curs 3 - interactiunea cu mediul fiziologic FIM.pdf

Curs 3

INTERACIUNEA CU MEDIUL FIZIOLOGIC

TIINA MATERIALELOR BIOCERAMICE

Universitatea POLITEHNICA din Bucureti Facultatea de Inginerie Medical

Biocompatibilitatea, modul n care un material interacioneaz cu mediul fiziologic, reprezint caracteristica esenial care trebuie avut n vedere la realizarea unui biomaterial. trebuie cunoscut mediul n care biomaterialul va

funciona; trebuie evaluat influena acestuia asupra mediului,

dar i a mediului asupra materialului. Problema biocompatibilitii materialelor i a

dispozitivelor destinate uzului medical este att de complex, nct adesea trebuie evaluat caz cu caz, prin testri specifice.

INTRODUCERE

Imediat dup implantare (1s) pe suprafaa implantului se formeaz un strat de proteine; acest strat influeneaz mecanismul de interacie

ulterioar a implantului cu celulele; Interaciunea cu celulele, care se deplaseaz

spre implant prin mecanisme difuzive, convective sau active (locomoie): ader; elibereaz substane active; atrag alte celule; cresc.

INTRODUCERE

Celulele se pot multiplica i organiza n esuturi. Materialele pot interaciona cu sau ntrerupe

dezvoltarea esuturilor.

Pentru a aprecia influena unui material sintetic asupra esuturilor vii, este necesar s studiem modul de

organizare i dezvoltare a acestora.

INTRODUCERE

Chimitii i inginerii au realizat un numr mare de materiale care pot fi utilizate n medii agresive chimic.

n mod obinuit caracteristicile unui astfel de mediu sunt foarte exact determinate, materialele putnd fi proiectate n consecin.

1. DEFINIREA MEDIULUI FIZIOLOGIC

Mediul dintr-un organism viu este ns foarte diferit.

Ar putea fi descris ca fiind constituit din: soluie apoas de NaCl (aprox. 0,15M); anioni (Cl-, PO43-, HCO3-) cationi (Na+, K+, Ca2+, Mg2+) acizi organici; macromolecule biologice (proteine, enzime); oxigen dizolvat; compui ai azotului; carbonai solubili.


n plus fa de complexitatea amestecului de substane prezente, trebuie luat n considerare i activitatea diverselor specii dizolvate, care sufer n mod continuu transformri.

pH-ul fluidului fiziologic este: 7,4 - valoarea normal; 5,5 (0,2) - atunci cnd esutul este bolnav.


esut Rezistena mecanic la traciune [MPa]

Alungirea la rupere [%]

Tendon 53,0 9,4

Piele 7,6 78,0 Elastin 1,0 100,0 Colagen 50,0 100,0 10,0

Proprieti

esuturi moi 1. DEFINIREA MEDIULUI FIZIOLOGIC

Cantitatea din fiecare faz difer n funcie de tipul de os i de diferite condiii, cum ar fi vrsta subiectului.

Faza Fracia masic [%]

Organic Fibre de colagen

16

Organic - Substan de umplutur

2

Mineral HAp carbonatat

60

Ap 22

Compoziia osului cortical

esuturi tari osul cortical 1. DEFINIREA MEDIULUI FIZIOLOGIC

Ap Fraciunea organic

fibre de colagen 90% proteine polizaharide mucopolizaharide

Fraciunea mineral hidroxiapatit n care 4-6% din gruprile fosfat sunt

nlocuite cu grupri carbonat dalit 3Ca3(PO4)2CaCO3; mai au loc i alte substituii n structura hidroxiapatitei; cristalite cu grosimea de 5nm i lungimea 20 40nm.

Se comport ca un ciment, umplnd golurile ntre fibrele

de colagen i particulele minerale.


Compoziia osului cortical

esuturi tari osul cortical

Cristalele de HAp carbonatat intr n spaiul dintre cozile i capetele microfibrelor sau n spaiul dintre fibre.

Cristalitele sunt orientate cu partea alungit pe direcia lungimii fibrelor.

Alctuirea esuturilor dure

1. DEFINIREA MEDIULUI FIZIOLOGIC esuturi tari osul cortical

esut Rezistena mecanic la

traciune [MPa]

Modulul de elasticitate

[GPa]

Os cortical longitudinal

130 12,00

Os cortical transversal

60 13,40

Os trabecular 2 0,39

Proprieti mecanice ale osului n funcie

de tipul de os i de orientare

1. DEFINIREA MEDIULUI FIZIOLOGIC esuturi tari

Faza Fracia masic [%]

Smal Dentin

Organic Fibre de colagen 2 20

Mineral HAp carbonatat 90 70

Ap 8 10

Compoziia smalului i a dentinei

1. DEFINIREA MEDIULUI FIZIOLOGIC esuturi tari - dintele

Proprieti: dens; foarte mineralizat; dur; casant.

Format din elemente structurale prismatice

HAp carbonatat.

1. DEFINIREA MEDIULUI FIZIOLOGIC esuturi tari smalul

Proprieti: mai puin dur dect smalul; mai rezistent mecanic.

Structur eterogen:

matrice; tuburi; cristalite minerale; fluid.

Imagine MEB a dentinei

1. DEFINIREA MEDIULUI FIZIOLOGIC esuturi tari - dentina

Proprietatea Smal Dentin Dimensiunile cristalitelor de

HAp 68nm/

26nm 29nm/3nm

Modul de elasticitate (GPa) 33-48 9,7-14,0

Rezistena mecanic la compresiune (MPa) 94,5-384,0 217-276

Rezistena mecanic la traciune (MPa) 10 37-52

Proprietile smalului i ale dentinei

1. DEFINIREA MEDIULUI FIZIOLOGIC esuturi tari - dintele

Orice implant interacioneaz ntr-un anumit

mod cu mediul fiziologic:

2. TIPURI DE INTERACIUNI

Efectul implantului

asupra gazdei

Efectul gazdei asupra

implantului

Clasificare

S-a demonstrat c rspunsul esutului este n

mare msur determinat, nu numai de natura materialului utilizat, dar i de caracteristici cum ar fi: form; dimensiuni; densitatea aparent (atunci cnd porozitatea este

prezent); distribuia dimensional a porilor (atunci cnd

porozitatea este prezent).

2.1. Factori de influen Implant

Pentru un material dat, o importan deosebit o are modul de realizare a implantului: pulbere; depunere n strat subire; fibre; corp solid.

Se consider de asemenea c exist o relaie ntre rspunsul esutului i raportul suprafa/volum, pentru un anumit implant realizat dintr-un anumit material.

Forma determin distribuia liniilor de for atunci cnd este aplicat o tensiune asupra implantului, influennd astfel abilitatea esutului de a se lega de materialul implantat.


LOCALI: natura locului de implantare (esut sau organ); alimentarea cu snge; potenialul de dezvolta infecii;

SISTEMICI: nutriia; particulariti hematologice; starea de sntate a pacientului.


Efectul implantului

asupra gazdei

1.Local Interaciunea snge material

- absorbia proteinelor; - coagulare; - fibrinoliza (procesul prin care

cheagurile de fibrin sunt nlturate de la nivelul leziunii, dup vindecarea acesteia, o dat ce nu mai este nevoie de ele; aceste cheaguri sunt vitale pentru limitarea pierderii de snge.);

- hemoliz (distrugerea globulelor roii);

- adeziunea / activarea leucocitelor; - Fagocitoza.

2.2. Efectul implantului asupra gazdei

1.Local Toxicitate

o Mecanisme non-autoimune acumularea, procesarea i reacia dintre gazd i produsele de degradare fizico-chimic i mecanic a materialului.

exist un prag sub care materialul nu este toxic; o Mecanisme autoimune identificarea

substanelor strine i neutralizarea lor prin intermediul substanelor poliproteice (proteine imunologice).

de obicei reacia are loc la cantiti foarte mici de material.

Efectul implantului

asupra gazdei


1.Local Modificarea vindecrii normale

- ncapsulare - reacie la corp strin este

influenat de forma i topografia suprafeei implantului, de raportul ntre aria suprafeei i volumul implantului:

raportul S/V ridicat mai multe macrofage i celule gigant; raportul S/V sczut mai mult esut fibros. - ndeprtarea unor poriuni de

esut

Efectul implantului

asupra gazdei


1.Local Infecii (fagocitoza) Tumori

o Experienele pe animale au artat o inciden statistic sczut a formrii tumorilor pentru polimeri i metale, i practic neglijabil pentru materiale ceramice dezvoltate n vederea utilizrii n sectorul medical.

o Cazurile studiate se mpart n dou categorii principale, n funcie de caracteristicile implantului care determin formarea tumorii:

forma, volumul, tipul i gradul de rugozitate al suprafeei; raportul suprafa-volum.

Efectul implantului

asupra gazdei


1.Local Tumori

o S-a observat c multe materiale polimerice i unele ceramici care nu sunt biocompatibile, mai ales atunci cnd sunt prezente n form de corpuri solide, pot avea influen n formarea tumorilor;

o Atunci cnd ns sunt prezente sub form de pulbere, incidena apariiei tumorilor scade simitor - implantarea polistirenului la cobai:

sub form de discuri a dus la o cretere a numrului de cazuri de formare a tumorilor de pn la 79%; valoarea scade pn la 41% dac discurile sunt sparte n buci; pulberea nu produce apariia tumorilor.

Efectul implantului

asupra gazdei


1.Local Tumori

o Situaia invers se nregistreaz atunci cnd avem de a face cu metale, ceea ce ne face s credem c n acest caz apariia tumorilor se datoreaz eliberrii de specii ionice care se pot reduce sau oxida, reacionnd astfel cu mediul biologic i conducnd la formarea unui numr mare de radicali liberi.

Efectul implantului

asupra gazdei


2. Sistemic Embolie (obstrucionarea vaselor

de snge) Formarea cheagurilor de snge Hipersensibilitate Creterea concentraiei

elementelor proprii implantului n snge

Transportul de particule desprinse din implant n sistemul limfatic

Efectul implantului

asupra gazdei


1. Fizico - chimic degradare datorit abraziunii degradare prin oboseal fisurare datorit coroziunii i eforturilor

mecanice coroziune dizolvare

2. Biologic absorbia de substane din esuturi degradare enzimatic calcifiere

Efectul gazdei asupra

implantului

Clasificare general

2.3. Efectul gazdei asupra implantului

Mediul fiziologic este surprinztor de agresiv, putnd conduce la o degradare rapid sau gradual a multor materiale.

La o prim vedere s-ar putea crede c: temperatura moderat; coninutul sczut de sruri; pH-ul neutru;

constituie atributele unui mediu prietenos.

2.3. Efectul gazdei asupra implantului Generaliti

Eforturi mecanice ciclice sau continue: deformarea implantului; abraziune;

Mediu apos, cu un coninut de ioni care pot fi electrochimic activi n raport cu metalele sau pot nmuia polimerii;

Mecanisme biologice: proteinele se absorb la suprafaa materialului; celulele elibereaz ageni oxidani puternici i

enzime, specializate n digestia materialului foarte concentrai, deoarece se elibereaz la contactul intim ntre celule i material.


Biodegradarea cuprinde toate reaciile care au loc, de la implantare, pe ntreaga durat de via a implantului.

Un material poate fi proiectat astfel nct s se degradeze dup o anumit perioad de timp.

Produii de degradare pot fi toxici pentru organism sau pot avea o funcie farmacologic.


Eforturile mecanice poteneaz efectul de degradare chimic n mediul fiziologic.

Datorit aportului suplimentar de energie procesul de degradare chimic va fi accelerat.

Aceste fenomene ar putea fi implicate n limitarea duratei de via a implanturilor, fiind astfel necesar mbuntirea proprietilor acestora, pentru a rspunde cerinelor de stabilitate pe termen lung.

2.3. Efectul gazdei asupra implantului Degradarea chimic

Materialele ceramice pot fi: foarte rezistente la coroziune inerte; solubile resorbabile;

cu reactivitate de suprafa controlat. n funcie de compoziia lor.

2.3. Efectul gazdei asupra implantului Degradarea chimic

Reziduurile eliberate prin degradare mecanic sunt de obicei blocate la interfaa material/mediu de implantare, conducnd astfel la amplificarea fenomenului.

Eliberarea de reziduuri n cazul implanturilor osoase provoac resorbia osului printr-un mecanism de osteoliz non-specific implantul nu mai este bine fixat, ceea ce amplific degradarea mecanic.

Un factor important care trebuie luat n consideraie atunci

cnd este proiectat un biomaterial este cantitatea, dimensiunea, forma i compoziia reziduurilor eliberate

prin degradare mecanic.

2.3. Efectul gazdei asupra implantului Degradarea mecanic

Distrugerea sau pierderea funcionalitii implanturilor poate fi cauzat de formarea unor depozite nodulare de fosfai de calciu sau ali compui pe baz de calciu pe suprafaa sau n interiorul acestora.

Acesta este un proces normal pentru dini i oase, dar devine patologic atunci cnd mineralizarea are loc la nivelul implantului.

Poate fi de 2 tipuri: distrofic: depunerea srurilor de calciu n esuturi

bolnave la indivizi cu metabolism normal; metastatic: depunerea srurilor de calciu n esuturi

sntoase la indivizi cu metabolism mineral anormal.

2.3. Efectul gazdei asupra implantului Calcifierea

n urma calcifierii se depune un fosfat de calciu slab cristalizat, derivat din hidroxiapatit.

Factorii de influen se refer att la gazd, ct i la implant: accentuat n zonele n care se manifest eforturi

mecanice ridicate; favorizat de prezena infeciilor.

Fiind un fenomen care se regsete i n mod normal n organism, calcifierea poate fi exploatat pentru mai buna fixare os-implant.

2.3. Efectul gazdei asupra implantului Calcifierea

Testarea presupune ntotdeauna existena mai multor variabile care depind de condiiile experimentale, numrul acestora crescnd cu ct este mai complex sistemul (organismul uman n comparaie cu o cultur de celule). Se utilizeaz metode statistice, pentru a:

o determina numrul de teste necesare; o prelucra rezultatele.

3. Evaluarea interaciunii implant mediu fiziologic

Generaliti

Testarea biomaterialelor poate s nu fie relevant: n ceea ce privete comportamentul dispozitivului

realizat din acesta, n mediul de implantare; avnd n vedere timpul limitat n care se

realizeaz, n comparaie cu durata de via a unui implant, care se poate msura n zeci de ani.

mai ieftin i mai uor de realizat.


Generaliti

Clasificare: In-vitro: n condiii de laborator, n general pe

culturi de celule; o relativ uor de realizat, limiteaz utilizarea animalelor

n astfel de experimente; o pot s apar diferene fa de comportarea n mediul

fiziologic, mult mai complex. In-vivo: testarea pe animale;

o trebuie utilizate animale care s fie similare cu omul, i totui este posibil ca datele obinute s nu fie valabile pentru acesta;

o se cere minimizarea utilizrii animalelor n experimente, asigurndu-ne c rezultatele obinute sunt relevante i obinute n condiii de tratament adecvat al subiecilor.


Generaliti

Evaluarea siguranei lansrii pe pia a oricrui dispozitiv medical const n decelarea efectelor adverse rezultate n urma utilizrii lui normale, nu greite.

Testarea preclinic a potenialului toxic al biomaterialelor componente minimalizeaz efectele neateptate.


Generaliti

n prezent exist teste de biocompatibilitate stabilite de: ISO (International Organization for Standardization) FDA (Food & Drug Administration) care permit predicii privind modul n care un biomaterial va reaciona la contactul cu un esut viu.


Generaliti

ISO a publicat un ghid ISO al biocompatibilitii (Biocompatibility Testing Matrix), care cuprinde diferite teste n funcie de: tipul de contact biomaterial-om; durata contactului; utilizarea clinic.

Majoritatea testelor trebuiesc realizate n condiii de laborator controlate, conform GLP (Good Laboratory Practices).

Pentru o anumit categorie de dispozitive se recomand un numr de teste de biocompatibilitate.


Generaliti

n Europa, pn recent, diferitele ri aveau reglementri proprii privind fabricarea i comercializarea dispozitivelor pentru uz uman.

Din ianuarie 1995, aceste dispozitive sunt comercializate n Uniunea European conform reglementrilor EU Medical Devices Directive 93/42/EEC, care specific cerinele evalurii biocompatibilitii.

(http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:31993L0042:EN:HTML).

n prezent, evalurile de biocompatibilitate ale dispozitivelor medicale se realizeaz conform recomandrilor standardului ISO 10993-1/EN 30993-1.


Generaliti

Parte Titlu Parte Titlu 1. Evaluare i testare 10. Teste pentru iritare i sensibilitate

2. Cerine de ntreinere a animalelor 11. Teste pentru toxicitatea sistemic

3. Teste de genotoxicitate, carcinogenicitate i toxicitate reproductiv

12. Prepararea probei i materiale de referin

4. Selectarea testelor pentru interacia cu sngele 13. Identificarea i dozarea cantitativ a produilor de degradare din polimeri

5. Teste de citotoxicitate metode in vitro 14. Identificarea i dozarea cantitativ a produilor de degradare din ceramice

6. Teste pentru efectele locale dup implantare 15. Identificarea i dozarea cantitativ a produilor de degradare din metale i aliaje

7. Reziduurile sterilizrii cu oxid de etilen 16. Schema studiului toxico-cinetic al produilor de degradare eliberai

8. Investigarea clinic a dispozitivelor medicale 17. Reziduri de glutaraldehid i formaldehid n dispozitive medicale sterilizate industrial

9. Degradarea materialelor pentru testarea biologic

Lista prilor ISO 10993

Protocolul evalurii biologice a unui dispozitiv medical depinde de:

natura materialelor utilizate la construcia lui; natura contactului cu organismul uman; durata contactului cu organismul uman.


Generaliti

CATEGORII DE DISPOZITIVE EXEMPLE

Superficiale

Piele electrozi, proteze externe, benzi de fixare, bandaje de comprimare, monitoare

Membrane mucoase lentile de contact, catetere urinare, dispozitive intravaginale i intraintestinale, tuburi endotraheale, bronhoscop, proteze dentare, dispozitive ortodontice

Suprafee cu leziuni/ compromise

dispozitive de vindecare sau bandajare, pansamente ocluzive

Comunicare extern

Indirect, flux sangvin

garnituri de transfer sau extensie, utilizate n administrare de snge, soluii, etc.

Comunicare esuturi, os, dentin

laparoscoape, artroscoape, sisteme de drenare, cimenturi dentare, materiale de umplutur dentare, capse piele

Flux sanguin catetere intravasculare, electrozi pacemaker temporari, tuburi i accesorii pentru oxigenatoare i dializ

Implanturi

Dispozitive implant esut/os

cuie i plci ortopedice, implanturi subperiostal i de sn, nlocuire de articulaii i tendoane, proteze osoase, cimenturi i dispozitive intraosoase i de eliberare de medicamente, senzori i stimulatori neuromusculari, laringe artificial, cleme de legare

Snge

electrozi pacemaker, fistule arteriovenoase artificiale, valve cardiace, grefe vasculare, catetere interne de eliberare medicamente, dispozitive de asisten ventricular

Clasificarea dispozitivelor utilizate n scopuri medicale, n funcie de natura contactului cu organismul

n funcie de durata contactului cu organismul deosebim dispozitive cu un contact: limitat (30 zile) - C.

Un dispozitiv destinat unui contact superficial, o

perioad limitat de timp, nu este necesar s rspund acelorlai cerine n ceea ce privete biocompatbilitatea, ca un implant obinut din acelai material i folosit permanent.


Generaliti

CATEGORII DE DISPOZITIVE

Durata contactului

Citotoxicitate

Sensibilitate

Iritaii

Toxicitate sistem

ic

Toxicitate subacut

Genotoxicitate

Implantare

Hem

ocompatibili

tate

Toxicitate cronic

Carcinogenicitate

Superficiale

Piele

A B C

Membrane mucoase

A B C

Suprafee cu leziuni/ compromise

A B C

Teste ISO Teste FDA

Matrice de testare a biomaterialelor


CATEGORII DE DISPOZITIVE

Durata contactului

Citotoxicitate

Sensibilitate

Iritaii

Toxicitate sistem

ic

Toxicitate subacut

Genotoxixicitate

Implantare

Hem

ocompati-

bilitate

Toxicitate cronic

Carcinogenicitate

Comunicare extern

Indirect, flux sangvin

A B C

Comunicare esuturi, os, dentin

A B C

Flux sanguin

A B C

Implanturi

Dispozitive implant esut/os

A B C

Snge

A B C

Teste ISO Teste FDA Matrice de testare a biomaterialelor

Proba de testat trebuie s reprezinte un specimen reprezentativ pentru dispozitivul produs n cantiti industriale. Ea trebuie s fie finisat sau tratat (acoperit sau

sterilizat) n acelai mod ca i dispozitivul comerciabil. Deoarece potenialul toxic al materialelor i dispozitivelor

depinde de gradul de eliberare a unor componente solubile, toxice, sunt testate uzual extracte din proba de analizat.

Totui unele teste necesit o evaluare n condiiile normale de folosire a dispozitivului, i atunci se testeaz direct citotoxicitatea unei piese din acesta.


Pregtirea probelor

n cazul solubilizrii unor componente din dispozitiv se utilizeaz o serie de soluii cu o polaritate descresctoare pentru a asigura o extracie corespunztoare a compuilor cu diferite solubiliti.

Cele mai comune medii de extracie utilizate sunt: ser fiziologic; ulei vegetal; dimetilsulfoxid; etanol; mediul de cultur al celulelor - pentru testarea

citotoxicitii in vitro.


Pregtirea probelor

Temperatura de extracie este un factor important n evaluarea citotoxicitii unor materiale. Unii compui solubilizai din prob sunt alterai

chimic la temperaturi nalte, motiv pentru care se recomand ca extracia s fie realizat la 37C (temperatura corpului), timp de 72 ore.

Pentru testele de citotoxicitate in vitro se recomand extracia la 37C timp de 24 ore, deoarece unii constitueni din mediu sunt relativ labili.


Pregtirea probelor

Cultura de celule (sau de esut) i are originile n secolul al XIX-lea, cnd oamenii au nceput s examineze n detaliu esuturile i organele din organism n recipiente de sticl.

Termenul in vitro nseamn literal n sticl, dei n prezent majoritatea culturilor celulare se realizeaz n sau pe plastic.

Prima ncercare, ncununat de succes, de a cultiva celule izolate din organismul vertebratelor a fost realizat n anul 1907 de ctre Ross Harrison, care era interesat n diferenierea neuronilor.


Culturi de celule

n prezent, culturile celulare reuesc s reproduc condiiile existente in-vivo, pentru a permite celulelor normale (netumorale) s creasc n cultur. Iniial, celulele prelevate/izolate din orice tip de

esut, de la diferite organisme, au fost cultivate n laborator pentru studii de morfologie i fiziologie.

Ulterior, culturile celulare au progresat de la examinarea celulelor izolate care mor dup un numr limitat de diviziuni (culturi primare), la cultura de lung durat (linii celulare), ale cror celule supravieuiesc un numr mare de generaii, datorit unui proces de transformare spontan sau indus.


Culturi de celule

n prezent, lista celulelor crescute n cultur este extrem de larg i include: elemente ale esuturilor conjunctive (fibroblaste,

osteoblaste, condrocite); celule musculare; celule epiteliale (de la nivelul ficatului, plmnului,

pielii, snului, rinichiului); celule nervoase, etc.


Culturi de celule

Presupune evaluarea biomaterialelor prin metode care utilizeaz culturi de celule, pentru a msura citotoxicitatea i compatibilitatea biologic a unui material.

Citotoxicitatea identific efectele toxice la nivelul celulelor: moartea celulelor; alterarea permeabilitii membranei celulare; inhibiia enzimatic, etc.


Testarea in - vitro

Pentru studiile in vitro de caracterizare a biocompatibilitii materialelor se pot folosi culturi de osteoblaste, obinute: din explante de os; din celule stem mezenchimale.


Testarea in vitro pe osteoblaste

Citomorfologia osteoblastelor n cultur se testeaz n prezena i absena materialelor, prin: microscopie n contrast de faz;

o pe tot parcursul realizrii experimentului; microscopie de fluorescen;

o la sfritul perioadei de meninere n cultur a celulelor de regul 48-72 ore;

o pentru vizualizarea celulelor n fluorescen cultura va fi tratat cu hipericin, care ptrunde n celule i le marcheaz fluorescent.



Estimarea numrului de celule viabile se realizeaz prin testul cu Albastru tripan. albastru tripan este un colorant care permite

identificarea celulelor moarte, n care ptrunde datorit deteriorrii structurii i permeabilitii membranei;

celulele moarte - colorate n albastru se deosebesc de cele vii - incolore;

numrarea se realizeaz cu ajutorul unui hemocitometru = lam de sticl mai groas, n care este practicat o fant; n fant este plasat un volum mic din suspensia celular de evaluat.



Hemocitometru



Etape de lucru: se introduce proba de material n placa Petri i se

sterilizeaz (8-10 ore) cu ajutorul lmpii cu ultraviolete, pe ambele suprafee alternativ;

se sterilizeaz proba prin cufundare n soluie PBS (Phosphate Buffer Saline) steril (2-4 ore);

se nsmneaz 100.000 celule/plac Petri, inclusiv n proba control (plac Petri care nu conine proba de material);

se incubeaz culturile n atmosfer cu 5% CO2, la 37oC;

dup 18-20 ore se vizualizeaz celulele la microscopul cu inversie i se fac poze n VIS (vizibil) cu o camer foto digital.



Etape de lucru: culturile se incubeaz (n atmosfer cu 5% CO2, la

37oC) cu hipericin (1-2 ore) care ptrunde n celule i le marcheaz fluorescent;

se ndeprteaz mediul care conine hipericin (pentru reducerea ecranrii semnalului de la celule datorat difuziei colorantului n mediu) i se adaug EMEM (Eagle's Minimal Essential Medium) proaspt;

se vizualizeaz la microscopul cu inversie i se fac poze n VIS i UV (ultraviolet);

se ndeprteaz probele i se spal celulele de 2 ori cu soluie PBS.



Etape de lucru: se trateaz celulele cu soluie MTT [bromur de 3-

(4,5dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazoliu] i se incubeaz n atmosfer cu 5% CO2, la 37oC (2-4 ore);

se ndeprteaz soluia MTT i se solubilizeaz formazanul obinut (culoare albastru-nchis) cu o soluie de izopropanol (15-20 minute);

se citete densitatea optic a formazanului solubilizat la 595nm cu ajutorul unui spectrofotometru, obinndu-se o funcie absorban concentraie colorant numr de celule active metabolic din cultur.



Micrografie n contrast de faz a fibroblastelor CCD-1070Sk din control (obiective A-10x; B-20x; C-40x).

Micrografie n contrast de faz a fibroblastelor CCD-1070Sk din plcile Petri cu probele: I; II; III (obiectiv 10x).

I II III



Micrografie n fluorescen a fibroblastelor CCD-1070Sk de pe suportul II (obiective A-20x; B-40x).



Pentru analiza comportamentului n mediul fiziologic a materialelor, probe pulverulente sau sub form de corp solid sunt imersate n SBF (simulated body fluid) i sunt meninute la 370C, urmnd a fi extrase i studiate dup diferite perioade de timp: 6 zile, 14 zile, 21 zile i 28 zile.

Probele extrase sunt analizate prin microscopie electronic i difracie de raze X, n vederea detectrii modificrilor compoziionale i microstructurale care apar.


Testarea in vitro n SBF

Valorile concentraiei de ioni din SBF i plasma uman

Ioni Concentraia ionilor [mmoli/l]

SBF Plasm uman Na+ 142 142 Cl- 126 103

HCO3- 27 27 K+ 5 5

Mg2+ 1,5 1,5 Ca2+ 2,5 2,5

HPO42- 1,0 1,0 SO42- 0,5 0,5



Materiile prime utilizate pentru obinerea SBF sunt: NaCl, Na2CO3, KCl, (NH4)H2PO4, MgCl26H2O, CaCl22H2O, Na2SO4.

Materiile prime se adaug n ordinea prezentat, ntr-o soluie tampon, obinut prin dizolvarea TRIZMA (tri hidroximetil aminometan) n ap deionizat.

Dup dizolvarea tuturor materiilor prime, dac este necesar, se regleaz pH-ul cu HCl, pentru a fi meninut n intervalul 7,2 7,4.



Studii in vitro n SBF

Spectre de difracie de raze X pentru o prob de biosticl, tratat termic la 1000OC / 2h, nainte i dup imersarea 6, 14, 21 i 28 zile n SBF

0

500

1000

1500

2000

2500

20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

CaSiO3 27-0088 HAp 46-0905Ca3(PO4)2 01-0941 CaCO3 70-0095NaCl 78-0751

70S - iniial

70S - 28 zile SBF

70S - 21 zile SBF

70S - 14 zile SBF

70S - 6 zile SBF


Micrografii de MEB pentru o prob de biosticl, nainte i dup imersarea timp de 6, 14, 21 i 28 zile n SBF

Iniial 14 zile 6 zile

28 zile 21 zile



Evaluarea comportamentului materialelor la implantarea in-vivo, pe animale, este necesar pentru determinarea urmtoarelor interaciuni biologice: Interaciunea diferitelor tipuri de celule cu implantul,

sau unele cu celelalte; Aciunea factorilor endocrini sau paracrini celulari; Interaciunea celulelor cu molecule solubile sau

componente extracelulare insolubile ale matricei, care pot fi alterate de prezena implantului;

Interaciunea cu celule, proteine, molecule din snge.


Testarea in vivo

Evaluarea bicompatibilitii presupune:

Determinarea compatibilitii material esut; o rspunsul de vindecare a esutului, n faz acut; o reacia de inflamaie cronic; o remodelarea esutului, n faza de adaptare la implant; o efectul local i sistemic al implantului.

Determinarea eficacitii dispozitivului, avnd n

vedere funcia creia i este destinat.



Slide Number 1Slide Number 2Slide Number 3Slide Number 41. DEFINIREA MEDIULUI FIZIOLOGICSlide Number 6Slide Number 7Slide Number 8Slide Number 9Slide Number 10Slide Number 11Slide Number 12Slide Number 13Slide Number 14Slide Number 15Slide Number 16 Slide Number 19Slide Number 20Slide Number 21Slide Number 22Slide Number 23Slide Number 24Slide Number 25Slide Number 26Slide Number 27 Slide Number 29Slide Number 30Slide Number 31Slide Number 32Slide Number 33Slide Number 34Slide Number 35Slide Number 36Slide Number 37Slide Number 38Slide Number 39Slide Number 40Slide Number 41Slide Number 42Slide Number 43Slide Number 44Slide Number 45Slide Number 46Slide Number 47Slide Number 48Slide Number 49Slide Number 50Slide Number 51Slide Number 52Slide Number 53Slide Number 54Slide Number 55Slide Number 56Slide Number 57Slide Number 58Slide Number 59Slide Number 60Slide Number 61Slide Number 62Slide Number 63Slide Number 64Slide Number 65Slide Number 66Slide Number 67Slide Number 68Slide Number 69Slide Number 70Slide Number 71Slide Number 72Slide Number 73

curs 3 - interactiunea cu mediul fiziologic FIM.pdf

Documents

Transcript of curs 3 - interactiunea cu mediul fiziologic FIM.pdf