INTRODUCERE

Obiectul de studiu al microbiologiei

Obiectul de studiu al microbiologiei este biologia microorganismelor, mai precis forma, structura şi activitatea fiziologică a acestora. Microorganismele sunt organisme mici, vizibile doar la microscop. Deoarece micros (gr.) = mic, bios (gr.) = viaţă, logos (gr.) = ştiinţă, termenul de microbiologie ar însemna ştiinţa despre organisme cu viaţă scurtă, provenind de la cuvântul „microb”, introdus de Sedillot (1878). Acest termen se referă în special la microorganismele patogene şi, deşi frecvent folosit, nu este ştiinţific. Noţiunea de microorganism nu are semnificaţie taxonomică, deoarece reuneşte un grup foarte vast, heterogen de organisme diferite ca poziţie sistematică, dar care prezintă o serie de caractere comune:

- au dimensiuni microscopice, dimensiunile lor se exprimă în µm (10-6m), iar ale organitelor lor în nm (10-9m) sau chiar în Å (10-10m);

- prezintă organizare în general unicelulară, sub două forme: o celule de tip procariot o celule de tip eucariot. Chiar dacă unele microorganisme formează asociaţii pluricelulare,

acestea nu prezintă diferenţiere celulară pentru a forma ţesuturi şi organe, iar o celulă izolată din aceste asociaţii îşi păstrează viabilitatea, creşte, se divide şi reface asociaţia;

- structura lor internă este în general simplă. Heterogenitatea microorganismelor este definită prin alte caracteristici:

- poziţia sistematică diferită; - activitatea biologică diversă; - morfologia şi structura internă a diferitelor grupe de microorganisme sunt de asemenea diverse.

În categoria microorganismelor intră: - celule procariote:

o Eubacterii (bacterii adevărate) o Cianobacterii (bacterii albastre-verzi) o Actinomicete (bacterii filamentoase, cu organizare de tip micelial) o Arhebacterii (microorganisme foarte asemănătoare din punct de vedere morfologic şi

structural cu bacteriile adevărate, care se găsesc în medii de viaţă variate şi corespund bacteriilor extremofile)

- celule eucariote: o Fungi microscopici, care includ:

� levuri (drojdii) � mucegaiuri (fungi filamentoşi, cu organizare pluricelulară)

o Alge microscopice o Protozoare.

Microbiologia studiază şi virusurile şi entităţile moleculare infecţioase cu organizare subvirală (viroizii şi prionii), deşi acestea nu sunt microorganisme şi nu au structură celulară.

Diviziunile microbiologiei

Diversitatea proceselor fiziologice bacteriene, rolul lor esenţial în ecosistemele naturale,

capacitatea de a sintetiza substanţe utile sau dea produce procese infecţioase la organismele superioare au determinat diversificarea domeniilor de studiu al microorganismelor.

Clasificarea diferitelor domenii se poate face după criterii taxonomice (bacteriologie, virologie, algologie, micologie, protozoologie), după criterii funcţionale (fiziologia, biochimia, ecologia, genetica microorganismelor), după mediul din care provin microorganismele (microbiologia solului, hidromicrobiologia, geomicrobiologia) şi după aplicaţiile practice ale diferitelor categorii de microorganisme (microbiologie industrială, medicală, biotehnologia).

Ecologia microorganismelor studiază legităţile generale de evoluţie şi interacţiune a microorganismelor în natură, interacţiunile dintre microorganisme şi interrelaţiile microorganismelor cu macroorganismele.

Genetica microorganismelor studiază substratul molecular al eredităţii şi variabilităţii microorganismelor şi mecanismele de transfer al materialului genetic la bacterii.

Microbiologia solului studiază ansamblul microorganismelor din sol, rolul lor în fertilitatea solului şi în circuitul elementelor biogene în natură, precum şi interacţiunile dintre aceste microorganisme şi plante.

Hidromicrobiologia studiază microorganismele din mediile acvatice şi rolul lor în lanţurile trofice.

Geomicrobiologia studiază în principal microbiologia petrolului, având un pronunţat caracter utilitar. Studiază rolul microorganismelor în geneza petrolului şi a zăcămintelor minerale, posibilitatea utilizării acestora în exploatarea, biodegradarea sau recuperarea petrolului şi zăcămintelor.

Microbiologia insectelor studiază relaţiile dintre microorganisme şi artropode, care pot avea un rol important ca vectori în patologia umană, animală şi vegetală.

Microbiologia industrială s-a dezvoltat pornind de la descoperirea proceselor fermentative de către Louis Pasteur. Ea studiază utilizarea diferitelor microorganisme producătoare de substanţe utile pentru alimentaţie, terapeutică sau industrie.

Microbiologia medicală studiază microorganismele patogene pentru om şi animale, patogenitatea şi virulenţa acestora, factorii care condiţionează virulenţa, modul lor de transmitere şi modalităţile de combatere.

Microbiologia generală este o ştiinţă biologică fundamentală, care studiază particularităţile organizării structurale şi funcţionale ale celulei bacteriene, biologia şi sistematica bacteriilor, răspândirea lor în natură, relaţiile lor ecologice cu alte microorganisme sau cu macroorganismele, originea şi evoluţia lor, fenomenele de ereditate şi variabilitate microbiană. Este o ştiinţă de sinteză şi se bazează pe date din domeniile aplicative ale microbiologiei. Cunoaşterea principiilor fundamentale ale microbiologiei generale este o necesitate pentru orice biolog, indiferent de domeniul său de activitate.

Istoricul microbiologiei

Descoperirea microorganismelor datează din 1676, când olandezul Anton van Leevenhoek a examinat picături de apă din diferite surse naturale, picături de salivă, picături de puroi cu ajutorul unui un aparat optic propriu de mărire a imaginii. Cu ajutorul acestui microscop special, care mărea de 270 de ori, el a observat o lume fascinantă, într-o mişcare perpetuă. În descrierile sale, printre alte organisme, se recunosc şi bacteriile, pe care Leevenhoek le-a denumit animalcule, considerându-le nişte „pui” ale animalelor acvatice mai mari. El nu a sesizat noutatea lumii pe care a văzut-o, de aceea, deşi 24 aprilie

1676 este considerată ziua de naştere a microbiologiei, Leevenhoek nu este considerat întemeietorul microbiologiei ca ştiinţă. Botanistul Carl Linaeus, în lucrarea sa „Systema naturae” (1735), grupează sistematic toate vieţuitoarele cunoscute, introducând microorganismele în categoria „chaos”. Întemeietorul microbiologiei ca ştiinţă este considerat Ferdinand Cohn (1875), cercetător care a intuit caracterele aparte ale microorganismelor, iar lucrările lui Louis Pasteur (1822 - 1895) au avut o importanţă deosebită pentru evoluţia acestei ştiinţe. Pasteur a înfiinţat primele laboratoare de cercetare microbiologică şi a studiat procesele fermentative. A demonstrat că fermentaţiile sunt procese biologice produse de acţiunea unor microorganisme facultativ anaerobe, fiecare fiind determinată de o categorie specifică de germeni. A studiat bolile fermentaţiilor, cauzate de contaminarea acestora cu organisme străine care le deviază cursul normal şi a pus la punct o metodă de evitare a contaminării fermentaţiilor cu agenţi nedoriţi (pasteurizarea).

A înlăturat concepţia generaţiei spontanee care data din antichitate, conform căreia vieţuitoarele ar putea să apară spontan din materie organică. Prin experimentele sale cu baloane de sticlă prevăzute cu un tub în formă de gât de lebădă, a demonstrat că de fapt vieţuitoarele „apărute spontan” erau contaminanţi din aer şi apă. Pasteur a pus la punct teoria originii microbiene a bolilor infecţioase studiind îmbolnăvirea viermilor de mătase şi a deschis era prevenirii bolilor infecţioase prin vaccinarea antibacteriană şi antivirală, practică medicală de o importanţă deosebită, ce a dus la crearea unui domeniu nou, imunologia. Medicul german Robert Koch a avut contribuţii importante la dezvoltarea domeniului bacteriologiei, fiind considerat fondatorul acestei ramuri microbiologice. Este cel care a introdus în practica de laborator folosirea mediilor solide pentru cultivarea tulpinilor bacteriene.

A descoperit mai multe specii de bacterii patogene, printre care bacilul tuberculozei şi vibrionul holerei.

În urma cercetărilor pe animale de laborator a elaborat principiile generale prin care un anumit germen poate fi considerat agentul etiologic al unei boli (cele 4 postulate ale lui Koch): 1. Microorganismul trebuie să fie găsit cu regularitate în leziunile bolii respective; 2. Microorganismul trebuie să fie izolat de la gazda infectată şi cultivat într-o cultură pură; 3. Inocularea culturii pure obţinute în laborator la un animal sensibil trebuie să reproducă boala; 4. Microorganismul trebuie să se regăsească din nou cu regularitate la noua gazdă în leziunile caracteristice bolii. Microbiologul rus Ilia Ilici Mecinikov (1845 - 1916) a studiat digestia intracelulară a particulelor de carmin la echinodermele marine la Institutul Pasteur de către celule pe care le-a denumit fagocite şi a emis ipoteza că astfel de celule există şi în organismele umane şi animale. Prin descrierea fenomenului de fagocitoză a pus bazele teoriei imunităţii celulare. Biologul rus Dimitri Ivanovski (1864 - 1920) a descoperit în 1892 virusul mozaicului tutunului (VMT), întemeind ştiinţa numită virusologie. Natura particulară a virusurilor a fost intuită în 1897 de către Martinus Willem Beijerinck, microbiolog şi botanist olandez, care le-a denumit „contagium vivum fluidum”. Alexander Fleming a descoperit în 1921 lizozimul şi în 1929 penicilina, antibiotic produs de Penicillium notatum, care a fost ulterior purificată de către savanţii britanici Florey şi Chain (1940). Cei trei cercetători au primit în 1945 Premiul Nobel pentru medicină pentru descoperirea acestui antibiotic. Winogradski este considerat întemeietorul microbiologiei solului. La noi în ţară, realizări de marcă în domeniul microbiologiei au aparţinut lui Victor Babeş (1854 - 1926), care a lucrat la Institutul Pasteur din Paris şi a fost colaborator al lui Robert Koch. El a studiat numeroase boli (lepra, holera, tuberculoza, turbarea, febra tifoidă), descoperind peste 50 de microbi.

Împreună cu Victor Cornil a scris în 1885 primul tratat de bacteriologie din lume, intitulat „Les bactéries et leur rôle dans l'anatomie et l'histologie pathologiques des maladies infectieuses”. A descris corpusculii Babeş-Negri în creierul animalelor moarte de turbare, importanţi pentru diagnosticul bolii, precum şi corpusculii Babeş-Ernst din citoplasma unor bacterii Gram pozitive. Ioan Cantacuzino (1863 - 1934), întemeietorul Institutului din Bucureşti care îi poartă azi numele, a fost elev al lui Mecinikov, studiind imunitatea şi fagocitoza la nevertebrate, dar şi numeroase boli ca scarlatina, holera, tuberculoza, difteria, producând numeroase seruri şi vaccinuri pentru prevenirea diferitelor boli infecţioase.

A emis prima lege sanitară din România (1910) şi a avut contribuţii importante la dezvoltarea învăţământului medical românesc. Alţi cercetători români care au avut contribuţii la dezvoltarea microbiologiei ca ştiinţă au fost Constantin Ionescu – Mihăeşti (1883 - 1962), cu realizări în prevenirea infecţiilor poliomielitice, Mihai Ciucă (1883 - 1969), renumit pentru descoperirea fenomenului de lizogenie determinat de bacteriofagi, Dumitru Combiescu (1887 - 1961) care a studiat antraxul, leptospirozele, rickettsiozele, Nicolae Nestorescu (1901 - 1969), continuator al şcolii create de Ioan Cantacuzino, Constantin Levaditi, Ştefan S. Nicolau, cu studii asupra virusurilor hepatitice, herpetice, asupra oncogenezei şi imunologiei virale. Interesul pentru studiul microorganismelor este într-o continuă creştere, de la descoperirea lor până astăzi, deoarece numeroase specii fie sunt benefice pentru activitatea omului, fie produc infecţii la om, animale sau plante. Bacteriile sunt importante şi din punct de vedere teoretic, nu numai practic, pentru studiul proceselor vieţii în condiţii extreme.

Poziţia microorganismelor în lumea vie În sistemul de clasificare a lumii vii propus de Aristotel, erau precizate două regnuri, Plantae (în care se încadrau şi Virophyta, Bacteriophyta şi Fungi) şi Animalia (care cuprindea şi protozoarele). Ulterior Hogg (1860) şi Haeckel (1866) au propus împărţirea în 3 regnuri: Protista, Plantae şi Animalia. Clasificarea protistelor în două categorii (inferioare - procariote şi superioare - microeucariote), a fost propusă de Stanier (1864). Copeland a propus în 1938 sistemul celor 4 regnuri: Monera (bacterii şi cianobacterii), Protista (organismele eucariote inferioare, de regulă unicelulare: microalge, fungi, protozoare), Plantae şi Animalia. În 1969 Whittaker a propus un nou sistem de clasificare, în 5 regnuri:

- Monera (organisme unicelulare, cu organizare de tip procariot: bacterii, cianobacterii, actinomicete);

- Protista (microorganisme eucariote: alge microscopice, fungi acvatici flagelaţi, protozoare); - Fungi (organisme eucariote imobile, ce formează spori);

- Plantae (plante nevasculare şi vasculare); - Animalia (organisme pluricelulare, cu nutriţie de tip ingestiv).

Ulterior, Bergey a schimbat numele regnului Monera în cel de Procaryota. Criteriile de clasificare în 5 regnuri se bazau pe trei niveluri de organizare: procariot, eucariot

unicelular şi eucariot pluricelular, dar şi pe modalităţile de nutriţie: fotosintetică, absorbtivă, ingestivă. Acest sistem de clasificare evidenţiază heterogenitatea microorganismelor. Rezultatele cercetărilor la nivel molecular au arătat că sistemul de clasificare a lumii vii în 5 regnuri nu este corect din punct de vedere filogenetic, cele două regnuri de microorganisme eucariote (Protista şi Fungi) fiind artificiale. Deoarece o primă divizare a lumii vii trebuie să se facă în procariote şi eucariote, sistemele moderne de clasificare rezervă bacteriilor o poziţie sistematică aparte.

Virusurile constituie o categorie aparte de agenţi infecţioşi. Ele sunt entităţi moleculare infecţioase fără organizare celulară şi nu se pot încadra alături de celelalte microorganisme.

CONCEPTUL DE BACTERIE

Bacteriile sunt microorganisme procariote unicelulare, care au fost recunoscute ca grup distinct.

Stanier a descris conceptul de bacterie, oferind posibilitatea grupării microorganismelor pe criterii ştiinţifice şi nu printr-un acord convenţional. Conceptul de bacterie trebuie definit în funcţie de organizarea de tip procariot şi numai prin antiteză cu celula eucariotă. Celula procariotă este mai puţin complexă, ea reprezintă unitatea de structură a bacteriilor şi cianobacteriilor. Celula eucariotă, complexă, este unitatea de structură a tuturor celulelor algelor, fungilor, briofitelor, plantelor vasculare şi animalelor. Diferenţa dintre procariot şi eucariot reprezintă cea mai mare discontinuitate evolutivă prezentă în lumea vie, deoarece între cele două tipuri nu se cunosc structuri intermediare.

Principalele caractere diferenţiale între celula de tip procariot şi cea de tip eucariot sunt prezentate în tabelul următor.

Caracterul Procariote Eucariote Dimensiuni Foarte mici, 1-10µ; unele pot fi mai mari,

spiralate sau de tip filamentos, dar celulele sunt identice în cadrul filamentului

Celule mai mari, 10-100 µ; unele sunt microorganisme; cele mai multe sunt unităţi de structură ale organismelor de talie mare

Peretele celular Prezent constant la bacterii, cu o structură caracteristică; necesar existenţei acestora în condiţii naturale; în compoziţia peretelui intră constant mureina (marker biochimic al celulei bacteriene), iar la unele bacterii se întâlnesc şi acizii teichoici, acidul diaminopimelic.

Există diferenţe între celulele animale (delimitate doar de membrană celulară, fără perete celular) şi celulele vegetale sau ale fungilor, la care peretele celular este prezent şi are o compoziţie chimică variată (celuloză, polioze, Si).

Membrana plasmatică

Structural asemănătoare cu cea a eucariotelor, cu particularităţi datorate compoziţiei chimice: - permeabilitate selectivă; doar unele substanţe liposolubile, fragmentele mici de ADN, apa, enzimele degradative, unii anioni străbat membrana; - bacteriile dispun de sisteme membranare de transport activ (permeaze de natură proteică, precum şi proteine de legare, cu funcţia de a asigura transportul substanţelor prin membrane) - sterolii lipsesc din compoziţia chimică a membranei (cu excepţia micoplasmelor).

Celulele animale au membrana caracterizată printr-o mare plasticitate, capabilă de endocitoză (fagocitoză sau pinocitoză). Cele vegetale şi fungii au membrana acoperită de peretele celular rigid, care îi anulează proprietăţile speciale. Sterolii sunt prezenţi în mod constant.

Citoplasma În stare de gel permanent, în lipsa membranelor interne şi a curenţilor citoplasmatici menţine intacte structurile intracelulare; schimburile dintre celula bacteriană şi mediul extracelular se fac direct, fără necesitatea unei circulaţii interne a substanţelor.

Există o permanentă tranziţie reversibilă gel ↔ sol, curenţi citoplasmatici şi structuri membranare intracelulare.

Organitele celulare

Lipsesc la procariote. Mitocondriile sunt esenţiale şi perfect delimitate; cloroplastele sunt prezente la plantele capabile de fotosinteză.

Structura şi funcţiile materialului genetic

Organizarea materialului genetic, sediul acestuia

şi raportul cu citoplasma

Procariotele nu prezintă un nucleu propriu-zis; materialul nuclear, sediu al informaţiei genetice bacteriene, se găseşte scufundat în citoplasmă într-o zonă numită nucleoplasmă, în contact direct cu citoplasma, neprotejat de o membrană nucleară. Este denumit nucleosom (nucleoid) şi e reprezentat de o moleculă de ADN dublu catenară, circulară, covalent închisă.

Structura moleculară a materialului genetic

Informaţia genetică bacteriană e de două feluri: esenţială, absolut necesară existenţei celulei, caracteristică speciei bacteriene în ceea ce priveşte compoziţia în baze azotate G+C (nucleosomul) şi accesorie (plasmidele), reprezentată de unităţi genetice extracromozomale, de dimensiuni mai mici, constituite tot din molecule de ADN dublu catenar, circular, covalent închis. Mecanismul replicării materialului genetic

Replicarea este de tip semiconservativ: are loc desfacerea celor două catene ale moleculei de ADN la bifurcaţia de replicare, fiecare catenă separat fiind folosită pentru sinteza unei catene complementare. Fiecare moleculă dublu catenară nou formată are o catenă veche şi una nou sintetizată complementară.

Sediul şi mecanismul traducerii informaţiei

genetice

Informaţia genetică e tradusă în citoplasmă la nivelul ribozomilor 70S, structuri tipice specializate pentru această funcţie. Informaţia genetică e înscrisă continuu în cadrul moleculei de ADN, prin transcrierea ei rezultă un ARN mesager şi prin traducere proteinele.

Organizarea materialului genetic,

sediul acestuia şi raportul cu

citoplasma

Informaţia genetică e disociată în nucleu şi în organitele celulare (mitocondrii şi cloroplaste). Materialul nuclear e separat de citoplasmă printr-o membrană nucleară dublu stratificată şi este organizat în cromozomi. Informaţia genetică din organite este protejată prin membranele organitelor respective. Structura moleculară a materialului

genetic

Informaţia genetică din nucleu este reprezentată de un număr constant, caracteristic speciei, de cromozomi, care reprezintă molecule de ADN asociate cu histone, cu o structură caracteristică. Informaţia genetică din organitele celulare este sub formă de molecule de ADN dublu catenar, circular, covalent închis. Mecanismul replicării materialului

genetic

Informaţia genetică nucleară urmează procesul caracteristic de mitoză, cu fazele caracteristice şi cu apariţia fusului de diviziune. În ciclul celular al eucariotelor prima fază (G1) este lipsită de sinteze, nucleul diploid (2n) este în interfază, faza de sinteză de ADN (S) duce la dublarea informaţiei genetice (4n), urmează o fază de eclipsă (G2) care este 4n şi mitoza care reface structurile 2n. Informaţia genetică din organitele celulare se replică semiconservativ, la fel ca la procariote. Sediul şi mecanismul traducerii

informaţiei genetice

Informaţia genetică nucleară este tradusă la proteine la nivelul ribozomilor 80S din citoplasmă, iar cea a organitelor este tradusă la nivelul respectiv cu ajutorul ribozomilor 70S. Eucariotele prezintă o structură discontinuă a informaţiei genetice, alcătuită din secvenţe codificatoare

(exoni) şi necodificatoare (introni). Transcrierea duce la formarea unui ARN premesager, netraductibil, care conţine secvenţe exonice şi intronice. Maturarea ARN premesager duce la îndepărtarea din moleculă a secvenţelor intronice şi legarea celor exonice între ele, rezultând un ARNm matur, care va fi tradus la proteine.

Echipamentul enzimatic oxidativ şi de fotosinteză

Este neîmpachetat în structuri specifice, dispus difuz la nivelul membranei plasmatice şi a diverticulilor rezultaţi din aceasta. La nivelul membranei şi al mezozomilor se găseşte sinergonul respirator (ansamblul reacţiilor chimice care duc la realizarea unei anumite căi metabolice, catalizate de o serie de enzime ce acţionează regulat pentru a îndeplini un anumit proces).

Este împachetat în structuri caracteristice: mitocondrii, cloroplaste. Sinergonul respirator şi cel al fotosintezei sunt autonome, localizate în structuri specifice.

Tipul de diviziune

- Diviziunea simplă, simetrică: celula creşte progresiv până la un punct critic, apoi se divide formând două celule fiice identice; - Diviziunea asimetrică prin înmugurire; - Diviziuni multiple prin fragmentare la bacteriile filamentoase. Lipseşte aparatul mitotic, repartizarea egală a informaţiei genetice este asigurată de mezozomi.

Există un aparat mitotic, care asigură repartizarea informaţiei genetice în cadrul mitozei, cu faze caracteristice.

Procesele de sexualitate

Sunt absente; există însă procese de protosexualitate, care constau în transferul de material genetic de la o celulă donatoare (♂) la o celulă acceptoare (♀). Caracterul de masculinitate este determinat de prezenţa unei plasmide (factor de sex, F), transferul este unidirecţional, celulele nu fuzionează, ci se formează o celulă numită merozigot (zigot parţial).

Procesele de sexualitate sunt frecvente, caracterizate prin formarea gameţilor haploizi, precedată de meioză; zigotul care rezultă prin unirea gameţilor este un zigot propriu-zis, diploid (2n).

Mecanismele de trasfer de material genetic

Transferul de material genetic se face intraspecific, interspecific, chiar intergeneric, prin:

- conjugare bacteriană - transformare bacteriană - transducţie fagică - sexducţie

Prezintă fuziunea gameţilor, care este intraspecifică, urmată de fuziunea nucleară.

Mecanisme de infectare cu virusuri în condiţii experimentale

Datorită existenţei peretelui celular, infectarea bacteriilor cu un bacteriofag specific se face prin injectarea genomului fagic în celula bacteriană, învelişul proteic rămânând la exterior.

Celulele animale se infectează cu virusurile integrale prin endocitoză, formând o vacuolă derivată din membrană. Celulele vegetale se pot infecta cu virusuri integrale doar după lezarea mecanică a peretelui celular.

Sensibilitatea la diferite substanţe inhibitoare

Penicilina inhibă sinteza mureinei din structura peretelui celular bacterian. Bacteriile sunt sensibile. Cloramfenicolul, tetraciclinele, streptomicina

acţionează la nivelul ribozomilor 70S. Bacteriile sunt sensibile.

Penicilina

Eucariotele sunt rezistente, deoarece nu au mureină. Cloramfenicolul, tetraciclinele,

streptomicina

Eucariotele sunt rezistente, deoarece ribozomii lor 70S sunt

Cicloheximida acţionează la nivelul ribozomilor 80S. Bacteriile sunt rezistente.

protejaţi de membranele organitelor în care se găsesc (mitocondrii, cloroplaste). Cicloheximida

Eucariotele sunt sensibile.

Capacitatea de a forma organisme multicelulare

Pot forma agregate multicelulare, dar celulele sunt identice între ele. Între celulele unei asociaţii pluricelulare pot avea loc interacţiuni simple, nutriţionale, dar celulele îţi păstrează individualitatea şi prin diviziune pot reface asociaţia.

Uneori celulele eucariote constituie organisme unicelulare, dar de cele mai multe ori formează organisme multicelulare.

Capacitatea de diferenţiere celulară

Procariotele sunt incapabile de diferenţiere celulară, cu excepţia bacteriilor sporogene. Formarea sporilor de rezistenţă reprezintă o formă primitivă de diferenţiere.

Au capacitate mare de diferenţiere, de la structurile sexuale până la celule înalt diferenţiate, ca neuronul .

Temperatura maximă de creştere

Eubacteriile cresc maxim până la 95˚C, arhebacteriile până la 110˚C.

Eucariotele cresc maxim până la 60˚C.

Bacteriile reprezintă o lume aparte, cu un cadru propriu de evoluţie, fără legătură cu lumea plantelor, nici măcar cu a celor inferioare.

MORFOLOGIA BACTERIILOR

Forma celulelor bacteriene

Forma bacteriilor este controlată genetic şi este în strânsă corelaţie cu peretele celular cu un anumit grad de rigiditate. Deşi într-o cultură pură forma bacteriilor poate varia în funcţie de condiţiile de mediu, forma caracteristică unei specii date este predominantă în populaţia bacteriană respectivă. Forma bacteriilor este un criteriu taxonomic important. Ea se apreciază în următoarele condiţii:

- în culturi pure, în condiţii artificiale, de laborator; - în culturi bacteriene tinere, aflate în faza activă de creştere; în culturile îmbătrânite apar forme

aberante necaracteristice (filamentoase, ramificate), datorită degenerării celulare; - în culturi aflate în condiţii de cultură corespunzătoare: medii de cultură adecvate, condiţii optime

de pH, temperatură, concentraţie a oxigenului; în condiţii improprii de cultivare apar acţiuni nocive, care determină alterări ale formei şi morfologiei bacteriene. Principalele tipuri morfologice bacteriene sunt:

- forma sferică (sferoidală), corespunde celulelor izodiametrice numite coci (de la coccus (lat.) = sămânţă); cocii pot fi:

o perfect sferici – ex. Staphylococcus aureus

o uşor ovoidali – ex. Streptococcus pyogenes

o coci lanceolaţi – ex. Streptococcus pneumoniae (iniţial denumit Diplococcus

pneumoniae) o coci cu aspect reniform – ex. Neisseria meningitidis

- forma sferic – ovalară, intermediară între coci şi bacili, corespunde cocobacililor - ex. Pasteurella

pestis - forma cilindrică, alungită, de bastonaş drept sau uşor curbat, corespunde bacililor; aceştia pot

avea: o extremităţile rotunjite – ex. Bacillus subtilis o extremităţile drepte – ex. Bacillus anthracis o extremităţi în formă de pişcot sau măciucă – ex. Corynebacterium diphteriae

o extremităţi ascuţite (fusiforme) – ex. Fusobacterium fusiforme

- forma spiralată, elicoidală, care prezintă câteva subtipuri: o vibrionul, cu formă de virgulă sau semilună – ex. Vibrio cholerae o spirilul, cu mai multe ture de spiră rigide – ex. Spirillum volutans o spirocheta, cu mai multe ture de spiră flexibile – ex. Treponema pallidum

- forma filamentoasă, întâlnită la actinomicete (bacterii asemănătoare cu fungii); e constituită din filamente lungi şi ramificate, asemănătoare unor micelii – ex. Actinomyces israeli

- forma pătrată este caracteristică unor bacterii incluse în genul Quadra, evidenţiate în unele ape hipersaline din Sinai (Walsby, 1980); aceste bacterii formează placarde de 8-16 pătrate cu latura între 1,5 şi 11µm, cu o grosime inegală.

(după Kayser, Thieme, 2005)

Gruparea bacteriilor

Bacteriile sunt organisme unicelulare, care se multiplică de obicei prin diviziune directă. La unele specii, după diviziune are loc separarea completă a celulelor fiice, astfel încât rezultă indivizi izolaţi. La alte specii, după diviziune celulele fiice rămân ataşate una de cealaltă, formând grupări caracteristice speciei bacteriene. Modul de grupare a doi sau mai mulţi indivizi bacterieni depinde de orientarea în spaţiu a planurilor de diviziune succesive. Gruparea cocilor Bacteriile sferice (cocii) se pot întâlni ca indivizi izolaţi (cocul simplu) sau sub forma unor grupări de doi sau mai mulţi coci:

- diplococi – diviziunea se face după planuri succesive paralele, celulele rămân grupate câte două – ex. Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis

- streptococi – planurile de diviziune succesive multiple sunt paralele, formându-se în final şiraguri de celule de dimensiuni variabile – ex. Streptococcus pyogenes

- tetradă - planurile de diviziune succesive sunt perpendiculare unul pe celălalt, rezultând grupări de 4 celule – ex. Micrococcus tetragenes

- sarcină - planurile de diviziune succesive sunt perpendiculare unul pe celălalt şi orientate în trei direcţii diferite, rezultând grupări de celule cu o simetrie cubică – ex. Sarcina flava

- stafilococi - planurile de diviziune succesive sunt orientate neregulat în spaţiu, astfel încât forma finală a grupării celulare este asemănătoare cu un ciorchine – ex. Staphylococcus aureus Gruparea bacililor Bacteriile alungite (bacilii) se pot întâlni ca indivizi bacterieni izolaţi (bacilul simplu) sau sub

forma unor grupări formate în funcţie de orientarea planurilor de diviziune succesive: - diplobacil - diviziunea se face după planuri succesive paralele, celulele rămân grupate câte două –

ex. Klebsiella pneumoniae - streptobacil - diviziunea se face după planuri succesive paralele, mai multe celule rămân unite –

ex. Bacillul cereus - grupări sub forma literelor V, M ori sub formă de armonică sau palisadă – după diviziune

celulele rămân împreună câte două sau mai multe, aşezate una faţă de cealaltă sub un unghi ascuţit sau de 180 grade – ex. Corynebacterium diphteriae

Proprietăţile fizice ale bacteriilor

Bacteriile au dimensiuni foarte mici, cuprinse în medie între 0,5 – 1µ (grosimea) şi între 3 – 6µ (lungimea). Există bacterii foarte mici, de exemplu cele din specia Francisella tularensis, cu o grosime de 0,2µ şi o lungime de 0,3 – 0,7µ sau bacterii mari, ca de exemplu cele din specia Beggiatoa mirabilis, cu o grosime de 3,5 - 4µ şi o lungime de până la 30µ. Volumul bacteriilor este de asemenea foarte mic, de exemplu cel al bacteriilor din specia Bacillus

anthracis, considerate bacterii mari, este de aproximativ 1,5µ3.

ANATOMIA CELULEI BACTERIENE Datorită dimensiunilor mici, organizarea internă a bacteriilor a fost mult timp controversată şi chiar contestată, existând opinia că celulele bacteriene ar fi lipsite de o structură internă sau ar avea una foarte rudimentară. Perfecţionarea tehnicilor de laborator (tehnici citologice, tehnici de microscopie electronică) a făcut posibilă descrierea a numeroase componente ale celulei bacteriene. Constituenţii celulari bacterieni pot fi clasificaţi în două categorii, în funcţie de poziţionarea lor faţă de peretele celular:

- componente extraparietale: o capsula bacteriană o stratul mucos o flagelii o pilii o fimbriile

- componente intraparietale: o membrana citoplasmatică

o mezosomii o citoplasma o nucleosomul o plasmidele o ribozomii o vacuolele o incluziile o endosporul

Unele structuri sunt esenţiale pentru viaţa celulei şi sunt prezente invariabil la toate celulele bacteriene (membrana citoplasmatică, citoplasma, nucleosomul, ribozomii), altele sunt accesorii şi pot lipsi la unele bacterii (flagelul, plasmidele, endosporul). Alte structuri apar doar în unele perioade de viaţă ale celulei (incluziile, vacuolele, endosporul).

(după Kayser, Thieme, 2005)

Peretele celular bacterian Peretele celular reprezintă o structură de înveliş bine definită, în general rigidă (cu excepţia spirochetelor), care delimitează celula bacteriană. Este situat în afara membranei citoplasmatice, de care aderă strâns, reprezentând 20 – 40% din greutatea uscată a celulei bacteriene. La microscopul fotonic nu poate fi evidenţiat la celulele vii, datorită indicelui mare de refracţie, decât în urma unor coloraţii speciale selective, dar poate fi evidenţiat la microscopul electronic. Grosimea peretelui celular este de 15 – 35nm. În funcţie de prezenţa şi particularităţile de structură ale peretelui celular, în regnul Prokaryotae se disting 4 categorii de bacterii:

- Firmacutes (de la firmus (lat.) = tare, cutis = înveliş), care cuprinde bacterii cu perete celular gros, rigid, lipsit de o membrană externă, caracteristic bacteriilor Gram (+);

- Gracilicutes (gracilis (lat.) = subţire, fin), care cuprinde bacterii cu perete celular subţire, cu o membrană externă, caracteristic bacteriilor Gram (-);

- Mollicutes sau Tenericutes (mollis, tener (lat.) = moale) cuprinde bacteriile din grupul Mycoplasma, lipsite de perete celular, la care membrana citoplasmatică ce conţine steroli devine înveliş extern;

- Mendosicutes (mendosus = o structură cu defecte), care cuprinde organismele din grupul Archaea, cu un perete celular atipic, din care lipseşte mureina, având în compoziţia lor chimică pseudomureină, ce le permite să trăiască în condiţii extreme de mediu. Marea majoritate a bacteriilor sunt cuprinse în primele două categorii, Gram (+) şi Gram (-).

Structura peretelui celular la bacteriile Gram pozitive La bacteriile Gram pozitive peretele celular este gros (0,02 – 0,08µm), rigid; componenta sa esenţială, care reprezintă 80 – 90% din structura peretelui şi asigură rigiditatea peretelui, este mureina

(murus = perete), denumită şi peptidoglican, glicopeptid, mucopeptid, glucozaminopeptid. Stratul de

mureină este sensibil la acţiunea enzimei lizozim, care atacă legăturile chimice din structura sa. Mureina este alcătuită din două componente, componenta glicanică (glucidică) şi componenta peptidică. Componenta glicanică este formată din lanţuri paralele polizaharidice alcătuite prin legarea alternativă a două zaharuri aminate: N-acetil-D-glucozamină şi acidul N-acetilmuramic. Componenta peptidică este un tetrapeptid, cu o compoziţie în aminoacizi variabilă în funcţie de specie, care conţine L-alanină, D-alanină, D-glutamină, L-lizină. Tetrapeptidele se prind pe lanţurile glicanice. Tetrapeptidele dintre două lanţuri adiacente se leagă între ele prin legături interpeptidice. Cu cât numărul acestor legături este mai mare, cu atât creşte rigiditatea peretelui celular. Se formează astfel o reţea care înconjoară structurile celulare.

La bacteriile Gram pozitive legarea transversală a două peptide învecinate se face printr-o punte peptidică, ce e formată, de exemplu la Staphylococcus aureus, din 5 molecule de glicină între D-alanină şi L-lizină. Sacul mureinic are astfel o structură tridimensională, cu multe lanţuri glicanice.

La acest nivel sunt localizate două tipuri de enzime ce contribuie la creşterea peretelui celular: murein-hidrolazele, care atacă legăturile chimice ale mureinei şi murein-sintetazele, care realizează noi constituenţi structurali pe care îi inseră în dreptul rupturilor create.

Numai bacteriile Gram pozitive prezintă la exteriorul stratului de mureină acizii teichoici (teichos (gr.) = zid), polizaharide specifice, sub forma unor molecule polimerice lungi, flexibile, cu aspect tubular. Din punct de vedere chimic acizii teichoici sunt polimeri de tipul poliribitol-fosfat şi 1,3 poliglicerol-fosfat, legaţi covalent de stratul de mureină.

Structura peretelui celular la bacteriile Gram negative Bacteriile Gram negative prezintă perete celular subţire, cu un strat fin de mureină sensibil la

lizozim, de 0,01µ grosime. La aceste bacterii mureina reprezintă doar 2,5 – 10% din greutatea uscată a peretelui. Sacul mureinic este un monostrat molecular, cu structură similară cu cea a bacteriilor Gram pozitive şi nu prezintă acizi teichoici.

Componenta peptidică a peretelui bacteriilor Gram negative conţine acid diaminopimelic (derivat al lizinei), punţile transversale interpeptidice reunind gruparea NH2 a acidului diaminopimelic cu gruparea –COOH a D-alaninei de pe alt lanţ glicanic.

Stratul de peptidoglicani este aderent la membrana citoplasmatică formând împreună cu aceasta membrana internă. La exterior stratul de peptidoglicani prezintă o membrană externă, cu o grosime de 6 – 20nm, care nu este sensibilă la lizozim, ci la EDTA (etilen-diamino-tetraacetat) 30%. Între cele două membrane se delimitează spaţiul periplasmic, care cuprinde stratul de peptidoglicani.

Membrana externă are în compoziţia sa chimică fosfolipide (35%), proteine (15%), lipopolizaharide (50%) şi o structură similară cu cea a membranei citoplasmatice. Fosfolipidele sunt în dublu strat, cu grupările hidrofile către exteriorul membranei şi cele hidrofobe către interiorul acesteia. Proteinele sunt inclavate în acest dublu strat. Unele proteine (numite porine) străbat complet membrana externă, asigurând trecerea unor substanţe din mediu în celule. Lipopolizaharidele (LPS) prezintă trei

porţiuni: lipidul A, legat de stratul de fosfolipide; componenta oligozaharidică numită porţiunea centrală R, care este legată covalent de lipidul A şi componenta polizaharidică (antigenul somatic O), variabilă ca structură şi compoziţie chimică, ce determină specificitatea antigenică a celulei bacteriene.

În spaţiul periplasmic, situat între membrana internă şi cea externă, se găsesc proteine enzimatice de tipul fosfatazelor, ribonucleazelor şi proteine neenzimatice, implicate în transportul substanţelor prin membrane, numite proteine de legare.

Funcţiile peretelui celular bacterian

Peretele celular bacterian menţine arhitectura structurală a celulei şi forma acesteia, conferindu-i elasticitate şi plasticitate. Elasticitatea se referă la capacitatea celulei bacteriene de a-şi mări volumul atunci când include o cantitate mai mare de apă şi de a reveni apoi la volumul iniţial. Plasticitatea reprezintă capacitatea celulei de a se deforma sub acţiunea unei presiuni, fără ca structura sa internă să fie alterată. Peretele celular participă la procesele de creştere şi multiplicare bacteriană, la procesul de sporogeneză şi funcţionează ca o barieră de permeabilitate între interiorul şi exteriorul celulei.

Acizii teichoici asigură celulelor bacteriene Gram pozitive concentraţii adecvate de ioni metalici în micromediul de la suprafaţa celulei, concentraţii importante pentru activitatea unor sisteme enzimatice membranare. Ei inhibă fagocitoza şi măresc astfel gradul de patogenitate al bacteriilor Gram pozitive patogene. Unii acizi teichoici acţionează ca receptori pentru bacteriofagi.

Membrana externă scade capacitatea de fagocitoză a celulelor gazdă faţă de bacteriile Gram negative patogene, iar prin intermediul porinelor asigură trecerea unor substanţe din mediul extracelular în cel intracelular. Antigenul somatic O conferă celulelor bacteriene specificitate antigenică, compoziţia sa în zaharuri fiind diferită chiar în cadrul aceleiaşi specii bacteriene. Lipopolizaharidele au rol de endotoxină, răspunzătoare de efectele nocive asupra celulelor gazdă.

Protoplaştii şi sferoplaştii

Prin tratarea unei celule Gram pozitive cu lizozim, peretele celular este îndepărtat integral, iar ansamblul structurilor celulare rămase, delimitate doar de membrana citoplasmatică, reprezintă un protoplast. Acesta are formă aproximativ sferică şi se menţine ca atare în medii izotonice sau uşor hipertonice. El păstrează proprietăţile vitale ale celulei bacteriene din care provine. Prin tratarea unei celule Gram negative cu lizozim, peretele celular nu este complet îndepărtat, deoarece membrana externă nu este sensibilă la acţiunea acestei enzime. Este distrus doar stratul de peptidoglicani, iar structurile celulare sunt delimitate de membrana externă şi constituie un sferoplast, de formă sferică, ce se menţine în medii hipertonice.

Membrana citoplasmatică

Membrana citoplasmatică este o formaţiune structurală ce acoperă de jur împrejur citoplasma bacteriană, separând-o de suprafaţa internă a peretelui celular. Grosimea membranei este de 7 – 10nm. La microscopul electronic apare ca o structură tristratificată, cu două straturi întunecate (electronodense), între care se găseşte un strat mai clar, mai puţin electronodens. Pornind de la imaginea electronomicroscopică a membranei, Robertson a numit această structură „structură în sandwich” sau „unitate de membrană” (unit membrane), considerând în mod eronat că cele două straturi electronodense sunt proteice, iar stratul mijlociu este lipidic. Determinările biochimice ulterioare au infirmat acest model, deoarece proteinele sunt într-o cantitate insuficientă pentru a forma două straturi. Singer şi Nicolson au propus în 1972 modelul mozaicului fluid pentru a descrie structura membranei plasmatice. Conform acestui model, membrana plasmatică are structură bidimensională, cu un strat dublu de fosfolipide în care sunt inclavate proteine („un ocean de fosfolipide pe care plutesc iceberguri de proteine”). În structura membranei se găsesc fosfolipide, proteine şi glucide.

Fosfolipidele sunt dispuse într-un dublu strat, cu grupările hidrofobe nepolare faţă în faţă, reprezentate de doi acizi graşi. Extremităţile polare hidrofile, reprezentate de o grupare fosfat, sunt orientate spre mediile apoase externe sau interne ale celulei. Moleculele fosfolipidelor se pot deplasa lateral în acelaşi strat, mişcare numită turnover, sau se pot deplasa de la un monostrat la altul, proces numit tranziţie flip – flop.

Proteinele sunt inclavate în dublul strat de fosfolipide. Ele pot fi inserate în structura membranei şi se numesc proteine integrate (transmembranare şi structurale, cele din urmă fiind expuse pe suprafaţa internă sau externă a membranei) sau pot fi proteine neincluse în structura membranei, numite proteine

periferice (de suprafaţă), care sunt enzime active către peretele celular sau către citoplasmă. Glucidele sunt slab reprezentate în structura membranei plasmatice, ele fiind sub formă de

glicoproteine sau de glicolipide. Spre deosebire de membrana eucariotelor, membrana plasmatică a procariotelor, cu excepţia

micoplasmelor, nu conţine steroli. Sterolii conferă un plus de rigiditate membranei plasmatice. Membrana plasmatică a arhebacteriilor are o structură electrono-optică obişnuită, dar este unică

prin natura lipidelor. Lipidele eucariotelor şi ale eubacteriilor sunt esteri ai acizilor graşi cu glicerolul. Lipidele arhebacteriilor nu conţin acizi graşi şi sunt de două feluri: glicerol - dieteri şi diglicerol – tetraeteri. Glicerol – eterii sunt markeri biochimici ai arhebacteriilor.

La arhebacterii membrana plasmatică nu conţine fosfolipide. Glicerol – dieterii formează stratul dublu lipidic, iar diglicerol – tetraeterii formează un monostrat lipidic, echivalent chimic al dublului strat, în care cele două straturi sunt însă legate covalent.

Membrana plasmatică reprezintă o suprastructură citoplasmatică permanentă, esenţială pentru viaţa celulei, care are rolul de a delimita spaţiul celular. Ea este o barieră între mediul extracelular extrem de variabil şi mediul intracelular relativ constant. Permeabilitatea selectivă a membranei este asigurată printr-o asimetrie structurală şi funcţională, care duce la un comportament diferit spre faţa sa citoplasmatică în raport cu faţa sa dinspre peretele celular.

Membrana plasmatică este o structură dinamică, urmare a mobilităţii fosfolipidelor şi a capacităţii de reînnoire a constituenţilor membranei. Este şi o barieră osmotică prin permeabilitatea pentru unele tipuri de molecule şi impermeabilitatea pentru altele.

Rolul membranei plasmatice

Prin permeabilitatea sa selectivă, membrana plasmatică este asociată cu transportul substanţelor de la exteriorul celulei către interiorul acesteia şi în sens invers. Unele proteine membranare joacă rol de transportori de electroni. La nivelul membranei sunt localizate enzime cu rol în fosforilare (de exemplu ATP-azele), precum şi sinergonul respirator şi al fotosintezei, echivalentul funcţional al mitocondriilor şi al cloroplastelor. Membrana intervine în biosinteza peretelui celular şi joacă rol de receptor specific pentru substanţele utile celulei bacteriene. Membrana intervine în mobilitatea orientată a bacteriei prin recepţionarea mesajelor chimice din mediu (prin intermediul proteinelor sale cu rol de chemoreceptori), determinate de substanţe repelente sau atractante. La nivelul membranei este localizat şi corpusculul bazal al flagelului, astfel încât membrana este implicată şi în mobilitatea celulei. Membrana plasmatică intervine şi în sinteza şi eliminarea unor exoenzime şi a unor proteine toxice bacteriene (exotoxine), cu rol nociv pentru organismul gazdă.

Mezosomii

Mezosomii (mezos (gr.) = mijloc, soma (gr.) = corp) sunt structuri derivate din membrana plasmatică, ce au deseori poziţie mediană în celulă. Ei se mai numesc şi corpi de mijloc, plasmalemasomi, corpi periferici. Sunt structuri intracitoplasmatice membranare, derivate prin invaginarea membranei, a căror semnificaţie biologică a fost controversată. Pentru ca o structură membranară bacteriană să fie încadrată în categoria mezosomilor, trebuie să îndeplinească 3 condiţii:

- să derive ultrastructural din membrana plasmatică (sub forma unor invaginări ale acesteia) şi să păstreze o legătură permanentă de continuitate cu aceasta;

- să poată fi extrudată în spaţiul dintre membrana plasmatică şi peretele celular prin variaţii ale presiunii osmotice;

- să fie asociată topografic cu următoarele procese bacteriene importante: replicarea şi segregarea cromozomului bacterian, formarea septului de diviziune şi procesul de sporulare.

Au fost descrise trei tipuri morfologice de mezosomi: tubulari, veziculari (sacciformi) şi lamelari. Într-o celulă bacteriană pot exista mai mulţi mezosomi, mai numeroşi, cu structură complexă şi mai bine dezvoltaţi la bacteriile Gram pozitive, mai puţini şi mai greu de observat la bacteriile Gram negative. Structura moleculară a mezosomilor este identică cu cea a membranei plasmatice din care provin, cu o grosime de 7 – 10nm şi un dublu strat fosfolipidic în care sunt inclavate proteine structurale şi cu rol enzimatic. Mezosomii îşi au originea în membrana plasmatică, ce creşte şi se invaginează datorită faptului că peretele celular rigid creşte mai încet decât membrana. Invaginarea membranei plasmatice duce iniţial la formarea unor mezosomi tubulari, apoi la mezosomi veziculari, în final ajungând la aspectul lamelar. Sunt structuri dinamice, care se formează atunci când sunt necesari bacteriei.

Tipuri morfologice de mezosomi: A – vezicular; B – sacciform turtit; C – formă intermediară; D – multilamelar, complex

(după G. Mihăescu, 2000)

Semnificaţia biologică a mezosomilor

Unii autori consideră mezosomii ca structuri vestigiale, fără semnificaţie biologică esenţială. Alţii consideră că mezosomii au funcţii multiple în celula bacteriană:

- Au rol în replicarea şi segregarea genomului bacterian şi în individualizarea celulelor, la bacterii neexistând un aparat mitotic care să intervină în aceste procese;

- Au rol în controlul replicării cromozomului bacterian şi plasmidelor, prin transmiterea semnalului biochimic de iniţiere a replicării materialului genetic; Se admite că procesul de replicare a genomului bacterian şi diviziunea consecutivă replicării sunt

declanşate de creşterea celulei bacteriene până la un punct critic, iar semnalul chimic se transmite prin mezosomi de la membrană la genom.

- Fiind derivaţi din membrana plasmatică, reprezintă împreună cu aceasta sediul sinergonului respirator, fiind consideraţi echivalentul funcţional al mitocondriei; participă la reacţii de fosforilare, oxidoreducere, transport de electroni;

- La nivelul lor se găsesc enzime degradative, astfel încât pot fi consideraţi echivalentul funcţional al lizozomilor;

- Au rol în procesele secretorii ale celulei, contribuind la producerea şi eliberarea unor exoenzime celulare (ca de exemplu penicilinaza, care este o enzimă inductibilă; în celulele secretoare de penicilinază mezosomii sunt mai numeroşi);

- Sunt asociaţi cu procesele de biosinteză a învelişurilor celulare (membrană plasmatică, perete celular, sept transversal de diviziune);

- Unii autori (Tichy şi colab., 1969) consideră că mezosomii ar reprezenta regiuni specializate de pătrundere în celula bacteriană a fragmentelor de ADN exogen în timpul transformării genetice bacteriene. Cu toate aceste funcţii multiple, unii cercetători (Nanninga, 1985) contestă existenţa mezosomilor,

considerând că ei sunt artefacte (structuri artificiale) care apar în timpul pregătirii materialului celular pentru examinarea la microscopul electronic şi că prin modificări ale tehnicilor folosite s-ar putea induce producerea de mezosomi tubulari, veziculari, lamelari, după bunul plac.

Citoplasma bacteriană

Citoplasma celulelor bacteriene este un sistem coloidal complex, care din punct de vedere fizic corespunde stării de gel şi este formată din proteine, glucide, lipide, apă şi substanţe minerale. Starea de gel permanent are ca rezultat o imobilitate a conţinutului celular în lipsa curenţilor citoplasmatici şi reprezintă o condiţie indispensabilă a nemiscibilităţii nucleosomului cu citoplasma, având în vedere lipsa membranelor intracelulare. Citoplasma bacteriilor nu prezintă organite citoplasmatice diferenţiate şi delimitate de membrane (de tipul mitocondriilor şi cloroplastelor).

Aspectul citoplasmei variază în funcţie de vârsta celulei bacteriene şi de condiţiile de cultivare. Astfel, la celulele tinere (din culturi de 24 – 48 ore) şi în condiţii favorabile de mediu, citoplasma aderă strâns de membrana citoplasmatică şi se prezintă ca o masă densă, omogenă, fin granulară, intens colorabilă cu coloranţi de anilină (coloranţi bazici) datorită conţinutului ridicat de acizi nucleici.

La celulele îmbătrânite şi în condiţii nefavorabile de mediu, citoplasma îşi pierde treptat afinitatea pentru coloranţii bazici, se îndepărtează de învelişul celular şi capătă un aspect granular, neomogen, cu multiple vacuole. În citoplasmă se găsesc: materialul nucleosomal, mezosomii, ribozomii, incluziile şi vacuolele. Ribozomii sunt responsabili de structura granulară a citoplasmei, prezentând două topografii diferite: cei care participă la sinteza proteinelor celulare şi a constituenţilor citoplasmatici sunt dispuşi omogen în masa citoplasmei, iar cei care contribuie la sinteza proteinelor care vor fi secretate sau excretate la exteriorul celulei sunt grupaţi pe faţa internă a membranei plasmatice. Citoplasma este foarte bogată în ARN, în special ARN ribozomal (ARNr, 80%), ARN de transfer (ARNt, 10 – 20%) şi ARN mesager (ARNm, 2%), ceea ce explică bazofilia ei intensă la celulele tinere, cu sinteze proteice intense. Celulele îmbătrânite se colorează mai puţin intens, deoarece sinteza de ARN ribozomal încetează şi cel existent este folosit ca sursă de azot şi fosfor.

Nucleosomul bacterian

Materialul genetic bacterian este reprezentat de două tipuri de structuri: nucleosomul, numit şi

nucleoid, material nuclear, echivalent nuclear, genofor, care corespunde din punct de vedere funcţional cromozomului, şi plasmidele, care poartă gene accesorii. Nucleosomul bacterian reprezintă o formă primitivă de organizare a nucleului, lipsită de membrană nucleară, inclavată direct în citoplasmă, în mod obişnuit în mijlocul celulei bacteriene, într-o zonă numită nucleoplasmă. Zona nucleoplasmei este mai clară, în raport cu citoplasma propriu-zisă, care este mai densă.

Studiul microscopic al nucleoidului întâmpină dificultăţi legate de bazofilia intensă a citoplasmei, foarte bogată în ARN, care nu permite diferenţierea cu coloranţi bazici a materialului genetic, constituit din ADN, la fel de bazofil. Dacă celula bacteriană este supusă unui tratament cu dezoxiribonuclează şi apoi unei coloraţii cu coloranţi bazici, în mijlocul celulei se observă o zonă clară, incoloră, în care a fost localizat nucleoidul. Evidenţierea microscopică a nucleoidului se poate face prin coloraţii selective, care constau în îndepărtarea ARN citoplasmatic prin hidroliză acidă (tehnica Robinow - Feulgen) sau enzimatică (cu ribonuclează, tehnica Boivin), urmată de colorarea cu coloranţi bazici de anilină. După hidroliza ARN, materialul nuclear apare sub diferite forme: sferică, ovalară, de halteră, de bastonaş, reprezentând 5 – 16% din volumul celulei.

La microscopul electronic nucleoidul apare în zona centrală a celulei, mai puţin electronodens decât citoplasma bacteriană, în contrast cu celula eucariotă la care nucleul este mai electronodens decât citoplasma. Celula procariotă are un contrast invers al structurilor sale în raport cu celula eucariotă, deoarece ADN nu este asociat cu proteine, iar citoplasma bacteriană are o densitate foarte mare. Pe secţiuni ultrafine regiunea nucleosomală apare ocupată de fibrile fine, cu diametrul de 2,5nm, uneori aranjate în şiruri ondulate, paralele.

Extras prin metode speciale (de exemplu tehnica Marmur) din celula bacteriană, sub forma unui corpuscul dens şi compact, nucleosomul s-a dovedit a fi alcătuit dintr-o singură moleculă de ADN, dublu catenară, circulară, covalent închisă, cu o lungime de aproximativ 1400µm şi diametrul de 2,5nm. Circularitatea moleculei de ADN este o condiţie esenţială a existenţei sale în celula bacteriană, în contact direct cu citoplasma în care se găsesc cantităţi mare de exonucleaze, care ar ataca moleculele lineare la extremităţile lor. Nucleosomul bacterian este cea mai mare moleculă biologică şi prin lungimea sa depăşeşte de 1000 de ori lungimea celulei bacteriene. În structura dublu catenară a nucleoidului intervin modificări topologice care constau într-un proces de împachetare prin suprarăsucire (supraspiralizare), ocupând astfel un volum de 1500 de ori mai mic. Pentru a ocupa un volum atât de mic, molecula de ADN se împachetează după norme extrem de riguroase, astfel încât în orice moment cele 3000 – 5000 de gene pe care le conţine să fie accesibile sistemelor celulare de transcriere şi traducere. Stonington şi Pettijohn au elaborat în 1971 un model de împachetare a ADN în celula bacteriană. Ei au demonstrat că ADN-ul poate fi extras din celula bacteriană prin metode blânde sub forma unei mase dense, compacte, care corespunde stării “împachetate” a nucleosomului. Din această masă compactă ei au izolat ADN, ARN şi proteine. Moleculele de ARN (ARNm, ARNt) şi proteinele au un rol esenţial în menţinerea stării compacte a nucleosomului., materialul genetic fiind reprezentat doar de ADN. Dacă nucleosomul extras din celulă este tratat cu ARN-ază, acesta se derulează într-o moleculă dublu catenară de ADN depliată, circulară, închisă, numită formă relaxată, cu diametrul de 350µm. Modelul de împachetare prin pliere şi supraspiralizare explică mecanismul molecular al drumului invers, de la structura relaxată a nucleosomului la forma sa compactă. După părerea celor doi autori, forma relaxată a moleculei de ADN, cu diametrul de 350µm, ar suferi mai întâi un proces de pliere (folding) în 40 – 60 bucle, rezultând o structură cu un diametru de 30µm. La baza fiecărei bucle se găsesc molecule de natură proteică (ARN – polimerază) şi ARN ribosomal sau mesager.

Aceste bucle reprezintă domenii de supraîncolăcire prin răsucirea dublului helix spre stânga, rezultând o structură cu diametrul de 2 - 3µm. Domeniile cromozomului bacterian sunt topografic independente. Supraspiralizarea, realizată în cadrul fiecărui domeniu de pliere, este o stare fizică, în care molecula de ADN se pliază prin răsucire în jurul axei sale.

Supraspiralizarea este urmarea acţiunii topoizomerazelor, care sunt de două tipuri: - helicaze, cu rol de suprarăsucire a moleculei dublu catenare de ADN (topoizomeraza II, AND -

giraza); - derulaze, cu rol de a produce dezrăsucirea ADN - ului şi aducerea lui într-o formă relaxată

(topoizomeraza I). În urma acţiunii helicazelor, structura ADN devine tridimensională, prin plierea zonelor

suprarăsucite superior şi inferior faţă de un plan orizontal, ajungându-se la forma condensată care a fost izolată iniţial din celula bacteriană.

În mod normal, bacteriile aflate în repaus conţin un singur cromozom (sunt haploide). Apariţia

unor celule multinucleate, cu 2 – 4 cromozomi, în culture tinere, pe medii ce conferă condiţii optime de creştere, este rezultatul nesincronizării între diviziunea celulară şi replicarea ADN – ului. Situaţia de celulă multinucleată este temporară.

Bacteriile au o cantitate mică de ADN neinformaţional. La numeroase bacterii s-au evidenţiat câteva sute de secvenţe palindromice de 20 – 40 de baze, care delimitează unele gene şi a căror funcţie nu este cunoscută.

Funcţiile materialului genetic nucleosomal

Nucleosomul conţine informaţia genetică esenţială necesară existenţei celulelor bacteriene în mediul lor natural. Informaţia genetică din nucleoidul bacterian este cuprinsă în aproximativ 3000 – 4000 gene (determinanţi genetici). Acestea asigură formarea structurilor celulare bacteriene, metabolismul energetic şi biosintetic, reglarea activităţilor celulare, replicarea celulei bacteriene, potenţialul de evoluţie a celulei. Pe medii neobişnuite, celulele bacteriene prezintă, pe lângă nucleosom, o informaţie genetică accesorie, reprezentată de plasmide. Acestea sunt molecule de ADN dublu catenar, circular, covalent închis, numite şi minicromozomi, reprezentând 1 – 2% din mărimea cromozomului bacterian, cu un număr mic de gene.

Ribozomii

Ribozomii sunt particule nucleoproteice intracitoplasmatice, de formă aproximativ sferică şi cu un diametru de 20nm; pot fi caracterizaţi prin constanta lor de sedimentare la ultracentrifugare în gradient de concentraţie (concentraţie de sucroză de 5 – 25%). Ribozomii eucariotelor sunt de tip 80S, iar ribozomii procariotelor sunt de tip 70S. Ribozomii sunt structuri dinamice, care au capacitatea de a disocia în cele două subunităţi componente, care se reasociază când ribozomii sunt funcţionali. Asocierea şi disocierea componentelor ribozomale sunt corelate cu variaţiile concentraţiei ionilor de magneziu: asocierea este favorizată de creşterea concentraţiei ionilor de magneziu, iar disocierea e corelată cu scăderea acestei concentraţii. Numărul ribozomilor în celula bacteriană este corelat cu activitatea ei fiziologică, fiind mic în celulele aflate în repaus şi mare în celulele fiziologic active. El variază între 15000 – 100000/celulă. Unii ribozomi se găsesc liberi în citoplasmă şi determină structura granulară a acesteia, mai ales la celulele tinere. Alţii se găsesc pe faţa internă a membranei citoplasmatice, la nivelul lor având loc sinteza proteinelor care vor fi eliminate la exteriorul celulei. Studiul electronomicroscopic a permis înţelegerea mecanismului de formare şi a activităţii ribozomilor. Ribozomii bacterieni 70S au două subunităţi: o subunitate mare, 50S, care are formă de fotoliu şi o subunitate mică, 30S, care are formă de halteră asimetrică, aşezată orizontal pe braţele şi spătarul fotoliului.

Ribozomii 70S conţin în total 55 molecule de proteine şi 3 molecule de ARN ribosomal. Subunitatea mare are greutatea moleculară de 16000000 Da, cu 34 molecule diferite de proteine, notate de la L1 la L34 (de la large = mare) şi două molecule de ARNr, una foarte mare, 23S, alta mică, 5S. Subunitatea mică are greutatea moleculară de 900000 Da, cu 21 molecule proteice, notate de la S1 la S21 (de la small = mic) şi o moleculă de ARNr, cu o constantă de sedimentare 16S.

Tehnicile fine de microscopie electronică au permis aprecierea organizării tridimensionale a ribozomilor (aranjamentul în spaţiu al componentelor): subunitatea mare are formă de fotoliu, iar subunitatea mică are aspect de halteră asimetrică, rezemată orizontal pe braţele şi spătarul fotoliului. Între cele două subunităţi, mai precis între scobitura fotoliului şi gâtul halterei, rămâne un canal lung şi îngust, prin care trece ARN mesager, purtătorul informaţiei genetice necesare sintezei proteinelor. O celulă de Escherichia coli în plină creştere sintetizează aproximativ 500 ribozomi/minut, acest proces implicând sinteza coordonată a moleculelor proteice şi a ARNr, precum şi asamblarea lor funcţională. Celulele bacteriene au o capacitate de a sintetiza ribozomi într-un ritm accelerat, o capacitate de biosinteză proteică rapidă şi eficientă, astfel încât se pot multiplica rapid, pentru a supravieţui în natură. Ribozomii sunt constituenţi esenţiali ai sistemului de traducere a informaţiei genetice, reprezentând adevărate fabrici de proteine. La nivelul lor se desfăşoară un ansamblu de reacţii care formează ciclul ribozomal, ce determină iniţierea, creşterea şi terminalizarea lanţului polipeptidic, în care ribozomii interacţionează cu ARN mesager pentru a lega specific moleculele de aminoacizi aduşi cu ajutorul ARN de transfer, asigurând formarea proteinelor. Ribozomii se asociază în polisomi (poliribozomi), grupări funcţionale formate din 4 – 50 unităţi ribozomale. Dimensiunile poliribozomilor variază în funcţie de lungimea ARNm. Polisomii se deplasează în lungul moleculei de ARNm şi permit sinteza concomitentă a mai multor molecule proteice pe aceeaşi moleculă de ARNm.

Rolul ribozomilor în sinteza proteică

În faza de creştere logaritmică a culturii bacteriene, la temperatura optimă (37˚C), cromozomul bacterian este transcris cu o rată de 60 nucleotide/secundă. La procariote ribozomii au relaţii spaţiale strânse cu ADN, deoarece transcrierea şi traducerea informaţiei sunt două procese intim coordonate, care se desfăşoară aproape concomitent. ARNm bacterian are o durată funcţională scurtă (1 – 2 minute). De aceea, înainte de a se încheia transcrierea, la capătul 5’ al moleculei de ARNm se ataşează un complex de iniţiere de 70S, care începe traducerea mesajului. Iniţierea începe cu aminoacidul metionină, care este adus de ARNt în compartimentul acceptor al subunităţii ribozomale 50S, ARNt prinzându-se cu anticodonul (ce conţine bazele complementare codonului ARNm). Ribozomul se deplasează spre codonul următor şi compartimentul acceptor se eliberează, metionina trecând în compartimentul peptidic. Metionina se va prinde de aminoacidul următor şi va elibera ARNt, care se desprinde. După ce a citit integral informaţia ARNm, ribozomul se desprinde, eliberând în acelaşi timp polipeptidul sintetizat. Polisomul este ataşat fizic de cromozomul bacterian pentru o perioadă scurtă de timp. Transcrierea moleculei de ARNm durează circa un minut. Rata traducerii este corelată cu rata transcrierii. Pe medii nutritive bogate, ribozomii celulelor bacteriene (ataşaţi de suprafaţa internă a membranei citoplasmatice) sintetizează exoproteine, care sunt eliminate la exterior. Unele proteine de acest fel nu apar niciodată în citoplasma celulelor bacteriene, sugerând că ele sunt eliminate pe măsură ce sunt sintetizate. Ele sunt molecule relativ mici, lipsite de rigiditate.

Incluziile bacteriene

Incluziile bacteriene sunt formaţiuni structurale inerte, care apar în citoplasma bacteriilor aflate la sfârşitul perioadei de creştere activă, de regulă în condiţii de abundenţă a surselor nutritive şi în prezenţa unui dezechilibru între carbon şi azot. Ele reprezintă rezerve intracelulare pentru microorganisme, care dispar după trecerea celulelor respective în medii sărace în nutrienţi. Mărimea, forma, conţinutul şi numărul incluziilor diferă. Ele pot fi:

- incluzii anorganice simple (sulf coloidal, carbonat de calciu); - polimeri anorganici (incluzii de polimetafosfat care constituie volutina); - polimeri organici polizaharidici (amidon, glicogen), lipidici (polibetahidroxibutirat) sau proteici

(incluziile parasporale de la Bacillus thuringiensis). După criterii structurale, se disting incluzii delimitate de membrane (de exemplu cele de

polibetahidroxibutirat) sau nedelimitate de membrane (de exemplu cele de glicogen, de volutină). La microscopul optic apar ca structuri granulare, de formă neregulată, refringente, cu dimensiuni între 50 – 100nm. De obicei, o specie bacteriană formează un singur tip de depozit celular, dar unele bacterii formează mai multe tipuri de depozite intracelulare, iar altele nu au materiale de rezervă intracitoplasmatice. Incluziile sunt structuri legate de activitatea metabolică a celulei bacteriene, reprezentând materiale de rezervă acumulate în celulă. Ele se formează în condiţiile unui mediu bogat în nutrienţi sau cu un raport C/N dezechilibrat şi dispar atunci când mediul sărăceşte în substanţe nutritive sau se reface echilibrul C/N. Stocarea moleculelor în formă polimerizată este o modalitate prin care celula îşi menţine echilibrul osmotic, deoarece polimerii sunt inactivi din punct de vedere osmotic.

Granulele de volutină (corpusculii Babeş Ernst) sunt polimeri de polifosfaţi care au fost evidenţiate la Spirillum volutans şi care se formează în condiţiile deficitului oricăruia dintre nutrienţi prin adăugarea secveţială a resturilor de fosfat la pirofosfat. Au fost evidenţiate şi la Corynebacterium

diphteriae, având semnificaţie de diagnostic. Ele reprezintă o rezervă de fosfor şi de energie intracelulară. Incluziile de sulf anorganic sunt structuri refringente, localizate intracitoplasmatic sau la nivelul

unor pliuri ale membranei citoplasmatice. Se întâlnesc la bacteriile sulfuroase purpurii (Chromatiaceae) care folosesc în fotosinteză H2S ca donor de electroni şi la bacteriile filamentoase autotrofe nefotosintetizante (Beggiatoa), care oxidează H2S. După epuizarea H2S din mediu, sulful depozitat în celule este oxidat la sulfat.

O categorie aparte de incluzii e reprezentată de magnetosomi, incluzii ce conţin magnetită (Fe3O4), răspunzătoare de fenomenele de orientare descrise la bacterii sub influenţa câmpurilor magnetice slabe sau a câmpului magnetic al pământului (magnetotaxie). Bacteriile magnetotactice au fost izolate din sedimentele marine şi de apă dulce, ca de exemplu Aquaspirillum magnetotacticum, singura obţinută în cultură pură. Aceste bacterii au o importanţă deosebită în studiile asupra câmpului magnetic al pământului. Incluziile proteice parasporale se sintetizează odată cu formarea sporilor.

Vacuolele bacteriene

Sunt formaţiuni sferice cu diametrul de aproximativ 0,3 – 0,5µm, mai puţin refringente decât citoplasma. În funcţie de mediul de cultură numărul lor într-o celulă este între 6 şi 20. Vacuolele conţin substanţe dizolvate în apă şi sunt delimitate de un înveliş lipoproteic unistratificat, cu grosimea de 3nm, numit tonoplast. Unii autori consideră că vacuolele se formează ca urmare a pătrunderii unei cantităţi mari de apă în celulă. În apa aflată în exces se dizolvă produşi de metabolism hidrosolubili, iar lipidele şi proteinele acumulate în jurul picăturilor de apă formează tonoplastul. Rolul vacuolelor ar fi acela de reglatori ai presiunii osmotice în raport cu mediul extern, precum şi de depozite de substanţe de rezervă în perioada premergătoare formării incluziilor. Un tip special de vacuole este reprezentat de veziculele gazoase, numite aerosomi. Ele sunt întâlnite la bacteriile acvatice fotosintetizante imobile, ca de exemplu cianobacterii şi bacterii fotosintetizante verzi şi roşii. Sunt structuri refringente cu aspect ovalar, care dispar la o presiune moderată prin eliminarea aerului pe care îl conţin. Membrana lor este monostratificată, vacuolele cu gaz fiind structuri compartimentate, membranele periferice şi de compartimentare fiind constituite din proteine hidrofobe. Aerosomii conferă bacteriilor o densitate mai mică decât a apei şi permit deplasarea celor acvatice imobile într-o coloană verticală de apă în zone favorabile fotosintezei. De asemenea, joacă un rol protector pentru bacterii, dispersând lumina şi apărând structurile fotosensibile de acţiunea nocivă a ultravioletelor. Aerosomii sunt numeroşi la cianobacteriile care cresc cu o rată mare şi produc fenomenul de „înflorire a apelor”.

Endosporul bacterian

Anatomia bacteriilor permite adaptarea lor la habitate diverse. Dintre toate structurile microorganismelor, endosporul este cel mai performant din punct de vedere al rezistenţei la condiţiile ostile de mediu, care facilitează supravieţuirea.

Sporul bacterian este o formă primitivă de diferenţiere celulară, care constă în formarea în celula vegetativă a unui nou tip de celulă, cu ultrastructură, compoziţie chimică şi enzimatică diferită.

Există cel puţin 10 tipuri diferite de spori, caracteristice anumitor grupuri sistematice de bacterii, cu particularităţi structurale şi biologice. Cea mai comună formă de spor este endosporul, care poate fi considerat sporul tipic. El este frecvent întâlnit la bacteriile Gram pozitive cilindrice (de exemplu la genurile Bacillus, Clostridium) şi în mod excepţional la bacterii sferice (Sporosarcina). Endosporul are formă sferică sau ovalară, cu dimensiuni între 0,5 - 1µm pentru axul mic şi între 1 – 1,5µm (3µm) pentru axul longitudinal. Are o refringenţă deosebită şi e foarte greu colorabil datorită învelişurilor impermeabile pentru coloranţi. Se poate colora însă după permeabilizarea învelişurilor prin tehnici speciale energice. În funcţie de aşezarea în celula bacteriană, sporul poate fi terminal, subterminal sau ecuatorial (central), iar în funcţie de diametrul său comparativ cu cel al celulei în care se formează, sporul poate fi nedeformant (terminal, subterminal, central) sau deformant (terminal, ecuatorial).

În general sporii sunt unici în celula bacteriană, dar există şi excepţii, când în celule se formează câte doi spori (celule bisporulate) sau chiar mai mulţi (celule polisporulate). În timp ce celula vegetativă este o entitate metabolic activă, sporul este o entitate inertă, latentă, în stare de criptobioză. Ultrastructura endosporului Sporul este alcătuit dintr-o porţiune centrală, ce reprezintă protoplastul sporal, format din: perete

sporal, citoplasmă granulară denumită sporoplasmă, în care se găsesc ribozomii şi materialul nuclear inclus în nucleoplasmă. Protoplastul sporal este înconjurat de o zonă transparentă, mai puţin densă, numită cortex, alcătuită din peptidoglican modificat, acoperit de un înveliş sporal lamelar cu 3 straturi suprapuse: la interior este situată intina bistratificată, urmează un strat mijlociu şi apoi exina multistratificată. La unele bacterii există în jurul sporului un exosporium, uneori multistratificat, ancorat de spor prin filamente

suspensoare. Unii spori au la una dintre extremităţi un smoc de apendici sporali, de aproximativ două – trei ori mai lungi decât sporul, cu aspect tubular şi cu striaţii orizontale sau în formă de pană. Rolul acestor apendici ar fi acela de a facilita dispersarea sporilor în natură, precum şi nutriţia sporului în cursul sporogenezei sau germinării, prin preluarea nutrienţilor din mediu.

1. Spor central nedeformant 2. Spor terminal nedeformant, cu cristale proteice parasporale 3. Spor terminal deformant 4. Spor central deformant

Spori de Clostridium difficile

Spori de Clostridium botulinum

Compoziţia chimică a sporului

Sporul conţine toate categoriile de molecule necesare reluării creşterii celulei bacteriene. Lipsesc componentele celulare instabile (ARNm şi nucleozidtrifosfaţi), dar există precursorii lor mai stabili (nucleozid mono- şi difosfaţi). În spor nu se realizează deci sinteze proteice.

Sporii conţin proteine structurale specifice, codificate de gene care sunt active numai în spori, numite gene sporale. De asemenea, conţin enzime noi, în general proteaze, lipsindu-le enzimele importante în metabolismul celulelor bacteriene (ca de exemplu cele ale ciclului Krebs). Le lipsesc şi sistemele transportatoare de electroni, care în celula vegetativă sunt localizate la nivelul membranei. Enzimele sporale au o greutate moleculară mult mai mică decât enzimele celulare. Unele dintre ele provin din enzimele celulei vegetative prin digestia proteolitică a acestora, realizată de proteaze codificate de enzimele sporale. Ele reprezintă doar situsul activ al enzimelor celulare, sunt mai termorezistente şi sunt stabilizate prin legături intramoleculare.

Sporii conţin o cantitate mare de ioni de calciu şi magneziu, în raport cu celula vegetativă. Ionii de calciu sunt legaţi cu o cantitate echivalentă de acid dipicolinic (ce se formează din acidul diaminopimelic), ce reprezintă între 10 - 15% din greutatea uscată a sporului. Acidul dipicolinic este implicat în termorezistenţa crescută a sporilor, modificând conformaţia enzimelor. Concentraţia de ATP este foarte scăzută în spori. Iniţial s-a considerat că sporul se formează prin deshidratarea celulei vegetative, ceea ce ar explica lipsa metabolismului la spor. Cercetările ulterioare au evidenţiat că deosebirile dintre spor şi celula vegetativă nu sunt de ordin cantitativ, ci calitativ, referindu-se la starea apei. Apa liberă din spor este în cantitate foarte redusă, între 3 – 10%, iar restul de 90 – 97% este în stare legată de constituenţii celulari. Apa legată nu este implicată în procese metabolice. Sporul este în stare vie, dar este o viaţă latentă (criptobioză), fără metabolism sau cu un metabolism extrem de redus, nedecelabil. În celula vegetativă 70% din apă este în stare liberă, implicată în diverse procese metabolice. Particularităţile de structură şi compoziţie chimică a sporilor determină termorezistenţa acestora, deosebita rezistenţă la substanţele chimice (antiseptice, dezinfectanţi), rezistenţa la radiaţii. Sporogeneza este procesul de formare a sporilor, care se desfăşoară în 6 – 7 stadii succesive şi durează aproximativ 8 ore. Este declanşată de lipsa unui nutrient esenţial pentru celula bacteriană (sursa de azot, sursa de carbon). Apar modificări ultrastructurale, biochimice şi biologice, în sensul creşterii rezistenţei la factorii nefavorabili de mediu. Procesul este complex şi din punct de vedere genetic, implicând participarea a cel puţin 50 de gene, constând în blocarea activităţii genelor funcţionale în celula vegetativă şi activarea genelor sporale. Germinarea sporilor este procesul de conversie a sporului în celula vegetativă şi are loc atunci când sporul întâlneşte condiţii favorabile de mediu. Se realizează printr-o serie de etape succesive, care în general reproduc în ordine inversă fenomenul de sporogeneză. Sporul se hidratează, apa legată trecând în stare liberă, volumul sporului se măreşte, are loc gelificarea învelişurilor sporale, după care celula vegetativă părăseşte învelişul sporal, delimitată de un perete derivat din peretele sporal intern.

Semnificaţia biologică a sporilor Sporogeneza este o formă primitivă de diferenţiere celulară, dar şi o modalitate de adaptare a

celulei la condiţii de mediu nefavorabile. Mecanismele criptobiozei nu sunt cunoscute. Unul dintre ele ar putea fi starea specială a enzimelor, care sunt inactivate în mod reversibil. Inactivarea reversibilă a enzimelor ar fi determinată de 3 factori: modificările fizico – chimice ale moleculelor enzimatice; prezenţa unor inhibitori enzimatici în spori; lipsa în celula sporală a unor metaboliţi esenţiali, care ar condiţiona starea normală, activă, a enzimelor. Endosporul este şi o formă de conservare viabilităţii celulelor şi deci a speciei, nefiind o formă de multiplicare. Are rol în diseminarea celulelor bacteriene în natură, deoarece pot fi răspândiţi la distanţe foarte mari. Sporii au o longevitate deosebită (mii sau chiar sute de mii de ani; sporii din rocile perioadei cuaternare au germinat pe medii nutritive in vitro), rezistă foarte bine la temperaturi înalte. Sporogeneza poate fi asociată cu unele procese biologice importante. De exemplu, la Bacillus

subtilis, este asociată cu producerea unor enzime proteolitice, iar la Bacillus thuringiensis cu producerea unor cristale proteice parasporale. Aceste cristale au formă bipiramidală sau cuboidă, se formează în apropierea sporului şi sunt netoxice în stare nativă (pretoxine). Prin solubilizarea la pH alcalin (10) ele devin toxine. Aceste bacterii se pot utiliza pentru combaterea biologică a unor dăunători agricoli (coleoptere, lepidoptere).

COMPONENTELE EXTRAPARIETALE

Capsula bacteriană

Capsula bacteriană reprezintă o structură accesorie, care acoperă de jur împrejur celula bacteriană. Este alcătuită dintr-un material macromolecular, gelatinos, vâscos, inegal dezvoltat de la o specie bacteriană la alta. Se întâlnesc mai multe forme de capsulă:

1. Microcapsula este forma cea mai simplă, reprezentată de o peliculă fină, cu o grosime mai mică de 0,2µm, care acoperă de jur împrejur peretele celulei bacteriene.

2. Macrocapsula este o structură organizată, aderentă de celulă, cu o grosime mai mare de 0,2µm, demonstrabilă prin metode citologice.

3. Stratul mucos este o masă amorfă neorganizată, ale cărei componente vâscoase se dispun fără o semnificaţie anatomică în jurul celulei bacteriene, cu o grosime mult mai mare de 0,2µm.

4. Zoogleea (zoon = animal; glee = substanţă vâscoasă) constă din acelaşi material ca şi stratul mucos, dar cuprinde mai multe celule bacteriene, formând o asociaţie bacteriană mucilaginoasă. Indiferent de gradul de dezvoltare, capsula bacteriană nu se poate evidenţia prin tehnici

microscopice obişnuite, ci numai prin coloraţii speciale. Materialul capsular se găseşte la bacteriile Gram pozitive şi Gram negative din sol, ape dulci şi

sărate, rumen, la bacteriile patogene ce produc infecţii urinare sau pulmonare.

Materialul capsular este de natură polizaharidică, cu un grad înalt de polimerizare, ceea ce explică şi consistenţa vâscoasă şi refringenţa acestei formaţiuni. De cele mai multe ori, în alcătuirea sa intră D-glucoza, D-fructoza, D-galactoza. Mai rar, se întâlnesc manoza, fucoza, pentozele. Unele polizaharide capsulare seamănă cu acizii teichoici, deoarece conţin glicerol-fosfat sau ribitol-fosfat.

Capsula bacteriană poate conţine: - homopolizaharide: dextran, levan;

Dextranul este alcătuit din 40 – 500 resturi de glucoză. Este sintetizat de Peptococcus

(Leuconostoc) mesenteroides din sucroză. Sinteza este abundentă în melasa de la fabricile de zahăr, unde o cantitate semnificativă de zahăr este convertită la dextran, cauzând pierderi economice. În stare purificată, dextranul se poate folosi ca înlocuitor al plasmei sangvine, fiind solubil în apă.

Levanul este un polimer al fructozei, cu greutate moleculară de 1000 kDa sau mai mult, sintetizat de unele bacterii patogene pentru plante (Pseudomonas, Xanthomonas).

- heteropolizaharide, polimeri formaţi dintr-un număr mare de unităţi structurale diferite: glucoză, fructoză, galactoză, manoză etc. Diversitatea monomerilor glucidici din structura heteropolizaharidelor conferă o anumită

specificitate antigenică, de exemplu la Streptococcus pneumoniae există peste 80 tipuri chimice diferite de material capsular, care determină peste 80 de serotipuri.

La unele bacterii din mediul natural se întâlneşte un glicocalix adevărat, care are caracter adaptativ şi conferă celulei un avantaj selectiv, dispărând dacă bacteria este trecută pe medii artificiale. A fost propusă denumirea de glicocalix comportamental. Acesta este constituit dintr-o reţea de filamente polizaharidice şi glicoproteice, legate de lipopolizaharidele membranei externe la bacteriile Gram negative sau de mureina bacteriilor Gram pozitive. Formează o structură pericelulară dezordonată, ca o pâslă, prin care celulele se ancorează de diferite substraturi. Pentru bacteriile patogene, glicocalixul este structura prin care celulele se ancorează de celulele mucoaselor şi iniţiază procesul infecţios.

Indiferent de structură, glicocalixul capsular şi cel comportamental realizează funcţia de aderenţă a bacteriei la substrat.

Flagelul bacterian

Flagelii sunt structuri extracelulare, care reprezintă organite de motilitate, cu o structură rudimentară în raport cu flagelul eucariotelor. Flagelii se mai numesc şi undulipode (undula = undă mică, podos = picior).

Au originea în celula bacteriană, străbat învelişurile celulare şi prezintă un filament extracelular. Acest filament are o grosime constantă pe toată lungimea lui, egală cu 20nm. Lungimea flagelului este variabilă, de la 4 - 5µm până la 15µm, ajungând uneori până la 70µm, flagelii fiind mult mai lungi decât celula bacteriană.

Flagelii nu se pot observa direct la microscop, prezenţa lor poate fi dedusă pe baza mobilităţii accentuate a bacteriilor, care se deplasează în câmpul microscopic la întâmplare, în diferite direcţii.

În funcţie de prezenţa sau absenţa flagelilor, numărul şi gruparea lor, au fost descrise mai multe tipuri de bacterii:

- bacterii atriche (fără flagel) - bacterii monotriche (cu un singur flagel) - A - bacterii amfitriche (cu doi flageli, situaţi de obicei apical) - C - bacterii lofotriche (cu un smoc de flageli la unul din poli) - B - bacterii peritriche (cu flageli de jur împrejurul celulei) - D

Flagelul poate fi situat polar sau subpolar, smocul de flageli poate fi dispus ecuatorial.

Ultrastructura flagelului bacterian Flagelul este format din trei componente: o porţiune bazală rotatorie, situată în învelişurile celulei bacteriene; o porţiune în formă de cârlig, care se continuă extracelular cu flagelul propriu-zis, cu un diametru constant de 20nm.

Porţiunea bazală are caracter de motor rotativ şi prezintă o structură diferită la bacteriile Gram pozitive faţă de cele Gram negative.

La bacteriile Gram pozitive porţiunea bazală e simplă, formată din două discuri unite între ele printr-un ax central, precum butonii unei manşete.

La bacteriile Gram negative porţiunea bazală este formată din mai multe discuri unite printr-un ax central:

- discul M, situat la nivelul membranei plasmatice, este un disc mobil, cu funcţie de rotor (cu aproximativ 4000 rotaţii/minut), reprezintă partea rotatorie a flagelului;

- discul S, situat în regiunea supramembranară, în spaţiul periplasmatic, cu rol de stator, imobil; - discul P, imobil, legat de lanţul de peptidoglicani, în spaţiul periplasmatic; - discul L, situate la nivelul lipopolizaharidelor membranei externe a peretelui celular.

În jurul discurilor M şi S există o pereche de proteine Mot, care acţionează ca un motor al flagelului, determinând rotaţia filamentului şi proteinele Fli, care funcţionează ca un comutator al motorului, determinând sensul de rotaţie al acestuia în funcţie de semnalele primate din interiorul celulei.

Cârligul are caracter de articulaţie flexibilă universală, putându-se roti împreună cu filamentul cu 360˚.

Filamentul extracelular este flagelul propriu-zis, situat la exteriorul celulei, cu mişcări de bici, nu ondulatorii. El are un diametru constant pe toată lungimea sa. Mişcarea rotatorie se transmite spre cârlig datorită discurilor fixe. La o bacterie cu un singur flagel situat polar, acesta se învârte în sens antiorar şi propulsează bacteria înainte, precum elicea unui vapor. La bacteriile peritriche flagelii se grupează către extremitatea opusă direcţiei de înaintare. Prin rotirea flagelului în sens orar, bacteria se rostogoleşte si îşi schimbă direcţia de deplasare (iar flagelii dispuşi peritrich se răsfiră). Motorul rotativ conţine 15 proteine diferite. Filamentul este alcătuit dintr-o proteină majoră, flagelina, reprezentată de câteva mii de molecule de acelaşi tip, cu o greutate moleculară de 40.000 – 65.000 Da. Moleculele de flagelină sunt grupate în 11 şiruri de filamente dispuse după o simetrie helicoidală, conferind flagelului o structură tubulară.

Semnificaţia biologică a flagelului Prezenţa flagelilor asigură deplasarea activă a bacteriilor în medii lichide. S-a demonstrat că în medii neutre din punct de vedere chimic bacteriile se deplasează la întâmplare: o secundă în linie dreaptă, apoi o rostogolire în 0,1 secunde cu schimbarea direcţiei de deplasare, urmată de o nouă deplasare în linie dreaptă timp de o secundă. Viteza de deplasare a bacteriilor este mai mare decât a macroorganismelor, raportată la dimensiunile proprii.

De exemplu ghepardul se deplasează cu aproximativ 110km/h (cu 25 lungimi/secundă). Bacteriile flagelate se deplasează cu 20-80µm pe secundă, ceea ce reprezintă o viteză de 40 lungimi/secundă. Mişcarea orientată preferenţial a bacteriilor este numită taxie. Ea se poate realiza în funcţie de substanţele chimice din mediu (chimiotaxie), de lumină (fototaxie), de concentraţia de oxigen (aerotaxie), de temperatură (termotaxie). Substanţele chimiotactic pozitive (atractante) determină deplasarea bacteriilor împotriva gradientului de concentraţie, din zone în care concentraţia substanţelor respective este mică, spre zone în care ea este mare.

Substanţele atractante sunt în general substanţe utile bacteriilor (aminoacizi, zaharuri, ioni de calciu şi magneziu). În prezenţa atractanţilor se măreşte deplasarea bacteriilor în linie dreaptă şi se micşorează numărul de rostogoliri.

Substanţele chimiotactic negative (repelente) determină o deplasare a bacteriilor în sensul gradientului de concentraţie, spre zone în care concentraţia substanţelor respective este mică. Ele sunt reprezentate de substanţe nocive pentru bacterii (produse de excreţie, alcooli, acizi graşi, ioni ai metalelor grele).

În prezenţa repelenţilor se micşorează deplasarea bacteriilor în linie dreaptă şi se măreşte frecvenţa rostogolirilor.

Acest comportament bacterian se datorează prezenţei pe suprafaţa bacteriilor a unor chemosenzori, structuri moleculare care au capacitatea de a înregistra prezenţa substanţelor atractante sau repelente în mediul extracelular şi de a transmite această informaţie în interiorul celulei, influenţând sensul de rotaţie al motorului rotativ.

Din punct de vedere ecologic, mobilitatea bacteriilor este foarte importantă în natură, deoarece asigură supravieţuirea bacteriilor. Ea le oferă bacteriilor posibilitatea de a se deplasa spre regiuni în care condiţiile de existenţă sunt favorabile.

La bacteriile patogene flagelul favorizează ataşarea bacteriilor la suprafaţa celulelor diferitelor epitelii, mărindu-le astfel virulenţa.

Flagelul poate avea şi rol de antigen, prezentând o specificitate serologică la diferitele tulpini bacteriene.

Pilii

Pilii sunt apendici filamentoşi neflagelari, a căror sinteză este codificată de gene localizate pe plasmide. Aceste plasmide se numesc "plasmide de sex" sau conjugoni. Celulele purtătoare de pili au capacitatea de a dona material genetic celulelor lipsite de pili.

Numărul pililor este de aproximativ 1 - 10/celulă, au lungimea de aproximativ 20µm, iar diametrul de 6 - 15nm la exterior şi 2,5nm la interior. Pilii sunt alcătuiţi din molecule identice de pilină, care se sintetizează în celulă, este transferată în lumenul pilului şi este asamblată după o simetrie helicală la extremitatea liberă a pilului.

Celulele care poseda pili sunt considerate celule "mascule". Pilii pot fi îndepărtaţi mecanic prin agitare. Capacitatea de sinteză a pilinei se pierde odată cu pierderea plasmidei de sex şi este redobândită odată cu recâştigarea plasmidei.

Rolul pililor Prezenţa pililor este asociată cu procesul de conjugare bacteriană, fiind implicaţi în transferul de

material genetic de la celula donoare la celula receptoare. Rolul pililor în conjugare este argumentat de faptul că pierderea pililor este însoţită de pierderea capacităţii de conjugare a bacteriilor.

Pe suprafaţa pililor se găsesc receptori pentru bacteriofagii ARN "masculi", iar la extremitatea liberă a pililor se găsesc receptori pentru fagii filamentoşi.

Fimbriile Fimbriile sunt structuri de tipul apendicelor filamentoase drepte şi rigide, mai scurte şi mai subţiri

decât flagelii. Sinteza componentelor fimbriilor este codificată de gene situate pe cromozomul bacterian. Fimbriile pot fi până la 1000/celulă. Lungimea lor este variabilă (1 - 20µm), iar diametrul este

cuprins între 3 - 15/µm. Dacă sunt numeroase, au o dispoziţie pericelulară. Fimbriile sunt alcătuite din molecule de fimbrilină aşezate după o simetrie helicală, determinând o structură tubulară.

O bacterie posedă câteva tipuri de fimbrii, în funcţie de grosime, lungime, specificitate antigenică. Fimbriile sunt comune la bacteriile enterice şi nu se întâlnesc la bacteriile Gram pozitive.

Semnificaţia biologică a fimbriilor Semnificaţia biologică a fimbriilor nu este încă bine precizată. Ele sunt considerate structuri

adaptative, cu rolul de a mări suprafaţa de contact a bacteriei cu mediul înconjurător, fiind utilizate pentru absorbţia nutrienţilor.

Fimbriile favorizează asocierile dintre celule, formându-se astfel pelicule fine (filme) de bacterii la suprafaţa apei, asigurând condiţii bune de aerare pentru bacteriile aerobe şi condiţii de luminozitate pentru cele fotosintetizante.

Bacteriile fimbriate patogene au un grad superior de virulenţă, deoarece fimbriile aderă ferm de receptorii de pe suprafaţa celulelor epiteliale ale mucoaselor. Fimbriile sunt structuri din categoria adezinelor, mediind interacţiunea celulă bacteriană - suport.