faza staţionară nemiscibilă; aceasta se numeşte eluţie; solutul care are o mare

afinitate faţă de faza mobilă se va mişca prin coloană foarte încet; componenţii probei se vor

separa în benzi discrete vizibile la detector de la care rezultă cromatograma.

Cromatografia a devenit principalul instrument pentru separarea speciilor

asemănătoare. Ea poate fi utilizată de asemenea în determinări cantitative şi calitative ale

speciilor separate. În termeni de informaţii chimice calitative, cromatograma furnizează

timpul de reţinere al speciilor sau poziţiile acestora pe faza staţionară după un timp de eluţie

specific. Cromatografia poate fi extrem de utilă pentru recunoaşterea prezenţei sau absenţei

unor componenţi într-un amestec ce conţine un număr redus de specii cunoscute.

Confirmarea identităţii serveşte şi pentru alte investigaţii, şi nu în ultimul rând cromatografia

serveşte ca precursor pentru alte analize calitative sau pentru analize spectroscopice.

Informaţia cantitativă este principalul motiv pentru care cromatografia are o atât de

largă folosinţă. Ea se bazează pe compararea mai multor înălţimi sau suprafeţe ale picurilor

analitice cu etaloane. Analiza bazată pe aria picurilor, care este independentă de efectele de

deformare, este mult mai precisă şi de aceea mult mai comună. Oricum toate datele

18

cantitative sunt dependente de prepararea standardelor şi calibrările succesive ale coloanei,

folosind acele standarde. Fără o calibrare exactă şi precisă a datelor, nici o dată

cromatografică nu poate fi considerată exactă.

Sunt 5 categorii de cromatografii:

de absorbţie;

de partiţie;

cu schimb de ioni;

prin excluziune moleculară;

de afinitate.

Metodele cromatografice pot fi de asemenea clasificate în două moduri:

cromatografia planară si cromatografia pe coloană. Ele sunt bazate pe interacţiunea fizică,

ceea ce înseamnă că faza staţionară şi faza mobilă sunt în contact. În cromatografia pe

coloană, faza staţionară este introdusă în interiorul unui tub îngust şi faza mobilă este

introdusă în tub cu ajutorul presiunii sau a greutăţii proprii. În contrast, cromatografia plană

foloseşte o fază staţionară care este depusă pe o suprafaţă plană sau în hârtie. Faza mobilă se

deplasează prin faza staţionară datorită acţiunii capilare sau a greutăţii.

Cromatografia de lichide, gaze şi de fluide supercritice sunt 3 clase generale bazate

atât pe tipurile de faze mobile şi staţionare cât şi pe tipurile de echilibre implicate în

transferul solutului între faze. Fazele mobile sunt gaze, lichide şi fluide supercritice. Fazele

staţionare variază, şi tipul de echilibru este dependent de alegerea acestei faze.

Cromatografia de absorbţie utilizează o fază staţionară solidă şi o fază mobilă care

este un lichid sau un gaz. Solutul poate fi absorbit la suprafaţa particulelor solide, unde

echilibrul dintre starea absorbită şi soluţie produce separarea moleculelor solutului.

În cromatografia de partiţie, faza staţionară este un film subţire pe suprafaţa unui

suport solid. Solutul stabileşte un echilibru între lichidul staţionar şi faza mobilă (lichidă sau

gazoasă).

În cromatografia cu schimb ionic, anionii sau cationii sunt legaţi covalent de o fază

staţionară solidă, frecvent o răşină sau o fază solidă tare şi amorfă. Este utilizată o fază

mobilă lichidă. Ionii solutului de sarcină opusă sunt atraşi de faza stationară datorită forţelor

electrostatice.

19

Cromatografia de excluziune moleculară este mai comun denumită de gel permeabil

sau de filtrare cu gel. Această tehnică separă moleculele după mărime, şi moleculele mari

trec cu o viteză mai mare decât moleculele mici. Nu există interacţiuni active. Faza mobilă

gazoasă sau lichidă este trecută printr-un gel poros, care exclude moleculele mari, dar nu şi

pe cele mici. Moleculele mari curg peste, fără a intra în gel, şi ele eluează primele.

Cromatografia de afinitate este bazată pe interacţiunea între un tip de molecule de

solut şi un al doilea tip, acestea legate covalent de faza staţionară. Când amestecul este trecut

prin coloană, doar un tip de molecule de solut reacţionează cu moleculele legate şi formează

legături la răşină. Moleculele de solut dorite sunt dislocate apoi de moleculele legate variind

pH-ul sau tăria ionică a solventului. Mai sunt şi alte categorii de cromatografie cum ar fi:

cromatografia de gaze cu detecţia cu ionizarea în flacără (FID) şi cromatografia de gaze cu

detecţie cu captură de electroni (ECD).

Cromatografia de gaze, lichide şi pe strat subţire

În cromatografia de gaze (GC) lichidul volatil este injectat folosind o seringă

adecvată. Un gaz inert purtător, poartă proba prin coloana ce conţine faza staţionară. Gazul

purtător deserveşte faza mobilă. După traversarea coloanei, particulele separate de solut intră

într-un detector. Răspunsul este afişat pe un calculator ca funcţie de timp. În figura 8 este

redată schema principalelor etape în cromatografia de gaze.

Prepararea probei

Injectarea în coloană

Separarea componenţilor

Detectarea componenţilor din probă

Identificare şi măsurare

20

Fig.6 Etape în cromatografia de gaze

În figura 7 este ilustrată structura coloanei de separare, într-o perspectivă din secţiune.

Figura 8 prezintă construcţia unei coloane de separare.

Fig. 7 Structura coloanei de separare, într-o perspectivă din secţiune

Fig.8 Coloana capilară de rezoluţie ridicată (lungime mare)

Figura 9 ilustrează asamblarea părţilor componente ale unei instalaţii de cromatografie de

gaze.

Părţile componente ale unei instalaţii de cromatografie de gaze sunt: butelia cu gaz

purtător, gaz care este de obicei heliu, aflat într-un recipient sub presiune, regulatoarele de

presiune şi debit care au rolul de a regla presiunea şi volumul gazului purtător, cromatograful

de gaze propriuzis care are ca părţi componente sistemul de injectare, coloana de separare,

21

cuptorul cu posibilitate de încălzire programată. detectorul şi staţia de achiziţie date care este

de obicei un computer care controlează procesul de analiză a fazei.

Fig. 9 Asamblarea părţilor componente ale unei instalaţii de cromatografie de gaze.

În cromatografia pe strat subţire (TLC), un spot de probă este aplicat peste o bucată

de hârtie sau sticlă, având faza staţionară impregnată. Capătul suprafeţei de hârtie sau sticlă

este apoi scufundat într-o cantitate de solvent, care serveşte ca fază mobilă. Solventul

migrează de-a lungul fazei staţionare, separând componenţii probei în lungul drumului său.

Când solventul ajunge în vecinătatea părţii superioare, este înlăturată cantitatea

suplimentară de solvent şi este lăsat să se usuce. Câţiva dintre componenţii probei sunt

vizibili în acest moment. Alte măsurători sunt în mod curent efectuate pentru a detecta toţi

componenţii probei.

Cromatografia de lichide de înalta performanţă (HPLC), se referă la noile proceduri

de cromatografie de lichide bazate pe o instrumentaţie sofisticată. Acestea sunt cele mai mult

folosite metode dintre toate metodele de separare. În cadrul acestei metode se disting: HPLC

cu detecţie de fluorescenţă, HPLC cu detecţie electrochimică şi HPLC cu detecţie în

ultraviolet.

22

La fel ca şi în cromatografia de gaze cuplată cu spectrometria de gaze, în

cromatografia de lichide de înaltă performanţă există cinci etape care trebuie urmate pentru

ca o analiză să fie efectuată.

Aceste etape sunt:

Prepararea probei

Injectarea în coloană

Eluarea cu faza mobilă

Detectarea componenţilor din probă

Identificare şi măsurareFig. 10 Principalele etape în HPLC

Fig. 11 Schema bloc a unei instalaţii HPLC

Detecţia

Foarte multe detectoare sunt angajate în separările cromatografice.

23

Detecţia absorbanţei moleculare UV-VIS este cea mai comună. Detectorul ideal este

necesar să aibă:

sensibilitate adecvată;

bună stabilitate şi reproductibilitate;

răspuns liniar la diferitele ordine de concentraţie;

timp de răspuns scurt;

stabilitate pe un larg domeniu de temperatură;

durată lungă de viaţă;

uşurinţă în utilizare.

Monocromatorul este adesea o componentă a instrumentului UV-VIS. El permite

scanări spectrale, ceea ce înseamnă capacitatea de a varia lungimea de undă a radiaţiei în

mod continuu într-un domeniu larg. Fantele monocromatorului joacă un rol important. Fanta

de intrare serveşte ca sursă de radiaţie. Fantele largi sunt tipic utilizate pentru determinări

cantitative în care detaliul spectral este important, în comparaţie cu analiza calitativă.

Metode de prelucrare a informaţiei cromatografice

Dintre toate metodele de prelucrare a informaţiei cromatografice, metoda

standardului intern furnizează cea mai mare precizie pentru cromatografia cantitativă,

deoarece ea elimină incertitudinile introduse de simpla injecţie. În această metodă, o cantitate

exact măsurată de substanţă este adăugată fiecărui standard sau probe. Standardul intern

trebuie să fie ales astfel încât el să se separe foarte bine de celelalte picuri componente ale

probei. De asemenea, picul de standard intern trebuie să fie aproape de picul analitic.

Cantitatea de substanţă din picul de standard intern serveşte apoi ca parametru analitic.

Metoda normalizării ariilor este o altă aproximare utilizată pentru eliminarea

incertitudinilor asociate cu simpla injecţie. În această metodă, aria tuturor picurilor complet

eluate este calculată. Concentraţia analitică este găsită ca raport al ariei de pic la aria totală a

tuturor picurilor.

24

Lărgimea benzii cromatografice

O cromatogramă:

ilustrează răspunsul detectorului la un compus de analizat din probă la ieşirea

acestuia din coloana ca funcţie de timp sau de volum de fază mobilă adăugată;

este utilă atât pentru determinările cantitative cât şi cele calitative;

furnizează o serie de picuri, unde aria sub picuri furnizează informaţia

cantitativă despre cantitatea de component, iar poziţia picului serveşte pentru

identificarea compusului din probă.

Câteva probe de bandă pe cromatogramă este posibil să se desprindă de concentraţia

compusului de analizat în fazele mobilă şi staţionară şi de comportamentul fiecărui compus

în parte. (fig. 12)

Fig. 12 Tipuri de picuri

Un pic Gaussian este ideal (a). Mai mult, oricum picurile pot avea o creştere

progresivă urmată de o cădere abruptă datorata supraîncărcării coloanei (b), sau o formă cu

coadă care rezultă din faptul că unele lăcaşuri ale coloanei reţin solutul mai mult decât altele

(c). Lărgimea benzii poate fi explicată din punct de vedere cantitativ. O particulă individuală

suportă multe transformări în timpul migrării, în consecinţă, timpul de staţionare în coloană

este extrem de diferit precum şi migrarea particulelor de-a lungul coloanei este neregulată.

Odată cu creşterea timpului, lăţimea benzii creşte în timp ce se parcurge coloana, timpul de

staţionare în coloană va fi mai mare, iar viteza de curgere a fazei mobile scade.

25

Fig. 13 Elementele unei cromatograme.

Există patru parametri care caracterizează în general viteza de migrare: timpul de

reţinere, coeficientul de partiţie, factorul de capacitate şi factorul de separare. Aceşti

parametrii descriu echilibrul de distribuţie care există şi implicit transferul soluţiei în cele

două faze (fig 12).

Timpul tR la care apare maximul unui pic, măsurat din momentul introducerii probei

se numeşte timp de reţinere şi este o caracteristică calitativă a componentului respectiv.

Înălţimea picului h sau aria lui, A, sunt caracteristici cantitative, proporţionale cu cantitatea

componentului din probă. Se notează cu tM timpul în care eluentul si componentele care nu

interacţionează cu faza staţionară parcurg distanţa până la detector.

Astfel, putem explica viteza componentului din faza staţionară (v) şi a eluentului (u)

prin următoarele ecuaţii:

v = (1)

şi

u = (2)

Coeficientul de partiţie K reprezintă raportul dintre concentraţia molară (cS) a

substanţei în faza staţionară şi concentraţia în faza mobilă (cM):

K = (3)

Fracţiunea din timpul de reţinere în care o moleculă se găseşte în faza mobilă se

notează cu R şi reprezintă probabilitatea ca molecula să se găsească în faza mobilă, respectiv

26

fracţiunea din totalul moleculelor care se află în faza mobilă. 1-R reprezintă restul

moleculelor care se găsesc în faza staţionară. La echilibru putem scrie:

(4)

unde VM si VS reprezintă volumul fazei mobile, respectiv staţionare.

Factorul de capacitate

Din relaţia (3) si (4) se obţine:

R = (5)

unde k =

reprezintă raportul dintre cantitatea totală de substanţă aflată în faza staţionară şi cantitatea

totală de substanţă aflată în faza mobilă şi se numeşte factor de capacitate.

Din (5) este clar că componentele amestecului de separat vor ieşi din coloană cu

viteze diferite:

R = (6)

Din (5) si (6) rezultă:

v = (7)

Pentru o specie A aflată în amestec, factorul de capacitate kA va fi:

kA = (8)

Factorul de capacitate k este o funcţie de parametrii de solubilitate, în cazul

cromatografiei de separaţie lichid-lichid. Experimental, în vederea obţinerii unei rezoluţii

maxime pe unitatea de timp, valoarea lui k trebuie să fie cuprinsă între 2 şi 5.

d)Factorul de separare pentru o anumită coloană de separare este un parametru

utilizat pentru descrierea diferenţelor ce apar între vitezele de migrare a componenţilor. Se

defineşte ca fiind raportul dintre factorii de capacitate kA si kB ai componentului B (care

trece mai greu prin coloană) si A (componentul care se eluează mai repede) aflaţi în amestec.

27

(9)

Numărul de talere şi înălţimea talerului

Una dintre cele mai importante caracteristici ale unui sistem cromatografic este

eficienţa sau numărul de talere teoretice. Cu cât o coloană va avea mai multe talere pe

unitatea de lungime cu atât eficacitatea ei de separare va fi mai bună. Numărul de talere poate

fi definit din cromatograma unui singur pic (fig. 12) astfel:

N= =16 =5.54 (10)

unde tR este timpul de reţinere, 2t este dispersia aceleiaşi benzi în unităţi de timp iar W este

valoarea segmentului pe abscisă rezultat din intersecţia celor doua tangente prin punctele de

inflexiune ale picului.

N este un număr adimensional. Aceeaşi valoare a lui N poate fi obţinută din volumul

de reţinere VR si dispersia 2V exprimata în unităţi de volum:

(11)

Numărul de talere N este o măsură a eficientei întregului suport la coloanei. O altă

măsură a eficienţei coloanei este dată de înălţimea unui taler H (înălţimea echivalentă a unui

taler teoretic):

H= (12)

unde L este lungimea coloanei cu umplutură. Relaţia între cele două mărimi este:

H= (13)

Este bine cunoscut faptul că zona îngustă şi compactă a componentului de la

începutul coloanei (la introducerea probei) se va lărgi astfel încât concentraţia pe unitatea de

volum de coloană se va micşora. Această lărgire a zonei este rezultatul următoarelor procese:

difuziunea longitudinală a componentului în eluent; timpul finit de stabilire a echilibrului

moleculelor componentului între cele două faze şi fluctuaţiile vitezei eluentului în diferite

28

puncte ale coloanei, fluctuaţii determinate de structura geometriei interne a coloanei.

Lărgirea zonei acţionează în sensul micşorării separării ducând la o reamestecare a

componentelor, respectiv la o suprapunere a picurilor cromatografice.

Rezoluţia

Rezoluţia este o caracteristică foarte importantă a unui aparat, şi reprezintă puterea

sau abilitatea de a separa diferiţi componenţi.

Pentru caracterizarea separabilităţii a celor doi componenţi, s-a introdus noţiunea de

rezoluţie, notată cu RS. În expresia rezoluţiei s-a căutat să se lege mărimile care

caracterizează proprietăţile termodinamice ale fazelor şi componenţilor, precum şi mărimile

care caracterizează dinamica proceselor din coloană. Rezoluţia este o noţiune mai

cuprinzătoare, conţinând şi mărimile care caracterizează eficacitatea precum şi selectivitatea

coloanei.

RS= (14)

Dacă cele doua picuri sunt apropiate având suprafeţele egale şi simetrice, atunci şi

W1=W2=W. Ecuaţia de mai sus se poate scrie astfel:

RS= (15)

Este evident că dacă diferenţa dintre coeficienţii de repartiţie a componenţilor creşte,

atunci selectivitatea coloanei s-a îmbunătăţit. Aceasta se realizează prin alegerea

corespunzătoare a fazelor staţionară şi mobilă.

Un alt mod de mărire a rezoluţiei este acela de a acţiona în sensul reducerii lărgimii

zonei, adică de a realiza coloane mai eficace, cu un număr de talere mai mare pe unitatea de

lungime. Evident, rezoluţia este influenţată atât de proprietăţile termodinamice ale

sistemului, prin intermediul coeficienţilor de capacitate, respectiv de repartiţie, precum şi de

eficacitatea de separare a coloanei, prin intermediul termenilor N şi H. Cu ajutorul ecuaţiilor

10, 11 şi 15 rezultă:

29

RS ≈ ≈ (16)

Cele mai utilizate noţiuni în cromatografia de gaze şi relaţiile dintre ele sunt

prezentate în tabelul următor.

Numele Simbol Ecuaţia, unităţide măsură

Ecuaţia de legăturăcu diferite mărimi

Viteza în faza staţionară (elut)

Vv= L/tR (cm/s)

Viteza eluentului(fazei mobile)

U u=L/tM (cm/s)

Factor de Capacitate

K k=(tR-tM)/tM k=KVS/VM=(tR-tM)/tM

Coeficientul dePartiţie

K K=cS/cM K=kVM/VS

Factorul de Separare

Rezoluţie RSR= RS=

Număr de talere NN=16

Înălţimea taleruluiTeoretic

HH=

Tabel 2. Cele mai importante noţiuni şi relaţii utilizate în cromatografie

30

CAPITOLUL 4

Drogurile

Drogurile sunt substanţe halucinogene care conţin alcaloizi, produc obişnuinţă şi

distrug sistemul nervos. Opiul este cel mai cunoscut drog, obţinut din latexul capsulelor de

mac (papaver somniferum). Foarte utilizat de mult timp în medicină, opiul a fost folosit şi

pentru plăcere. Abuzul de opiu şi de derivaţi ai acestuia a stat la originea primelor eforturi

internaţionale de control a stupefiantelor. Opiul este rezina obţinută din latexul capsulelor de

mac şi conţine o gamă de alcaloizi, printre care şi morfina, în proporţie de 10-17%. Doza

toxică este de 1,5-3mg, copiii prezentând sensibilitate mărită.

Compusul cel mai activ al opiului este morfina, obţinută fie din opiu, fie din paiele de

mac; şi această substanţă este folosită în medicină pentru calmarea temporară a durerilor de

după operaţiile chirurgicale, a celor produse de fracturi sau arsuri şi în ultimele faze ale

bolilor incurabile.

Fig. 14Morfina M=285

31

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 2800

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance#166055: Morphine $$ Morphinan-3,6-diol, 7,8-didehydro-4,5-e (*)

18

31

42

59 70

94 115

124

145

162

174

197

215

216

242256

268

285

Fig. 15Codeina(metil morfina) M=299

Fig 16Heroina M=369

Fig. 17Cocaina M=303

32

OHO

N

O

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 3000

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

m/z-->

AbundanceScan 98 (5.810 min): ALKDEMO.D

42

59 70 8194

115124

146

162

175

188214

229

242256 270

282

299

O OO

N

O

O

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 3600

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

8500

9000

9500

m/z-->

Abundance#221296: Heroin $$ Morphinan-3,6-diol, 7,8-didehydro-4,5-epo (*)

43

70

81

94 124

146 162

174

204

215

226253

268

285

310

327

355

369

N

HO

O

H O

O

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 3000

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000

1200000

1300000

1400000

m/z-->

AbundanceScan 33 (5.289 min): ALKDEMO.D

42

5168

82

94

122

124152 166

182

198

207 222 244 259

272

288

303

Fig. 18Marijuana(Tetrahidrocanabinol) M=286

În figurile de mai sus sunt reprezentate cele mai periculoase droguri (formula chimică

şi m/z a acestora în funcţie de abundenţă).

1.1 Morfina este principalul alcaloid din opiu. Ea induce morfinomania, una din cele

mai periculoase toxicomanii, după 5-15 doze. Tratamentul se face prin suprimarea morfinei

şi administrare de insulină în doze optimizate individual. Doza letală este de 100 mg

parenteral. În afară de efectele sociale dezastruoase, morfinomanii se expun la două mari

pericole: administrarea din greşeală a unei supradoze şi riscul îmbolnăvirii cu SIDA, datorită

lipsei de igienă în folosirea acelor şi siringilor cu care îşi administrează drogul.

2.1 Codeina.

Este obţinută mai ales din morfină şi este utilizată de asemenea în medicină, pentru

calmarea durerilor .

3.1 Heroina.

Heroina, diacetilmorfina, este obţinută din morfină prin acetilare şi dintre toate

drogurile cunoscute este cea care produce cel mai uşor dependenţa, toxicomania.

Toate opiaceele naturale sau sintetice, au în general un efect sedativ sau analgezic;

prima reacţie este dezagreabilă, dar este urmată de o impresie de calm care, în funcţie de

doză, se poate transforma în comă şi duce la moartea prin asfixie. Intoxicaţia poate fi

recunoscută prin: pupile contractate, calm, neatenţie, somnolenţă, încetinire a pulsului şi a

respiraţiei.

33

OH

O

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 2800

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance#167165: 3-PROPYL-.DELTA.9-TETRAHYDROCANNABINOL $$ 6H-Dibenz (*)

41

43

67 81

91115

128141 161

165

189

203

215 229

243

267

271

286

Este cel mai puternic dintre derivaţii morfinei. Doza letală la adult este de 100mg.

Efectul euforizant este mai puternic, pericolul supradozării fiind şi mai mare ca la morfină. În

Suedia, prima cauză de deces a tinerilor între 18 şi 35 ani este supradoza cu heroină.

Sindromul de abstinenţă este deosebit de grav.

4.1 Cannabis.

Produsele plantei Cannabis Sativa L pot fi fumate sau dizolvate în băuturi;

constituenţii intoxicanţi se găsesc în flori. Cannabisul, marijuana, haşişul, desemnează

diferite forme de canabis preparat. În doze infime, canabisul poate duce la o anume acutizare

a percepţiei şi a senzaţiilor de plăcere. Dozele sporite duc la incoerenţă în comportare,

pierderea memoriei, alterarea noţiunilor de timp şi spaţiu, ilaritate, etc. Drogurile obţinute din

cânepă (canabis sativa indica) sunt haşişul (din vârfurile de floare ale cânepii) se fumează în

pipe; marihuana (obţinută din flori şi frunze) se fumează în ţigări. Substanţa activă este

tetrahidrocanabinolul, care afectează sistemul nervos central. Doza halucinogenă este de 30-

60mg. In prima fază apare o senzaţie de mulţumire, bucurie, râs nestăpânit, gândire

dezordonată, reflexe întârziate, halucinaţii, iluzia de persoană dublă, delir, comă.

5.1 Cocaina.

Coca (Erythroxilon Coca) este un arbust care creşte în America de Sud, frunzele sale

fiind mestecate de secole de către locuitorii platourilor înalte, pentru anestezie locală.

Cocaina este principalul alcaloid extras din aceste frunze. Este o pudră albă şi

inodoră, sub formă de cristale, şi poate fi consumată pe cale orală sau intravenos.

Luată pe cale orală, cocaina înşeală foamea, alungă oboseala şi este uşor euforizantă.

Prin injectare, aceasta are un efect net asupra psihicului, provoacă halucinaţii şi manifestări

paranoice. Sub acţiunea repetată a dozelor de cocaină, individul devine anormal de agitat, are

ticuri şi mişcări convulsive, pupilele i se dilată. Euforiei şi impresiei de forţă musculară îi

urmează o perioadă de depresiune. Induce dependenţă psihică. In timp apar tulburări

digestive, respiratorii, cardiovasculare, halucinaţii, delir, crize de furie, şi diminuarea

facultăţilor intelectuale, sfârşind cu o decădere totală fizică şi intelectuală.

În doze ridicate, apare starea de neîncredere, halucinaţiile, uneori comportamentul

agresiv şi antisocial, iar o doză prea mare poate duce la convulsii şi chiar la moarte.

2. Halucinogenele.

34

Termenul se aplică unor substanţe foarte diferite, aparţinând unor grupuri chimice şi

farmacologice diverse.

2.1 LSD.

Cea mai cunoscută substanţă halucinogenă este LSD, abreviere a sintagmei germane

Lyserg Saure Diethylamid – acid lisergic dietilamidă. Este un compus semisintetic obţinut

din alcaloizii conţinuţi de cornul de secară..

Pentru prepararea unei doze sunt suficiente 100 – 250 micrograme, sub formă de

soluţie diluată. Doza halucinogenă este de 50µg. Alterează profund psihicul, produce

decădere

2.2 Mescalina.

Este un alcaloid conţinut de un mic cactus, Lophophora Williamsii, cunoscut popular

sub numele de peyotl şi care creşte în zonele secetoase din Mexic şi Sud-Vestul SUA.

2.3 Alte halucinogene.

Psilocybina şi psilocina sunt extrase din ciuperca halucinogenă Psilocybe mexicana.

DMT şi DET sunt abrevierile de la dimetiltriptamină şi dietiltriptamină, cu efecte

halucinogene puternice.

STP, sau dimetoximetamfetamina, este un produs sintetic apropiat de amfetamine, cu

efecte mai durabile decât LSD.

Toate acestea produc halucinaţii, euforie sau depresiune, putând sta la originea unor

grave tulburări psihice, precum impulsurile ucigaşe sau sinucigaşe. Au de asemenea

posibilitatea de a produce o schimbare radicală a personalităţii, cu o conduită iraţională. Doze

infime de LSD sunt suficiente pentru a produce halucinaţii care durează zile întregi sau

tulburări psihotropice prelungite pe mai multe luni. S-a demonstrat de asemenea că apar

tulburări ale

sistemului cromozomial, ceea ce afectează deseori generaţia următoare a toxicomanului.

3. Substanţele stimulante.

Cele mai importante dintre aceste substanţe sunt amfetaminele, termen ce înglobează

aminele sintetice, analoge sub multe aspecte adrenalinei secretate de corpul uman.

35

Amfetaminele au fost larg folosite da către studenţii care se pregăteau pentru examene

dificile sau de atleţii care voiau să-şi depăşească performanţele şi sunt adeseori folosite în

combinaţie cu alte droguri.

ANALIZA DROGURILOR CU AJUTORUL CUPLAJULUI CROMATOGRAFIE DE GAZE-SPECTROMETRIE DE MASĂ (GC/MS)

Introducere

Majoritatea articolelor ştiinţifice din literatura de specialitate din ultimii ani care au ca

scop analiza drogurilor utilizează pentru analiza cantitativă cuplajul GC/MS şi mai nou

GC/MS/MS , alături de tehnici imunologice, mai scumpe şi mai laborioase. Subiectul este

tratat în special de toxicologie şi criminalistică, dar şi în studii de metabolism.

Extracţia din mediu biologic presupune o preconcentrare a compuşilor din mediul

biologic ales, sânge, urină, transpiraţie, păr. Se utilizează tot mai mult tehnici moderne de

preconcentrare, cum sunt extracţia pe fază solidă (SPE) utilizând cartuşuri şi microextracţie

pe fază solidă (SPME), microseringi cu silicagel C-18 sau se utilizează extracţia cu fluid

supercritic (SFE).

În cele ce urmează fac o trecere în revistă a unor articole recente care au ca scop

analiza cantitativă a unor droguri de abuz şi care utilizează în special analiza cantitativă prin

GC/MS sau GC/MS/MS.

Gaillard si Pepin dezvoltă o metodă nouă de extracţie rapidă pe faza solidă (SPE) cu

o singură eluţie, din fire de păr. Extracţia s-a facut după o decontaminare a probelor cu soluţii

de fosfat şi diclormetan, mărunţire a firelor de păr într-o moară cu bile, adăugare de standard

intern deuterat, hidroliză acidă la cald şi SPE. Metoda a fost validată (D.S.R < 9% pentru

concentraţia de 4ng/mg). Acurateţea s-a studiat faţă de un material de referinţă de la NIST.

Limita de detecţie a fost 0,1 - 0,3 ng/mg. Metoda s-a aplicat în criminalistică pentru cazuri de

intoxicare cu cocaină şi opiacee. S-au determinat concentraţii de 0.9 -242.0 ng/mg (cocaine),

0.3 -71.3 ng/mg (benzoylecgonine), 0.0 -9.8 ng/mg (methylecgonine ester), 0.0 -2.9 ng/mg

36

(cocaethylene), 0.1 -11.5 ng/mg (codeine), 0.4 -44.6 ng/mg (morfină) şi 0.7 -131.2 ng/mg (6-

acetylmorphine).

Korte şi autorii compară metode rapide test cu rezultate obţinute cu EMIT şi prin

GC/MS. Autorii constată deficienţe ale metodelor rapide prin reacţii suprapuse pentru mai

mulţi compuşi sau metaboliţi (RapiTest MOP reacţionează şi la codeine şi etilmorfină, şi

RapiTest MET şi la amfetamină).

Underwood determină următoarele limite de detecţie în laboratorul de criminalistică

prin cromatografie de gaze: LOD: 11-nor-delta 9-tetrahidrocanabinol-9-carboxilic acid, 2

ng/mL; benzoilecgonină, 5 ng/mL; fenciclidină, 2.5 ng/mL; amfetamină, 150 ng/mL;

metamfetamină, 100 ng/mL; codeină, 500 ng/mL; şi morfină, 1000 ng/mL.

Gracioso studiază efectul toxic al unor infuzii de plante utilizate în medicina populară

pentru tratarea unor boli. Autorii constată lipsa toxicităţii orale a extractului şi explică efectul

antiinflamator prin interferenţa cu procesul inflamator.

Chasin şi Midio validează o metodă de analiză cantitativă a cocainei şi metaboliţilor

săi: benzoilecgonină (BE), ecgonin-metilester (EME) şi 'biomarkeri' interacţiunii,

etilencocaina (CE) în sânge, în cazuri post mortem, utilizând un spectrometru de masă cu

trapă ionică. Autorii subliniază că în cazul coingerării cocainei şi a etanolului creşte pericolul

de moarte, prin formarea cocaetilenei, compus chiar mai toxic decât cocaina. Ei studiază

rolul etanolului în cazuri de intoxicare letală cu cocaină. S-au utilizat standarde interne

deuterate, extracţia s-a facut pe coloane “Bond Elut Certify” şi residuul s-a evaporat şi

derivatizat cu N-metil-N-t-butildimetilsililtrifluoroacetamidă (MTBSTFA). Ionizarea s-a

făcut cu impact electronic. Ionii monitorizaţi au fost m/z 82/85 pentru EME-tert-

butildimetilsilil (TBDMS)/EME-d3-TBDMS; m/z 182/185 pentru COC/COC-d3; m/z

196/199 pentru CE/CE-d3 si m/z 282/285 pentru BE-TBDMS/BE-d3-TBDMS. Limitele de

detecţie si cuantificare determinate au fost 25 ng pentru COC si 50 ng /ml pentru CE, si 50 si

100 ng /ml pentru BE si EME.

Toennes şi autorii au elaborat o metodă de testare a persoanelor care ingerează

cocaină prin fumat prin analiza cantitativă din sânge. Produsul de piroliză al metilecgonidinei

(AEME), produs care apare la fumatul cocainei, este un marcher al acestui tip de drogare.

Analitul s-a derivatizat prin tert.-butildimetilsililare. Au fost analizate 13 persoane şi s-au

determinat valori de AEME între 3 si 34 ng/ml.

37

Huestis şi autorii au elaborat un nou dispozitiv pentru colectat transpiraţie, timp de 30

minute, din palmă, abdomen, torace. Acest dispozitiv colectează transpiraţia pentru a

determina nivelul concentraţiei de codeină si cocaină din corpul uman. Extracţia probei se

face cu soluţie de acetat de sodiu, urmată de extracţie pe fază solidă şi derivatizare. Analiza

cantitativă s-a făcut prin GC/MS şi s-au determinat 33-3579 ng/plasture şi 11 -1123 ng/

plasture, de cocaină şi respectiv codeină. Această metodă este o modalitate neinvazivă pentru

a determina drogul la 4,5-48 ore de la ingerare.

Hall şi autorii au elaborat o metodă de analiză a benzoilecgoninei în urină prin

derivatizare şi “solid phase microextraction (SPME)”. S-a extras 1 mL urină prin sonicare

timp de 3 min cu 12 µL cloroformiat de hexil şi 70 µL de amestec acetonitril: apa: hexanol:

2-dimetilaminopiridina (5:2:2:1 v/v), conţinând benzoilecgonina hexil ester (BHE) ca produs.

După 3 minute, un “aliquot”de 250 µL a fost transferat într-o fiolă pentru SPME. 100

microni polidimetilsiloxan fibla SPME este transferat în GC-MS pentru separare şi analiză cu

un spectrometru de masă cuadrupolar. Metoda a fost liniară în domeniul de 0.10 -20.0 µg/mL

(r2 = 0.999) de benzoilecgonina în urină utilizând benzoilecgonina-d3 ca şi standard intern

(1.5 µg/mL). Precizia a dat RSD 8.8 si 6.8% pentru 0.30 µg/mL şi respectiv 17 µg/mL

etaloane de benzilecgonină în urină (n = 6). Precizia de la o zi la alta a dat RSD (n = 3) < sau

= 3.3%. Limita de detecţie a fost 0.03 µg/mL (S/N = 3) , făcând astfel posibil ca SPME să fie

o alternativă a SPE pentru probe confirmate prin test EMIT (limita de detecţie 0,3µg/ml)

benzoilecgonina.

Ohshima şi Takayasu au pus la punct o metodă de analiză cantitativă a cocainei şi a

unor anestezice prin extracţie pe fază solidă şi GC/MS din sânge si urină. Limita de detecţie a

fost de 100ng/ml.

Segura şi autorii au analizat droguri din fire de păr spălate cu diclormetan, 10 mg

tăiate, incubate cu metanol -acid trifluoroacetic (9:1) la 37oC, peste noapte. Apoi s-au

derivatizat şi analizat prin două metode, analiză prin imunoabsorbţie de enzime legate

(enzyme-linked immunosorbent assay ) EMIT şi monitorizare de ion selectat SIM /GC/MS.

Pichini şi autorii analizează droguri tot din fire de păr, tăiate fin şi incubate în

metanol la 56oC, timp de 18ore. Cocaina, morfina si etilencocaina au fost derivatizate prin

trimetilsililare. Metoda de analiză prin GC/MS/MS s-a dovedit foarte sensibilă pentru astfel

de compuşi.

38

elSohly a sintetizat m-Hydroxibenzoilecgonina (m-OH-BE) si d3-m-

hydroxibenzoilecgonina (d3-m-OH-BE)şi a dezvoltat o metodă de analiză prin GC/MS cu

d3-m-OH-BE ca şi standard intern pentru a determina aceşti marcheri în urina persoanelor

dependente.

Segura face o monografie a metodelor GC/MS pentru analiza unor medicamente,

droguri de abuz şi substanţe de dopaj. Scăderea preţului analizoarelor în spectrometria de

masă a condus la un număr foarte mare de aplicaţii al acestor metode mai ales în toxicologie.

Probele sunt derivatizate de mai multe ori înainte de analiză.

Eser şi autorii compară metode de extracţie în apă sau solvenţi organici a compuşilor

din fire de păr tăiate mărunt sau sub formă de pudră. Concluzia studiului este ca probele nu

sunt omogene şi creşterea părului este un factor care influenţează printre mulţi alţii. Solventul

indicat pentru droguri este metanolul şi rezultatele sunt mai precise dacă extracţia se face din

fire de par aduse sub formă de pudră.

M.Uhl consideră ca analiza din fire de păr a drogurilor de abuz şi a substantelor de

dopaj este extrem de importantă. GC/MS/MS oferă o bună sensibilitate în acest sens.

Mieczkowski şi autorii compară probe de păr ale aceleaşi persoane analizate prin două

metode, radioimunoanaliza (RIA) si GC/MS. Rezultatele sunt foarte apropiate, dar analiza

GC/MS oferă o precizie mai mare şi limita de detecţie atinge valori mai mici.

Prima analiză prin GC a compusilor din Cannabis sativa (marihuana) a fost făcută în

1961 de către Kingstone si Kirk care au separat răşini produse de plantă pe o coloană

cromatografică cu faza 2% SE 30. Analize pe extracte în benzen de frunze şi flori cu detector

cu 90Sr cu ionizare cu radiaţie beta şi un catarometru în serie, colectare de fracţiuni (Davis şi

autorii, 1963) au arătat prezenţa compuşilor: canabidiol, canabinol, tetrahidrocanabinol, acid

canabidiol (decarboxilat în GC la canabidiol), pirahexil. Analizele au arătat diferenţe

importante între constituenţii plantei din diferite regiuni care depind de diferiţi factori

climatici, soare, temperatură, ploi. Analiza GC a uleiului esenţial de marihuana, care conţine

compuşii volatili, (Nigam şi autorii) a condus la determinarea următorilor compusi: alfa-

pinen, camfen, beta-pinen, mircen, alfa-terpinen, limonen, beta-felandren, gama-terpinen,

para-cimen, linalool oxid, linalool, sabinen hidrat, alfa-bergamoten, terpinen-4-ol, cariofilen,

bata-farnesen, alfa-terpineol, beta-humulene, alfa-selinen, curcumene, cariofilen-oxide.

Aceşti constituenţi sunt constituenţi de aromă care intră în compoziţia multor plante.

39

Allen şi autorii compară două metode de extracţie a morfinei din sânge, extracţia pe

fază solidă (SPE) şi extracţia cu lichid supercritic (SFE). Rezultatele cantitative sunt

comparabile, dar SFE este o metodă mai rapidă, mai curată, cu randament de extracţie mai

bun, dar este mai scumpă.

Dempsey şi autori determină timpului de înjumătăţire la eliminarea cocainei şi

benzoilecgoninei (BZE) la nou născut. Analiza cantitativă s-a făcut prin GC/MS. Metoda de

extracţie s-a dezvoltat pentru probe de sânge şi urină de 0,1 ml. S-a determinat un timp de

înjumătăţire pentru cocaină de 11,6 h; pentru BZE s-a determinat în prima zi de viaţă 16h

(bazat pe probe de sânge); în prima săptămână de viaţă 11,2 h, (bazat pe probe de urină);

Metoda nouă de extracţie din volume mici de probe se poate aplica şi pentru alte

medicamente.

Se ştie că în ţările occidentale şi mai ales în SUA se utilizează analiza unor lichide

organice în laboratoarele de toxicologie ale unor instituţii cum ar fi poliţia, centrele de

dezintoxicare, spitale şi mai ales în centrele de medicină legală.

Prezint în continuare un control doping pentru metenolon utilizând analiza părului

uman cu ajutorul cuplajului GC/MS.

Printre alte metode utilizate în analiza substanţelor halucinogene din corpul uman

(HPLC, EMIT) GC/MS este o tehnică puţin mai simplă dar totodată la fel de performantă ca

şi celelalte.

Probele de păr au fost prelevate de la doi culturişti ce au fost arestaţi de către poliţia

franceză fiind acuzaţi de trafic de substanţe halucinogene.

Prepararea probelor

Proba de păr (100 mg), este în prima fază decontaminată cu clorură de metilen.

Această probă este introdusă în 1ml (1M) de NaOH timp de 15 minute la o temperatură de

95˚C, în prezenţa a 1 g de testosteron-d3,(cu concentraţia finală de 10 pg/mg) folosit ca şi

standard intern. După cum se vede, metoda de analiză este metoda standardului intern.

Produsul omogen obţinut este neutralizat cu 1ml 1M HCl, pentru ca substanţele din păr şi

mai precis keratina să se descompună, şi extras utilizând consecutiv faza solidă şi extracţia

lichid-lichid. Reziduul urmat în urma acestor operaţii este derivatizat prin adăugarea a 50μl

MSTFA-NH4I-2-mercaptoetanol, (N-Metil-N-trimetilsililtriforacetamină) apoi este incubat la

40

o temperatură de 60˚C timp de 20 de minute. Din întreg extractul derivatizat, doar 1,5 μl este

introdus în coloana spectrometrului.

Aparatura

Pentru efectuarea acestei analize s-a folosit un aparat Hewlett-Packard cu

caracteristicile următoare: coloana capilară compusă din 5% fenil-95% metilsiloxan, de

dimensiune 30m/0.25mm şi de grosime 0.25 m.

Metenolonul a fost identificat prin ionul părinte cu m/z=446 şi ionii cu m/z=208 şi

m/z=195 cu un detector Finnigan TSQ 700 MS-MS. Prin această metodă şi utilizând GC/MS

ca şi aparat de analiză acesta poate să detecteze 1 pg/mg de metenolon în condiţiile în care au

fost procesate doar 100 mg de păr.

Rezultate şi discuţii

Liniaritatea a fost observată atunci când concentraţia merge de la 2 la 100 pg/mg

având un coeficient de corelaţie de 0,965 -0,981. Această analiza relevă prezenţa

metenolonului în corpul acestor doi sportivi în concentraţie de 7,3 si 8,8 pg/ml.

Folosirea NaOH presupune o completă descompunere a părului, dar nu afectează

analiţii a căror stabilitate în condiţii alcaline a fost demonstrată în timpul analizei. În condiţii

cromatografice nu a avut loc nici o interferenţă între analiţi şi materialele extractabile

endogene prezente în păr. Pentru a obţine un grad optim de selectivitate care este de o mare

importanţă în controlul anti-doping, a fost aplicată tehnica SRM (selectare monitorizată a

reacţiilor). Este de preferat să se producă un semnal ionic intens, caracteristic pentru

compusul analizat. Selectivitatea şi sensibilitatea sunt mărite foarte mult prin micşorarea

zgomotului. O cromatogramă obţinută de la un calibrator la 5 pg/mg este arătată în figura 19

Ionii selectaţi şi timpii de reţinere ai metenolonului sunt trecuţi în tabelul 3. Ionul

părinte al metenolonului corespunde ionului molecular (m/z 446), cei doi ioni secundari (m/z

208 şi 195) au fost aleşi pe baza criteriului de specificitate şi abundenţă. Liniaritatea se

observă între 2-100 pg/mg. Mai jos sunt prezentaţi timpii de reţinere ai metenolonului şi ai

testosteronului, care a fost folosit ca şi standard intern şi ionii corespunzători timpilor de

reţinere. Metenolonul are doi ioni părinte, unul cu m/z 195 şi unul cu m/z 208.

41

Tabel 3. Timpii de reţinere şi ionii selectaţi ai metenolonului şi testosteronului-d3.

Analitul Timpul de reţinere(minute)

Ionii (m/z)

Metenolon 10,84 446-195 şi 208Testosteron d3 10,54 209

42

Fig. 19 Cromatogramele obţinute după extracţie: prima cromatogramă indică primul ion al metenolonului m/z=195; cromatograma a doua indică al doilea ion al metenolonului m/z=208

43

Fig 20 Cromatograma de sus reprezintă testosteronul d3 cu ionul principal la m/z=209, iar cromatograma de jos reprezintă metenolonul

În urma a trei calibrări independente, coeficienţii de corelaţie au variat între 0.965 şi

0.981. Din materialul introdus în coloană, s-a recuperat un procent de 97%. Limita de

44

detecţie a metenolonului a fost de 1pg/mg. Limita de cuantificarea fost primul punct al curbei

de calibrare (2pg/mg).

Procedeele cromatografice extensive: (două faze de purificare, una prin faza solidă şi

o extracţie lichid-lichid) au fost premisele analitice pentru identificarea metenolonului din

păr datorită concentraţiei mici din proba analizată.

Analiza firelor de păr obţinute de la doi culturişti relevă prezenţa metenolonului în

corpul acestora în concentraţie de 7.3 respectiv 8.8 pg/mg. Figura 19 reprezintă

cromatograma obţinută prin selectarea monitorizată a reacţiei (SRM) primului atlet. Aceste

rezultate nu au fost contestate de către subiecţi.

Literatura de specialitate este foarte săracă în lucrări care să trateze identificarea

metenolonului din păr. În 1999, Deng şi autorii au testat steroizii anabolici din firele de păr

de la 7 persoane care abuzau de steroizi. Oricum, la o limită de detecţie de 20 pg/mg şi o

recuperare la 24%, autorii lucrării nu au reuşit să diagnosticheze pozitiv nici un subiect

suspect.

Prepararea probelor de păr pentru determinarea conţinutului de metenolon implică o

puternică hidroliză alcalină pentru a mări recuperarea urmelor de metenolon din păr.

Substanţele omogene din păr au fost extrase conform tehnicii propuse de Comitetul

Internaţional Olimpic pentru urină care au fost adaptate pentru analiza părului.

Când se utilizează analiza părului în cazul unui subiect suspectat de dopaj, în mod

special în cazul în care substanţa fost identificată în urină iar în păr nu, apare problema dacă

procedura a avut acurateţea necesară.

Dacă în probele de păr sunt găsite urme de substanţe anabolizante, iar în urină nu sunt

detectate, cazul respectiv de dopaj devine ambiguu, neputându-se ajunge la o concluzie

unanimă, riscându-se o eroare în acel caz.

Până când laboratoarele care se ocupă cu astfel de analize nu vor deţine o aparatură

adecvată şi în acelaşi timp destul de performantă pentru a analiza cele două tipuri de probe,

compararea rezultatelor obţinute în cele două cazuri nu este indicată. Pentru ca steroizii

anabolici să aibă un efect vizibil în îmbunătăţirea performanţelor unui sportiv, trebuie să fie

administrate regulat, spre deosebire de cocaină sau amfetamină, care au un efect imediat.

O mai mare rezistenţă a corpului uman la efort este dată de administrarea unor

substanţe active. Aceste substanţe sunt denumite steroizi anabolici şi sunt componente

45

structurale aparţinând testosteronului, hormonul bărbătesc. Metenolonul, drog folosit de

asemenea pentru dopajul sportivilor de performanţă, pe lângă stanozolol sau nandrolon, este

ambalat în tablete pentru administrare orală sub denumirea de Primobolan, şi pentru

administrare intravenoasă în fiole, sub denumirea de Primobolan-Depot. Acest drog

accelerează dezvoltarea muşchilor printr-un efect anabolic

Termenul lung de menţinere în corpul uman a unor substanţe anabolizante a fost tot

timpul o provocare pentru laboratoarele care se ocupă cu controlul anti-doping.

În controlul anti-doping, steroizii anabolici sunt detectaţi în urină folosind tandemul

GC-MS, tehnica HPLC sau EMIT. Abuzul de steroizi anabolici este foarte greu de detectat în

urină datorită faptului ca aceştia sunt administraţi pe o perioadă bine determinată de timp,

între 4 si 18 luni, după care urmează o pauză de la o lună până la un an, aceste perioade

alternând tot timpul.

Efectele care apar în urma administrării acestor steroizi anabolici, cum ar fi severe

disfuncţii cardio-vasculare, au fost depistate la tinerii care abuzează de aceste droguri în

perioada administrării acestora. Efecte mai grave, cum ar fi tumori hepatice sau tulburări

neuronale, se depistează după acea perioadă de administrare în care sportivul a făcut abuz de

acest drog. Mai mult decât atât, abuzul de anabolizante în general are efect asupra

metabolismului, funcţiilor organelor vitale, şi în special al inimii şi ficatului, ducând frecvent

la infarct miocardic sau insuficienţă renală.

Analiza părului în vederea obţinerii unor informaţii în legătură cu administrarea unor

droguri, a fost introdusa de 20 de ani în practică, toxicologia fiind de departe ramura care se

ocupă amănunţit cu această metodă. Studiile clinice şi criminalistice indică folosirea acestei

metode pe scară largă, metodă foarte precisă de detectare a drogurilor si steroizilor prezenţi

în corpul uman. Analiza urinei nu dă informaţiile scontate din cauză că drogurile pot fi

administrate cu mult înaintea controlului doping, şi informaţia din sânge se pierde mai repede

decât cea din păr. De aceea, cu ajutorul analizelor de păr rezultatele sunt satisfăcătoare şi duc

întotdeauna la confirmarea sau infirmarea existenţei acestor droguri în sânge. Locul şi rolul

analizei părului în controlul anti-doping este pe larg descris în revistele de specialitate.

46

Determinarea unor compuşi toxici din substanţe de abuz

Componenţii aromatici volatili, cum sunt benzenul, toluenul, etil benzenul şi xilenul

sunt foarte toxici. Expunerea la astfel de componenţi este în mare măsură datorată traficului

autovehiculelor în aerul din mediu, iar în spaţiile închise se datorează în mare măsură

fumatului, dar şi unor substanţe ca: vopsele, lacuri, adezivi.

Prepararea probelor

Probele de aer au fost adsorbite pe cărbune activ, cca 250mg, aşezat în cartuşuri, cu

un debit de 60 ml/min. Extracţia s-a făcut cu clorură de metilen, agitând 2 min, apoi, după

centrifugare şi adăugare a piridinei, standardul intern, 3 µl s-au injectat în cromatograful de

gaze.

Aparatura

S-a utilizat spectrometrul de masă cuadrupolar DSQ Thermo Finnigan cuplat cu

cromatograful de gaze Trace GC . Coloana cromatografică utilizată a fost o coloană capilară

Rtx-5MS, 15 m x 0.25 mm, 0.25µm grosime film, într-un program de temperatură de 9 min ,

de la 30 oC (2min), 10 oC/min la 70oC, apoi 30oC/min la 220oC în modul de lucru

monitorizare pe ion selectat (SIM), precum şi în modul de lucru SCAN. Condiţiile de lucru

au fost: linia de transfer 250oC, temperatura injectorului:200 oC; a sursei de ioni 250 oC;

Splitter: 10:1. Energia electronilor a fost de 70eV iar curentul de emisie al filamentului de

100µA. În modul SIM s-au utilizat următorii ioni: m/z 78 pentru benzen, m/z 91 şi 92 pentru

toluen, m/z 91 şi 106 pentru etilbenzen şi xilen şi m/z 52 şi 79 pentru standardul intern.

Rezultate şi discuţii

Concentraţiile de benzen, toluen, etil-benzen şi xilen în diferite probe sunt prezentate

în tabelul 4. După cum se vede, toate cele 4 substanţe se află în aurolac şi prenandez, de aici

ne putem da seama de periculozitatea inhalării acestora. Se vede că în prenadez şi în aurolac,

concentraţia toluenului este foarte ridicată. Probele cu prenadez s-au prelevat şi dintr-un

atelier de reparaţii încălţăminte. Pentru toate aceste probe s-a folosit aceeaşi metodă de

prelevare, adică folosind o pompă specială cu ajutorul căreia se pompează 60 ml/min aer

poluat într-un cartuş în care se află cărbune activ, pe care aceste substanţe se adsorb.

În tabelul următor sunt prezentate concentraţiile BTEX din probele analizate mai sus.

Componentă Aurolac Prenadez Atelier reparaţii Parc auto

47

încălţăminteB 38,81 60,15 21,43 0,024T 41,31 157,86 95,85 0,001E 0,55 - 1,5 -X 1,79 2,56 0,7 -

Tabel 4. Concentraţia (BTEX, n=2) în diferite probe

RT: 0.00 - 13.67

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Time (min)

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

20

40

60

80

1002.13

2.46

1.301.06 2.98 4.19 7.934.583.34 7.146.815.16

2.16

2.46

1.30

1.08 4.19 7.852.981.58 7.054.60 6.313.59 5.29

1.31

2.66

1.41

2.713.04

4.2211.213.53 6.354.62 9.018.53 9.957.315.83 11.91 13.66

NL:7.02E7

TIC MS papuci1py1mg

NL:4.06E7

TIC MS Pren1l

NL:4.21E8

TIC MS pren2-20

Fig. 21 Cromatogramele SIM şi SCAN pentru componenţii extraşi dintr-un litru de aer (din atelierul

de reperaţii încălţăminte şi din aerul din apropierea unei sticle deschise de prenandez);

(Benzenul, 1,30 min; toluenul, 2,46 min; piridina, standard intern, 2,16 min);

Primul ion monitorizat este ionul benzenului, după cum se vede şi din cromatogramă.

48

RT: 0.00 - 15.62

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100Re

lative

Abu

ndan

ce2.13

2.461.30

1.06 4.03 4.19 7.882.98 4.74 7.056.341.61

1.07

1.31

2.12 2.50 10.4510.31 10.808.644.07 11.788.44 15.2713.13 14.694.74 6.32 7.535.31

NL:4.11E7

TIC MS Auro1l

NL:3.53E8

TIC MS auro1scan_040303195726

Fig 21. Cromatogramele SIM şi SCAN pentru componenţii extraşi dintr-un litru de aer (din apropierea unei sticle deschise de aurolac)

(Benzenul, 1,30 min; toluenul, 2,46 min; piridina, standard intern, 2,16 min);

49

Nr.ctr. Componentă tR M1 Ciclohexan 1.08 842 Benzen 1.34 783 3-metil hexan 1.41 1004 Dimetilciclopentan 1.48 985 Heptan 1.63 1006 Metilciclohexan 1.88 987 Toluen 2.66 928 Octan 3.04 1149 Etilciclohexan 3.53 11210 Etil benzen 4.07 10611 (m+p)-xilen 4.22 10612 o-xilen 4.62 10613 Nonan 4.75 12814 Izopropilciclohexan 5.22 12615 Decan 6.38 14216 Undecan 7.30 15618 Etilbenzoat 7.86 15019 Benzylbromid 8.49 18420 Butil benzoat 8.95 17821 Difenileter 9.01 17022 Tetradecan 9.45 19823 Hexadecan 9.84 22624 Diizobutilftalat 9.95 27825 Nonadecan 10.23 26826 Benzil benzoat 10.62 21227 Dibutilftalat 11.21 278

50

Tabel 5 Componenţii identificaţi în prenadez, timpii de reţinere şi masele lor moleculare.

Tabel 6 Componenţii identificaţi în aurolac, timpii de reţinere şi masele lor moleculare. În tabelul 6 sunt prezentaţi componenţii identificaţi în aurolac, timpii de reţinere şi

masele

lor

moleculare. La fel ca şi în prenadez, se pot observa aproape aceiaşi componenţi şi în aurolac.

Nr.crt. Component tR(min) M1 Benzen 1.34 782 acetaldehida dietilacetal 2.12 1183 Octan 3.04 1144 Tetracloretan (impuritate din solvent) 3.16 1665 etil benzen 4.07 1066 (m+p)-xilen 4.22 1067 o-xilen 4.62 1068 Nonan 4.75 1289 Izopropilciclohexan 5.22 12610 trimetil benzen 5.92 12011 metilpropil ciclohexan 6.11 14012 Decan 6.38 14213 Undecan 7.30 15614 Butil izooctil ftalat 8.64 33415 Diizobutilftalat 9.53 27816 Diizooctil ftalat 10.45 390

51

Aproape toţi aceşti componenţi identificaţi în aceste probe sunt toxici, şi inhalarea acestor

substanţe este foarte periculoasă pentru sănătatea oamenilor.

Din aceste două tabele se poate trage o concluzie foarte importantă: metoda GC-MS

este foarte sensibilă şi selectivă pentru analize de cantităţi în urme.

În tabelul 7 sunt prezentate limitele de detecţie a celor mai des folosite droguri,

alături de metoda de detecţie.

Drog/matrice biologica Limita de determinare cantitativă

Preconcentrare/Metodă Referinţă

Cocaina, opiacee/păr 0,1-0,3ng/mg SPE;GC/MS

Gaillard şi Pepin

Tetrahidrocanabinol-9-carboxilic acid/sangeBenzoilecgonina; Fenciclidina,Amfetamina, Metamfetamina, Codeina,Morfina,

2 ng/ml

5 ng/ml2.5 ng/ml150 ng/ml100 ng/ml500 ng/ml1000 ng/ml

SPE;GC/MS

Underwood

CocainaEtilencocainaBenzoilecgonina Ecgonin-metilester

25ng/ml50ng/ml50ng.ml100ng/ml

GC/MS (ITD) Chasin şi Midio

Benzoilecgonina/urină 0.03µg/ml0.3µg/ml

SPME;GC/MSEMIT

Hall

Cocaina/sange,urina 100ng/ml GC/MS Ohshima şi Takayasu

Tabel 7 Limita de detecţie cantitativă a celor mai importante droguri

CONCLUZII

În ţările dezvoltate, analiza diferitelor substanţe cu ajutorul metodei GC-MS ocupă

un loc foarte important în special în toxicologie şi criminalistică. Dezvoltarea tehnicii de

52

analiză cantitativă duce la o dezvoltare a industriei farmaceutice, ajută foarte mult în special

criminaliştii şi toxicologii în determinarea unor anumite substanţe aflate în corpul uman.

Datorită sensibilităţii foarte ridicate a acestor aparate, acestea sunt capabile să găsească în

corpul uman anumite substanţe care au fost administrate cu mult înaintea efectuării analizei.

Din păcate, în ţara noastră tehnica de analiză cu ajutorul GC-MS este foarte puţin

dezvoltată, din cauza costurilor prea ridicate a aparatelor, a substanţelor necesare efectuării

analizelor, şi din cauza existenţei insuficiente de specialişti în domeniu.

Introducerea unui astfel de sistem de analiză ar face mai uşoară munca farmaciştilor,

a toxicologilor, a criminaliştilor, pentru că, după cum se ştie, doar la Institutul de Medicină

Legală din Bucureşti se fac astfel de analize. În general aceste instituţii sunt dotate doar cu

spectrometre de masă pe strat subţire, cum de altfel există si la Institutul de Medicină Legală

din Cluj-Napoca, care nu poate exprima cantitativ nivelul unor substanţe, doar confirmă sau

infirmă existenţa acestor substanţe în organism.

Analizarea probelor prelevate de la sportivii de performanţă este de asemenea

importantă, şi după cum am amintit mai sus, aceste analize se fac doar la Institutul de

Medicină Legală din Bucureşti. Existenţa a mai multor Centre de Medicină Legală dotate cu

astfel de sisteme de analiză este foarte importantă mai ales pentru sportul de performanţă în

general. Analizele de alcoolemie a unor produşi biologici prelevaţi de la conducătorii auto

surprinşi in stare de ebrietate, este de asemenea importantă pentru stabilirea alcoolemiei.

Inspectoratele de poliţie ar trebui să fie dotate şi ele cu astfel de aparatură, pentru uşurarea

procedurii pe care trebuie să o facă organele de poliţie. În ţările dezvoltate, în mai toate

centrele regionale de poliţie există astfel de aparate, care pot să analizeze probele biologice

recoltate de la conducătorii auto. La o astfel de analiză pot să apară şi surprize, dacă persoana

investigată a consumat şi droguri. Un control de rutină al alcoolemiei nu este suficient, mai

ales dacă persoana a mai consumat şi droguri.

Substanţele de abuz cum sunt în care se încadrează şi aurolacul sau prenadezul, conţin

componenţi toxici, printre care toluenul şi benzenul sunt în cantitate foarte mare şi reprezintă

solvenţii utilizaţi în substanţele respective.

Metoda GC-MS este rapidă, precisă şi specifică pentru analiza unor compuşi de

interes pentru toxicologie şi criminalistică.

53

Sistemul de analiză cromatografie de gaze cuplat cu spectrometrie de masă poate fi

utilizat, în ecologie la determinarea de poluanţi organici, poluanţi BTEX (benzen, toluen,

etil-benzen, xilen), după cum se poate vedea şi din analizele efectuate în capitolul 4,

hidrocarburi din aer, sol, alimente, metale în urme, control alimente; în farmacie la

determinarea de parametrii farmacocinetici, purităţi ale medicamentelor, studii de

bioechivalenţă; în medicină pentru tratament, diagnosticare, pentru că, această metodă este

foarte eficientă mai ales când este vorba de diagnosticarea disfuncţiilor hepatice; în nutriţie,

în studii de metabolism; în geologie, chimie, fizică, biofizică, agricultură pentru determinarea

poluanţilor din sol, pentru determinarea calităţii solului, etc.

Datorită unei defecţiuni la aparatul de analiză, nu am mai putut să analizez şi unele

probe prelevate de la indivizi care au consumat droguri, aflaţi sub supraveghere clinică la

Secţia Clinică de Psihiatrie III din Cluj-Napoca. Analizarea acestor probe dădea un înţeles

mai profund acestei lucrări şi oferea rezultate care puteau fi folosite de către medicii care îi

ţin sub supraveghere pe aceşti consumatori, dar putea fi şi un material de referinţă pentru

cercetătorii din acest domeniu, pentru că pe acest domeniu nu s-a pus până acum un accent

deosebit.

Bibliografie

1. M. Culea, E. Culea, “Metode fizice de analiză“; Editura Risoprint, Cluj-Napoca, 2004.

54

2. Y.Gaillard, G.Pepin, “Simultaneous solid-phase extraction on C18 cartridges of opiates and cocainics for an improved quantitation in human hair by GC-MS“ one year of forensic applications, Forensic Sci. Int. 86(1-2):49-59, 1997.

3. T.Korte, J.Pykalainen, P.Lillsunde, T.Seppala, “ Comparison of RapiTest with Emit d.a.u. and GC-MS for the analysis of drugs in urine “, J Anal Toxicol. 21(1):49-53, 1997.

4. P.J.Underwood. G.E.Kananen, E.K.Armitage, “A practical approach to determination of laboratory GC-MS limits of detection” J Anal Toxicol. 21(1):12-6, 1997.

5. J.S.Gracioso, M.Q. Paulo, C.A. Hiruma Lima, A.R.Souza Brito, “Antinociceptive effect in mice of a hydroalcoholic extract of Neurolaena lobata (L.) R. Br. and its organic fractions” J Pharm Pharmacol. 50(12):1425-9, 1998.

6. A.A.Chasin, A.F.Midio, “Validation of an ion-trap gas chromatographic-mass spectrometric method for the determination of cocaine and metabolites and cocaethylene in post mortem whole blood”, Forensic Sci Int. 109(1):1-13, 2000.

7. S.W.Toennes, A.S.Fandino, G.Kauert. “Gas chromatographic-mass spectrometric detection of anhydroecgonine methyl ester (methylecgonidine) in human serum as evidence of recent smoking of crack” J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 735(1):127-32, 1999.

8. M.A.Huestis, J.M.Oyler, E.J.Cone, A.T.Wstadik, D.Schoendorfer, R.E.Joseph Jr., “Sweat testing for cocaine, codeine and metabolites by gas chromatography-mass spectrometry” [Review] [54 refs], J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 733(1-2):247-64, 1999.

9. B.J.Hall, A.R.Parikh, J.S.Brodbelt, “Aqueous phase hexylchloroformate derivatization and solid phase microextraction: determination of benzoylecgonine in urine by gas chromatography-quadrupole ion trap mass spectrometry” J Forensic Sci. 44(3):527-34, 1999.

10. T.Ohshima, T.Takayasu, “Simultaneous determination of local anesthetics including ester-type anesthetics in human plasma and urine by gas chromatography-mass spectrometry with solid-phase extraction”, J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 726(1-2):185-94, 1999.

11. J. Segura, C.Stramesi, A.Redon, M.Ventura, C.J.Sanchez, G.Gonzalez, L.San, M.Montagna, “Immunological screening of drugs of abuse and gas chromatographic-mass spectrometric confirmation of opiates and cocaine in hair” J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 724(1):9-21, 1999.

55

12. S.Pichini, R.Pacifici, I.Altieri, M.Pellegrini, P.Zuccaro, “Determination of opiates and cocaine in hair as trimethylsilyl derivatives using gas chromatography-tandem mass spectrometry”, J Anal Toxicol. 23(5):343-8, 1999.

13. M.A.elSohly, W.J.Kopycki, S.Feng, T.P.Murphy, B.J.Lukey “GC/MS analysis of m-hydroxybenzoylecgonine in urine. Forensic implication in cocaine use” Clin Lab Med. 18(4):699-704, ix, 1998.

14. J.Segura, R.Ventura, C.Jurado,”Derivatization procedures for gas chromatographic-mass spectrometric determination of xenobiotics in biological samples, with special attention to drugs of abuse and doping agents”. [Review] [281 refs] J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 713(1):61-90, 1998.

15. H.P.Eser, L.Potsch, G.Skopp, M.R.Moeller, “Influence of sample preparation on analytical results: drug analysis [GC/MS] on hair snippets versus hair powder using various extraction methods” Forensic Sci Int. 84(1-3):271-9, 1997.

16. M.Uhl “Determination of drugs in hair using GC/MS/MS”, Forensic Sci Int. 84(1-3):281-94, 1997.

17. T. Mieczkowski, R.Mumm, H.Connick, “A research note: an analysis of RIA and GC/MS split hair samples from the New Orleans Pretrial Diversion Program”, Forensic Sci Int. 84(1-3):67-73, 1997.

18. B.J.Gudzinowicz , Gas Chromatographic Analysis of Drugs and Pesticides, Edward Arnold ltd., London, Marcel Dekker,Inc., New York, 1967.

19. D.L. Allen, K.S. Scott, J.S. Oliver, Comparison of solid-phase extraction and supercritical fluid extraction for the analysis of morphine in whole blood, J.Anal. Toxicol., 23(3);216-218, 1999.

20. D.Dempsey, P. Jacob, J.C. Partridge, R.T. Jones, K. Panganiban, M.C. Rowbatham, Cocaine metabolite kinetics in the newborn, J.Anal. Toxicol., 23(1);24-8, 1999.

21. G. Guiochon, C. Pommier, La chromatography en phase gaseuse, Chimie inorganique ,1971.

22. Robert L. Grob, Modern practice of gass chromatography, 1977.

23. M.A. Frankle, J. Payne, G.J. Cicero, J.Am. Med. Assoc. 252 (1984) 482;

24. S.B. Karsch, in: S.B. Karsch (Ed.), The Pathoogy of Drugs Abuse, 2nd ed., CRCPress, FL,1996, p.409.

25. R. Hausmann, S. Hammer, P.Betz, Int. J. Leg. Med. 111, (1998) 261.

56

26. B. Madea, W. Grellner, F. Musshoff, R. Dettmeyer, J. Clin.Forensic Med.5 (1998) 1.

27. P. Kintz, Toxicol. Lett. 102-103 (1998), 109.

28. L. Rivier, Forensic Sci. Int. 107 (2000), 309.

29. P. Kintz, V. Cirimele, B. Ludes, Forensic Sci. Int. 107 (2000), 325.

30. F. Pragst, M. Rothe, K. Spiegel, F.Sporkert, Forensic Sci. Rev.10 (1998) 81.31. R. Wennig, Forensic Sci. Int. 107 (2000), 5.

32. Y. Nakahara, in: T. Mieczkowiski (Ed.), Drug Testing Technology, CRC Press, Boca Raton, FL. 1999, p. 49.

33. X.-S. Deng, A. Kurosu, D.J. Pounder, J. Forensic Sci. 44 1999, 343.

34. D. Thieme, J. Grosse, H. Sachs, R.K. Mueller, Forensic Sci. Int. 107 (2000) 335.

35. Loi No. 99-223 from March 23, 1999 and Decret No. 2001-35 from 11 january2001, Ministere de le Jeunesse et des Sports.

36. D. Paul Buddha, C. Dreka, S. Eric Knight, M. Smith Gas chromatographic/Mass Spectrometric Detection of Narcotine, Papaverine,and Thebaine in seedsof Papaver Somniferum, Division of Forensic Toxicology, Armed Forces Institute of Pathology (1998).

37. M. ElSholy, A.B. Jones, Handbook of Workplace Drug Testing, (1995) p.225-237.

38. Department of Health and Human Services, Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs,Part IV. 11970-11988.

39. K. Pfleger, H. Maurer, A. Weber, Mass Spectral and GC Data of Drugs, Poison and Their Metabolites, Part II, VCH, Weinheim, (1985).

57