CAPITOLUL 4Testele ADN n cercetarea filiaiei biologiceMotto: Orice copil are dreptul de a-i cunoate prinii (art.9)Orice copii are dreptul ia un nume i o naionalitate (art.7)(Convenia Naiunilor Unite cu privire ia Drepturile Copilului)Primatul adevrului biologic n filiaie din perspectiva istoriei societii umane. Societatea uman a evoluat de-a lungul timpului, iar, de la o epoc istoric la alta, s-au schimbat i mentalitile oamenilor cu privire la rolul adevrului biologic n determinarea relaiilor lor sociale i de descenden biologic. n ntreaga lume antic, copiii malformai sau ilegitimi erau omori fiind considerai un pericol pentru societatea respectiv. Sofocle obinea n 450 .e.n., la Atena, medalia de aur a festivalului cu Oedip Rege, pies care nfiera adopia datorit pericolului unor relaii incestuoase dintre copilul adoptat, Oedip, i propria sa mam. Cu toate acestea, n 466 .e.n., tot atenienii au fost cei care au promulgat o lege a adopiilor, prima de acest fel din lumea antic. Legea permitea expunerea copiilor adulterini pe o mas, n plin agora, i garanta libertatea oricrei femei din cetate s-i adopte.Dup modelul grec, paternitatea nu era considerat nici n Roma antic un fapt biologic evident. Evidena de ordin biologic era doar matern: Mater semper certe est, pater semper incertus est. Cum o eviden biologic a paternitii nu era posibil, ceea ce conta era decizia de recunoatere a tatlui. Ritualul recunoaterii unui copil n societatea roman consta n nchinarea nou-nscutului zeului Jupiter de ctre brbatul care se considera tatl acelui copil.mpraii romani cretini au interzis i au dispus msuri severe pentru combaterea infanticidului pe motive de ilegitimitate, ncurajnd adopiile. Ct privete ritualul adopiei, acesta era identic cu cel al recunoaterii copiilor biologici. Romanii refuzau s recunoasc copiii malformai, iar grecii recunoteau de preferin bieii. Romanii nu adoptau numai nou-nscui, adopia unor tineri sau chiar aduli era un fapt curent, mai ales n familiile aristocrate, unde legea sngelui nu era puternic, precum era onoarea familiei respective de a-i asigura urmai demni s le duc mai departe numele. mpraii romani nu decideau succesiunea la tron numai prin succesiune natural, ci i prin adopie. mpratul Augustus a fost fiul adoptiv al lui Cezar, iar n dinastia Antoninilor toi suveranii, cu excepia lui Marc Aureliu, i-au adoptat succesorii.Cretintatea nu a atribuit un primat absolut adevrului biologic pentru simplul motiv c lumea cretin s-a nscut n cuprinsul civilizaiei greceti i romane. Doctrina cretin nu a acceptat procrearea n afara sfintei cstorii, ns, pn n secolele XV-XVI, nu a acordat o importan prea mare relaiilor premaritale i situaiei bastarzilor. n epoca medieval, n multe provincii franceze, faptul c o fat rmnea nsrcinat nainte de a se mrita nu era considerat o catastrofa, ci mai curnd o calitate. Sarcina era privit ca o dovad de nepreuit a fertilitii femeii respective.Testele ADN n cercetarea filiaiei biologice4544GENETICA JUDICIARTestele ADN n cercetarea filiaiei biologice43/ cunoate prinii i o naionalitate vire ia Drepturileane. Societatea i mentalitile de descenden considerai unr a festivalului dintre copilul ist cei care au unerea copiilor adopte.ologic evident. tus est. Cum o tere a tatlui, i zeului Jupiterifanticidului pe entic cu cel al leii recunoteau r aduli era un m era onoarea aii romani nu tugustus a fost Aureliu, i-auotiv c lumea )tat procrearea mare relaiilor )tul c o fat ilitate. SarcinaHenri al II-lea, prin edictul su din 1556, obliga, sub pedeapsa cu moartea, ca toate femeile s i declare sarcina; scopul edictului regal era de a proteja fetele necstorite de rzbunarea tailor acestora, care frecvent le omorau, dect s fac familia de ruine. Fata care i declara sarcina era ajutat s primeasc o reparaie contra unei declaraii cu privire la identitatea seductorului. In timpul marilor dureri ale facerii fata era ntrebat de numele seductorului, sub ameninarea cu moartea sau a trsnetelor iadului n caz de minciun. Numele pronunat de fat era acceptat, iar, sub presiunea regelui i a bisericii, brbatul incriminat era obligat s recunoasc i s ntrein copilul. Fr ndoial c abuzurile erau frecvente i muli inoceni au pltit pentru ali culpabili.Dup Conciliul de la Trente, biserica i-a modificat poziia sa tolerant, nfiernd aspru naterea bastarzilor. n acelai spirit vor aciona de acum ncolo i puterile laice regale. Micrile protestante din secolele urmtoare au accentuat i ele aceste schimbri de atitudine n lumea cretin. De atunci i pn n prezent, adevrul biologic n materie de filiaie - jure sanguinis - a reprezentat un domeniu tabu n toat lumea cretin.n ultimii ani ns, asistm la o reevaluare pe scar larg a reperelor tradiionale n materie de paternitate i chiar de maternitate, repere care tind s se atenueze datorit apariiei unor personaje noi n constelaia parental; donatorii anonimi de celule germinale, mamele surogat etc., concomitent cu educaia susinut i pledoaria societilor modeme pentru reacceptarea social a filiaiei de suflet - jure soli.Donatorul de sperm este, spre exemplu, un personaj foarte diferit de clasicul amant adulterin, pentru faptul c el nu cunoate pe mama copilului. Muli donatori anonimi de sperm triesc ns cu frica deconspirrii anonimatului, n timp ce alii sunt interesai s afle dac sperma lor a servit la conceperea unui copil, dei in s i pstreze anonimatul i afirm c nu vor s ntlneasc copilul respectiv. Pentru motivele expuse mai sus, Suedia a adoptat recent o lege care interzice anonimatul donatorilor de sperm, acceptnd numai acei donatori care sunt dispui s i ntlneasc descendenii biologici, dac, bineneles, acetia o doresc. i Consecina imediat a legii a fost reducerea semnificativ a numrului donatorilor suedezi.Aspecte reflectate de statisticile medicale. Statisticile medicale apreciaz c, n 7-10% din familii, * copiii nu sunt descendenii biologici ai tailor lor legitimi, de cele mai multe ori fiind vorba de primul r nscut sau de ultimul nscut. n aceste familii, tatl se acomodeaz cu adopia involuntar, pentru ca un eveniment de ordin medical, neprevzut, s releve incompatibilitile de ordin biologic: frecvent este | vorba de o simpl testare a grupului de snge al copilului, n spital sau pentru actul de identitate, la | mpliifirea vrstei de 14 ani.Un aspect recent remarcat, i deloc de neglijat prin amploarea raportrii, l constituie excluderile de la paternitate realizate involuntar, de o serie de studii genetice ntreprinse pentru depistarea n mas [ a unor maladii genetice cu transmitere ereditar. n prezent, n Statele Unite i Europa, screening-urile i genetice prenatale efectuate de rutin pentru diagnosticarea defectelor metabolice evideniaz constant o | rat medie de excludere de la paternitate de circa 10% - procentul este mai crescut n oraele portuare I (25-30%) i neglijabil n comunitile mici nchise (~1%). Aceste excluderi intempestive reprezint o | problem de etic pe care o ridic n general testrile genetice n practica medical modern.Este important de tiut c, datorit performanelor noilor metode de analiz, genotiprile n scopul | stabilirii unui pedigree vizeaz n prezent i alte aspecte dect cele clasice, interfernd adeseori cu domeniul identificrilor de persoane n: probleme de imigraie, testarea paternitii in utero dup agresiuni I sexuale, dispariii de persoane, catastrofe de mas, stabilirea descendenilor biologici n scopul aflrii | adevrului istoric, solicitri ale societilor de asigurare, respectarea drepturilor omului etc.Teste pentru emigrani. Primul caz rezolvat de ctre Sir Alee Jeffreys, descoperitorul amprentelor genetice i pionier al aplicrii acestor teste n justiie, a fost un caz de imigraie datnd din 1985, cnd autoritile britanice au pus la ndoial identitatea unui copil pentru care mama cerea repatrierea. Testele serologice fiind neconcludente, s-a recurs n acest caz la nou aprutele teste genetice. Coroborarea profilelor ADN ale copilului, mamei sale i a unor rude paterne, tatl nefiind disponibil, a evideniat c maternitatea i paternitatea biatului erau certe, permind repatrierea acestuia. n acelai an, autoritile britanice au respins ns jumtate din cele peste 12 000 de cereri de reziden cu statut de emigrant n baza rezultatelor testelor ADN.Identificarea lui Josef Mengele: doctorul Josef Mengele, supranumit ngerul moriipentru c a condus unele din cele mai oribile experimente cu fiine umane n lagrele de concentrare naziste, s-a ascuns dup rzboi n America de Sud, sub o identitate fals. Autoritile germane au fost informate n 1979 c acest personaj a decedat n urma unui atac de cord, motiv pentru care, civa ani mai trziu, au deschis o anchet oficial pentru a investiga identitatea persoanei suspectate a fi fost Josef Mengele. ntruct existau mai multe dubii cu privire la identificarea scheletului, s-a dispus efectuarea unui test ADN din respectivul material osos. Profilul obinut a fost comparat cu profilul ADN al soiei lui Mengele i cu cel al fiului acestuia, concluzionndu-se c osemintele aparineau cu certitudine lui Josef Mengele. Urmare a reuitei testelor genetice, autoritile germane au nchis cazul Mengele considerndu-l definitiv rezolvat.Cercetarea filiaiei - un domeniu n expansiune datorit amprentelor genetice. Determinarea relaiilor de descenden biologic reprezint o solicitare n cretere n practica medico-legal a ultimilor 20 de ani, motivat exclusiv de dezvoltarea tehnicilor performante de analiz molecular i aplicarea lor pe scar larg. Volumul cel mai mare de testri pentru paternitate raportat la numrul de locuitori se nregistreaz constant n Statele Unite.n laboratoarele acreditate din Statele Unite, numrul de cazuri oficial nregistrate i testate n 2003 a fost de 354 011. Volumul testrilor a crescut cu 3,9% fa de 2002 i cu 700% fa de 1984. Pentru cazurile nregistrate n 2003 au fost testate un numr de 991 000 persoane (preluat din Annual Report Summary for Paternity Testing in 2003 - Prepared by the Parentage Testing Standards Program Unit - October 2004 - www.aabb.org).Legislaiile referitoare la cercetarea filiaiei difer de la o ar la alta, de aceea nu exist statistici oficiale pe plan mondial care s reflecte cu exactitate numrul global de solicitri ntr-o anumit perioad de timp. Putem s ne facem ns o idee despre volumul actual al testelor de paternitate dac l corelm cu numrul naterilor n afara cstoriilor - fenomen care a nregistrat i el o cretere simitoare n ultimele dou decenii.Din Anuarul Eurostat publicat de Biroul de Statistic al Comunitii Europene reiese c n Uniunea European media naterilor n afara mariajelor este n prezent de 24%, procentul fiind n medie mai mic dect n S.U.A. (32%), dar diferind foarte mult de la o ar european la alta (tabelul 4.1).TABELUL 4.1Nateri n afara mariajului n procente din totalul naterilor (date publicate de Biroul de Statistic al ComunitiiEuropene pentru 1996 i 1997 i de Anuarul Eurostat n 1999)Uniunea European24Finlanda37Spania20Elveia8 1Islanda65Marea Britanie37Olanda19Italia8 jNorvegia49Germania28,4Luxemburg17Grecia3 IDanemarca46Austria27Belgia15Statele Unite32Frana39Irlanda27Portugalia11Canada31 'Rata cea mai ridicat a naterilor n afara cstoriei se nregistreaz n rile Americii Latine, aspect care ns nu este reflectat nici pe departe ntr-un volum crescut al testrilor de paternitate - se apreciaz c aproximativ 80% din nou-nscui sunt nregistrai cu tat natural.Ce trebuie remarcat este c, dei n Statele Unite numrul testrilor de paternitate este foarte mare, mai puin de 0,1% din cazuri ajung n instanele de judecat. Explicaia este dat de faptul c testarea se face de regul la cererea prilor, n laboratoare genetice private, dar acreditate s efectueze investigaii de paternitate de ctre Comitetul pentru Testarea Paternitii al Asociaiei Americane a Bncilor de Snge (.American Association of Blood Banks - AABB). Acest organism monitorizez ndeaproape toate aspectele tiinifice i tehnice legate de testarea filiaiei i elaboreaz standardele de analiz, acordnd anual pentru laboratoarele americane i canadiene acreditrile oficiale de efectuare a testrilor.Aspecte legislative n materie de filiaie n Romnia. La noi n ar, expertiza medico-legal pentru filiaie se realizeaz att la solicitarea instanelor de judecat, ct i la cererea persoanelor. In majoritatea expertizelor se solicit cercetarea filiaiei faa de tat, fie n cazul copiilor nscui n afara cstoriei, fie al celor nscui n cadrul unei cstorii i, doar foarte rar, cercetarea filiaiei fa de mam - cazul schimburilor de copii n materniti, pierderilor accidentale de copii, furturilor de copii, pruncuciderilor.n legislaia romn, aciunea de tgduire a paternitii are un caracter personal, putnd fi pornit numai de ot, n timp ce n alte legislaii acest drept revine i mamei copilului sau chiar procurorului. Aciunea se prescrie n termen de 6 luni de la naterea copilului, n timp ce alte legislaii prevd termene de 1 sau 3 ani dup atingerea vrstei majoratului. n Romnia, consacrarea expertizei medico-legale eredo-biologice ca mijloc de probaiune n procesele civile avnd ca scop stabilirea filiaiei a avut loc n 1955. Decalajul pare semnificativ fa de Germania (ar cu cea mai ndelungat tradiie din lume n ce privete testrile de paternitate, efectuarea acestui tip de investigaii coinciznd practic cu descoperirea grupelor de snge de ctre Karl Landsteiner, n 1899), sau Statele Unite (testrile de filiaie serologice au fost statuate aici din 1935). Nu acelai lucru se poate spune dac ne referim la Frana, o ar a crei legislaie foarte restrictiv n materie de cercetare a filiaiei nu a permis efectuarea de teste biologice dect ncepnd cu 1973.Costurile testelor genetice de paternitate. Costurile testelor ADN este considerabil mai ridicat dect al clasicelor teste serologice, deoarece tehnicile de analiz molecular necesit echipamente i reactivi de laborator cu mult mai costisitori. La aceste costuri se adaug i cele legate de retribuirea unui personal nalt calificat. Sistemele de asigurri medicale, fie ele de stat sau private, nu prevd nicieri n lume decontarea acestui tip de investigaii. n aceste condiii, devine o realitate faptul c efortul financiar legat de efectuarea unor teste ADN pentru cercetarea filiaiei este uneori foarte dificil de suportat de solicitani.Referitor la costul expertizelor de filiaie, trebuie spus c, n Romnia, testele reprezint o problem exclusiv a solicitanilor, n timp ce, n alte ri, stabilirea unei paterniti este considerat o problem social. Ori de cte ori mama nu are posibilitatea s suporte costul unei investigaii serologice sau genetice n calitate de reclamant, statul este cel ce ordon testele i suport costul acestora. Guvernul federal american, confruntat la sfritul anilor 1970 cu un numr tot mai mare de copii cu statut ilegitim sau abandonai, a stabilit mecanisme legislative foarte eficiente pentru identificarea tailor biologici, concomitent cu transferarea ctre acetia a obligaiilor de ntreinere. Aa se explic numrul mare al solicitrilor de analize din partea organizaiilor guvernamentale americane. n Europa, este binecunoscut faptul c rile scandinave efectueaz n prezent un numr foarte mare de expertize de filiaie din raiuni ce in deopotriv de legislaie i de aspecte sociale. Legiuitorii scandinavi au decis c este mai rentabil44GENETICA JUDICIAR44GENETICA JUDICIARs identifice prin testare tatl biologic al unui copil, dect s ncarce bugetul de stat cu cheltuielile de ntreinere i educaie ale respectivului copil, pn la vrsta majoratului. Dac inem cont de politica de protecie social aplicat de rile scandinave, costurile unei testri, fie ea testare ADN, sunt neglijabile n raport cu cele legate de ntreinerea unui minor.Schimbrile operate n sistemele de testarea paternitii. Dup 1986, testele serologice clasice i serotiprile HLA au nceput s fie nlocuite ntr-un ritm foarte rapid cu teste ADN. Astfel, dac ntre 1986 - 1988 s-au efectuat n Statele Unite teste ADN doar pentru 3% din cazurile de paternitate, n 1991 ponderea acestor investigaii a crescut la 45%, iar n 1994 a depit 50% (American Association ofBlood Banks - 1994 - Annual Report Summary for Parentage Testing).ntre 1993-1998 s-a produs o schimbare de proporii, prin comutarea investigaiilor de la markerii tradiionali (antigene eritrocitare, leucocitare, proteice i enzimatice) la sistemele de markeri ADN. Tot n acest interval de timp s-au operat modificri importante n ce privete chiar sistemele de markeri i tehnicile de analiz molecular - s-a trecut pe scar larg de la testele prin tehnica RFLP la aplicaiile PCR. Pentru a cunoate datele i a caracteriza fenomenul, AABB i College of American Patologists (CAP) au monitorizat selectarea sistemelor utilizate n testrile de paternitate ncepnd cu 1993 printr-un Program de Testare a Paternitii (fig. 4.1).PSi3dPV. UtilizareFig. 4.1. Evoluia schimbrilor operate n tehnicile de investigare a paternitii n laboratoarele americane (preluat dup Polesky H.F. & colab. - Systems reported by Laboratories participating in the AABB/ CAP Parentage Testing Program: 1993-1998).aSsliit1P:fn;sc1cRaportul din 1998 din cadrul programului a evideniat faptul c testele ADN (RFLP/PCR cumulat) au fost utilizate n rezolvarea a 94% din cazuri. Testarea serologic, limitat cu precdere la grupele eritrocitare ABO, a fost raportat numai pentru 6% din cazuri i a urmrit doar s opereze rapid i ieftin o triere grosier a cazurilor. Electroforeza proteinelor serice i enzimatice a disprut practic dup 1998 din bateriile de teste de cercetare a paternitii efectuate n laboratoarele americane, n timp ce n laboratoare europene, mai conservatoare, acest tip de teste nc se efectueaz. Serotiparea HLA n domeniul paternitii a cunoscut de asemenea un declin major n ultimii 5 ani, fiind raportat numai la 3% din cazuri n 1998 i la 0,00085% din cazuri n 2003 (preluat din Annual Report Summary for Paternity Testing in 2003).Testele ADN n cercetarea filiaiei biologice4948GENETICA JUDICIARTestele ADN n cercetarea filiaiei biologice47S-a consemnat n ultimii ani i o cretere a varietii probelor biologice acceptate pentru testarea paternitii, nregistrndu-se o tendin marcat de a se renuna la prelevatele de snge integral n favoarea prelevatelor de saliv pe tampoane sau perii de broaj citologic sau a spoturilor de snge depuse pe microcarduri impregnate. Din totalul probelor testate n 2003 n laboratoarele americane, tampoanele salivare au reprezentat 91,57% din eantioanele prelucrate, n timp ce probele de snge integral numai 3,28% - o reducere semnificativ, de 61%, a probelor de snge fa de anul 2002.Pe continentul european lucrurile au evoluat n ansamblu de o manier foarte asemntoare cu cele de pe continentul american, dar ceva mai lent, fapt evideniat n rapoartele Comitetului de Testare a Paternitii ce activeaz n cadrul International Society of Forensic Genetics (ISFG), organizaie care monitorizeaz performanele de lucru ale laboratoarelor de profil din ntreaga lume.n ntreaga lume, laboratoarele care efectueaz teste de paternitate sunt de civa ani ntr-o competiie acerb de ordin economic i tehnologic datorit schimbrilor operate n sistemele de testare. Dac n Statele Unite se raportau n 1978 un numr de 11 000 de testri, efectuate n 259 de laboratoare, statisticile din 2003 au indicat un volum de peste un sfert de milion de testri, efectuate n doar 44 de laboratoare, toate acreditate i echipate cu tehnologii modeme de analiz molecular.Markerii ADN utilizai n cercetarea filiaiei. Selecia sistemelor de markeri ADN utilizai pentru investigarea filiaiei este an de an monitorizat i evaluat n dinamic dup rezultatele raportate de laboratoarele specializate din ntreaga lume, care particip periodic la trialurile de verificare a performanelor de lucru n testarea ADN a paternitii organizate de AABB sau ISFG.Tehnicile de analiz molecular au suferit ntr-un interval foarte scurt de timp modificri importante, n sensul renunrii la aplicaiile RFLP i la detecia radioactiv sau prin colorare cu sruri de argint, n favoarea aplicaiilor PCR i a tehnicilor cu detecie fluorescent a produilor de reacie. Sistemele de markeri ADN sunt de asemenea ntr-o continu schimbare, selecia acestora fiind condiionat de tehnicile de analiz i, mai nou, de lansrile pe pia a kiturilor de analiz comerciale. Astfel, markerii de tip VNTR multilocus au fost nlocuii la mijlocul anilor 90 de cei VNTR unilocus, pentru ca, n prezent, s fie preferai markerii de tip STR.Experii geneticieni din domeniu atrag atenia c, din necesitatea de a face fa rapidelor schimbri de tehnologii din domeniul investigaiilor moleclare i pentru a-i eficientiza activitatea, unele laboratoare limiteaz numrul de markeri ADN testai. Aceast tendin pune n primejdie enormul potenial al geneticii judiciare modeme.Pentru a fi selectai n investigarea filiaiei umane, markerii ADN trebuie s ndeplineasc urmtoarele criterii:1. Mod de transmitere ereditar cu respectarea obligatorie a legilor mendeliene (tabelul 4.II).TABELUL 4.IICromozomLocus STRAlte sisteme de markeri analizai prin PCR1F13B. RENA4, D1S1171D1S802TPOX*. APOB, D2S410, D2S436, D2S1242, D2S1338apoB3D3S1349, D3S1352, D3S1358*, D3S1359, D3S1744, ACPP4FGA (FIBRA)*, FABP, GABARB15GC (PM), GYPA (PM)5CSF1PO*. D5S373, D5S815, D5S818*6F13A1, ACTBP2 (SE33E FOLP23. D6S366. D6S502. D6S965DQ?(Continuare Tabelul 4.11)7D7S460, D7S809, D7S820*, D7S1517, D7S1520D7S8 (PM)8L1POT. LPL1. D8S306. D8S320. D8S323. D8S344. D8S347. D8S639, D8S1179*9D9S5210D10S8911TH01* rrcil), APOAIl, D11S554, UGBHBGG (PM)12VWA*. CD4. PLA2A1, D12S67, D12S391. D12S109013D13S308, D13S317*14D14S30615FF.S/FPS. CYAR04 (P450), Penta E16D16S539*, D16S53717D17S976D17S5, YNZ2218MBP, D18S51*, D18S535, D18S84919D19S253, D19S433LDLR (PM)20D20S85, D20S47021D21S11*. Penta D22XHPRTB. ARA, STRX1, DXYS156Amelogenin*YDYS19. DYS385. DYS389a. OYS389b DYS390. DYS391. DYS392. DYS393. DXYS156Amelogenin*mtDNAHV1, HV2Localizrile cromozomiale pentru principalii markeri ADN genotipai n scop de identificare (Date publicate de National Institute of Science and Technolgy (SUA) pe site-ul www.cstl.nist.gov/div831/strbase).* Loci inclui n sistemul 13 STR CODIS (Combined DNA Index System) al FBI.Grad nalt de polimorfism - variante structurale multiple ale unei secvene ADN denumit i locus ADN; tipuri de polimorfisme ADN: unilocus, multilocus, dialelic, hipervariabil etc.Independen - localizarea pe cromozomi distinci a markerilor ADN din setul de analizat.Grad nalt de heterozigozitate.Distribuie cunoscut a alelelor n populaie - echilibru de tip Hardy-Weinberg, validat prin studii de genetic populaional.Genotipare uoar - n sensul detectrii prin tehnici uzuale a tuturor alelelor specifice unui locus ADN.Rata sczut a mutaiilor - de regul n jurul valorii de 0,2 x 10"3.Minisateliii VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). Minisateliii de tip VNTR unilocus sunt caracterizai printr-un grad nalt de polimorfism i heterozigozitate, lucru care le confer o nalt putere discriminatorie n analizele de paternitate. n ciuda acestui fapt, utilizarea sistemelor de markeri VNTR unilocus este din ce n ce mai limitat datorit preciziei sczute cu care se pot identifica alelele i frecvenei relativ mari cu care se semnaleaz artefactele de amplificare de tipul amplificrii prefereniale - artefactele apar datorit tendinei de amplificare a alelelor mai scurte n defavoarea celor lungi, rezultatulfinal al analizei fiind prejudiciat prin absena unei variante alelice neamplificate corespunztor. n plus, markerii VNTR necesit pentru analiz cantiti crescute de material genetic - ntre 5 ng pn la 250 ng ADN per prob biologic. Tiparea locilor VNTR prin PCR a fost raportat doar pentru un numr limitat de loci avnd dimensiunea alelelor mai mic de 3 000 de perechi de baze.Se apreciaz c analiza a 3 sau 4 loci polimorfi de tip VNTR unilocus este de regul suficient pentru investigarea unei filiaii, ntruct ofer o orientare clar cu privire la cazurile de excludere i pot confirma paternitatea cu o probabilitate de 99%. ansa ca 2 indivizi nenrudii s aib aceeai combinaie de alele pentru 4 loci VNTR este apreciat statistic ca fiind de 1:1 milion. Pentru testarea paternitii se opteaz pentru seturi de loci VNTR unilocus situai pe cromozomi diferii, astfel nct ntre loci s nu existe asocieri, iar transmiterea alelelor s se fac independent, conform legilor mendeliene. Principalele caracteristici moleculare ale unui set de markeri VNTR unilocus utilizai pentru cercetarea paternitii sunt prezentate n tabelul de mai jos (tabelul 4.III):TABELUL 4.IIILocusVNTRLocalizarecromozomialLungimea unitii repetitive (pb)Nr.alelelorIntervalul de variaie a lungimii alelelorHeterozigozitate(%)D1S80Ip36-p351620398 - 71881ApoB2p24-p231514660 - 102077D17S517p 13,37013170 - 101085IgH14q5011370 - 87074D1S80 este unul dintre primii markerii VNTR utilizai n genetica judiciar. Unitile repetitive din structura D1S80 pot prezenta mici variaii n ce privete compoziia n nucleotide, purtnd numele de secvene degenerate. Aceste variaii pot fi sesizate de regul pe gelurile de electroforez, nefiind critice n detecia alelelor. Alelele frecvente n populaiile caucaziene sunt 18 i 24 - prezena lor ntr-un genotip scade puterea de discriminare pentru acest locus.ApoB este un marker localizat pe braul scurt al cromozomului 2 n vecintatea genei apolipoproteinei umane - gena prezint la cptui 3 o regiune coninnd tandemuri repetitive alctuite din 11-16 pb (Knott, 1986, citat de Poltl & colab.). Markerul este larg utilizat n testrile de genetic medical. Aplicaiile din genetica judiciar sunt mai limitate n prezent.Microsateliii STR (Short Tandem Repeats). Secvenele de ADN repetitiv de tip STR, spre deosebire de minisatelii, sunt de dimensiuni mult mai mici, lucru care le recomand pentru analiza PCR. Microsateliii de tip STR unilocus au un grad mai sczut de polimorfism i heterozigozitate, de unde rezult i informativitatea lor mai sczut. Dintre sutele de tipuri de STR identificate n genomul uman, pentru practica medico-legal sunt utilizate doar sistemele STR cu (1) localizare unic, (2) formate din tetra- i pentarepetiii, (3) potenial mare de discriminare, (4) minimum de artefacte genetice (microvariante) i (5) minimum de artefacte de amplificare (stutter bands sau shadow bands"). Se apreciaz c analiza combinat a 13 loci STR are putere discriminatorie foarte mare, stimat n raport de datele populaionale la 0,99999999 (Commisssion on DNA Forensic Science, National Research Council - Statistical Issues (1996). The Evaluation of Forensic DNA Evidence National Academy Press, Washington D.C., 125-166). Validarea paternitii se poate realiza prin investigarea unui set minim de 9-10 loci STR (tabelul 4.IV).Testele ADN n cercetarea filiaiei biologice5152GENETICA JUDICIAR50GENETICA JUDICIARCaracteristicile structurale de baz ale 9 loci de tip STR unilocus utilizai curent n cercetarea paternitii (preluat dup GenePrint STR Systems Silver Stain Detection Technical Manual- Promega)Locus STRLocalizarecromozomialIntervalul de variaie a lungimii alelelorLungimea unitii repetitive (pb)Nr. alelelorCSF1PO5q33.3-q34295-3274pb10THOl11 p 15.5179-2034pb7TPOX2p25.1-pter224-2524pb8F13A016p24.3-25.1283-3314pb13FESFPS15q25-qter222-2504pb8vWA12pl2-pter139-1674pb8D16S35916q24-qter264-3044pb9D7S8207ql 1.21q22215-2474pb9D13S31713q22-q31165-1974pb9HPRTBXq26259-3034pb12LPL8p22105-1334pb7F13B1 q31q32.1169-1894pb6Formularea concluziilor medico-legale n investigaiile ADN de filiaieRezultatele testrilor ADN conduc la confirmarea sau infirmarea unei relaii de descenden biologic cu un grad nalt de concluden.Confirmarea paternitii se face prin studiul comparativ al profilelor ADN aparinnd persoanelor testate, n care se urmrete dac au fost respectate legile clasice ale transmiterii caracterelor ereditare. Conform acestor legi, un individ motenete n proporii perfect egale material genetic de la genitorii si. Prin urmare, pentru un locus ADN, orice individ posed dou caractere genetice (alele, adic variante structurale ale secvenei de tip STR): una de origine matern (alela matern) i una de origine patern (alela patern). Atunci cnd ntr-o investigaie de paternitate, cu mama copilului prezumat ca fiind cert, profilul ADN al copilului evideniaz, pe lng alelele materne, o serie de alele ce se regsesc n profilul brbatului prezumat tat biologic, se poate vorbi de o confirmare a paternitii.TABELUL 4.1Vprofilul A a paternii prezumtiv de conch.tat biolpentru unse regse: paternitat Exc evidenia de prezu prezumii expert aiRExcare au Fcpentru : (regula Opuin 2 formula marker c o c profileRezultatul final al unei testri ADN care valideaz paternitatea brbatului investigat n calitate de prezumtiv tat biologic se exprim ntotdeauna n termeni de probabilitate.Rezultatele genotiprii tr/'o-ului (mam-copil-prezumtiv tat) sunt introduse n formula lui Bayes mpreun cu frecvena caracterelor genetice n populaia general (frecvena alelelor). Aplicarea formulei conduce la obinerea indicelui de paternitate i a probabilitii de paternitate (prezentarea n detaliu a principiilor i formulelor de calcul s-a fcut ntr-un alt capitol). Probabilitatea de paternitate reprezint n fapt opinia expertului formulat n termeni statistici cu privire la posibilitatea existenei unei relaii de nrudire biologic ntre copil i brbatul investigat.Cercetarea paternitii este posibil i n condiiile n care nu se cunoate profilul genetic al mamei. Analiza pornete tot de la premisa c un tat biologic transmite obligatoriu copilului jumtate dintre caracterele sale genetice. Dac pentru setul de markeri ADN investigat alelele copilului se regsesc ninvestinecon iar pentru s = 2, PI Mutaie = Hlocus/40 fRConcluzia n favoarea unei non-patemiti sau n favoarea unei paterniti, dar cu prezena mutaiilor de novo, este foarte dificil de luat, impunnd lrgirea investigaiilor pe loci suplimentari sau alte categorii de markeri ADN.O problem aparte n cadrul fenomenelor mutaionale o constituie alelele nule. Mutaiile nu survin n astfel de cazuri la nivelul markerului ADN, ci la nivelul situsurilor de legare a primerilor PCR. n consecin, alela corespunztoare situsului de legare mutant nu poate fi pus n eviden (definiie preluatTestele ADN n cercetarea filiaiei biologice5554GENETICA JUDICIARATestele ADN n cercetarea filiaiei biologice53dup Annual Report Summary for 1998 - Prepared for the Parentage Testing Standards Program Unit 1998). Dac se folosesc primeri ce ocolesc situsul de legare mutant sau tehnici de secveniere, alela nul--Profil heterozigotA2poate fi evideniat. Profilul aparent homozigot datorat unei alele nule se modific ntr-unul de tip heterozigot (fig. 4.2). n situaia unor alele nule, testele genetice de paternitate pot conduce la false concluzii de excludere de la paternitate. Existena unei alele nule este presupus atunci cnd pentru un singur locus din toat bateria investigat profilul homozigot al copilului nu are un corespondent n cel evideniat la brbatul testat.Profil aparent homozigotAlela nul (neevideniat)A2MwFig. 4.2. Reprezentarea schematic a mecanismului prin care sunt generate alele nule. Primenii de amplificare PC.R (>) nu se leag de secven datorit situsului mutant i nu genereaz alela corespunztoare.Problema pseudo-excluderilor n investigaiile de filiaieFenomenul pseudo-excluderilor a fost raportat pn n prezent n urmtoarele circumstane:rezultate fals pozitive prin limitarea investigaiilor, decizie motivat de indicii statistici. Pragul legal, conform cerinelor Comisiei de Testare a Paternitii din cadrul American Ass. of Blood Bank, de la care se poate formula o prezumie de paternitate, este pentru un Indice de Paternitate Combinat (CPI) de 100, respectiv pentru o probabilitate de Paternitate (PP) de 99%. Acest nivel de rezoluie a fost posibil de atins graie testelor genetice prin tehnica RFLP i PCR. Dac testarea se realizeaz pn la pragul de probabilitate impus de standardele de acreditare ale AABB de 99%, ansa unui rezultat fals pozitiv ester totui estimat la 2,3-2,6%. Dac ns pragul probabilitii de paternitate obinut prin testare se crete la 99,9%, atunci procentul rezultate fals pozitive scade ntre 0,7-1,3%. Problema acestui procent aparent foarte mic prognozat pentru rezultate fals pozitive se pune n special pentru situaiile n care se suspicioneaz c . un alt brbat, nrudit cu cel testat, este tatl biologic al copilului;rezultate fals negative datorate prezenei unor maladii genetice. Necunoaterea fenomenelor aberante de segregare mendelian poate conduce la concluzii eronate de non-patemitate. Fenomenul disomiei 16 uniparentale este un astfel de fenomen, cel mai frecvent din clasa disomiilor uniparentale. Disomia 16 const n prezena la un individ a doi cromozomi, ambii provenii numai de la unul dintre prini; individul prezentnd o disomie uniparental poate fi fenotipic normal, dar poate prezenta linii celulare trisomice (zigot trisomic, zigot cu mozaic di- i trisomic). Primul caz de pseudo-excluderes datorat fenomenului disomiei uniparentale 16 a fost raportat ntr-un caz la care testele au evideniat excluderea prezumtivului tat pe sistemul haptoglobinic i pe un locus ADN (D16S309/Hinf I), amndou situsurile de excludere fiind situate pe cromozomul 16 (Bein G. & colab. - Pseudo-exclusion frompaternity due to maternal uniparental disomy 16 1998, Int. J. Legal Med. 111: 328-330). Aprofundarea I investigaiilor pe nc ali 10 microsatelii i studierea setului de cromozomi prin cariotipare au diagnosticat I la copil fenomenul heterodisomiei 16 uniparentale de origine matern. Pentru toi markerii localizai la I nivelul cromozomului 16, copilul prezenta doar alelele de origine matern, cele de origine patern fiind I complet absente. Cazul a atras atenia asupra necesitii selectrii n testele de paternitate a unor seturi I de markeri polimorfi cuprinznd loci situai pe cromozomi distinci. Pornind de la acest caz s-a observat I c este necesar includerea n criteriile de formulare a unei concluzii de non-patenitate i criteriul de I discordan observat la loci situai pe cromozomi distinci; rezultate fals pozitive la pacienii transfuzai. Recomandarea general este ca orice testare I serologic s se fac dup cel puin 3 luni de la ultima transfuzie, pentru a se preveni potenialele erori I de serotipare. Contaminarea cu leucocite a preparatelor de snge nu trebuie neglijat nici n cazul I genotiprilor, mai ales c leucocitele sunt principala surs de ADN din snge. De aceea, n cazurile de I paternitate n care prezumtivul tat sau copilul au primit transfuzii cu diferite preparate de snge, se I recomand evidenierea profilelor ADN ale subiecilor investigai pornind de la prelevate tisulare, eantioane I de pr sau de saliv. Compararea acestor profile ADN, etichetate profile de referin, cu profilul ADN I sanguin poate trana i o eventual contaminare biologic pentru un individ transfuzat.Cazuri speciale de testare a paternitiiGemenii dizigoi rezultai prin superfecundare dipaternal. Fertilizarea simultan a dou ovule are ca rezultat dezvoltarea unei sarcini gemelare dizigote. Fenomenul, denumit i superfecundaie, se poate produce dup un eveniment copulator cu un singur partener (superfecundaie monopatemal) i, cu totul excepional, ca urmare a dou evenimente copulatorii cu parteneri diferii (superfecundaie dipaternal). n multe culturi ale lumii, dubla paternitate a gemenilor dizigoi a fost considerat un mit sau subiect fascinant de folclor pn la apariia testelor serologice, eritrocitare i HLA. n total, circa 30 de cazuri de acest gen au fost raportate n literatura medical, ns se apreciaz o cretere n viitor a acestor evenimente de fertilizare simultan mono- i heteropatemal datorit toleranei crescute a libertinajului sexual, utilizrii pe scar tot mai larg a tratamentelor de fertilizare cu medicamente inductoare ale ovulaiei i a procedeelor de fertilizare in vitro cu sperm de la mai muli donatori. Rata general a heteropatemitii gemenilor dizigoi este estimat la circa 2,36%, adic 1 pereche din 40 de gemeni dizigoi, ns se apreciaz c investigaiile ADN vor permite o evaluare mai exact a fenomenului superfecundaiei dipatemale. ntr-un caz recent, testele pe un set de markeri STR autozomali i cromozomiali Y au reuit s traneze cu o probabilitate de 99,999957% paternitatea unor gemeni dizigoi de sex masculin rezultai prin superfecundare accidental dipaternal, n timp ce testele serologice extinse i cele RFLP s-au dovedit echivoce.Organismele himer. Himerismul sanguin este un fenomen rar ntlnit la specia uman, ns necunoaterea sa poate conduce la interpretarea eronat a unor investigaii de laborator. Exist un himerism sanguin artificial, de tip tranzitoriu, rezultat n urma transplantelor de mduv alogen, i un himerism spontan, de tip permanent, consecutiv anastomozelor sanguine intrauterine stabilite ntre gemenii plurizigoi. La indivizii cu himerism sanguin spontan pot fi puse n eviden n snge mai multe populaii de celule derivate din dou sau mai multe linii de celule-ou distincte. Himerismul sanguin spontan a fost pentru prima oar identificat la donatorii de snge, cnd prin teste serologice uzuale s-au detectat mixturi de dou sau mai multe tipuri de celule sanguine. Spre deosebire de investigaiile serologice, testele genetice pot identifica la organismele himere liniile celulare germinale, de liniile celulare grefate i pot, de asemenea, distinge o himer de un mozaic celular - rezultat prin erorile mitotice sau mutaiile unei liniide celulare zigotice unice. Pentru indivizii prezentnd himerism sanguin, genotipul original se stabilete investignd oricare tip de prob biologic a subiectului, exceptnd prelevatele de snge. Genotiparea comparativ a gemenilor sau tripleilor himerici i a genitorilor acestora permite stabilirea cu exactitate a constelaiilor alelice normale i himerice n astfel de cazuri.Testarea in tero a paternitii dup o agresiune sexual declarat. Toate statele lumii au legi care aprob ntreruperea cursului unei sarcini dac aceasta este consecina unei agresiuni sexuale. n acelai timp, nici o legislaie nu face referiri la legalitatea unei decizii de ntrerupere a unei sarcini acolo unde femeia este cea care agreeaz relaiile cu mai muli parteneri. Diagnosticul prenatal al paternitii prin tiparea ADN poate rezolva la ora actual problemele pe care le ridic o sarcin nedorit, consecina unei agresiuni sexuale propriu-zise sau a unei relaii extraconjugale etichetate ns drept agresiune sexual. Ins o investigare prenatal a paternitii dup pretinse agresiuni sexuale ridic probleme de etic medical i genereaz i conflicte de ordin legal (divor, violene intrafamiliale, infanticid etc.). n plus, testarea paternitii pe probe de lichid amniotic ridic problema riscurilor medicale binecunoscute ale amniocentezei; din cauza acestor riscuri, cei mai muli medici prefer s nu recurg la aceast manevr dect n caz de necesitate (diagnostic al unor maladii genetice cu risc malformativ). Este deci preferabil ca, n cazurile n care sarcina nedorit nu este rezultatul unei reale agresiuni sexuale, s se temporizeze testarea dup ; naterea copilului, asumarea riscurilor unei amniocenteze nefind justificat de solicitarea femeii nici etic i nici legal. Pentru considerentele enunate mai sus, medicii recomand ca etapa de diagnostic prenatal al paternitii s fe precedat obligatoriu de o etap clinic, de sfat genetic i consult medico-legal. Medicii care s-au ocupat de studiul unor astfel de cazuri au raportat o serie de trsturi clinice medico-legale sugestive pentru identificarea unor false acuze de viol:declararea tardiv a agresiunii sexuale - cu o ntrziere de circa 6 zile de la data evenimentului;declararea agresiunii doar la medic, rareori i la poliie (1 caz din 10);relatarea de ctre victim a unor evenimente neplcute legate de relaiile cu partenerul de via.n funcie de decizia femeii de a avorta sau nu, materialul fetal poate fi examinat fe prin prelevareI in tero prin amniocentez, fie dup vid-extracie. Profilul obinut din materialul fetal sau mixturi de . material fetal cu esuturi placentare este ulterior comparat cu profilul matern i al prezumtivului tat biologic. Sistemele de markeri unilocus STR sunt deosebit de performante pentru formularea unei concluzii de paternitate sau non-patemitate chiar n cazul mixturilor biologice matemo-fetale.Testarea paternitii legat de o serie de maladii genetice. Genotiparea ADN cu ajutorul markerilor STR-PCR autozomali i gonozomali este un instrument valoros de diagnostic pentru excluderea sau confirmarea unei relaii incestuoase suspectate a fi cauza unei maladii genetice. Incestul este, din nefericire, o problem social nu tocmai rar ntlnit n lume. Este bine tiut c incestul poate genera maladii genetice grave. Acest lucru este mai evident pentru bolile genetice cu inciden rar, dar poate fi ilustrativ i pentru o serie de maladii genetice mai frecvente n populaie. Genetica medical i cea medico-legal se intersecteaz n astfel de investigaii pentru a rezolva aceste cazuri speciale, ce necesit o abordare clinic i de laborator complex. Clinicianul genetician poate diagnostica o afeciune punnd-o n legtur 1 cauzal cu o posibil cosanguinizare incestuoas, dup cum medicul legist poate ndruma ctre investigaii I complexe de genetic medical subiecii testai pentru relaii incestuoase. Pentru exemplificare, citm cazul unui sindrom ATR-X (a-talasemie cu retard mintal sever X-linkat) diagnosticat clinic i confirmat [ paraclinic prin studiul incluziunilor de hemoglobin H n eritrocite i prin detectarea mutaiei n gena XH2 (Xql3.3), la un nou-nscut de sex masculin, presupus a fi rezultatul unei relaii incestuoase ntre o adolescent i bunicul su matern. Cercetarea relaiilor de filiaie biologic a fost complex, efectundu-se prin genotiparea a 13 loci STR autozomali i a 5 loci STR specifici cromozomului Y. Rezultatul a confirmat relaia de filiaie incestuoas cu o probabilitate de 99,99%, ns a exclus cosanguinitatea drept cauz a transmiterii maladiei genetice n acest caz.58GENETICA JUDICIAR56GENETICA JUDICIARTehnologiile automate n testarea ADN a paternitii. Cellmark Diagnostics, cel mai mare laborator de testare a paternitii din Europa, aparinnd companiei AstraZeneca, a validat n 1998, n cadrul unui proiect intitulat STRident, un sistem complet automatizat pentru investigarea filiaiei, care are capacitatea de a analiza 360 de probe de ADN pe zi, echivalentul a 120 de cazuri de paternitate formate din trio-ul clasic mam-copil-tat. Prelucrarea probelor se face complet automat, ncepnd de la prelevarea probelor din eantioane, extracie, PCR, secveniere automat, i pn la citirea i interpretarea statistic a rezultatelor. Realizatorii proiectului recunosc ns c tehnologia STR nu este suficient pentru investigarea unor cazuri de descenden biologic mai complexe. Performana celor de la Cellmark Diagnostics pare oarecum incredibil i, pn n prezent, nu a fost egalat de nici un alt laborator din lume. Proiectul are printre avantaje i capacitatea de a construi ntr-un timp extrem de scurt o baz de date ADN.Investigarea medico-legal a paternitii - Quo vadisLegislaiile din ntreaga lume stipuleaz c este n interesul copilului s i cunoasc tatl biologic. Cu toate acestea, tocmai acest drept fundamental al copilului este grav nclcat astzi de accesul nengrdit i extrem de facil la testele ADN, efectuate uneori n condiii de legitimitate incert. Experii n genetic judiciar i pun pe drept cuvnt problema implicaiilor legale ale acestui fenomen. n timp ce, pentru investigaiile de filiaie solicitate prin instan, completul de judecat informeaz prile asupra consecinelor juridice ce decurg dintr-o astfel de testare, stabilete custodia copilului i verific calificarea i acreditarea experilor n genetic medico-legal, pentru investigaiile la cerere i efectuate n laboratoare private, numai analistul este responsabil de rezultatele testrii sale. Urmare a costului destul de ridicat al expertizelor oficiale i a modificrilor legislative operate de mai multe ri ale Europei de Vest, menite s faciliteze stabilirea paternitii n afara instanelor de judecat (dar care sunt deosebit de restrictive n alte domenii, precum: adopiile, mamele surogat, protecia embrionului) - s-a dezvoltat o arie cenuie a investigaiilor genetice de filiaie, localizat predilect n sistemul privat. Cuplurile trimit frecvent prin pot mostre de fluid amniotic i saliv n laboratoare private pentru astfel de testri la limita legalitii.Testarea prenatal a paternitii nu este ilegal n prezent nicieri n lume, dar Organizaia Mondial a Sntii, la iniiativa Societii Germane de Genetic Uman, a propus n 1997 un moratorium care recomand exercitarea unui auto-control i o triere atent a cazurilor de acest gen, pentru a nu se lsa loc abuzurilor. Germania, ara cu cea mai ndelungat tradiie din lume n ce privete testrile de paternitate, atrage astfel atenia comunitii tiinifice internaionale asupra testrilor ilegale cu implicaii juridice evidente. n Statele Unite, AABB a luat de asemenea atitudine mpotriva proliferrii testrilor la limita legalitii. Documentul referitor la Standardele pentru Laboratoarele de Testare a Paternitii din 1998 reglementeaz strict condiiile de efectuare a paternitii, condiionndu-le de obinerea consimmntului scris al fiecrei persoane testate, indiferent dac metoda de prelevare este invaziv sau nu. Consimmntul scris poate fi direct sau indirect, prin nscris oficial sau prin intermediul printelui sau tutorelui legal n custodia cruia se afl un minor sau o persoan cu discernmntul abolit. Dac prinii au n comun custodia copilului; atunci ambii sunt obligai c trebuie s consimt n scris la prelevarea de probe biologice. n caz contrar, prelevarea se consider ilegal i aductoare de prejudiciu persoanei n cauz. Documentul mai precizeaz c principiul confidenialitii rezultatelor trebuie respectat cu strictee de ctre expert, deoarece informaii cu privire la paternitate sau alte tipuri de nrudiri pot fi speculate de rude i de anturaj pentru revendicarea unor drepturi materiale etc.n prezent, tehnicile de investigaie genetic permit stabilirea celor mai diverse relaii de nrudire biologic pornind de la cele mai diverse tipuri de probe biologice. Performanele de ordin tehnic i tiinifice nu sunt aplicate ns de expertul n genetic judiciar dect n contextul strict al reglementrilor legale i al unei etici profesionale fr cusur.CAPITOLUL 5'Tehnicile, metodele de prelevare a probelor de la locul fapteii utilizarea tehnologiei ADN n criminalistic i medicina legalInvestigarea locului infraciunii. Locul infraciunii este cel a crui examinare competent poate permite identificarea suspecilor i a victimelor, probeaz sau nltur alibiurile, modul cum a fost svrit fapta, descoper corpurile delicte, stabilete legturile sau asocierile dintre victim i suspect. Pentru rezolvarea tuturor acestor complexe aspecte, trebuie avute n vedere anumite standarde, n special cele legate de modul de colectare i conservare al probelor, pn la sfritul cercetrilor i stabilirea concluziilor. Cu ct sunt mai judicios respectate aceste standarde, cu att sunt mai mari ansele unei rezolvri corecte a cazului.Dei sursa rezolvrii corecte este dat de examinarea victimei, a suspectului, a locului infraciunii i a probelor, uneori cazul poate fi rezolvat chiar n absena acestor 4 elemente, spre exemplu prin analiza amprentelor digitale, a mrcilor mucate sau a unor urme de material biologic (pete de snge, saliv, sperm) prin teste ADN. De ajutor pot fi uneori i investigaiile prezentate n mass-media i antrenarea interesului public n caz.Exist o anume succesiune a grijii pe care trebuie s o aib cel ce asigur calitatea activitii la locul faptei:izolarea locului faptei (cteodat dificil n primele momente), rolul poliiei fiind acela de a stabili ce persoane au acces aici, adic numai al acelora care pot aduce reale contribuii la elucidarea cazului;cutarea materialelor care au evident valoare pentru anchet, prin localizarea exact a acestora;colectarea, mpachetarea i etichetarea materialelor de prob, asigurndu-se ajungerea acestora ct mai rapid la laborator;depozitarea i transmiterea la laborator s se fac n cele mai bune condiii (inclusiv prin refrigerare).Odat ajunse la laborator, responsabilitatea se transfer omului de tiin; acesta va avea n primulrnd n vedere:prevenirea oricrei contaminri, mai ales a probelor cu cantiti mici de material;criminalistul trebuie s fie capabil s demonstreze c prin procedurile cercetrii a prevenit contactulIa dou surse de probe;- securitatea probelor trebuie asigurat notndu-se numele oricrei persoane care a putut avea contact cu proba;- oricare etap a cercetrii trebuie documentat, facndu-se referire la procedurile i operaiunile > standard.Metodele standard trebuie astfel scrise i prezentate nct s corespund diferitelor proceduri specifice probelor examinate.La locul faptei, evidenierea urmelor este acceptat n medicina legal i criminalistic drept o preocupare primordial. Este de reinut c, cel mai adesea, aceste urme sunt greu evideniate, dar principiul atribuit lui Edmund Locard, conform cruia cel ce comite o crim las n mod obligatoriu ceva la locul faptei care nu se gsea nainte de comiterea ei, pe de o parte, iar, pe de alta, preia pe corpul su ceva din acel loc care nu se gsea pe el, rmne o dogm a crei valoare este unanim acceptat i azi ncriminalistic. Urmele lsate de fptuitor la locul crimei se pot gsi pe diferite suporturi, iar cercetarea I corpului i hainelor fptuitorului sau suspecilor poate descoperi elemente materiale caracteristice i I prezente numai n locul nfptuirii infraciunii. Inutil s mai insistm asupra faptului c metodele de I descoperire a acestor urme s-au amplificat i mbuntit n pas cu descoperirile tiinifice, odat cu I creterea abilitii expertului de a le cuta. Numai un expert bine pregtit poate stabili din multitudinea I de materiale pe care le are la dispoziie n cercetarea locului faptei dac i ct de extins poate fi I cercetarea pentru fiecare din variatele tipuri de materiale suport al urmelor, ct de mare poate fi perspectiva I de valorificare a fiecrei urme, iar ntreag aceast munc i, mai ales, reuita ei, n cazul n spe, I presupun o mare experien de specialitate.Probele biologice cele mai obinuite sunt sngele, sperma, saliva, urina, fecalele, voma, resturile de I esuturi, pr, oase sau dini; nmulirea germenilor bacterieni pe aceste probe diminueaz ansele unor I rezultate corecte. Pstrarea dup prelevare a acestor probe se va face n anvelope vidate, ferite de I contaminarea cu alte probe, acest ultim aspect realizndu-se prin prelevri cu instrumente separate (pensete, I bisturie, pipete etc.). Respectarea cu strictee a acestor msuri va crete sensibilitatea i valoarea tiprii I ADN, inndu-se cont c n special ADN mitocondrial este n mod particular compromis prin nerespectarea standardelor amintite. Cu ct cantitile de material biologic sunt mai mici, cu att fiabilitatea probelor I este mai mic. Este de neles c cel care realizeaz prelevrile va purta mnui i masc, spre a se evita 1 contaminrile.Sngele, care reprezint cea mai obinuit prob biologic, se recolteaz uscat, n tifon sterilizat, dar, n cazurile cnd este lichid, se pipeteaz, se introduce n eprubete sterile cu EDTA i este refrigerat n condiii de vid.Este de reinut c, uneori, materialul biologic este n cantitate att de mic, nct nu poate fi detectat dect miroscopic, condiii n care locul prelevrii trebuie extrem de atent reinut, n vederea prelevrii ulterioare de contraprobe.Odat recunoscut proba biologic, izolat i ferit de orice contaminare, se face o descriere corect a locului unde a fost identificat, folosindu-se de regul fotografia i msurtorile.Urmtoarea etap este recoltarea i conservarea, etap care difer dup natura probei (biologic, chimic, fizic). Va urma identificarea naturii probei respective, n general prin metode de laborator (microscopic, analiza chimic etc.). Este de asemenea necesar descrierea obiectului de pe care a fost prelevat proba, caracteristicile acesteia facndu-se prin compararea cu obiecte asemntoare.Locul infraciunii trebuie protejat de poteniale substane periculoase, cum ar fi expunerea la radiaii, substane chimice, contaminare biologic (n special microbian) sau explozii (cum se ntmpl n catastrofe). Se va avea n vedere c nsui materialul de marcaj al probelor le poate altera.Marcajul locului de prelevare a probelor este o etap important n identificare i prelevri ulterioare. Marcajul presupune precizarea datei i orei n care a avut loc prelevarea, locul de prelevare i iniialele celui care a efectuat aceast manoper. Se folosesc etichete standardizate.Toate aceste msuri presupun un personal extrem de bine instruit, criminaliti profesioniti. Aceste msuri trebuie avute n vedere i la transportul probelor ctre laboratoarele specializate.n condiiile de nalt tehnologie actual, locul infraciunii este investigat i prin metode electronice i baze de date computerizate.Apare deci limpede c numai respectarea acestor reguli simple i nalt standardizate de cercetare a locului infraciunii poate cpta o real valoare probatorie n instan, cu alte cuvinte demonstraia c proba prezentat este cea recoltat de la locul faptei.acestor bine pu urmtoa n-pentru-3absorbaNprelevacomparntotde.PiPtrece d se va judicia n gene s fie j avea d va fi p prime prelevi saliv Iidentif mental| se aflaeste d< colectisecuri: i prii acetii chimiiCantitatea de material ce poate fi prelevat depinde de natura suportului, iar timpul n care urmele biologice rmn pe suport variaz n funcie de natura acestora. Oricum, primordial este descoperirea59n, iar cercetarea caracteristice i c metodele de tifice, odat cu din multitudinea extins poate fi ite fi perspectiva cazul n spe,>ma, resturile de z ansele unor 'idate, ferite de parate (pensete, valoarea tiprii in nerespectarea ilitatea probelor spre a se evitatifon sterilizat, i este refrigerattoate fi detectat ierea prelevriisscriere corectbei (biologic, e de laborator pe care a fost toare.erea la radiaii, se ntmpl n ;ra.vri ulterioare, ire i iniialeleioniti. Aceste)de electronicee de cercetare cmonstraia cin care urmele i descoperireaTehnicile, metodele de prelevare a probelor de la locul faptei i utilizarea tehnologiei ADNacestor urme care, de cele mai multe ori, nu sunt vizibile cu ochiul liber. Exist n criminalistic tehnici bine puse la punct, prin care se ncearc recuperarea urmelor materiale de pe diferite suporturi, etapa urmtoare fiind, bineneles, stabilirea surselor de origine a acestora, fie prin identificare, fie prin excludere.n criminalistic, recuperarea urmelor materiale are la baz urmtoarele metode:scuturarea suportului deasupra unor recipiente curate;periajul, utilizat cnd scuturarea nu este eficient; acoperirea suportului cu un material lipicios;aplicrile vacuumatice;splarea cu tampoane ude, utilizat n prelevarea multor urme biologice (snge, sperm), mai ales pentru tiparea ADN;unele suporturi pot fi ridicate i cu mna (cu mnui);dizolvarea urmelor cu solveni i extragere ulterioar;aspirarea cu pipeta n cazul unor urme lichide bine vizibile sau absorbirea acestora cu material absorbant.Nu intrm aici n detalii de ordin criminalistic privind variatele metode de stabilire a naturii urmelor prelevate. Odat identificate, recuperate i analizate aceste urme, se poate trece la etapa urmtoare, de comparare, care poate duce la identificarea sau excluderea sursei. n privina ADN i nu numai, se au ntotdeauna n vedere posibilitile de contaminare.Pentru a avea valoare n justiie, trebuie ndeplinite mai multe condiii:munca s fi fost efectuat ntr-un laborator criminalistic acreditat, iar expertul s fie calificat;expertul s aib cunotin de toate circumstanele cazului;activitatea s nu fie umbrit de lipsa fondurilor.Prima precauie care se impune const n nconjurarea locului faptei cu o centur prin care nu pot trece dect persoanele avizate. Aceast zon reprezint un perimetru de securitate, n interiorul cruia nu se va gsi nici o alt persoan n afara celor nsrcinate cu prelevarea probelor, precum i autoritatea judiciar creia i este ncredinat rezolvarea cazului; toate aceste persoane vor purta inute de protecie, n general sunt folosite salopete de unic folosin cu fermoar, astfel nct orice mbrcminte de dedesubt s fie perfect acoperit; deasupra nclmintei se folosesc cizme uoare din material plastic, ceea ce va avea drept efect imposibilitatea de a aduce n perimetrul de securitate materii strine. O calot special va fi purtat spre a se evita eventuale fire de pr ce pot cdea de pe capul lucrtorului. Deasupra unei prime perechi de mnui se adaug o alt pereche din folie plastifiat; acestea se schimb dup fiecare prelevare; n sfrit, masca aplicat pe figur este indispensabil spre a evita picturi de transpiraie, saliv sau alte secreii.La locul infraciunii, un rol important l au martorii. Astfel, la locul comiterii unei omucideri pot fi identificate persoane care au vzut ultima oar victima, eventuale probleme medicale ale acesteia, starea sa mental. Persoana care a descoperit prima victima poate face o descriere a locului i poziiei n care aceasta se afla, dac mai era sau nu n via. Rudele victimei pot fi uneori martori importani n caz.n cazurile de omucidere, corpul victimei este cea mai important pies a cazului. Examenul acesteia este de competena medicului legist, dar acesta va colabora cu criminalistul n multe privine (fotografii, colectare de probe etc.).Activitile la locul faptei n caz de crim depind de felul morii. Scena crimei este mai nti j securizat nainte de sosirea criminalistului i a medicului legist, de ctre ofieri de poliie, care culeg i primele informaii ce vor fi furnizate anchetatorilor, criminalitilor i medicilor legiti. nainte ca acetia s-i nceap activitatea, locul faptei trebuie ferit i de posibile pericole (explozii, substane chimice, gaze toxice, prbuire de cldiri etc.).Tehnicile, metodele de prelevare a probelor de la locul faptei i utilizarea tehnologiei ADN61Tehnicile, metodele de prelevare a probelor de la locul faptei i utilizarea tehnologiei ADN6160GENETICA JUDICIARFotografia locului faptei, a poziiei corpului victimei, evitarea contaminrilor prin purtarea de ctre anchetatori a mtilor, costume de protecie, mnui i nclminte sunt msuri comune i cunoscute n astfel de cazuri, indiferent c este vorba de omucidere, accident sau moarte neviolent. Acestea vor fi pstrate i dup terminarea examinrii, pentru cercetri ulterioare.Fiecare investigare a locului faptei depinde de felul morii i de ali numeroi factori, neexistnd dou investigaii identice. Micarea corpului victimei trebuie astfel fcut nct s nu fie distruse urmele sau s se contamineze probele.Cu privire la mediul n care o crim poate fi comis, este de reinut c multe din aceste fapte se petrec n jurul sau chiar n mediu acvatic; s-a dezvoltat chiar specialitatea criminalistic de investigator n mediul acvatic. De fapt, problemele tehnice apar cnd este vorba de a extrage corpurile delicte sau cadavrele din ap. Prima problem ce se pune este aceea de a localiza zona n care astfel de corpuri se gsesc n ap. Reconstrucia corpurilor umane impune colaborarea cu antropologul. Fotografiile subacvatice n crime capt o mare importan.Alte mprejurri de producere a morii sunt utilizarea diferitelor arme de foc, existnd criminaliti specializai n acest sens. De asemenea, s nu uitm decesele prin accidente rutiere sau aviatice.Criminalitii disting n cercetarea locului crimei o arie primar i o arie secundar. Spre exemplu, dac victima este n mijlocul unei camere, camera reprezint aria primar, tot ce se afl n jurul acestei camere fiind considerat aria (zona) secundar. Victima nsi poate fi considerat corp delict i felul cum corpul este ridicat, mpachetat i transportat este identic ca regul ce trebuie respectat cu acelea ce se refer la orice corp delict.Corpurile extrase din ap trebuie considerate ca fiind, din punct de vedere al tiprii genetice, contaminate. Spaiul limitat n care se afl victima unui accident rutier ngreuneaz cercetrile. Probleme complicate ridic gsirea resturilor unor corpuri de victime n diferite stadii de putrefacie (uneori numai oase) dup diferite perioade de timp de la deces, n locuri ascunse, fie n cldiri sau, mai ales, n mediul natural. Condiiile de mediu n care aceste corpuri sunt descoperite trebuie atent studiate cnd se discut despre posibile contaminri n cadrul tiprii ADN. Spre exemplu, n funcie de mediu, prile corpului victimei pot fi consumate de vieuitoare din ap, iar pe uscat de diferite animale, aspect foarte important n cazul tiprii ADN.Evident c prima problem care se pune pentru criminalist este de a se preciza dac decesul a survenit acolo unde s-a descoperit cadavrul, iar dac nu, unde?Tehnologiile recente folosite n managementul locului unde s-a produs o crim constau n folosirea bazelor de date - inclusiv cele referitoare la ADN.Este evident c cercetrile criminalistice avanseaz din punct de vedere tiinific extrem de rapid, iar rspunsul la ntrebrile: cum s observi probele, prioritile, ridicarea i transportul acestora, au cele mai mari anse de rezolvare corect dac criminalistul i medicul legist particip mpreun de la nceput la cercetarea locului faptei.Trebuie inut cont c locul faptei sau scena crimei nu reprezint un spectacol unde s miune ziaritii sau tot felul de curioi. Chiar ptrunderea autoritilor judiciare i administrative n perimetrul cercetat este extrem de limitat, atta timp ct au loc prelevrile, iar aceste persoane vor respecta regulile expuse. Medicul legist care ptrunde n perimetru va avea aceeai inut adecvat, ndeplinindu-i misiunea specific (constatarea morii, cauzele posibile, data morii i semnele de violen) sub supravegherea i n limitele admise de criminalist.n activitatea sa, tehnicianul criminalist se servete de instrumentar steril, de unic folosin. Toate probele vor fi nregistrate i filmate. Ele vor fi plasate n locuri precizate, dat fiind posibilitatea ordonrii unei reconstituiri.Pentru prelevrile medico-legale, trebuie s existe o trus special cu tot ce este necesar pentru o prelevare corect (pense sterile, lame i eprubete pentru prelevri sanguine cu EDTA).ea de ctre anoscute n jstea vor fneexistnd ruse urmeleste fapte se investigator delicte sau e corpuri se subacvaticecriminalitidatice.are exemplu, jurul acestei lelict i felul at cu aceleatice, contami- ne complicate ) dup diferite Condiiile de le contaminri 2 de vieuitoareiac decesul aau n folosireatrem de rapid, estora, au cele de la ncepute s miune [n perimetrul aecta regulile u-i misiunea ravegherea ifolosin. Toate litatea ordonriilecesar pentru oTehnicianul criminalist nu trebuie s aib idei preconcepute i s se abin de la orice comentariu. Orice urm va fi atent identificat i descris (sarcin ce intr i n preocuprile medicului legist), nu trebuie date verdicte (spre exemplu: iat o pat de snge), ntreaga activitate la locul faptei putnd dura ore ntregi de munc.Tehnicile de prelevare vor avea la baz norme foarte stricte, utilizndu-se numai material steril, principalul scop fiind evitarea contaminrilor; am amintit c mnuile vor fi schimbate dup fiecare prelevare. Se va ncerca ca prelevarea materialului s se fac mpreun cu suportul su, dup ce a fost descris din punct de vedere al formei, aspectului, culorii i mirosului.Utilizarea profilului ADN n medicina legal i n justiie const n a demonstra c la o serie de locus-uri VNTR profilul suspectului se potrivete cu ADN-ul obinut de la locul comiterii infraciunii. Utilizarea profilului ADN se extinde asupra urmtoarelor domenii:expertiza filiaiei (tehnica se bazeaz pe faptul c alelele fiecrui locus minisatelit sunt motenite independent dup sistemul mendelian, astfel nct, pe o pereche de cromozmi omologi pentru acelai locus, VNTR-ul provenit de la mam este diferit de VNTR-ul provenit de la tat, ceea ce permite nu numai identificarea individului, dar i a prinilor si). n plus, tehnica VNTR-PCR ofer posibilitatea de colorare a benzilor de origine matern fa de cele paterne dintr-o pereche de benzi i uurina identificrii fragmentelor caracteristice,stabilirea identitii urmelor biologice (snge, secreie vaginal, sperm, pr etc,),identificarea speciei pentru diferenierea originii umane sau animale,identificarea eantioanelor de snge prelevat pentru alcoolemie,identificarea resturilor scheletice,identificarea resturilor cadaverice ale victimelor catastrofelor,confirmarea sau infirmarea vinoviei n delicte sexuale,confirmarea sau infirmarea vinoviei n omucideri,redeschiderea unor cazuri nesoluionate sau verificarea unor condamnri eronate,constituirea unor bnci de date cu amprenta genetic a delicvenilor.Ca urmare a progreselor nregistrate de biologia molecular, prelevrile pentru cercetarea criminalistic au cptat o importan primordial. Se va avea n vedere c orice persoan care a ptruns neprotejat n perimetrul cercetat poate depune pe obiectele pe care le atinge celule epiteliale, care, identificate prin mijloacele genetice medico-legale, pot falsifica datele anchetei. n msura posibilului, prelevatul va fi ridicat odat cu suportul su i transportat imediat (protejat) n laborator. Se tie c expunerea la soare (raze UV), cldur sau umiditate poate denatura proba ADN. Transportul se face n containere sigilate i n general conservarea se face la o temperatur ce coboar lent pn la 4C, dar, dac se impune o conservare mai ndelungat, temperatura va fi de -20C. Suporturile umede se cer uneori a fi uscate.Respectarea regulilor expuse va asigura fiabilitatea rezultatelor pe care laboratoarele de specialitate le vor furniza organelor judiciare.Materialele care servesc la identificare prin aplicarea tehnologiei ADN sunt urmtoarele:snge prelevat de la persoane sau cadavre; se preleveaz 5-10 ml snge n tuburi de plastic pe EDTA, iar adaos de heparin, conservat la 4C, transportul putndu-se face la ghea (fr congelare) sau chiar la temperatura ambiant (n funcie de vechimea petei); 1 ml snge conine 30 micrograme ADN (hematiile neavnd nucleu, cantitatea de ADN este mai mic), fiind necesari circa 20 microlitri snge pentm sondele multilocus i cantiti mai mici pentru sondele monolocus; probele de snge prezint dezavantajul c nu sunt omogene, cheagul fiind mai bogat n ADN;secreia vaginal se recolteaz n trei probe, n tuburi de plastic care se pstreaz la loc uscat; se va avea n vedere c secreia vaginal supus expertizei este de regul amestecat cu sperm, precum iTehnicile, metodele de prelevare a probelor de la locul faptei i utilizarea tehnologiei ADN6364GENETICA JUDICIAR62GENETICA JUDICIARfaptul c, n timp, devine dificil identificarea chiar i prin sistemul ABO; separarea spermei de secreia I vaginal se face tot prin incubarea eantionului n soluie SDS/proteaz K, enzima avnd proprietatea de I a liza celulele vaginale, care sunt mai fragile, dar nu afecteaz nucleii spermiilor datorit marelui lui I coninut n legturi S-S. Punile S-S din nucleul spermiilor pot fi disociate cu dithiotreitol, dup care I urmeaz centrifugarea; n interpretarea rezultatelor trebuie avute n vedere eventualele cazuri de azoospermie I sau de viol neurmat de ejaculare; trei microlitri de sperm conin circa 0,5 micrograme ADN (cantitate I suficient dac se utilizeaz sonde multilocus); sondele unilocus pot fi folosite cu succes i pentru! identificarea mai multor participani la viol, lucrndu-se pe cantiti de circa 200-500 ng ADN;petele de snge sau sperm trebuie s aib diametrul de cel puin 0,5-1 cm; probele se pstreaz I la loc uscat;firele de pr se recolteaz cel puin 10-20 de fire cu rdcin, urmnd a fi ambalate n plastic I i inute la uscat;fragmentele de organe (piele, muchi, os, viscere, provenind chiar de la cadavre combustionate) I conin ADN, care, n astfel de condiii, este supus degradrii datorit condiiilor de mediu (umiditate, I temperatur crescut) care favorizeaz nmulirea bacteriilor i, astfel, accelerarea autolizei i putrefaciei; I sub aciunea exo- i endonucleazelor se produce hidroliza atipic a ADN-ului, rezultnd fragmente de I lungimi variabile, susceptibile de a constitui surse de eroare n interpretarea rezultatelor. Utilizarea sondei I 33,15 a evideniat o scdere pn la dispariie a fragmentelor lungi de ADN 15-25 kb, dar nu s-au pus I totui n eviden benzi care s duc la concluzii eronate; oricum, n probele supuse aciunii factorilor I de mediu, cantitatea de ADN scade; astfel, degradarea ADN-ului (ca i a altor fragmente tisulare) este I condiionat n mai mic msur de timpul scurs de la deces (dovad este obinerea de fragmente ADN I de 3,4 kb de la mumiile egiptene, de la creier, vechi de 7 000 de ani, i de la oase, de o vechime de pn I la 5 000 de ani); n cazul unor persoane disprute, probele prelevate de la cadavru pot fi comparate cu I acelea provenite de la membrii familiei, avnd n vedere transmiterea mendelian a caracterelor (amprentelor I ADN); referitor la conservarea ADN n funcie de organul din care se execut prelevarea, s-a artat c I durata cea mai scurt de conservare post-mortem este n ficat (24-36 de ore) datorit bogiei n ap i I enzime; din splin i glanda tiroid s-a putut recolta ADN n condiii satisfctoare dup cinci zile, din I scoara cerebral, ganglionii limfatici i muchiul psoas dup trei sptmni, iar din snge pn la patru I ani; din organe se preleveaz fragmente cubice de circa 2-3 cm3, n flacoane de plastic (fr adaos de I formol), evitnd pe ct posibil zonele putrefiate; conservarea se face la 40C; ADN-ul se gsete n I cantitate mai mare n oasele spongioase (pentru testare sunt necesare 10 mg de esut osos spongios) dect I n osul compact; aplicarea metodei amprentei genetice pe oase a dus la creterea unui nou capitol n I identificare (arheologia molecular); cele mai bune rezultate n identificarea pe oase s-au obinut prin I testarea ADN mitocondrial;unghii, saliv, sput i chiar urin;pulpa dentar din care se extrage ADN-ul cu greutate molecular convenabil, chiar de la dinii I care au fost supui unor factori de mediu extrem de defavorabili pentru conservarea materialului biologic.La fragmentele prelevate de la cadavre combustionate, s-au identificat n mod frecvent fragmente I (GTG)5 i mai rar (GaACA)4 i (GATA)4. Aceste fragmente sunt consecina denaturrii ADN la temperaturi I ridicate. Alteori, inexplicabil, s-a constatat prezena unor situs-uri care au necesitat cantiti foarte mari I de enzime pentru digestie.nespemunqactiviaceeade indosaiva trproc-A nucleotide. Aceste diferene sunt n general mai mari pentru afro-americani (14,1), africani (13,1) i japonezi (9,97) i mai puin importante pentru caucazieni: basci (3,15), nord-italieni (3,77), sardinieni (4,22), toscani (5,03), francezi (8,38) sau britanici (8,48). Datele din literatura de specialitate sugereaz c, pentru europenii caucazieni, analiza combinat a regiunilor HV1, HV2 i, mai nou, HV3, relev n medie 8 mutaii neutre fa de secvena de referin Anderson.Testarea identitii genetice mitocondriale. n practic, raritatea unui profil ADNmt se exprimn mod curent prin frecvena cu care profilul se regsete ntr-o baz de date considerat de referin.Noi markeri ADN folosii n genetica judiciar. ADN mitocondrial8182GENETICA JUDICIAR80GENETICA JUDICIARProbabilitatea ca doi indivizi, selectai la ntmplare dintr-o populaie, s aib profile ADNmt identice, poate fi estimat cu ajutorul probabilitii de identitate, dup formula:P = x2Unde: x = frecvena unui profil ADNmt ntr-o baz de date, iar P - probabilitatea de identitate (random match probability).P are valori cuprinse ntre 0,52% i 2,5%, n funcie de baza de date de referin (tabelul 7.1). Mrimea bazelor de date este factorul limitativ pentru calculul P n cazul profilelor ADNmt. Un studiu multicentric american, condus de FBI, a ncercat s elimine acest neajuns, compilnd datele din mai multe baze de date, reprezentative pentru mai multe grupuri populaionale. Rezultatele studiului au demonstrat c toate populaiile prezint un grad nalt de polimorfism la nivelul regiunilor hipervariabile ale ADNmt.TABELUL 7.1Baza de dateMrimea bazei (N)Diversitatea geneticProbabilitatea de identitate PCaucazieni americani6040,9960,52%Afro-americani1490,9980,89%Africani1110,9901,87%Caucazieni francezi1090,9961,30%Caucazieni austrieci1010,9971,28%Hispanici americani990,9931,74%Asiatici americani580,9922,50%Japonezi1620,9961,01%Tabelul arat grupurile populaionale, mrimea bazei de date (N - numr de indivizi), diversitatea I genetic i probabilitatea de identitate. Se observ c n diferite populaii diversitatea genetic a ADNmt I (echivalentul heterozigoiei) pentru analiza combinat a HV1 i HV2 este asemntoare, situndu-se n B jurul valorii de 0,99.n concluzie, un profil ADN mitocondrial poate fi raportat prin probabilitatea de identitate P atunci I cnd baza de date de referin este destul de cuprinztoare i are o diversitate genetic ridicat (de peste I 99%).Heteroplasmia ADNmt. Existena unui singur tip de ADNmt n toate celulele unui organism uman I face ca genomul mitocondrial s fie considerat un genom de tip homoplasmic (monoclonal). Acest lucru I nu exclude posibilitatea ca, uneori, datorit fenomenelor mutaionale, mai multe tipuri de ADNmt s fie I detectate la acelai individ. La nivelul ADNmt uman, regiunea necodant este caracterizat printr-o rat I nalt a mutaiilor. Datorit acestor mutaii, n celulele somatice ale unui adult se pot identifica mixturi I de mitocondrii, unele cu genom normal i altele cu genom modificat prin mutaii. Termenul careB desemneaz coexistena ntr-un organism a mitocondriilor cu genom normal i a mitocondriilor mutante I este cel de heteroplasmie.Fenomenul heteroplasmiei la nivel mitocondrial este frecvent raportat n ultimii ani n domeniul I identificrilor de persoane, heteroplasmia regiunii necodante a ADNmt fiind mult mai rspndit dect I s-a estimat anterior. La ora actual, se admite c toi indivizii umani au la nivelul genomului mitocondrial Iun oarecare grad de heteroplasmie mai mult sau mai puin detectabil. Organismul uman este compus din circa trei miliarde de celule, fiecare dintre aceste celule coninnd mii de copii de ADNmt. Prezena aceluiai genom mitocondrial n toate celulele unui organism adult ar fi un fapt oarecum surprinztor, dat fiind cantitatea imens de material genomic mitocondrial cu particularitile sale morfologice i funcionale. Indivizii heteroplasmici pot prezenta:ADNmt heteroplasmie la nivelul unui singur esut.ADNmt heteroplasmie ntr-un numr limitat de esuturi concomitent cu ADNmt homoplasmic n l restul esuturilor.Dou tipuri de ADNmt homoplasmic, n proporii relativ egale, la nivelul tuturor esuturilor. Frecvena heteroplasmiei ADNmt pare a fi mai ridicat n esuturile non-mitotice. Astfel, au fost; raportai indivizi homoplasmici pentru celulele sanguine prezentnd nivele detectabile de heteroplasmie [ n esuturile cerebrale. Fenomenul heteroplasmiei este raportat frecvent i n asociere cu diferite maladii genetice mitocondriale.Nivelele de heteroplasmie n firele de pr sunt mai mari dect n probele de snge, frecvena acestora fiind estimat la 9,7%.Cnd se lucreaz pe probe de snge, 2,6% din cazurile de mam-copil prezint heteroplasmie I mitocondrial.Testarea gemenilor a evideniat, de asemenea, heteroplasmii n 1,8% din cazuri; gemenii pot avea acelai tip de heteroplasmie sau numai unul dintre gemeni prezint un profil heteroplasmie.Tipuri de heteroplasmii mitocondriale. Varietile de heteroplasmii cel mai frecvent semnalate la nivelul ADNmt necodant sunt: heteroplasmia punctiform (sau de poziie) i heteroplasmia prin modificarea lungimii, de regul a unui lan homopolimeric.Heteroplasmia punctiform se definete prin prezena n aceeai poziie i n proporii relativ egale a dou nucleotide diferite. Dac prin secveniere, ntr-o anumit poziie a regiunilor hipervariabile ale ADNmt se detecteaz simultan dou semnale - de exemplu A i T - atunci ADNmt este considerat heteroplasmie n poziia respectiv. Condiia este ca semnalul secundar s aib aproximativ 40% din intensitatea semnalului de baz. Prezena celor dou semnale desemnnd prezena a dou nucleotide diferite n aceeai poziie trebuie obligatoriu confirmat printr-o analiz de secveniere de sens contrar (de regul, a lanului L a ADNmt). Conform acestei definiii, heteroplasmiile intra-individuale punctiforme la nivelul ADNmt au o inciden sczut i nu par s afecteze identificrile de rutin din laboratoarele de genetic judiciar.Heteroplasmia de lungime apare prin modificarea numrului de nucleotide ce intr n structura unui lan homopolimeric (poriune din lanul polinucleotidic, alctuit din nucleotide de acelai tip). Lanurile policitozinice (poly-C strech) din ambele regiuni hipervariabile HV1 i HV2 prezint deseori heteroplasmii prin modificarea lungimii, inseria unei nucleotide C reprezentnd varianta cea mai comun. Aglomerrile de citozine n exces sunt uneori dificil de interpretat, raportndu-se frecvent numai poziia de start a unei serii de citozine.Exist o serie de loci unde polimorfismele mitocondriale, n special cele de lungime, sunt frecvent raportate: HV2 - 304. 309. 315 (inseria unor baze C adiionale este frecvent); aceste observaii au condus la un consens general n comunitatea tiinific judiciar, n sensul c aceste polimorfisme s nu fie utilizate n interpretarea probelor pentru confirmarea identitii unor indivizi sau excluderea acesteia.Heteroplasmia n 2 poziii simultan, cunoscut i sub numele de triplasmie, este rar ntlnit; dac se suspicioneaz o astfel de triplasmie, ea trebuie evaluat i raportat ca atare numai n condiiile n care se exclude posibilitatea unei mixturi de ADNmt provenind din surse diferite.Dac mai multe poziii de la nivelul moleculei de ADNmt investigate prezint mixturi de baze nucleotidice I (cel puin 2 baze pentru acelai locus), atunci cel mai probabil este vorba de o mixtur de probe biologice i nu I despre un ADNmt cu heteroplasmii multiple. Cnd exist dificulti de interpretare datorit unor artefacte, I exist posibilitatea coamplificrii ADNnc mpreun cu cele dou secvene HV1 i HV2 - unele pseudogene. I ADNnc pot amplifica i se pot confunda cu ADNmt ca fiind heteroplasmii: pn n prezent nici o pseudogen I omolog cu HV2 nu a fost identificat, dar 2 pseudogene prezentnd omologie structural cu regiunea HVI au I fost descrise; oricum fiecare dintre aceste pseudogene are cel puin 20 de nucleotide diferite fa de regiunea I HVI aparinnd ADNmt. n aceste condiii, un analist experimentat cu greu face aceast confuzie, catalognd I ca heteroplasmie un produs de amplificare al unei pseudogene.Raportarea fenomenului heteroplasmiilor n investigaiile medico-legaleFenomenul heteroplasmiei, precum i rata cu care este raportat acest fenomen sunt n strns I legtur cu diferitele definiii adoptate pentru a descrie fenomenul heteroplasmiei. Fenomenul heteroplasmiei I n regiunea necodant a ADNmt a fost prima oar raportat n 1994, de ctre Forensic Science Servicies, I cu ocazia identificrii rmielor familiei Romanovilor.n poziia 16169 a ADNmt provenit din rmiele osoase ale putativului ar Nicolae al II-lea al Rusiei a fost detectat o heteroplasmie punctiform. Analiza rmielor fratelui arului, marele duce Georgij Romanov, a evideniat identitatea secvenei sale mitocondriale cu cea a arului Nicolae, inclusiv heteroplasmia punctiform din poziia 16169, singura diferen fiind proporia uor diferit a celor dou nucleotide din mixtura heteroplasmic. Prezena heteroplasmiei ADNmt deopotriv I la ar i ducele Georgij a crescut probabilitatea identificrii osemintelor respective ca aparinnd arului Nicolae al II-lea.Se estimeaz c detecia heteroplasmiilor n practica de genetic judiciar este de circa 5% dintre I cazurile investigate pentru ADNmt.Detectarea unei poziii heteroplasmice prin secveniere mitocondrial necesit n general tehnici de I secveniere cu rezoluie nalt, metode care nu se aplic de rutin n practica de genetic judiciar, I numrul laboratoarelor abilitate s fac astfel de investigaii fiind limitat. Odat detectat o heteroplasmie, I nivelul acesteia poate fi cuantificat prin procedee de integrare gravimetric a intensitii semnalelor I secvenelor.Studiile ntreprinse de laboratorul FBI au precizat modalitile prin care se exprim heteroplasmia I n probele judiciare, conducnd la o mai bun nelegere a fenomenului. Toate aceste informaii s-au putut I obine datorit, n primul rnd, sporirii considerabile a performanelor tehnicilor de lucru n secvenierea I ADNmt n ultimii ani.Din punct de vedere al practicii medico-legale, compararea direct ntre dou secvene de ADNmt I simplific ntr-o oarecare msur problema. Marea variabilitate a regiunii necodante a ADNmt uman nu I permite dect n situaii extrem de rare ca doi indivizi, complet nenrudii biologic, s difere doar prin I unul sau dou nucleotide. n cazurile n care apar aceste diferene minime, de numai una sau cel mult I dou nucleotide ntre dou probe biologice, specialitii n analiz mitocondrial recomand a se avea n I vedere posibilitatea existenei unei heteroplasmii.Strategiile de lucru n analiza ADNmtMetoda care s-a impus n prezent n investigarea polimorfismelor ADNmt const n amplificarea I PCR a regiunilor de interes din ADNmt (HVI, F1V2 i, mai recent, HV3) i urmat de secvenierea I direct a produilor de amplificare. Etapele unei analize ADNmt sunt: analiz vizual i prepararea I probelor n vederea extraciei, extracia ADN, amplificarea PCR a regiunilor de interes, purificarea i INoi markeri ADN folosii n genetica judiciar. ADN mitocondrial8584GENETICA JUDICIARNoi markeri ADN folosii n genetica judiciar. ADN mitocondrial83cuantificarea produilor de amplificare, amplificarea de secveniere, purificarea produilor de secveniere, detecia automat a produilor de secveniere i analiza datelor. Accentul cade n special pe etapele de extracie i PCR, care sunt eseniale n obinerea de rezultate fiabile pentru secveniere. n prezent, un potenial neajuns al secvenierii ADNmt n scop de identificare l reprezint nc tehnica n sine, extrem de laborioas. Pe viitor, se preconizeaz automatizarea tehnicilor de analiz astfel nct s permit un randament nalt al secvenierii i s minimizeze erorile de laborator i de interpretare.Complexitatea analizelor mitocondrialeAnaliza ADNmt reprezint cel mai laborios tip de investigaie ADN ce se efectueaz n prezent n scop de identificare. Genotiparea mitocondrial se realizeaz la ora actual n laboratoarele ADN cu experien i echipamente performante, iar numrul acestor laboratoare este nc redus. Spre exemplu, n S.U.A., doar 7 laboratoare sunt acreditate s efectueze n prezent acest tip de analize, din care doar unul singur aparine FBI. ntre 1996-2001, numrul specialitilor n analize mitocondriale din acest laborator de referin al FBI a crescut de la 4 la 12. Statisticile arat c rata comunicrii unor rezultate finale pentru tipri de ADNmt este de aproximativ 1-2 cazuri/analist/lun (ntre 1996-1999 acest laborator al FBI a raportat aproximativ 150 de cazuri de genotipri ADNmt).Motivele acestui randament sczut de lucru sunt:probele biologice degradate sau n cantiti mici, necesitnd numeroase reacii PCR i adaptarea permanent a protocoalelor de lucru, astfel nct s se obin suficient ADNmt pentru etapa de secveniere;procedurile exhaustive necesare controlului contaminrilor;analiza prin secveniere automat a ambelor catene de ADNmt (H i L) i n amndou regiunile hipervariabile.Comisia ADN a International Society for Forensic Genetics recomand n recentul Guidelines for mitochondrial DNA typing (2000) ca metodologia de lucru de rutin s cuprind, acolo unde este desigur posibil, efectuarea secvenierii ADNmt n duplicat, precum i secvenierea obligatorie a ambelor catene ale ADNmt (H i L), n scopul reducerii ambiguitilor de interpretare a secvenelor.Avantajele i dezavantajele tiprilor mitocondrialeADNmt, n general, nu poate servi ca unic element de identificare genetic al unei persoane, ntruct indivizi aparent nenrudii pot avea acelai ADNmt printr-o descenden comun pe linie matern, situat undeva n trecut, uneori la distan de cteva generaii. n contrast cu profilul mitocondrial, profilul ADN nuclear are o putere discriminatorie foarte mare, astfel nct se poate aprecia c genotipul nuclear al unei persoane este unic prin raportare la o populaie de ordinul milioanelor. Dac, totui, : analiza profilului ADNmt nu este att de discriminatorie, ea poate reprezenta unica soluie pentru cazurile unde genotiparea nuclear este practic imposibil. n acest sens, analiza ADNmt i-a ctigat deja un loc important n aria identificrilor medico-legale.Genotiparea ADNmt n genetica judiciar rmne o investigaie relativ limitat, rezervat numai cazurilor unde tiparea ADNnc eueaz.Candidate pentru mitotipare sunt urmtoarele tipuri de probe biologice:firele de pr fr folicul pilos,oasele i dinii degradai prin carbonizare, mediu acid, umiditate, nhumare prelungit,alte tipuri de probe pentru care a euat tiparea cu markeri nucleari.Analiza ADNmt este extrem de util pentru identificrile unde nu este posibil obinerea unor probe biologice de referin pentru genotipare; n aceste situaii, orice rud de pe linia matern poate servi ca element de referin n investigaie, deoarece toi motenesc aceeai secven a ADNmt. Din cauza recombinrilor meiotice i a ereditii biparentale (diploide) a ADNnc, reconstituirea unui profil genetic nuclear, pornind chiar de la rudele de gradul I ale unei persoane disprute sau decedate, nu este deloc o misiune simpl, nici pentru cele mai performante laboratoare i experimentai specialiti, de aceea se prefer n aceste situaii lucrul pe ADNmt.Genotiparea ADNmt izolat din fire de pr. Cea mai mare parte a firelor de pr prelevate de la locul unei crime sunt fire de pr czute n mod natural, care nu conin bulb pilos i, implicit, nici material genetic nuclear. Singurul material genetic care se gsete n firul de pr fr bulb este cel mitocondrial. Analiza ADNmt prin secveniere reprezint singura metod prin care se poate identifica donorul unui fir de pr fr bulb.Scalpul uman conine njur de 100 000-150 000 de foliculi piloi, aflai ntr-unul din cele trei stadii de dezvoltare (tabelul 7.II, dup Linch i colab. 1998, Petraco i colab. 1988).TABELUL 7.11 IStadiile de dezvoltare ale folculilor piloiDescrierea stadiului de dezvoltareProporia n care se regsesc foliculii piloiAnagen- faza de cretere activ a prului capilar, cu durat cuprins ntre 2 pn la 8 ani80%Catagen faza de ncetare a activitii foliculului pilos1%Telogen- faza de repaus, cnd firele de pr cad n mod natural20%Rata de succes a genotiprilor. n prezent, nu se cunosc foarte exact factorii care influeneaz direct rata succesului genotiprilor ADNmt n cazul firelor de pr. Rata de succes n genotiparea ADNmt din firele de pr capilare este prezumat a fi cea mai mare pentru firele de pr aflate n faza de cretere (anagen). Dac reuita genotiprii ar depinde n principal de stadiul de dezvoltare al firelor de pr, ansa obinerii unui profil ADNmt ar trebui s fie mai mic dect media raportat n practic - 75% pentru fire de pr aflate n telogen (aceste fire de pr sunt cele mai comune probe biologice prelevate n cazurile judiciare). S-a observat c reuita genotiprii ADNmt este ceva mai ridicat pentru firele de pr provenind de la indivizii de sex masculin (79% vs 71% - fire de pr provenind de la persoane de sex feminin). Pentru firele de pr de culoare nchis i groase exist o uoar tendin de cretere a anselor genotiprilor comparativ cu firele de pr deschise la culoare i subiri. Tratamentele cosmetice (colorani, ampon) nu par s influeneze genotiprile ADNmt, rata medie a succesului fiind de 67-71% la analiza firelor de pr capilare prezentnd diferite tratamente cosmetice.Studiile au evideniat faptul c localizarea specific a firelor de pr pare a influena direct rata succesului: genotiparea ADNmt este raportat n procent de 75% pentru firele de pr capilare, urmat de 66% pentru firele de pr pubian i 52% pentru firele de pr axilar.Problema contaminanilor. Se cunoate faptul c probele de pr sunt contaminate n proporie de 85% cu alte materiale biologice avnd cele mai diferite origini: saliv, snge etc. n cazurile n care probele de pr nu sunt curate extrem de riguros de contaminani n etapele ce preced extracia ADN, sensibilitatea deosebit a reaciei PCR permite coamplificarea contaminanilor alturi de ADN propriu firului de pr. Coamplificarea contaminanilor poate duce la obinerea de rezultate eronate, n principalla excluderi eronate ale suspecilor. Avndu-se n vedere aceast problem, probele judiciare reprezentate de fire de pr, cu sau fr bulb, trebuie prelucrate cu mult rigoare. Procedeele de curare aa-zise clasice constau n principiu n incubarea firelor de pr peste noapte n soluie salin, urmat a doua zi de mai multe splri cu alcool absolut.Omogenitate versus heterogenitate la nivelul ADNmt. ntrebarea, la care nu exist pn n prezent un rspuns clar, este dac apar variaii intra-individuale ntre secvenele de ADNmt provenite din fire de pr i alte tipuri de probe biologice aparinnd aceluiai individ, i n ce proporie apar aceste variaii intra-individuale. Se argumenteaz c rata nalt a diviziunii specific celulelor foliculului pilos favorizeaz apariia de mutaii n firul de pr n timpul vieii unui individ. Aceast ipotez ar putea explica incidena crescut a heteroplasmiei raportat pentru firele de pr comparativ cu alte esuturi. Nu trebuie nici un moment pierdut din vedere faptul c, n cazul firelor de pr, unele secvene de ADNmt etichetate heteroplasmice pot reprezenta n realitate doar consecina unei banale contaminri. Optimizarea metodelor de secveniere i procesarea simultan a lanurilor H i L mitocondriale ajut analitii s disceam aspectele menionate anterior.Deleiile ADNmt i corelarea lor cu vrsta. Deleiile genomului mitocondrial sunt detectate frecvent la indivizii aduli. Ele apar mai frecvent n celulele bine difereniate cu rat mitotic joas, cum ar fi celulele creierului. Deleiile cresc cantitativ i se acumuleaz cu vrsta, putnd servi la determinarea vrstei unui individ. n prezent, studiile ncearc s coreleze fenomenul cu naintarea n vrst. Cea mai comun deleie a ADNmt, observat pe preparte biopsice i autopsice, a fost cea raportat n poziia 4977, ea fiind un marker util pentru mbtrnirea fiziologic. Astfel, un ADNmt prezentnd o deleie n poziia 4977 poate fi sugestiv pentru un individ avnd vrsta biologic de peste 50 de ani. n afar de factorul vrst, deleia n poziia 4977 a mai fost corelat cu maladii degenerative de tipul parkinsonului, cirozelor hepatice sau cardiomiopatiilor. Un factor exogen ce pare a influena proporia deleiilor ADNmt este expunerea la soare: proporia deleiilor din celulele pielii expuse la soare este de 10 ori mai mare dect n ariile neexpuse.Standardele de calitate ale analizei i bazele de date ADNmtBazele de date cu ADNmt uman sunt nc la nceputul constituirii lor, dar cantitatea de informaii care se acumuleaz pe zi c